Universidad de Chile. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química

OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE

INULINA ENTRECRUZADA COMO AGENTE

ENCAPSULANTE DE

α-TOCOFEROL

Investigación financiada por el proyecto FONDECYT 1090209.

Tesis para optar al título de Químico Farmacéutico

AUTOR: JUAN ANDRÉS VEGA VELÁSQUEZ

Profesor Patrocinante:

Dra. Paz Robert Canales.

Departamento de Ciencia de los

Alimentos y Tecnología Química,

Universidad de Chile.

Director de Memoria:

Dr. Jorge Chávez Arrué. Departamento

de Ciencias y Tecnología

Farmacéutica, Universidad de Chile.

Santiago, Chile

2011

ii

999999999999

Nota y Firma

Autoridad Responsable

iii

DEDICATORIA

A Dios.

Por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado la perseverancia para

lograr mis metas, además de su infinita bondad y amor.

A mi Madre y Padre.

Por su gran amor y esfuerzo, por sus consejos que me han permitido ser un hombre de

bien y por el sacrificio que tan desinteresadamente han llevado a cabo todos estos

años por nosotros, sus hijos.

A mis Abuelos.

Por su amor, por su apoyo incondicional y por todas aquellas cosas que para ustedes

parecían mínimas, pero que para mí fueron de un valor incalculable. En especial

dedico mi esfuerzo de años a mi abuelo Delfín Velásquez Lizana, quien dejó una huella

indeleble en mi vida y quien contribuyo en gran medida a quien soy.

A mi Hermana y mi Sobrina.

Por los grandes momentos de felicidad que me han dado.

A mi profesora.

Doctora Paz Robert por su apoyo, confianza y motivación para la culminación de mis

estudios profesionales y elaboración de esta tesis. En quien encontré una maravillosa

persona y amiga.

A Paula García.

Por toda su ayuda en este trabajo, por compartir conmigo durante meses, por hacer

más llevaderas las infinitas horas que significó realizar este proyecto y más que nada

por la gran persona que eres.

iv

A mis amigos.

Que nos apoyamos mutuamente en nuestra formación profesional y que hasta ahora,

seguimos siendo amigos: Sebastián Silva, Francisco Ormazábal, Carolina Velasco,

Cesar Vásquez y Francisco Mura y a quienes conocí durante el desarrollo de esta tesis

y pasaron a formar parte de mi vida: Paula Jiménez y Andrés Bustamante.

A la Universidad de Chile y en especial a la Facultad de Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacéuticas.

Por permitirme ser parte de una generación de triunfadores y gente productiva para el

país.

v

AGRADECIMIENTOS

Agradezco la colaboración, participación y ayuda en el desarrollo de esta tesis a:

Doctora Paz Robert Canales y Paula García Concha, Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas, Universidad de Chile.

Proyecto FONDECYT 1090209.

Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química, Universidad de

Chile.

Departamento de Ciencias y Tecnología Farmacéutica, Universidad de Chile.

vi

TABLA DE CONTENIDOS

I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1

II. HIPÓTESIS ............................................................................................................ 3

III. OBJETIVOS ........................................................................................................ 4

1. Objetivo General: ................................................................................................ 4

2. Objetivos Específicos: ......................................................................................... 4

IV. MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 5

1. Antioxidantes: α-Tocoferol ................................................................................... 6

2. Microencapsulación: ........................................................................................... 7

2.1. Secado por aspersión o por Atomización: .................................................... 9

3. Material Encapsulante: ...................................................................................... 11

3.1. Inulina: ....................................................................................................... 11

3.2. Inulina Entrecruzada: ................................................................................. 12

4. Mecanismos y cinéticas de liberación: .............................................................. 13

V. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 16

1. Lugar de Trabajo: .............................................................................................. 16

2. Materiales: ........................................................................................................ 16

3. Equipos: ............................................................................................................ 16

4. Metodología: ..................................................................................................... 17

4.1. Elaboración de inulina entrecruzada: ......................................................... 17

4.1.1. Tricloruro de Fosforilo: ........................................................................ 17

4.2. Análisis realizados a la inulina nativa y entrecruzada: ................................ 18

4.3. Elaboración de microcápsulas: ................................................................... 20

4.3.1. Preparación del vehículo: .................................................................... 20

4.3.2. Microencapsulación: ........................................................................... 20

4.4. Diseño estadístico: ..................................................................................... 20

4.5. Determinación del porcentaje de Encapsulación de α-tocoferol: ................ 22

4.5.1. Contenido de α-tocoferol superficial: ................................................... 22

vii

4.5.2. Porcentaje de encapsulación: ............................................................. 22

4.6. Liberación de α-tocoferol en matrices alimentarias modelos: ..................... 23

4.7. Análisis Estadístico: ................................................................................... 24

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 25

1. Caracterización de inulina nativa y entrecruzada: ............................................. 25

1.1. Caracterización por FT-IR: ......................................................................... 25

1.2. Caracterización por 1H-RMN: ..................................................................... 27

1.3. Caracterización por 31P-RMN: .................................................................... 29

1.4. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido (DSC): ................... 30

1.5. Caracterización por Espectroscopia de Emisión Atómica ICP-AES: ........... 32

1.6. Determinación de la Capacidad de Retención de Agua y Solubilidad:........ 33

1.7. Morfología de la inulina nativa y entrecruzada: .......................................... 34

2. Microencapsulación. ......................................................................................... 36

2.1. Diseño de α-tocoferol con inulina nativa (AT-InN) y entrecruzada (AT-InE1 y AT-INE2). .............................................................................................................. 36

2.2. Microcápsulas obtenidas en condiciones óptimas: ..................................... 39

2.2.1. Condiciones de Microencapsulación: .................................................. 39

2.2.2. Porcentajes de encapsulación de las microcápsulas óptimas: ............ 40

2.2.3. Morfología de las microcápsulas óptimas: ........................................... 41

3. Evaluación de la cesión del activo: .................................................................... 44

3.1. Cinética de Liberación de α-tocoferol en n-hexano: ................................... 44

3.2. Cinética de Liberación de α-tocoferol en agua-tween 80: ........................... 45

VII. CONCLUSIONES ............................................................................................. 50

VIII. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................. 51

IX. GLOSARIO ....................................................................................................... 57

X. ANEXOS .............................................................................................................. 58

viii

INDICE DE TABLAS

TABLA Nº 1: NOMBRE DE LOS DISTINTOS TIPOS DE TOCOFEROL. .................................................................................. 7

TABLA Nº 2: NIVELES PARA LAS VARIABLES INDEPENDIENTES USADAS EN EL DISEÑO ESTADÍSTICO COMPUESTO CENTRAL 22 MÁS

ESTRELLA, PARA LA ENCAPSULACIÓN DE AT EN LOS DISEÑOS: AT-INN, AT-INE1 Y AT-INE2. ................................... 21

TABLA Nº 3: MATRIZ DE RESPUESTA PARA CADA SISTEMA (AT-INN, AT-INE1, AT-INE2). .............................................. 21

TABLA Nº4: DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FÓSFORO POR ICP-AES Y CÁLCULO DEL GRADO DE ENTRECRUZAMIENTO

(DC) PARA INULINA ENTRECRUZADA CON POCL3. .......................................................................................... 33

TABLA Nº5: CAPACIDAD DE RETENCIÓN DE AGUA (WBC) Y SOLUBILIDAD (%) DE INN, INE1 E INE2. ................................. 34

TABLANº6: PORCENTAJES DE ENCAPSULACIÓN DE Α-TOCOFEROL PARA LOS SISTEMAS AT-INN, AT-INE1 Y AT-INE2. ........... 36

TABLA Nº7: CONDICIONES ÓPTIMAS PARA LA ELABORACIÓN DE LAS MICROCÁPSULAS DE LOS SISTEMAS AT-INN, AT-INE1 Y AT-

INE2...................................................................................................................................................... 39

TABLA Nº8: Α-TOCOFEROL SUPERFICIAL Y ENCAPSULADO EN LAS MICROPARTÍCULAS OBTENIDAS BAJO CONDICIONES ÓPTIMAS

DE LOS SISTEMAS AT-INN, AT-INE1 Y AT-INE2. ............................................................................................ 40

TABLA Nº9: CONSTANTES DE ORDEN CERO Y UNO PARA LA LIBERACIÓN DE AT SUPERFICIAL DESDE LAS MICROCÁPSULAS

ÓPTIMAS PARA LOS SISTEMAS AT-INN, AT-INE1 Y AT-INE2 EN N-HEXANO. ........................................................ 45

TABLA Nº10: CONSTANTES DE LIBERACIÓN DE AT EN AGUA-TWEEN 80 A 25 ºC PARA MODELOS DE ORDEN CERO Y UNO. .... 48

TABLA Nº11: AJUSTE DE LOS PERFILES DE LIBERACIÓN DE Α-TOCOFEROL. .................................................................... 49

ix

INDICE DE FIGURAS

FIGURA Nº1: ECUACIONES QUE DESCRIBEN EL DETERIORO OXIDATIVO DE LÍPIDOS. RH: ÁCIDO GRASO INSATURADO; R.: RADICAL

ALQUIL; ROO.: RADICAL PEROXIL. ................................................................................................................. 5

FIGURA Nº2: ESTRUCTURA GENERAL DEL TOCOFEROL. ............................................................................................... 6

FIGURA Nº3: ECUACIONES QUE DESCRIBEN EL EFECTO ANTIOXIDANTE DEL TOCOFEROL. TH: TOCOFEROL; ROO.: RADICAL

PEROXIL; T.: RADICAL TOCOFEROXIL; T-T Y T-OOR: PRODUCTOS NO RADICALARIOS. ............................................... 7

FIGURA Nº 4: ESTRUCTURA DE LA INULINA. ........................................................................................................... 12

FIGURA Nº 5: REACCIONES DE ENTRECRUZAMIENTO. .............................................................................................. 13

FIGURA Nº6: ESPECTRO FT-IR DE LA INULINA NATIVA (INN). ................................................................................... 26

FIGURA Nº7: ESPECTRO FT-IR DE LA INULINA ENTRECRUZADA CON 0,3% DE POCL3 (INE1). .......................................... 26

