ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ...14/03/2014! Καθηγητής Δρ....

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ!

14/03/2014!Καθηγητής Δρ. Κωνσταντίνος

Ε. Βοργιάς! 1!

14/03/2014! Καθηγητής Δρ. Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς! 2!

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ

1.  Ποιά είναι τα διάφορα είδη RNA 2.  Ποιά είναι τα στάδια της

µεταγραφής 3.  Μεταγραφική ωρίµανση RNA 4.  Ποιά είναι η ενζυµολογία της

µεταγραφής 5.  Πως ρυθµίζεται η µεταγραφή



Τι είναι µεταγραφή του γενετικού υλικού;

Μεταγραφή είναι το πρώτο βήµα στην ΕΚΦΡΑΣΗ της γενετικής πληροφορίας και η µετατροπή µιας αλυσίδα δίκλωνου DNA σε µονόκλωνο RNA.



Γενικά χαρακτηριστικά της µεταγραφής

•  Σύνθεση µιας νέας αλυσίδας (RNA) συµπληρωµατικής προς την αρχική (DNA)

•  Κατά τη µεταγραφή αντιγράφεται επιλεκτικά ένα πολύ µικρό τµήµα του DNA παράγοντας από 1 έως χιλιάδες αντίγραφα RNA

•  Η επιλεκτική αντιγραφή προϋποθέτει την ακριβή µεταγραφή ενός τµήµατος γονιδίου µε αρχή και τέλος

•  Η ασυνεχής πληροφορία που πιθανόν να παράγεται και να τροποποιείται=ωριµάζει

•  Διαφορική έκφραση: τοπικά και χρονικά = ρύθµιση (regulation of gene expression)

•  Σηµαντική πιστότητα (10-4) αλλά µικρότερη της αντιγραφής (10-7)



Γενικά για τη µεταγραφή

•  Η πιστότητα της µεταγραφής εξαρτάται από: •  Την ακριβή αντιγραφή µιας αλληλουχίας DNA βάσει της αρχής της συµπληρωµατικότητας

•  Την αναγνώριση των ειδικών σηµείων έναρξης και λήξης

•  Σωστή λειτουργία των ενζύµων που παράγουν RNA από DNA.

•  Μεταγραφική µονάδα (transcription unit) ορίζεται: η περιοχή που µεταγράφεται (σηµεία έναρξης και λήξης) και µπορεί να περιλαµβάνει περισσότερα του ενός γονίδια.

•  Υποκινητές (promoters) είναι: οι αλληλουχίες του DNA που προσδένεται η RNA πολυµεράση και αρχίζει η µεταγραφή.


Μια µεταγραφική µονάδα µεταγράφεται σε ένα ενιαίο RNA.

Ένας τυπικός υποκινητής αποτελείται από τρία στοιχεία: τις πρότυπες αλληλουχίες στις θέσεις -35 και -10 και το

σηµείο έναρξης.





•  Τα πρόδροµα µόρια για τη σύνθεση RNA είναι 5’-τριφωσφορικά ριβονουκλεοτίδια (ATP, GTP, CTP, UTP), οπότε το 5’-ακρο του RNA έχει ένα τριφωσφορικό και το 3’-ακρο ένα -ΟΗ

•  Ο πολυµερισµός είναι η αποµάκρυνση ενός µορίου Η2Ο από την ένωση της 3΄-ΟΗ και της 5’-τριφωσφορικής οµάδας του νεοεισερχόµενου νουκλεοτιδίου




Το RNA συντίθεται µε κατεύθυνση 5’>3’ άρα προσθήκη στο 3’-ΟΗ (όµοια µε τη σύνθεση DNA στην αντιγραφή) Οι RNA πολυµεράσες δεν χρειάζονται πρωταρχικό τµήµα (σε αντίθεση µε τις DNA πολυµεράσες)


1.   Ποιά είναι τα διάφορα είδη RNA που παράγονται κατά τη µεταγραφή

Τα διάφορα είδη RNA είναι: •  mRNA (προ- και ευκαρυωτικό) •  ριβοσωµικό RNA (rRNA) (προ- και ευκαρυωτικό)

•  µεταφορικό RNA (tRNA) (προ- και ευκαρυωτικό)

•  Μικρά κυτταροπλασµατικά RNAs (scRNAs) •  Μικρά πυρηνικά RNAs (snRNAs)