FIGURA Nº 8: ESPECTRO FT-IR DE LA INULINA ENTRECRUZADA CON 1,0% DE POCL3 (INE2). ......................................... 27

FIGURA 9: ESPECTRO 1H-RMN DE LA INULINA NATIVA (INN). .................................................................................. 28

FIGURA Nº 10: ESPECTRO 1H-RMN DE LA INULINA ENTRECRUZADA CON 0,3% DE POCL3 (INE1). .................................. 28

FIGURA Nº 11: ESPECTRO 1H-RMN DE LA INULINA ENTRECRUZADA CON 1,0% DE POCL3 (INE2). .................................. 29

FIGURA Nº 12: ESPECTRO 31

P-RMN DE LA INULINA ENTRECRUZADA CON 1,0% DE POCL3 (INE2). ................................. 30

FIGURA Nº 13: TERMOGRAMA (DSC) DE LA INULINA NATIVA (INN). ......................................................................... 31

FIGURA Nº 14: TERMOGRAMA (DSC) DE LA INULINA ENTRECRUZADA CON 0,3% DE POCL3 (INE1). ................................ 31

FIGURA Nº 15: TERMOGRAMA (DSC) DE LA INULINA ENTRECRUZADA CON 1% DE POCL3 (INE2). ................................... 32

FIGURA Nº16: FOTOMICROGRAFÍAS DE INULINA NATIVA. LA FOTOGRAFÍA DE LA IZQUIERDA POSEE UNA AMPLITUD X45 Y LA DE

LA DERECHA UNA AMPLITUD DE X1500 VECES. .............................................................................................. 34

FIGURA Nº17: FOTOMICROGRAFÍAS DE INULINA ENTRECRUZADA CON POCL3 AL 0,3% (INE1). LA FOTOGRAFÍA DE LA

IZQUIERDA POSEE UNA AMPLITUD X200 Y LA DE LA DERECHA UNA AMPLITUD DE X1000 VECES. .............................. 35

FIGURA Nº18: FOTOMICROGRAFÍAS DE INULINA ENTRECRUZADA CON POCL3 AL 1,0% (INE2). LA FOTOGRAFÍA DE LA

IZQUIERDA POSEE UNA AMPLITUD X200 Y LA DE LA DERECHA UNA AMPLITUD DE X1000 VECES. .............................. 35

FIGURA Nº19: GRÁFICO DE SUPERFICIE DE RESPUESTA PARA EL DISEÑO AT-INN. .......................................................... 37

FIGURA Nº20: GRÁFICO DE SUPERFICIE DE RESPUESTA PARA EL DISEÑO AT-INE1. ......................................................... 38

FIGURA Nº21: GRÁFICO DE SUPERFICIE DE RESPUESTA ESTIMADA PARA EL DISEÑO AT-INE2. .......................................... 38

FIGURA Nº22: MICROFOTOGRAFÍA DE MICROCÁPSULAS OBTENIDAS BAJO CONDICIONES ÓPTIMAS PARA EL SISTEMA AT-INN.

LA FOTOGRAFÍA DE LA IZQUIERDA POSEE UNA AMPLITUD X3000 Y LA DE LA DERECHA UNA AMPLITUD DE X8000 VECES.

............................................................................................................................................................ 41

x

FIGURA Nº23: MICROFOTOGRAFÍA DE MICROCÁPSULAS OBTENIDAS BAJO CONDICIONES ÓPTIMAS PARA EL SISTEMA AT-INE1.

LA FOTOGRAFÍA DE LA IZQUIERDA POSEE UNA AMPLITUD X3000 Y LA DE LA DERECHA UNA AMPLITUD DE X8000 VECES.

............................................................................................................................................................ 42

FIGURA Nº24: MICROFOTOGRAFÍA DE MICROPARTÍCULAS OBTENIDAS BAJO CONDICIONES ÓPTIMAS PARA EL SISTEMA AT-INE2.

LA FOTOGRAFÍA DE LA IZQUIERDA POSEE UNA AMPLITUD X3000 Y LA DE LA DERECHA UNA AMPLITUD DE X8000 VECES.

............................................................................................................................................................ 42

FIGURA Nº25: PERFIL DE LIBERACIÓN DE AT PARA LAS MICROPARTÍCULAS OBTENIDAS BAJO CONDICIONES ÓPTIMAS, PARA LOS

SISTEMAS AT-INN, AT-INE1 Y AT-INE2, UTILIZANDO N-HEXANO COMO MEDIO DE DISOLUCIÓN. ............................. 44

FIGURA Nº 26: PERFIL DE LIBERACIÓN DEL AT FRENTE AL TIEMPO PARA LAS MICROCÁPSULAS DE INE2 OBTENIDAS BAJO

CONDICIONES ÓPTIMAS EN AGUA-TWEEN-80 COMO MEDIO DE DISOLUCIÓN. ....................................................... 46

FIGURA Nº27: PERFIL DE LIBERACIÓN DE AT PARA LAS MICROPARTÍCULAS OBTENIDAS BAJO CONDICIONES ÓPTIMAS, PARA LOS

SISTEMAS AT-INN, AT-INE1, AT-INE2, UTILIZANDO AGUA-TWEEN 80 COMO MEDIO DE DISOLUCIÓN. ..................... 47

INDICE DE ECUACIONES

ECUACIÓN Nº1: ECUACIÓN DE HIGUCHI. .............................................................................................................. 14

ECUACIÓN Nº2: ECUACIÓN DE KORSMEYER & PEPPAS: ........................................................................................... 14

ECUACIÓN Nº3: DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD DE RETENCIÓN DE AGUA (WBC). .................................................. 19

ECUACIÓN Nº4: DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIDAD. ............................................................................................ 19

ECUACIÓN Nº5: CALCULO DEL PORCENTAJE SUPERFICIAL DE TOCOFEROL. .................................................................. 22

ECUACIÓN Nº6: CALCULO DEL PORCENTAJE DE ENCAPSULACIÓN DE TOCOFEROL. .......................................................... 23

ECUACIÓN Nº7: CALCULO DEL GRADO DE ENTRECRUZAMIENTO (DC). ........................................................................ 32

xi

RESUMEN

El alfa tocoferol (AT) es uno de los antioxidantes más utilizados en diferentes

industrias, aunque su baja estabilidad y pobre solubilidad en medio hidrofílico limitan

sus aplicaciones. Estas desventajas pueden ser superadas utilizando la tecnología de

Microencapsulación, para esto la técnica más utilizada es el secado por atomización.

Para propósitos de liberación controlada el agente encapsulante es esencial, siendo

posible a través de modificaciones químicas, cambiar las características físico-

químicas de los polímeros y su perfil de liberación. El objetivo de este trabajo fue

estudiar el efecto del entrecruzamiento químico de la inulina (dos grados: InE1 e InE2)

como agente encapsulante sobre el porcentaje de encapsulación y evaluar el

comportamiento de liberación de AT desde las microcápsulas obtenidas bajo

condiciones óptimas en solventes modelos hidrofóbico (n-hexano) e hidrofílico (agua-

tween 80), utilizando inulina nativa (InN) como control. Las microcápsulas fueron

elaboradas mediante secado por atomización, utilizando un secador mini spray-dryer

Büchi modelo B-290. Se aplicó un diseño estadístico central compuesto 22 más

estrella, considerando como variables independientes: la razón AT/agente

encapsulante (1:10 – 1:30) y la temperatura del aire de entrada al secador (160-200

ºC) y como variable dependiente el porcentaje de encapsulación de AT. Se

desarrollaron 10 experimentos para cada sistema estudiado (AT-InN, AT-InE1 y AT-

InE2). Se utilizó la metodología de superficie respuesta para optimizar la variable

dependiente.

El porcentaje de encapsulación de las microcápsulas de AT obtenidas bajo condiciones

óptimas para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2 fue de 86%, 88% y 90%,

respectivamente, mostrando que un aumento en el grado de entrecruzamiento de la

inulina aumentó significativamente (p<0,05) el porcentaje de encapsulación de AT,

favoreciendo la interacción AT-polímero.

El perfil de liberación de AT (Mt/M0 versus tiempo) desde las microcápsulas obtenidas

bajo condiciones óptimas en n-hexano mostró un perfil limitante, mientras que en agua

xii

tween 80 a 25°C presentó un perfil bifásico para los tres sistemas estudiados (AT-InN,

AT-InE1 y AT-InE2). La primera fase se caracterizó por una liberación correspondiente

al AT superficial. Los perfiles de liberación se ajustaron a modelos matemáticos de

primer orden, Higuchi y Korsmeyer & Peppas. Las constantes de liberación de AT

superficial fueron significativamente mayores (p<0,05) para las inulinas entrecruzadas,

respecto a la inulina nativa. La segunda fase sugeriría el comienzo de la liberación del

AT encapsulado.

Las microcápsulas de AT con inulina entrecruzada, representan un interesante aditivo

alimentario para el diseño de alimentos funcionales.

xiii

ABSTRACT

Obtention and characterization of crosslinked inulin as encapsulting agent of

alpha-tocopherol.

Alpha tocopherol (AT) is one of the most used food antioxidants. However its low

stability and poor aqueous solubility have limited their application. The use of

microencapsulation technology, such as spray drying is a form of overcome this

limitation.

The encapsulating agent is essential for purposes of controlling the release in food, yet

few biopolymers are available for spray-drying microencapsulation. However, they can

be chemically modified to change their physical and chemical properties. The aim of

this research was to study the chemical cross-linking of the inulin (two degrees: CIn1

and CIn2) on AT encapsulation percentage and to evaluate the release behavior of AT

from microcapsules obtained under optimal conditions in a hydrophobic solvent (n-

hexane) and hydrophilic solvent (water-tween 80), using native inulin (NIn) as a control.

AT microcapsules were prepared by a spray-drying method with a laboratory scale

Büchi spray drier (B-290). The experiments were performed with a 22 central composed

design constituted by 10 experiments of each system studied (AT-NIn, AT-CIn1 and AT-

CIn2). The independent variables were the AT/encapsulating agent ratio (1:10 – 1:30)

and the inlet air temperature (160-200ºC); the dependent variable was AT

encapsulation percentage. The response surface methodology was applied to optimize

the performance of the dependent variable.

The encapsulation percentage of the microcapsules obtained under optimal condition in

the AT-NIn, AT-CIn1 and AT-CIn2 systems were 86%, 88% and 90%, respectively.

These results showed that an increase in the cross-linking degree of the inulin provided

a significant higher (p<0.05) AT encapsulation percentage, showing a better AT-

polymer interaction between. The AT release profiles (Mt/M0 versus time) from AT-NIn,

AT-CIn1 and AT-CIn2 systems obtained under optimal conditions in hexane showed a

limiting profile. However, in aqueous medium a two phase profile can be distinguished,

with a first phase corresponding to AT superficial release. Different mathematical

xiv

models (First order, Higuchi and Korsmeyer-Peppas) were adjusted to the release

profiles. The AT release rate constant were significantly higher (p<0.05) in the cross-

linked inulin than native inulin. The second phase would suggest the beginning of AT

release from the microcapsules.

The AT–crosslinked inulin microcapsules studied represent an interesting food additive

for to design functional foods.

1

I. INTRODUCCIÓN

El α-Tocoferol (AT) se ha utilizado como aditivo en alimentos por su rol antioxidante

y como material funcional en la prevención de enfermedades relacionados con

estrés oxidativo, como enfermedades cardiovasculares y cáncer (Mergens et al.,

1980). Sin embargo, su labilidad frente a la exposición a oxígeno y temperatura

limita su utilización y por lo tanto su biodisponibilidad, ya que se transforma de

manera irreversible en una quinona, vía formación de un epóxido, inactivando la

molécula (Barrera et al., 1999; Verleyen et al., 2001). Una forma de superar estas

limitantes, dando mayor estabilidad al α-tocoferol, es a través de la aplicación de la

tecnología de encapsulación (Somchue et al., 2009). Esta técnica permite proteger

al α-tocoferol de las exposiciones deletéreas que puedan resultar de su interacción

con el medio ambiente y/o con los constituyentes de la matriz a la cual podría ser

adicionado (Gharsallaoui et al., 2007). Existen algunos trabajos sobre

encapsulación de α-tocoferol, principalmente con el objetivo de protegerlo para

aumentar su vida útil, empleando diferentes agentes encapsulantes y métodos de

encapsulación como: proteínas de arvejas y carboximetilcelulosa por secado por

atomización (Pierucci et al., 2007), proteínas de huevo y β-lactoglobulinas por

gelificación iónica (Somchue et al. 2009), alginato por gelificación iónica (Yoo et al.,

2006), maltodextrinas y gelatina por freeze-dried (Campagnaro et al., 2007).

Además algunos de estos se enfocan en la cesión del AT en diferentes medios:

gastrointestinales (Yoo et al., 2006; Somchue et al., 2009) e hidrofóbicos (Duclairoir

et al., 2002).

En este trabajo, se utilizará inulina debido a que presenta algunas características

destacables como lo son: su buena compatibilidad con los tejidos y su paso intacto

a través de la mayor parte del tracto gastrointestinal, siendo metabolizada sólo en el

colon por bacterias intestinales. Esto permitiría la liberación controlada de

compuestos bioactivos en un sitio específico del organismo (Hovgaard y Brondsted,

1996). Además los polisacáridos en general son una alternativa atractiva debido a

que presentan una amplia disponibilidad, bajos costos, capacidad de ser

modificados químicamente (Bogdansky, 1990) y son biodegradables; sitúandolos

como sustancias de amplia versatilidad y aplicabilidad. La modificación química de

2

inulina por entrecruzamiento con tricloruro de fosforilo (POCl3) permitiría obtener

polímeros con nuevas características físico-químicas.

3

II. HIPÓTESIS

La cesión en medio hidrofóbico (n-hexano) e hidrofílico (agua) de α-tocoferol desde

las microcápsulas (MCPs) obtenidas bajo condiciones óptimas, elaboradas con

inulinas entrecruzadas será menor, cuanto mayor sea su grado de

entrecruzamiento, en comparación con la inulina nativa.

4

III. OBJETIVOS

1. Objetivo General:

Desarrollar microcápsulas de α-Tocoferol (antioxidante), mediante el método de

secado por atomización, utilizando inulina nativa e inulina entrecruzada con dos

grados de entrecruzamiento, como agentes encapsulantes, para su posterior

aplicación a matrices alimentarias modelos.

2. Objetivos Específicos:

1.1. Modificar inulina por medio de entrecruzamiento químico (con POCl3) y

caracterizarlo mediante pruebas físico-químicas, térmicas y morfológicas.

1.2. Estudiar la razón AT/agente encapsulante y la temperatura de secado

(variables independientes), sobre el porcentaje de encapsulación (variable

dependiente), por medio de metodología de superficie de respuesta (MSR).

1.3. Caracterizar las microcápsulas de α-tocoferol obtenidas bajo condiciones

óptimas para cada material encapsulante en estudio.

1.4. Caracterizar cinéticamente el patrón de liberación de α-tocoferol desde las

microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas para cada polisacárido,

tanto nativo como entrecruzado, en una matriz alimentaria modelo:

hidrofóbica (n-hexano) e hidrofílica (agua).

5

IV. MARCO TEÓRICO

Las especies reactivas de oxígeno, se forman de manera natural como un

subproducto del metabolismo normal del oxígeno, pero también se forman por una

serie de factores ambientales (humo del cigarro y radiación UV entre otros). Estas

especies son capaces de oxidar lípidos, proteínas y ADN. La exposición a especies

reactivas de oxígeno induce un aumento en la peroxidación lipídica, la cual puede

causar daños en distintos sitios del organismo, debido a un desequilibrio entre la

producción de EROs (especies reactivas del oxígeno) y la capacidad antioxidante

del sistema biológico.

La exposición a radicales libres puede promover cataratogénesis (Trevithick et al.,

1992) y enfermedades cardiovasculares debido a la toxicidad de los lípidos

peroxidados en las células endoteliales de los vasos sanguíneos (Kaneko et al.,

1991) o daños a la piel, tales como envejecimiento prematuro (Epstein, 1983),

fragilidad de la piel y algunos tipos de cánceres (melanomas entre otros) (Sober,

1987). Es también esta oxidación de lípidos la que limita la vida útil de grasas y

aceites en alimentos, produciendo el enranciamiento de éstos.

La autoxidación de lípidos es una reacción en cadena de ácidos grasos

insaturados, que incluye tres etapas: iniciación, propagación y término (figura Nº1).

Figura Nº1: Ecuaciones que describen el deterioro oxidativo de lípidos. RH: ácido graso insaturado; R.: radical alquil; ROO.: radical peroxil.

Iniciación:

RH + Iniciador � R•

Propagación:

R• + O2

� ROO•

ROO• + RH � ROOH + R•

Término:

R• + R• � R-R

ROO• + R• � ROOR

ROO• + ROO• � Productos no radicalarios

6

1. Antioxidantes: α-Tocoferol

Los tocoferoles están compuestos por cuatro tipos homólogos de 6-hidroxi

cromanoles que poseen actividad de vitamina E en la dieta (Azzi y Stocker, 2000).

α-, β-, γ- y δ-Tocoferol; consisten de un grupo hidroxil en la posición 6 y uno o más

grupos metil en las posiciones 5, 7 u 8 del anillo cromanol con un grupo fitilo de 16

carbonos saturados (figura Nº2). El grupo fitilo tiene 3 centros quirales en los

carbonos 2, 4’ y 8’. Todos los tocoferoles que existen naturalmente, tienen

configuración R en las tres posiciones antes mencionadas del grupo fitilo, RRR-α-

Tocoferol (2D, 4’D, 8’D) (Gregory, 1996). Las posiciones de los grupos metil sobre

el anillo cromanol determinan las formas α-, β-, γ- y δ-Tocoferol (tabla Nº1).

El tocoferol es una molécula capaz de retrasar el deterioro oxidativo, debido a su

acción antioxidante, al donar un hidrógeno del grupo 6-hidroxi del anillo cromano al

radical peroxil, formando un hidroperóxido y por lo tanto inhibiendo la reacción de

propagación. Es así como el tocoferol con un potencial de reducción de 300-400

mV fácilmente dona un hidrógeno al radical peroxil (ROO•) que posee un potencial

de reducción de 1000 mV, obteniéndose como resultado un hidroperóxido más un

radical tocoferoxil (T•). Los radicales tocoferoxil pueden ser estabilizados por

resonancia. La velocidad de reacción entre el α-tocoferol y los radicales peroxil es

del orden de 107 M-1s-1 y 105-106 veces más rápido que la reacción entre los lípidos

insaturados y el radical peroxil (Niki et al., 1984; Choe y Min, 2005). Además los

radicales tocoferoxil son capaces de reaccionar con radicales peroxil para formar

productos no radicalarios (T-T y T-OOL) (figura Nº3) (Kamal-Eldin y Appelqvist,

1996).

Figura Nº2: Estructura general del tocoferol.

7

Tabla Nº 1: Nombre de los distintos tipos de tocoferol.

Figura Nº3: Ecuaciones que describen el efecto antioxidante del tocoferol. TH: tocoferol; ROO.: radical peroxil; T.: radical tocoferoxil; T-T y T-OOR: productos no radicalarios.

El tocoferol es capaz de prevenir daños agudos o crónicos en membranas lipídicas

(Kligman y Kligman, 1986). Además, cuando es aplicado sobre la piel reduce el

daño causado por la peroxidación fosfolipídica de la membrana celular (Burton y

Ingold, 1981), retrasando el daño producido por el envejecimiento (Mayer et al.,

1993). Estas características hacen interesante su uso, ya sea para prevenir el

deterioro oxidativo de alimentos y/o para ser añadido como un componente

funcional de ellos. El problema reside en que la exposición a la luz, calor y oxígeno

promueven una rápida degradación. En este sentido, se ha reportado que el α-

tocoferol presenta la mayor actividad antioxidante en aceites vegetales, pero la

menor estabilidad durante su almacenamiento en ellos (Kamal-Eldin y Appelqvist,

1996). Por esta razón es tan necesario proteger el tocoferol de condiciones

deletéreas.