2. Ποιά είναι τα στάδια της µεταγραφής

1ο στάδιο: Αναγνώριση του υποκινητή από την RNA πολυµεράσης και πρόσδεση σε αυτόν




2ο στάδιο: Έναρξη της µεταγραφής

•  Αλληλουχία υποκινητών (προ- και ευκαρυωτικά)

•  Παράγοντες έναρξης (προ- και ευκαρυωτικά)




3ο στάδιο: Επιµήκυνση της αλυσίδας 4ο στάδιο: Λήξη της µεταγραφής και αποµάκρυνση της αλυσίδας RNA. Αλληλουχίες λήξης (προ- και ευκαρυωτικά και Παράγοντες λήξης (προ- και ευκαρυωτικά)



Η RNA πολυµεράση των βακτηρίων αποτελείται από τέσσερεις υποµονάδες:

•  οι α, β και β΄ έχουν σχετικά σταθερά µεγέθη σε διάφορα είδη βακτηρίων (core RNA enzyme)

•  η σ ποικίλλει σε µεγαλύτερο βαθµό (παράγοντας έναρξης, initiation factor)

•  Α2ββ΄ως ολοένζυµο

Αναγνώριση και έναρξη της µεταγραφής


14/03/2014! 14!

Οι υποµονάδες β και β΄ δηµιουργούν επαφές τόσο µε τη µήτρα όσο και µε την κωδική αλυσίδα του DNA, κυρίως στην περιοχή της µεταγραφικής

θηλιάς και πιο καθοδικά από αυτή.

Καθηγητής Δρ. Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς!



Χαρακτηριστικά των RNA πολυµερασών

14/03/2014! 15!Καθηγητής Δρ. Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς!




Στους προκαρυωτικούς µια RNA πολυµεράση µεταγράφει όλα τα γονίδια ενώ στους ευκαρυωτικούς έχουµε περισσότερες

Είδος RNA που συνθέτει0 Όνομα πολυμεράσης0

mRNA! RNA pol II!

tRNA! RNA pol III!

rRNA 5.8s, 18s, 28s! RNA pol I!

rRNA 5 s! RNA pol IIl!

snRNA και scRNA! RNA pol II (sn) και II+IΙΙa (sc)!

Μιτοχονδριακά γονίδια! Mitochondrial b!

Γονίδια χλωροπλάστη! Chloroplast b!

14/03/2014! 16!

Το κεντρικό ένζυµο προσδένεται αδιακρίτως σε οποιαδήποτε αλληλουχία DNA.

Ο παράγοντας σίγµα µειώνει τη συγγένεια για τις τυχαίες αλληλουχίες και παρέχει εξειδίκευση για τους υποκινητές.





14/03/2014! 17!

Ο παράγοντας σίγµα συνδεδεµένος µε το κεντρικό ένζυµο

καθορίζει την οµάδα των υποκινητών όπου

θα αρχίσει η µεταγραφή.





14/03/2014! 18!

Οι παράγοντες σίγµα της E. coli αναγνωρίζουν υποκινητές µε διαφορετικές πρότυπες αλληλουχίες.




Χαρακτηριστικά του παράγοντα σ

14/03/2014! 19!

Εκτός από τον σ70, η E. coli έχει αρκετούς παράγοντες σίγµα που επάγονται σε

συγκεκριµένες περιβαλλοντικές συνθήκες. Καθηγητής Δρ. Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς!



Χαρακτηριστικά του παράγοντα σ




Χαρακτηριστικά των υποκινητών

•  Το πρώτο βήµα στη µεταγραφή είναι η πρόσδεση της RNA pol στον υποκινητή (θα το δούµε αργότερα)

•  Υποκινητής: -10 (Pribnow box, TATAAT consensus) και -35 bp (TTGACA consensus) από το σηµείο έναρξης της µεταγραφής

•  Νέα upstream elements είναι ισχυροί υποκινητές (-40 ως -60) ειδικά για γονίδια που κωδικοποιούν rRNA

•  Υποκινητές (ασθενείς και ισχυρούς) ανάλογα µε τον αριθµό των RNA που παράγονται στην µονάδα του χρόνου.


Η µία όψη του υποκινητή περιέχει τα

σηµεία επαφής µε την RNA πολυµεράση.



Χαρακτηριστικά του υποκινητή

14/03/2014! 22!

Στον υποκινητή

•  η αλληλουχία -35 χρησιµοποιείται για την αρχική αναγνώριση και

•  η αλληλουχία -10 για την αντίδραση τήξης, που µετατρέπει ένα κλειστό σύµπλοκο σε ανοικτό.