2. Microencapsulación:

La microencapsulación es un procedimiento complejo por el cual ciertas sustancias

activas sólidas, líquidas o gaseosas (antioxidantes, bactericidas, etc.) son

Nombre trivial Nombre Químico R1 R2

α-Tocoferol 5,7,8-Trimetiltocoferol/tocotrienol CH3 CH3

β-Tocoferol 5,8-Dimetiltocoferol/tocotrienol CH3 H

γ-Tocoferol 7,8-Dimetiltocoferol/tocotrienol H CH3

δ-Tocoferol 8-Metiltocoferol/tocotrienol H H

TH+ ROO• � T• + ROOH

T• + ROO• � T- OOR

T• + T• � T –T

8

introducidas en una matriz o sistema pared de naturaleza polimérica lográndose,

por las propiedades del polímero, y si se precisa, una liberación gradual de estos

agentes activos. De esta forma se puede además proteger el activo del medio

ambiente y de influencias que puedan resultar deletéreas (Moreau y Rosenberg,

1996). Dentro del término microencapsulación, se incluyen a las microcápsulas, las

microesferas, nanocápsulas y sustancias activas atrapadas o embebidas (Ré,

1998).

Existen diferentes técnicas para la realización del proceso de microencapsulación

(Brazel, 1999). No obstante se pueden clasificar en tres grandes grupos:

a. Procesos Físicos: Secado por atomización, extrusión, recubrimiento por

lecho fluidizado, y separación por suspensión rotacional.

b. Procesos físico-químicos: coacervación simple o compleja, liposomas y

gelificación iónica.

c. Procesos químicos: inclusión molecular, polimerización interfacial y co-

cristalización.

Podríamos destacar seis razones por las cuales la microencapsulación por secado

por atomización es tan ampliamente aplicada en la industria (Fereidon y Xiao-Qing,

1993):

1. Reduce la reactividad del núcleo (o material encapsulado) en relación con su

ambiente externo (luz, oxígeno y agua).

2. Disminuye la velocidad de evaporación o transferencia del material

encapsulado hacia el exterior.

3. Promueve la fácil manipulación del material encapsulado, de manera tal que:

a. Previene la agregación del material.

b. Distribución más uniforme del material núcleo a través de la mezcla,

dado por un tamaño y superficie externa adecuado para la mezcla.

c. Convertir un líquido en un sólido.

d. Promover el fácil mezclado del material núcleo.

4. Controlar la liberación del material núcleo, de manera tal de lograr un

adecuado retraso en la entrega bajo un estímulo adecuado.

9

5. Enmascarar sabores u olores del material núcleo.

6. Diluir el material núcleo cuando es usado solo en pequeñas cantidades, para

así lograr una dispersión uniforme a través de la mezcla.

2.1. Secado por aspersión o por Atomización:

El secado por atomización o secado spray es ampliamente utilizado en las

industrias farmacéuticas y de alimentos para encapsular principios activos e

ingredientes alimenticios, puesto que es un método económico y efectivo para la

obtención de microcápsulas.

El material a encapsular es homogenizado con el agente encapsulante o material

muralla, la mezcla es alimentada al secador y se atomiza por medio de una boquilla

o disco (Yánez et al., 2002). La potencialidad de este método radica en que permite

la transformación de un fluido en un material sólido (cuando este sea el caso),

atomizándolo en forma de pequeñas gotitas en un medio de secado (aire caliente);

dando como resultado un material que queda incluido dentro de otro. Una de las

grandes ventajas de este proceso, además de su simplicidad, es su utilidad para

materiales sensibles al calor, ya que el tiempo de exposición a temperaturas

elevadas es muy corto (5 a 30 s) (Deasy, 1983).

La distribución del tamaño de las partículas obtenidas por este método es en

general menor a 100 µm, aunque hay que destacar que ello depende de las

condiciones del proceso (Pedroza-Islas, 2002). Además el tamaño está

condicionado por las características del agente encapsulante y de las del agente a

encapsular. La adecuada selección del agente encapsulante, es un factor crítico en

el proceso.

El proceso de secado por atomización se compone principalmente de cuatro fases:

a. Atomización: El objetivo de esta fase es crear una máxima superficie

para la transferencia de calor entre el aire caliente y el liquido, de

manera tal de optimizar la transferencia de masa y de calor. Para una

misma energía de atomización el tamaño de partícula se incrementa

10

con el aumento en la velocidad de alimentación (mL/min). Además el

tamaño de partícula puede verse incrementado cuando la viscosidad

y la tensión superficial del líquido inicial son altas.

b. Contacto de las gotas con el aire caliente: Este contacto toma lugar

durante la atomización e inicia la fase de secado. Según la

disposición en la cual se encuentre el aire de secado con respecto a

la nube atomizada nos encontramos con las configuraciones de co-

corriente y de contra-corriente. En la configuración en co-corriente,

que es la utilizada en este caso, el liquido es atomizado en la misma

dirección del flujo de aire caliente, la temperatura de entrada de este

aire caliente típicamente va entre los 100-220ºC, la evaporación

ocurre instantáneamente (Fleming, 1921) y el polvo seco es expuesto

a temperaturas moderadas (50-80ºC) lo que limita la degradación

térmica.

c. Evaporación del agua: en el momento en que el aire caliente se pone

en contacto con el liquido atomizado, se establecen balances de

temperatura y presión parcial de vapor entre la fase liquida y la

gaseosa. De manera tal que la transferencia de calor ocurre desde el

aire caliente hacia las gotas atomizadas producto de la diferencia de

temperaturas, mientras que el agua es transferida en forma opuesta,

debido a la diferencia de presión de vapor. Basado en la teoría

fundamental de secado se pueden distinguir tres pasos sucesivos.

Justo después del contacto entre aire caliente-gotas atomizadas, la

transferencia de calor causa un aumento en la temperatura de las

gotas hasta un valor constante. Después la evaporación ocurre a

temperatura constante y presión de vapor constante. Finalmente,

cuando el contenido de agua alcanza un valor crítico en las gotas se

comienza a formar una coraza alrededor de ellas y la velocidad de

secado disminuye rápidamente, dependiendo de la difusión de agua a

través de dicha coraza. El secado termina teóricamente cuando la

temperatura de la partícula se iguala a la del aire.

d. Separación del producto-aire húmedo: esta separación es realizada a

través de un separador ciclónico, el cual reduce la pérdida de

producto hacia la atmosfera.

11

3. Material Encapsulante:

Existe una amplia variedad de materiales para cobertura que pueden ser usados

para encapsular ingredientes alimentarios y farmacéuticos. En general los requisitos

para que un material encapsulante sea óptimo para el secado por atomización

incluyen un alto grado de solubilidad, una baja viscosidad con un alto contenido de

sólidos en la solución (entre 35-45% en contenido de sólidos), buenas propiedades

emulsificantes, buenas propiedades de secado, un carácter no higroscópico, sabor

suave, no reactivo, y un bajo costo (Murúa-Pagola et al., 2009).

Los agentes encapsulantes o materiales formadores de pared más utilizados en

este tipo de método han sido: Carbohidratos (almidón y derivados, maltodextrinas,

jarabes de maíz, ciclodextrinas, carboximetilcelulosa y derivados); gomas (arábiga,

mezquite, alginato de sodio); lípidos (ceras, parafinas, grasas) y proteínas (gelatina,

proteína de soya, caseinatos, suero de leche, zeína) (Gharsallaoui et al., 2007). El

tipo de material encapsulante influye en la estabilidad antes del secado, en el

tamaño de partícula, en las propiedades de flujo, en las propiedades mecánicas y

en la vida útil del material deshidratado (Pedroza-Islas, 2002). En este estudio se

trabajará específicamente con el polisacárido inulina.

3.1. Inulina:

La inulina es un polisacárido constituido principalmente de unidades de fructosil

fructosa β (2-1) y que presenta normalmente, pero no necesariamente, unidades de

glucopiranosas en los extremos reductores (figura Nº4). La inulina es un fructano

que presenta pocas ramificaciones β (2-6) variando entre un 1-5% (Stevens et al.,

2001). Las fuentes más importantes de inulina son Cichorium intybus (chicoria),

Dahlia pinuata Cav (dahlia) y Helianthus tuberosus (jerusalem artichoke).

12

Figura Nº 4: Estructura de la Inulina.

La inulina es escasamente hidrolizada en el estómago y en el intestino delgado, sin

la formación de monosacáridos y es fermentada por la microflora del intestino

delgado, lo que da como resultado la formación de pequeñas cadenas de ácidos

grasos, ácido láctico y gases. Por esto, la inulina no incrementa la glicemia y puede

ser utilizada como ingrediente en los alimentos para diabéticos. La ingestión de

inulina por largos períodos de tiempo reduce los niveles de triglicéridos en la sangre

e incrementa la relación HDL/LDL (Delzeme et al, 1993). Además, este polisacárido

mejora la absorción de calcio jugando un rol importante en el tratamiento de la

osteoporosis.

3.2. Inulina Entrecruzada:

Vervoort et al. (1997) han estudiado el entrecruzamiento de la inulina a través de

una serie de reacciones que incluyen la adicción de glicidil metacrilato y

epiclorhidrina. Las propiedades físicas y químicas de la inulina metacrilada han

demostrado su habilidad de hinchamiento y producción de geles, además de su

capacidad de formar complejos con mayor estabilidad respecto a la inulina nativa

(Grimenko et al., 1998). El fin del entrecruzamiento químico es lograr una

modificación en los polisacáridos, la cual está orientada a agregar enlaces intra e

inter moleculares estabilizando y fortaleciendo los polímeros (Acquarone y Rao,

2003), además de agregar otras características que serán estudiadas para el caso

de la inulina.

13

El entrecruzamiento químico se ha estudiado mayoritariamente sobre almidón y

para lograrlo se han utilizado reactivos como: el Trimetafosfato de sodio (STMP), el

Cloruro de Fosforilo (POCl3) y la Epiclorhidrina (EPI), cuyas reacciones generales

se representan en la figura Nº5.

Figura Nº 5: Reacciones de entrecruzamiento.

StOH: almidón; POCl3: tricloruro de fosforilo; STMP: trimetafosfato de sodio EPI:epiclorhidrina.

El POCl3 y STMP (figura Nº5) forman uniones di-esteres, las cuales son más

resistentes, siendo entre ambas la formada por el tricloruro de fosforilo la que mejor

resiste agresiones severas de calor, acidez y cizalla. La epiclorhidrina también

forma uniones di-esteres y los productos entrecruzados presentan una buena

resistencia a los ácidos (Bemille y Whistler, 2009).

Para lograr el entrecruzamiento de inulina se utilizará el tricloruro de fosforilo,

reactivo multifuncional capaz de formar uniones intermoleculares del tipo éter o

éster entre los grupos hidroxilos de las moléculas de polisacáridos (Rutenberg y

Solarek, 1984)

4. Mecanismos y cinéticas de liberación:

La liberación controlada de una especie encapsulada a una fase liquida es de gran

interés, ya que con esto se logra crear diferentes perfiles de liberación adecuados al

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uso que se quiera dar al producto. Existen diferentes tipos de sistemas que se

pueden utilizar para lograr una liberación controlada, entre los que se pueden

mencionar:

a. Sistemas de liberación controlados por disolución.

b. Sistemas de liberación controlados por difusión.

c. Sistemas de liberación controlados por difusión y disolución.

d. Sistemas de liberación controlados por penetración de agua.

e. Sistemas de liberación controlados químicamente.

f. Hidrogeles

g. Sistemas de liberación controlados por resinas de intercambio iónico.

En la práctica no es común encontrar un único sistema de liberación, sino más bien

una mezcla de ellos. Varios modelos matemáticos se utilizan para explicar las

cinéticas de liberación, aunque la mayoría de las veces los propuestos por Higuchi

y Korsmeyer & Peppas son los más aplicados (Cuerda et al., 2003). Ambos

suponen que la liberación a la fase liquida de un compuesto (A) retenido en un

sólido (S) viene condicionada (mayoritariamente) por la difusión debida a un

gradiente de concentración. Las ecuaciones propuestas son:

� =��

��= � × �

�

Ecuación Nº1: Ecuación de Higuchi.

� =��

��= � × ��

Ecuación Nº2: Ecuación de Korsmeyer & Peppas:

Donde:

F: Fracción liberada.

Mt: Cantidad de compuesto liberado a tiempo t.

M0: Cantidad total de compuesto retenido inicialmente por el sólido.

15

k: Constante relacionada con el coeficiente de difusión D.

n: Exponente relacionado con la naturaleza del proceso.

El valor del exponente n proporciona información sobre el mecanismo de liberación

del activo. Para la liberación desde microcápsulas con geometría esférica se

establece que: si n es igual a 0,43 la liberación del activo tiene lugar a través de un

fenómeno de difusión de tipo Fickiano (modelo matemático de Higuchi); si n toma

valores entre 0,43 y 0,85 indica que la liberación del activo es debida a un

mecanismo de difusión no Fickiano o anómalo y cuando n es igual a 0,85 el

mecanismo de liberación del activo depende del proceso de relajación de las

cadenas poliméricas (Siepmann y Peppas, 2001). Generalmente, el perfil de

liberación de un activo desde microcápsulas y microesferas, es bifásico, con una

liberación inicial grande y rápida, seguida por una liberación mucho más lenta.

Entre los factores que influyen en la cesión se encuentran: el tamaño de las

microcápsulas, el tipo de matriz, la razón agente encapsulante/agente a encapsular,

el grado y la naturaleza del entrecruzamiento, la interacción entre activo-matriz y el

medio de liberación, entre otros (Sáez et al., 2004).

En la literatura se encuentran algunos trabajos relacionados con

microencapsulación de tocoferol y posterior estudio de liberación, entre ellos:

Duclairoir et al. (2002) prepararon nanopartículas por el método de desolvatación

usando gliadina como agente encapsulante, para luego estudiar el porcentaje de

liberación del activo versus tiempo, en decano como medio modelo. Yoo et al.

(2006) y Somchue et al. (2009) estudiaron la liberación de AT in vitro con fluido

gástrico simulado (SGF) y fluido intestinal simulado (SIF) desde microcápsulas de

AT con alginato y desde micocápsulas de AT con proteínas del suero y β-

lactoglobulinas obtenidas por gelificación iónica, respectivamente. En ambos

estudios los datos fueron ajustados a las ecuaciones empíricas desarrolladas por

Korsmeyer & Peppas.

16

V. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Lugar de Trabajo:

El trabajo experimental se llevó a cabo en el laboratorio de Química de Alimentos

del Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química, y en el

laboratorio de Tecnología Farmacéutica del Departamento de Ciencias

Farmacéuticas de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la

Universidad de Chile.

2. Materiales:

� Agente encapsulante: Inulina Nativa, Raftiline HP (DP >23).

� Antioxidante: Alfa tocoferol (AT), Sigma-Aldrich, 98% pureza.

� Reactivos:

- Agua HPLC, Merck, Alemania.

- Acetona p.a., Merck, Alemania.

- Acetona técnica Merck, Alemania.

- Ácido Clorhídrico concentrado p.a., Merck, Alemania.

- Caseinato de sodio grado alimentario, Prinal, Chile.

- Etanol p.a., Merck, Alemania.

- Hexano HPLC, Merck, Alemania.

- Hidróxido de Sodio p.a., Merck, Alemania.

- Isopropanol p.a., Merck, Alemania.

- Sulfato de sodio anhidro, Merck, Alemania.

3. Equipos:

� Agitador eléctrico vortex Cenco Instrument B.V, Breda, Holanda.

� Agitador magnético Nuova Barnstead Thermolyne. Dubuque, Iowa, Estados

Unidos.

� Balanza analítica modelo MJ – 300, Japón.

� Calefactor Stuart, modelo CB 162, USA.

� Balanza granataria SCALTEC SP0 51. Heiligenstadt, Alemania.

� Centrifuga Hettich ROTOFIX 32, Alemania.

� Compresor Haug, Suiza.

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� Estufa de aire forzado WTB binder, Alemania.

� Equipo cinética Farma Test, modelo PTW.

� Homogenizador Polytron PT-2100, Kinematica, Suiza.

� HPLC compuesto por bomba Merck–Hitachi L-6200 con detector de

fluorescencia Merck-Hitachi F-1050, acoplado a un computador con software

Clarity versión 2.4.1.43; columna LiChrocart Superspher Si-60 (5 µm, 4,0

mm d.i. x 250 mm, Merck).

� HPLC compuesto por bomba Merck–Hitachi L-6200 con detector de arreglo

de diodos Waters 996, acoplado a un computador con software Empower

Pro; columna C18 (3 µm, 4,6 mm d.i. x 250 mm, Atlantis.).

� Secador Spray Büchi modelo B-290, Suiza.

� pH – metro HANNA HI 111 pH/ORP meter, Alemania.

4. Metodología:

4.1. Elaboración de inulina entrecruzada:

El entrecruzamiento de inulina se realizó de acuerdo a una modificación del método

descrito por Woo y Seib (2002) para entrecruzar almidones. Como agente

entrecruzante se ensayó el reactivo: tricloruro de fosforilo.

4.1.1. Tricloruro de Fosforilo:

Se adicionó la inulina (25 g) en agua destilada (100 g) a 50ºC con agitación suave

hasta lograr la disolución y se dejó adicionalmente 1h a 25ºC. Luego de esto, se

añadió el sulfato de sodio anhidro (3,75 g) y se ajustó el pH de la mezcla a 11,5 con

hidróxido de sodio 1M. Alcanzado dicho pH se procedió a adicionar el tricloruro de

fosforilo (0,3% y 1% con respecto al peso de inulina) por goteo, manteniendo el pH

entre 10,5-11,5. Se dejó reaccionar la inulina con el tricloruro de fosforilo por 1 hora

y se añadió ácido clorhídrico (1M) hasta alcanzar un pH de 5,5. Posteriormente, se

precipitó la inulina entrecruzada con acetona, se filtró a vacio con un embudo

Büchner y la torta se enjuagó con 3 porciones sucesivas de una mezcla 60:40 de

acetona-agua (200 mL cada una). El precipitado se dejó en estufa a 50ºC por 24

horas, para posteriormente triturarlo en mortero. Finalmente se colocó el polvo por

dos horas más en estufa a 50ºC para eliminar rastros de solvente. Como resultado

18

se obtuvo la inulina entrecruzada InE1 e InE2, correspondientes a la reacción con

0,3 y 1% de tricloruro de fosforilo, respectivamente.

4.2. Análisis realizados a la inulina nativa y entrecruzada:

� Espectroscopia de Infrarrojo (IR): Se realizó para estudiar la modificación del

espectro de inulina y la inclusión de grupos fósforo a la molécula. Los

espectros se obtuvieron empleando un espectrofotómetro de Infrarrojo

Mediano con Transformada de Fourier (FT-MIR) marca BRUKER, modelo

VECTOR 22, realizando un barrido entre 4000 y 600 cm-1. Las muestras

fueron analizadas en comprimidos de KBr. Estos ensayos fueron realizados

por la Unidad Central de Instrumentación de la Facultad de Química de la

Pontificia Universidad Católica de Chile.

� Espectroscopia Resonancia Magnética Nuclear de Fósforo 31 (31P-RMN):

Se realizó como análisis cualitativo de la inclusión de fósforo a la molécula.

Estos ensayos se realizaron por la Unidad Central de Instrumentación de la

Facultad de Química de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

� Espectroscopia Resonancia Magnética Nuclear de Protones (1H-RMN): Este

análisis se realizó para estudiar cambios en la molécula de inulina. Los

espectros fueron obtenidos por medio de un equipo BRUKER AVANCE-400.

Las muestras fueron suspendidas en dimetilsulfóxido deuterado (d-DMSO).

Estos ensayos se realizaron por la Unidad Central de Instrumentación de la

Facultad de Química de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

� Microscopia Electrónica de Barrido (SEM): se efectuó para determinar la

morfología (forma y tamaño de partícula) de la inulina (nativa y

entrecruzada). Se realizó mediante un microscopio JEOL JSM-25SII. Este

análisis fue realizado por el Servicio de Microscopía de la Pontificia

Universidad Católica de Chile.

� Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC): se realizó para determinar las

propiedades térmicas de la inulina (tanto nativa, como entrecruzada).

Este análisis fue realizado por el Departamento de Química de los

Materiales de la Universidad de Santiago de Chile.