Χαρακτηριστικά του υποκινητή

14/03/2014!Καθηγητής Δρ. Κωνσταντίνος

Ε. Βοργιάς! 23!

Τα αµινοξέα στην α-έλικα 2.4 του σ70 δηµιουργούν ειδικές επαφές µε βάσεις στην κωδική περιοχή της

αλληλουχίας -10 του υποκινητή.



Δοµική βάση της αλληλεπίδρασης του παράγοντα

σ µε τον υποκινητή

14/03/2014! 24!

Με τη δηµιουργία του ανοικτού συµπλόκου η RNA pol είναι έτοιµη να αρχίσει να συνθέσει.

Η θέση έναρξης προσδένει µόνο πυρίνες (ATP, GTP) και κυρίως ΑΤP, οπότε συνήθως η πρώτη βάση που µεταγράφεται είναι Τ.

Τα νουκλεοτίδια συνδέονται µε φωσφοδιεστερικό δεσµό.

RNA pol – DNA κινούνται η µια σε σχέση µε την άλλη κατά ένα νουκλεοτίδιο.

Ανεπιτυχής έναρξη (abortive initiation) συµβαίνει όταν µικρά (<10b) RNA απελευθερώνονται και σταµατά η µεταγραφή.

Εργαλείο στη µελέτη της µεταγραφής είναι το αντιβιοτικό ριφαµπικίνη (β-υποµονάδα RNA pol και αναστέλλει την έναρξη αλλά όχι την επιµήκυνση).



Έναρξη της µεταγραφής



H επιµήκυνση της αλυσίδας του RNA επι της ουσίας αρχίζει µετά τις πρώτες 10 βάσεις που είτε θα γίνει ανεπιτυχής έναρξη ή θα προχωρήσει και θα ολοκληρωθεί ο πολυµερισµός της αλυσίδας του RNA δηλαδή πλήρης µεταγραφή.




H επιµήκυνση της αλυσίδας του RNA •  Μήτρα: DNA τοπικό αντιστρεπτό ξετύλιγµα που µετατοπίζεται µε το ένζυµο

•  Κατεύθυνση: 5’->3’ •  Ενζυµα: αρχικά η RNA πολυµεράση που καλύπτει -50 -> +20 (75-80 bp)




H επιµήκυνση της αλυσίδας του RNA •  Δυναµική της επιµήκυνσης της µεταγραφής: αφού ο παράγοντας σ αποδεσµευτή η RNA pol µεταγράφει χωρίς ειδικότητα.


Το µήκος του DNA που δεσµεύεται από την RNA πολυµεράση αλλάζει καθώς προχωρά από την έναρξη (75-80 bp) στην

επιµήκυνση (30-40 bp).

14/03/2014! 28!

Καθώς η µεταγραφική θηλιά (υβρίδιο 8-9 bp DNA/RNA) προχωρά, το δίκλωνο DNA επανασχηµατίζεται πίσω της, εκτοπίζοντας το RNA στη µορφή µονόκλωνης πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας.



Επιµήκυνση της µεταγραφής

14/03/2014! 29!

Κατά τη µεταγραφή, η θηλιά διατηρείται

µέσα στη βακτηριακή RNA πολυµεράση, η οποία αποδιατάσσει και επαναδιατάσσει το

DNA συνθέτοντας RNA.



Δυναµική και δοµική βάση της επιµήκυνσης της

µεταγραφής


14/03/2014! 30!

Η RNA pol κατά την επιµήκυνση παίρνει µέρος και σε διαδικασίες επιδιόρθωσης:

•  Πυροφωσφορολυτική επιδιόρθωση: αντικατάσταση λάθους µε PPi και ενσωµάτωση της σωστής βάσης

•  Υδρολυτική επιδιόρθωση: Η RNA pol γυρίζει προς τα πίσω κατά 1-2 nt, τέµνει την αλυσίδα του RNA, αποµακρύνει το λάθος, συνεχίζει. Συµµετέχουν και άλλοι παράγοντες που εξασφαλίζουν την αποτελεσµατικότητα της RNA pol.



Διαδικασίες επιδιόρθωσης κατά τη µεταγραφή




Οι αλληλουχίες λήξης έχουν τα εξης χαρακτηριστικά: •  Μια περιοχή δυαδικής συµµετρίας του DNA (αντίστροφα επαναλαµβανόµενη αλληλουχία-inverted repetitions), µια κεντρική περιοχή µη επαναλαµβανόµενη αλληλουχία.