� Determinación de fósforo por espectrofotometría de emisión atómica (ICP-

AES): Esta técnica se utilizó para determinar cuantitativamente el contenido

19

de fósforo de las muestras de inulina entrecruzadas y posterior cálculo del

grado de entrecruzamiento. La técnica de análisis fue espectroscopia de

emisión atómica plasma inductivamente acoplado. Este análisis fue

desarrollado por CEQUC de La Pontificia Universidad Católica de Chile.

� Determinación de la capacidad de unir agua (WBC) y solubilidad: Se utilizó

la técnica descrita por Medcalf y Gilles (1965) con modificaciones. Se pesó

en un tubo de ensayo (previamente tarado: Po), se le adicionó 0,5 g de

muestra (Pm), se añadió 10ml de agua destilada, luego se agitó en vortex

por 1 minuto y se dejó hinchando por 24 hrs. Transcurrido este lapso de

tiempo se centrifugó el tubo a 5000 rpm por 30 minutos y se eliminó el

sobrenadante. Se procedió a pesar el tubo (Ph) y se dejó por 24 horas en

estufa a 105ºC. Se pesó el tubo con la muestra seca (Ps). La capacidad de

unir agua y la solubilidad, se calcularon a partir de las ecuaciones 3 y 4,

respectivamente.

�� =��� − ��� − ��� − ���

��� − ���

Ecuación Nº3: Determinación de la capacidad de retención de agua (WBC).

% Perdida de peso = Solubilidad =P& − �P' − P��

P&

Ecuación Nº4: Determinación de la solubilidad.

Donde se tiene que:

Ph : Peso muestra húmeda + tubo de ensayo.

P0 : Peso tubo de ensayo.

Ps : Peso muestra seca + tubo de ensayo.

Pm : Peso muestra inicial.

20

4.3. Elaboración de microcápsulas:

4.3.1. Preparación del vehículo:

Para la preparación de estos vehículos se consideró 100 g de emulsión de acuerdo

a una relación AT/agente encapsulante que varió desde 1:10 hasta 1:30 (anexo

Nº1).

La pre-emulsión se preparó mezclando caseinato de sodio (0,8 g), α-tocoferol (0,5

g) y una parte del agua (20%), la cual se homogeneizó con un homogeneizador

Polytron PT-2100 (Kinematica AG, Switzerland) a 20.000 rpm por 3 minutos.

Paralelamente se disolvió el agente encapsulante inulina nativa (InN) o inulina

entrecruzada (InE) (5 g, 10 g o 15 g dependiendo de la relación empleada) en agua

destilada a 55ºC, se dejó enfriar a 30ºC y luego se añadió sobre la pre-emulsión,

completando el volumen con agua destilada (csp. 100 g). Finalmente, se

homogeneizó la mezcla resultante a 20.000 rpm por 3 minutos y la emulsión

resultante se atomizó inmediatamente en el secador spray.

4.3.2. Microencapsulación:

Las emulsiones obtenidas fueron alimentadas a un secador mini Spray-Dryer Büchi

modelo B-290 (Alemania) con alimentación y flujo de aire de secado en

configuración co-corriente. La temperatura de entrada del aire al secador fluctuó

entre 160ºC-200ºC dependiendo del diseño. El flujo de aire, la velocidad de

alimentación, temperatura de alimentación y la presión de atomización fueron de

600 L/h, 10 mL/min, 40ºC-45ºC, y 20 psi, respectivamente. Las microcápsulas

resultantes fueron almacenadas en envases de polipropileno a -20 ºC hasta el

momento de su utilización.

4.4. Diseño estadístico:

Para este análisis se utilizó un diseño estadístico compuesto central 22 más estrella

con un total de 10 experimentos para cada sistema (AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2).

Las variables independientes para este estudio fueron la relación AT/agente

encapsulante y la temperatura del aire de entrada al secador. En la tabla Nº 2 se

21

presentan las variables que se utilizaron para el diseño estadístico. La variable de

respuesta fue el porcentaje de encapsulación y la matriz de respuesta utilizada se

presenta en la tabla Nº 3.

Tabla Nº 2: Niveles para las variables independientes usadas en el diseño estadístico compuesto central 22 más estrella, para la encapsulación de AT en los diseños: AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2.

Variable Nivel

-1 0 1

Relación AT/Agente

encapsulante

1:10

1:20

1:30

Temperatura (ºC)

160ºC

180ºC

200ºC

Tabla Nº 3: Matriz de Respuesta para cada sistema (AT-InN, AT-InE1, AT-InE2).

PE: porcentaje de encapsulación.

AT-InN AT-InE1 AT-InE2

Relación

AT/InN

Temperatura

(ºC)

PE Relación

AT/InE1

Temperatura

(ºC)

PE Relación

AT/InE2

Temperatura

(ºC)

PE

1:10 160 1:10 160 1:10 160

1:10 180 1:10 180 1:10 180

1:10 200 1:10 200 1:10 200

1:20 160 1:20 160 1:20 160

1:20 180 1:20 180 1:20 180

1:20 180 1:20 180 1:20 180

1:20 200 1:20 200 1:20 200

1:30 160 1:30 160 1:30 160

1:30 180 1:30 180 1:30 180

1:30 200 1:30 200 1:30 200

22

4.5. Determinación del porcentaje de Encapsulación de α-tocoferol:

4.5.1. Contenido de α-tocoferol superficial:

Las microcápsulas de inulina nativa (InN) o entrecruzadas (InE1 ó InE2) (50 mg) se

trataron con 2 mL de hexano y se agitaron en vortex por 1 minuto. Las muestras se

filtraron (filtro Millipore 0,22 µm), luego se tomó una alícuota de 200 µL y se aforó

con hexano (grado HPLC) a 25 mL. La concentración de α-tocoferol superficial fue

obtenida a través de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (AOCS, 1993)

mediante una curva de calibración entre 1,05 a 5,25 [µg/mL] (R2=0,9992) (anexo

Nº2).

El equipo HPLC, estuvo compuesto de una bomba Merck-Hitachi L-6200 A (Merck,

Darmstadt, Alemania), inyector Rheodyne 7725i, loop 20 µL, detector de

fluorescencia Merck-Hitachi F-1050 acoplado a un computador con el software

Clarity 2.4.1.43. La detección se realizó a 290 nm (longitud de onda de excitación) y

330 nm (longitud de onda de emisión). Se utilizó una columna LiChrocart

Superspher Si60 (5µm x 4 mm d.i. x 250 mm, Merck, Alemania). La fase móvil

correspondió a 2-propanol en hexano (0,5: 99,5 v/v) con un flujo de 1 mL/min. El

análisis se realizó en duplicado.

4.5.2. Porcentaje de encapsulación:

El porcentaje de α-tocoferol superficial se calculó de acuerdo a la siguiente

ecuación:

%Super(iciales =Contenido �μg�de α − toc super(icial

Contenido �μg� de ∝ −toc añadido en la formulación× 100

Ecuación Nº5: Calculo del porcentaje superficial de tocoferol.

23

Y el porcentaje de encapsulación fue calculado a través de la siguiente ecuación:

% Encapsulación = 100 − % Super(iciales

Ecuación Nº6: Calculo del porcentaje de encapsulación de tocoferol.

4.6. Liberación de α-tocoferol en matrices alimentarias modelos:

La cinética de liberación del agente activo desde las microcápsulas obtenidas en

condiciones óptimas para los distintos agentes encapsulantes estudiados, se

obtuvo empleando un equipo Farma-Test (método USP/NF 1) a 25±1 ºC, velocidad

de rotación de 50 rpm y 500 mL de agua bidestilada más Tween 80 (0,5% p/p) o n-

hexano (p.a. Merck), como matrices modelos. El n-hexano representa a un alimento

hidrofóbico como grasas o aceites; el agua a un alimento hidrofílico como un jugo,

sopa o yogurt entre otros. El perfil de liberación determina la aplicabilidad de las

micropartículas en alimentos.

Para esto se pesaron 0,5 g de las microcápsulas (AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2)

dentro de bolsas-filtro de celulosa, para posteriormente ser introducidas en los

canastillos (malla de 40 mesh de 1 pulgada de diámetro por 13/8 pulgadas de alto).

La liberación de antioxidante se siguió durante 8 h tomando 17 muestras en este

intervalo de tiempo. Los muestreos correspondieron a alícuotas de 10 mL, con

reposición del volumen. La determinación de α-tocoferol se realizó por

cromatografía líquida de alta resolución HPLC, dependiendo de la matriz de

disolución, el método de detección fue HPLC acoplado a detector de fluorescencia

(AOCS, 1993) para muestras provenientes de matrices hidrofóbicas (n-hexano)

(anexo Nº2) y HPLC con detector de arreglo de diodos (Sánchez-Machado et al.,

2002) para muestras provenientes de matrices hidrófilas (agua) (anexo Nº3),

utilizando las siguientes curvas de calibración: entre 1,05 - 5,25 [µg/mL]

(R2=0,9992) y entre 10 - 100 [µg/mL] (R2=0,9998), respectivamente.

24

Los resultados fueron graficados calculando la fracción del agente activo liberado

(Mt/M0) a tiempo t. Mt es la cantidad de agente activo liberado a tiempo t y M0 es la

cantidad de agente activo total contenido en las microcápsulas inicialmente.

4.7. Análisis Estadístico:

La determinación de las condiciones óptimas de microencapsulación para cada

agente encapsulante se realizó a través de la metodología de superficie de

respuesta (MSR). Para determinar el orden de reacción y la constante de velocidad

de liberación del antioxidante en modelos alimentarios se utilizó regresión lineal y

para realizar la comparación del porcentaje de encapsulación y las constantes de

velocidad de liberación de AT entre los sistemas estudiados, se realizó un análisis

de varianza de una vía. Los análisis se realizaron usando el programa Statgraphics

versión 7.0, con un nivel de significancia de un 95%. Las comparaciones de las

medias de las variables se realizaron mediante el test de rangos múltiples de

Tukey.

25

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Caracterización de inulina nativa y entrecruzada:

La caracterización de la inulina nativa y entrecruzada con tricloruro de fosforilo se

realizó mediante FT-IR, 1H-RMN, 31P-RMN, DSC, WBC, solubilidad y SEM.

1.1. Caracterización por FT-IR:

En la figura Nº6 se muestra el espectro FT-IR de la inulina nativa, observándose

una señal característica alrededor de ~3400 cm-1 correspondiente a los grupos

hidroxilos (-OH) presentes en los monómeros de fructosa. En los espectros para la

inulina entrecruzada con cloruro de fosforilo al 0,3% (figura Nº7) y 1% (figura Nº8),

se observa la aparición de una señal alrededor de los 620 cm-1 probablemente

debida a las vibraciones stretching P-C, además la aparición de otras dos señales

alrededor de 987 cm-1 y 1200 cm-1 correspondientes a las vibraciones P-O

stretching y P=O stretching, respectivamente.

Figura Nº6: Espectro FT-IR de la

Figura Nº7: Espectro FT-IR de la

IR de la inulina nativa (InN).

de la inulina entrecruzada con 0,3% de POCl3 (InE1).

26

Figura Nº 8: Espectro FT-IR de la i

1.2. Caracterización por

En los espectros 1H-RMN

cloruro de fosforilo al

observa un grupo de señales

de la fructosa y una señal alrededor

anomérico de la unión α1

inicio de las cadenas de inulina

inulina no produjo nuevas

inulina nativa. Sólo se pudo apreciar una pequeña distorsión entre las señales

ubicadas entre δ 3,3-4,6 ppm

de la inulina entrecruzada con 1,0% de POCl3 (InE2).

Caracterización por 1H-RMN:

RMN de inulina nativa (figura Nº9) e inulina entrecruzada

al 0,3% y 1,0% (figuras Nº10 y Nº11, respectivamente

grupo de señales entre δ 3,3-4,6 ppm correspondiente a

una señal alrededor de δ 5,42 ppm correspondiente al prot

α1-β1 de la unidad de D-glucopiranosil que se encuentra al

inicio de las cadenas de inulina (Vervoort et al., 1997). El entrecruzamiento de la

nuevas señales en los espectros 1H-RMN, con respecto a la

lo se pudo apreciar una pequeña distorsión entre las señales

4,6 ppm.

27

entrecruzada con

, respectivamente), se

los protones

δ 5,42 ppm correspondiente al protón

glucopiranosil que se encuentra al

El entrecruzamiento de la

con respecto a la

lo se pudo apreciar una pequeña distorsión entre las señales

Figura 9: Espectro 1H-RMN de la

Figura Nº 10: Espectro 1H-RMN

de la inulina nativa (InN).

RMN de la inulina entrecruzada con 0,3% de POCl3 (InE1).

28

29

Figura Nº 11: Espectro 1H-RMN de la inulina entrecruzada con 1,0% de POCl3 (InE2).

1.3. Caracterización por 31P-RMN:

Los espectros de resonancia magnética nuclear de fósforo, tanto de la inulina nativa

como de la inulina entrecruzada con POCl3 al 0,3% (InE1) no mostraron señales, ya

que el contenido de 31P se encontraba por debajo del límite de detección. En

cambio el espectro de la inulina entrecruzada con POCl3 al 1% (figura Nº12)

presentó tres señales a los 1,375, 0,506 y -0,635 ppm. La señal a los -0,635 ppm

puede ser debida a residuos del agente entrecruzante, ya que este produce

desplazamientos químicos entre -0,5 ppm a -30 ppm correspondiente a las

vibraciones O=P-Clx (Kühl, 2008) y la señal a δ 1,375 ppm podría deberse a

vibraciones O=P(OR)x. Estos resultados fueron semejantes a los encontrados por

Yijun et al. (2007) para almidón entrecruzado con trimetafosfato de sodio (STMP).

30

Figura Nº 12: Espectro 31P-RMN de la inulina entrecruzada con 1,0% de POCl3 (InE2).

1.4. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido (DSC):

En las figuras Nº 13, 14 y 15 se presentan los termogramas de DSC para la inulina

nativa y entrecruzada con 0,3 y 1,0% de POCl3, respectivamente. En los

termogramas se puede apreciar claramente que la inulina nativa presenta un peak

endotérmico que da cuenta de la temperatura de transición vítrea, la cual está

ausente en los espectros de la inulina entrecruzada con POCl3 (InE1 e InE2). Esto se

debe a que el entrecruzamiento de la inulina genera productos que tienden a ser

más cristalinos y esto se traduce en un debilitamiento de los peaks de transición

vítrea (Ronkart et al., 2007).

-80-70-60-50-40-30-20-1040 30 20 10 0 ppm

-0.637

0.506

1.375

31

Figura Nº 13: Termograma (DSC) de la inulina nativa (InN).

Figura Nº 14: Termograma (DSC) de la inulina entrecruzada con 0,3% de POCl3 (InE1).

32

Figura Nº 15: Termograma (DSC) de la inulina entrecruzada con 1% de POCl3 (InE2).

1.5. Caracterización por Espectroscopia de Emisión Atómica ICP-AES:

La técnica de espectroscopia de emisión atómica plasma inductivamente acoplada

se utilizó para determinar el contenido de fósforo de las muestras de inulina

entrecruzada. El grado de entrecruzamiento (DC) de la inulina se determinó a partir

del cálculo entre los moles de fósforo incluidos en la inulina y los moles de inulina

totales, de acuerdo a la ecuación Nº7:

DC =Moles de fósforo en 100g de InE

Moles de inulina en 100g

Ecuación Nº7: Calculo del grado de entrecruzamiento (DC).

En la tabla Nº 4 se presentan los resultados para el contenido de fósforo y grado de

entrecruzamiento de la inulina e inulina entrecruzada. Es posible apreciar que el

grado de entrecruzamiento depende del contenido de cloruro de fosforilo utilizado

en la reacción. Cabe destacar que las estipulaciones de la FDA solo regulan el uso

33

de cloruro de fosforilo en almidones, con valores permitidos de hasta un 0,1% de

fosforilo con respecto al peso de almidón (Food and Drug Administration, 21 Code

of Federal Regulations 172.892, 1995). En este trabajo se utilizaron valores muy

superiores a lo permitido por la FDA para almidones, con el fin de aumentar las

diferencias que se podrían producir al hacer reaccionar la inulina con este agente

entrecruzante.

Tabla Nº4: Determinación del contenido de fósforo por ICP-AES y cálculo del grado de entrecruzamiento (DC) para inulina entrecruzada con POCl3.

InN: inulina nativa; InE1: inulina entrecruzada con 0,3% de POCl3; InE2: inulina entrecruzada con 1,0% de POCl3

1.6. Determinación de la Capacidad de Retención de Agua y Solubilidad:

Para determinar estos parámetros se utilizó la técnica descrita por Medcalf & Gilles

(1965), con modificaciones.

En la tabla Nº5 se presentan los resultados obtenidos para la solubilidad y la

capacidad de retención de agua de inulina nativa y entrecruzada. Se puede ver que

el entrecruzamiento disminuye significativamente (p<0,05) la solubilidad de la

inulina y aumenta significativamente su capacidad de retención de agua con

respecto a la inulina nativa (InN). Sin embargo, entre los polímeros entrecruzados

no hubo diferencia significativa en estos parámetros. Resultados similares

obtuvieron Alummoottil et al. (2006) para el almidón de Cassava entrecruzado. Sin

embargo, no se encontraron trabajos en la literatura sobre entrecruzamiento de

inulina con tricloruro de fosforilo.

Muestra Peso InN (g)

POCl3 Adicionado

(g)

POCl3 Adicionado

(ul)

Fósforo en la

muestra (mg/kg)

Fósforo total

(mg en 100 g)

Mol fósforo en la muestra

Mol de inulina

DC

InN 100 0 0 8,2 0,82 - - -

InE1 100 0,3 179 404 40,4 0,0012625 0,0241331 0,052

InE2 100 1 598 706 70,6 0,0022062 0,0241331 0,091

34

Tabla Nº5: Capacidad de retención de agua (WBC) y solubilidad (%) de InN, InE1 e InE2.

Muestra Retención agua (WBC) Solubilidad (%)

InN 3,73±0,32 (a) 59,32±3,10 (a)

InE1 5,46±0,04 (b) 26,20±0,17 (b)

InE2 5,76±0,10 (b) 22,54±0,06 (b) Letras distintas entre sistemas indican diferencias significativas (p<0,05), para WBC y %Solubilidad.

1.7. Morfología de la inulina nativa y entrecruzada:

La figura Nº16 muestra la morfología de la inulina nativa. Es posible apreciar que se

trata de estructuras amorfas, de diferentes tamaños, con partículas pequeñas

adsorbidas en las superficies de las de mayor tamaño.

Figura Nº16: Fotomicrografías de inulina nativa. La fotografía de la izquierda posee una amplitud x45 y

la de la derecha una amplitud de x1500 veces.

35

Figura Nº17: Fotomicrografías de inulina entrecruzada con POCl3 al 0,3% (InE1). La fotografía de la izquierda posee una amplitud x200 y la de la derecha una amplitud de x1000 veces.

Figura Nº18: Fotomicrografías de inulina entrecruzada con POCl3 al 1,0% (InE2). La fotografía de la izquierda posee una amplitud x200 y la de la derecha una amplitud de x1000 veces.

En las figuras Nº17 y 18 se puede apreciar que tanto la InE1, como la InE2 poseen

una morfología similar entre sí, pero diferente de la InN. Probablemente esto se

deba a que el tricloruro de fosforilo afecta la conformación helicoidal de cinco

vueltas de la inulina (Stevens et al., 2001), provocando una alteración de estas y así

un cambio en su morfología.

36

2. Microencapsulación.

2.1. Diseño de α-tocoferol con inulina nativa (AT-InN) y entrecruzada (AT-

InE1 y AT-INE2).

Las microcápsulas fueron preparadas según el método anteriormente descrito,

usando un rango de temperaturas entre 160° y 200ºC y una relación de AT/(InN o

InE) que varió desde 1:10 hasta 1:30. En la tabla Nº6, se muestra el porcentaje de

encapsulación para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2.

El rango de encapsulación de AT para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2 varió

entre 84,3 a 90,4%; 81,8 a 88,2% y 83,4 a 90%, respectivamente. Estos resultados

muestran la alta interacción entre el α-tocoferol y los polímeros de inulina (en sus

tres formas).

TablaNº6: Porcentajes de encapsulación de α-tocoferol para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2.