•  Μια περιοχή πλούσια σε G+C που να βρίσκεται µέσα στην περιοχή που δηµιουργείται η φουρκέτα.

•  Μια πλούσια Α+Τ περιοχή που βρίσκεται µετά την περιοχή πλούσια σε G+C.

•  Άλλες αλληλουχίες απαιτούν τον πρωτεϊνικό παράγοντα Rho.

Ποιά είναι τα στάδια της µεταγραφής Λήξη της µεταγραφής

14/03/2014! 33!

•  Οι ενδογενείς αλληλουχίες τερµατισµού περιλαµβάνουν παλινδροµικές περιοχές οι οποίες σχηµατίζουν φουρκέτες (δοµές στελέχους-βρόχου) µε ποικίλο µήκος, από 7-20 bp.

•  Η δοµή στελέχους-βρόχου περιλαµβάνει µια περιοχή πλούσια σε G-C και ακολουθείται από µια σειρά καταλοίπων U.






3. Μετα-µεταγραφικές τροποποιήσεις των RNAs

Γενικά για την ωρίµανση στους ευκαρυωτικούς Τα αρχικά παραγόµενα µόρια RNA δεν είναι πάντα ίδια µε τα λειτουργικά ώριµα RNA. Αρχικό µετάγραφο (primary transcript) τροποποιείται για να δώσει το ώριµο RNA µέσω της διαδικασίας της ωρίµανσης (processing) αµέσως µετά τη µεταγραφή. Τροποποιήσεις: •  Νουκλεολυτικές αντιδράσεις (αποκοπή προδρόµου µορίου) •  Προσθήκες νουκλεοτιδίων στα άκρα του RNA (polyA 3’-

mRNA, capping-5’-mRNA και προσθήκη CCA στο 3’-άκρο του tRNA

•  Τροποποιήσεις βάσεων (µεθυλίωση της ριβόζης, ουριδίνη σε ψευδοουριδίνη κλπ).



3. Μετα-µεταγραφικές τροποποιήσεις των RNAs

Προκαρυωτικά: δεν υπόκεινται σε ωρίµανση του mRNA, έχουµε σύγχρονη µεταγραφή κα µετάφραση και µερικές φορές άµεση αποικοδόµηση: χαρακτηριστικά µεγάλης σηµασίας στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης στα προκαρυωτικά. Παρόλαυτα έχουµε πολυαδενυλίωση σε αρκετά βακτηριακά mRNA και σχετίζεται µε τη σταθερότητά τους. Τα προκαρυωτικά µυνήµατα είναι συνήθως πολυσιστρονικά (3-8 kb) δηλαδή κωδικοποιούν περισσότερες απο µια πρωτείνες. Στα άκρα τους έχουν σηµεία έναρξης και λήξης και αλληλουχίες που δεν µεταφράζονται (untranslated sequences). Οι αλληλουχίες µεταξύ των σιστρονίων µπορεί να είναι πολύ µεγάλες.

Προκαρυωτικά mRNA

Ένα βακτηριακό mRNA περιλαµβάνει µη µεταφραζόµενες, αλλά και µεταφραζόµενες περιοχές. Κάθε κωδική περιοχή έχει τα δικά της σήµατα έναρξης και τερµατισµού. Ένα τυπικό mRNA µπορεί να έχει αρκετές κωδικές περιοχές.



3. Μετα-µεταγραφικές τροποποιήσεις των RNAs Προκαρυωτικά mRNA

Το mRNA µεταγράφεται, µεταφράζεται και

αποικοδοµείται ταυτόχρονα στα βακτήρια.



Προκαρυωτικά mRNA

Οι µεταγραφικές µονάδες µπορούν να γίνουν ορατές στα βακτήρια.



Το ευκαρυωτικό mRNA τροποποιείται µε την προσθήκη µιας καλύπτρας στο 5΄ άκρο και µιας ουράς πολυ(Α) στο 3 ́άκρο.



3. Μετα-µεταγραφικές τροποποιήσεις των RNAs Ευκαρυωτικά mRNA

Η έκφραση του mRNA σε ζωικά κύτταρα απαιτεί µεταγραφή, τροποποίηση, επεξεργασία, πυρηνο-κυτταροπλασµατική µεταφορά και µετάφραση.



Το πολυ(Α)+ RNA µπορεί να διαχωριστεί από τα άλλα RNA µε κλασµάτωση σε στήλη σεφαρόζης-ολιγο(dT).



Οι τροποποιήσεις των άκρων του mRNA το προστατεύουν από την αποικοδόµηση. Εσωτερικές αλληλουχίες µπορεί να ενεργοποιήσουν τα συστήµατα αποικοδόµησης.



Η αποαδενυλίωση επιτρέπει την αφαίρεση της καλύπτρας, γεγονός που οδηγεί στην εξωνουκλεολυτική διάσπαση του 5΄ άκρου.



Σωµάτιο συρραφής = spliceosome





tRNA: Τα αρχικά προϊόντα της µεταγραφής των γονιδίων tRNA είναι µεγάλα πρόδροµα µόρια (precursor molecules)



1.  Όλα τα σταθερά µόρια RNA υπόκεινται σε ωρίµανση.

2.   Κάποια mRNA επίσης ωριµάζουν, αλλά λίγα είναι γνωστά

3.   Περισσότερες από 10 νουκλεάσες παίρνουν µέρος στη διαδικασία της ωρίµανσης

4.   Πολλά ένζυµα αναγνωρίζουν δοµικά χαρακτηριστικά παρά αλληλουχίες

5.   Δηµιουργούνται τροποποιηµένες βάσεις µε τη δράση ειδικών ενζύµων.

Τα βασικά χαρακτηριστικά που αφορούν την ωρίµανση στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς συνοψίζονται παρακάτω:



4. Πως ρυθµίζεται η µεταγραφή Ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης στους

προκαρυωτικούς

Στα βακτήρια γονίδια της ίδιας µεταβολικής οδού οργανώνονται σε συνεργιώµατα (operons) και µεταγράφονται σε ένα πολυσιστρονικό mRNA, οπότε η ρύθµιση γίνεται κυρίως στην έναρξη της µεταγραφής. Στα βακτήρια ένα σύστηµα ενεργοποιείται όταν χρειάζεται και αδρανοποιείται όταν δεν χρειάζεται.



4. Πως ρυθµίζεται η µεταγραφή Ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης στους προκαρυωτικούς

Δύο µεγάλες οµάδες γονιδίων-πρωτεϊνών: 1.   Δοµικά γονίδια (structural genes) είναι τα γονίδια του οπερονίου που κωδικεύουν ένζυµα και γενικά πρωτεϊνες που συµµετέχουν στη µεταβολική οδό την οποία ελέγχει το κάθε οπερόνιο.

2.   Ρυθµιστικά γονίδια (regulatory genes) Κωδικοποιούν πρωτεϊνες που δρούν ως καταστολείς: •  αρνητικά=καταστολείς (repressors) και δένονται στην ακολουθία του χειριστή (operator) που είναι σε άµεση επαφή µε την ακολουθία του υποκινητή (promoter). Οι καταστολείς αλληλεπιδρούν µε µικρά µόρια που να είναι επαγωγείς (inducers) και µειώνουν την κατασταλτική δράση

•  θετικά=ενεργοποιητές (activators) που προσδένονται στον υποκινητή και αυξάνουν την ικανότητα πρόσδεσης της RNA pol στον υποκινητή.



4. Πως ρυθµίζεται η µεταγραφή Ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς

H µοριακή βάση της ρύθµισης των γονιδίων στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς αποτελεί πεδίο εντατικής έρευνας. Τα συστήµατα ρύθµισης είναι διαφορετικά στους ευκαρυωτικούς που οφείλεται στον διαφορετική τους φυσιολογία. Η ρύθµιση σε επίπεδο µεταγραφής υπάρχουν τουλάχιστον 5 διαφορετικά επίπεδα που µπορούν να λειτουργήσουν οι ρυθµιστικοί µηχανισµοί.



4. Πως ρυθµίζεται η µεταγραφή Ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς

Αυτά τα επίπεδα είναι: 1.   της µεταγραφής ή µεταγραφικός έλεγχος

(transcriptional control) 2.   της ωρίµανσης του RNA (processing control) 3.   της µεταφοράς του mRNA από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα (transport control)

4.   της µετάφρασης του mRNA ή µεταφραστικός έλεγχος (translational control)

5.   του µεταµεταφραστικού ελέγχου (posttranslational control)

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ...14/03/2014! Καθηγητής Δρ....

Documents

Transcript of ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ...14/03/2014! Καθηγητής Δρ....