Ensayo Relación

AT:(InN ó InE)

Temperatura

(ºC)

InN

PE (%)*

InE1

PE (%)*

InE2

PE (%)*

1 1:10 160 88,8±0,1 86,9±0,1 90,0±1,0

2 1:10 180 88,5±0,2 87,5±0,2 87,5±0,1

3 1:10 200 87,4±0,4 88,2±0,0 85,2±0,1

4 1:20 160 88,1±0,4 86,5±0,1 84,5±0,0

5 1:20 180 86,4±0,3 87,3±0,2 84,1±0,2

6 1:20 180 87,7±0,4 87,5±0,1 84,3±0,1

7 1:20 200 86,9±0,3 86,5±0,4 84,8±0,1

8 1:30 160 84,3±0,3 81,8±0,1 83,4±0,3

9 1:30 180 86,8±0,4 87,7±0,2 86,2±0,2

10 1:30 200 90,4±0,2 86,5±0,3 85,0±0,2

* Valores expresados como media ± DS; PE: porcentaje e encapsulación.

El análisis de varianza (ANDEVA) para el porcentaje de encapsulación, mostró que

la temperatura de aire de entrada al secador en su forma lineal y cuadrática no

presentó un efecto significativo (p>0,05) en ninguno de los tres sistemas

estudiados. Mientras que, la relación AT/agente encapsulante en su forma lineal y

cuadrática tuvo un efecto significativo (p<0,05) solamente en el sistema AT-InE2.

37

Superficie de Respuesta Estimada

160 170 180 190 200Temperatura

1014

1822

2630

Relacion84

85

86

87

88

89

90

Por

c E

ncap

sula

cion

Por otro lado, la interacción entre la relación AT/agente encapsulante y la

temperatura de secado, mostraron un efecto significativo (p<0,05) sobre el

porcentaje de encapsulación de AT para los sistemas AT-InN y AT-InE2 (anexo Nº4,

5 y 6).

A pesar del efecto deletéreo de la temperatura sobre la estabilidad del AT (Kamal-

Eldin y Appelqvist, 1996), los resultados muestran que esta variable no ejerce un

efecto importante en el contenido de AT en ninguno de los tres sistemas

estudiados. Estos resultados están de acuerdo con Gharsallaoui et al. (2007),

quienes muestran que altas temperaturas con bajos tiempos de residencia en la

cámara de secado (5 a 100 s) no afectan el contenido de compuestos bioactivos.

En las figuras 19, 20 y 21 se presentan los gráficos de superficie respuesta para los

diseños AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2, respectivamente.

Figura Nº19: Gráfico de superficie de respuesta para el diseño AT-InN.

38

Figura Nº20: Gráfico de superficie de respuesta para el diseño AT-InE1.

Figura Nº21: Gráfico de superficie de respuesta estimada para el diseño AT-InE2.

Se puede afirmar que en este estudio tanto la técnica de secado por atomización,

como el uso de inulina nativa y de inulinas entrecruzadas como agentes

encapsulantes permitieron lograr porcentajes de encapsulación sobre un 80%.

Resultados similares para la encapsulación de AT obtuvieron Pierucci et al. (2007)

(77,8% a 96,7%) utilizando proteína de arveja, carboximetilcelulosa y mezclas de

estos materiales con maltodextrina, como agentes encapsulantes y secado por

atomización como método de encapsulación. Mediante otras técnicas de

encapsulación, como coacervación, Duclairoir et al. (2002) también obtuvieron

Superficie de Respuesta Estimada

160 170 180 190 200Temperatura

1014

1822

2630

Relacion

83

84

85

86

87

88

89

Por

c E

ncap

sula

cion

Superficie de Respuesta Estimada

160 170 180 190 200Temperatura

1014

1822

2630

Relacion83

85

87

89

91

Por

c E

ncap

sula

cion

39

sobre un 77% de encapsulación para AT al elaborar nanopartículas con gliadina de

trigo como encapsulante. Sin embargo Yoo et al. (2006), obtuvieron entre 31,2 a

58,3% de encapsulación utilizando alginato como agente encapsulante mediante

gelificación iónica.

2.2. Microcápsulas obtenidas en condiciones óptimas:

2.2.1. Condiciones de Microencapsulación:

Para la optimización de la variable respuesta (porcentaje de encapsulación), en

función de las variables independientes: relación AT/agente encapsulante y

temperatura del aire de entrada, se utilizó la metodología de superficie de respuesta

(MSR). La maximización de la variable respuesta para el diseño AT-InN se logró

con una relación de 1:30 y una temperatura de entrada de 200 ºC (figura Nº19);

para el diseño AT-InE1 con una relación de 1:10 y una temperatura de entrada de

180 ºC (figura Nº20) y finalmente para el diseño AT-InE2 con una relación de 1:10 y

una temperatura de entrada de 160 ºC (figura Nº21). En la tabla Nº7 se resumen las

condiciones óptimas para la elaboración de las microcápsulas de cada uno de los

diseños estudiados. En general diferentes agentes encapsulantes tienen diferentes

parámetros óptimos en el secado por atomización debido a que ciertas

características como solubilidad, viscosidad y conformación, entre otras, afectan la

formación de la costra en la superficie de la partícula durante el proceso de secado

(Kenyon, 1995; Gharsallaoui et al., 2007).

Tabla Nº7: Condiciones óptimas para la elaboración de las microcápsulas de los sistemas AT-InN, AT-

InE1 y AT-InE2.

Óptimo Relación AT/Agente encapsulante

T (°C) Secado

AT-InN 1:30 200

AT-InE1 1:10 180

AT-InE2 1:10 160

40

En la tabla Nº7 se puede apreciar que el entrecruzamiento produjo una disminución

en la cantidad de agente encapsulante utilizado para la obtención de los óptimos,

esto se debe a que la modificación química de la inulina mejora sus propiedades

como agente encapsulante. Esto último claramente representa una ventaja desde el

punto de vista de la aplicabilidad industrial, ya que el entrecruzamiento permitió

disminuir un 67% la cantidad de agente encapsulante utilizada para el diseño de los

óptimos, aun manteniendo altos porcentajes de encapsulación (resultados en la

tabla Nº6).

2.2.2. Porcentajes de encapsulación de las microcápsulas óptimas:

En la tabla Nº8 se presenta el AT superficial y el porcentaje de encapsulación para

las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas. El entrecruzamiento de la

inulina produjo un aumento significativo (p<0,05) en el porcentaje de encapsulación

de los óptimos.

Tabla Nº8: α-tocoferol superficial y encapsulado en las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas de los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2.

Diseño Grado de

entrecruzamiento

AT total teórico

(mg AT/g polvo)

AT superficial

(%)* PE (%)*

AT-InN 0,001 30,9535 13,9±0,3a 86,1±0,3a

AT-InE1 0,052 79,5696 12,0±0,4b 88,0±0,4b

AT-InE2 0,091 80,6201 10,2± 0,2c 89,8±0,2c

Letras distintas indican diferencias significativas entre sistemas (p<0,05), para el %superficial y el

%encapsulación; * Valores expresados como media ± DS; PE: porcentaje de encapsulación.

En la medida que aumenta el grado de entrecruzamiento de la inulina, disminuyó

significativamente el porcentaje de AT superficial de las microcápsulas óptimas.

Esta disminución del contenido de AT superficial podría ser debida a que la

inclusión de moléculas de fósforo y de uniones entre dos o más segmentos de la

misma o de diferentes cadenas de inulina mejora la tendencia a la formación de

redes finas y densas de agente encapsulante en la superficie de las microcápsulas

41

durante el proceso de secado. De este modo, al aumentar el grado de

entrecruzamiento en la inulina va disminuyendo la separación y migración hacia la

superficie de AT durante el secado (Gharsallaoui et al., 2007).

2.2.3. Morfología de las microcápsulas óptimas:

En las figuras Nº22, 23 y 24 se muestran las microfotografías electrónicas de

barrido (SEM) de las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas de los tres

sistemas estudiados.

Figura Nº22: Microfotografía de microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas para el sistema AT-InN. La fotografía de la izquierda posee una amplitud x3000 y la de la derecha una amplitud de x8000 veces.

Figura Nº23: Microfotografía InE1. La fotografía de la izquierda posee una amplitud x3000veces.

Figura Nº24: Microfotografía AT-InE2. La fotografía de la x8000 veces.

Las microcápsulas óptimas

presentan superficies

asociativo entre ellas (forman aglomerados

por Poulain et al. (2003)

método de coacervación.

que utilizan polisacáridos como materia

superficie, las cuales s

de microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas para el sistema zquierda posee una amplitud x3000 y la de la derecha una amplitud de x8

grafía de micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas izquierda posee una amplitud x3000 y la de la derecha una amplitud de

óptimas elaboradas tanto con inulina nativa como entrecruzada

con abolladuras y además exhiben un comportamiento

forman aglomerados). Resultados similares fueron obtenidos

2003), al estudiar microesferas de inulina obtenidas por el

do de coacervación. De acuerdo con Finotelli et al. (2010) las microcápsulas

polisacáridos como material pared exhiben notables indentaciones en la

las cuales son atribuidas al efecto de la composición de la pared

42

para el sistema AT-de la derecha una amplitud de x8000

óptimas para el sistema de la derecha una amplitud de

entrecruzadas

además exhiben un comportamiento

ron obtenidos

, al estudiar microesferas de inulina obtenidas por el

) las microcápsulas

pared exhiben notables indentaciones en la

efecto de la composición de la pared

43

(propiedades viscoelásticas), la atomización y los parámetros de secado; las

abolladuras se pueden formar por la contracción de las partículas durante el secado

y enfriado. Ronkart et al. (2007) estudió la influencia de la temperatura de

alimentación en el secado por atomización de inulina sobre sus propiedades físicas,

encontrando superficies lisas o rugosas dependiendo si la mezcla de alimentación

correspondía a una solución o a una dispersión, respectivamente. La presencia de

abolladuras tiene un efecto adverso sobre las propiedades de flujo de las

microcápsulas, debido a que los polvos que presentan irregularidades en su

superficie poseen una relación superficie/volumen bastante mayor comparados con

partículas perfectamente esféricas y esto hace que las propiedades de flujo de

dichas partículas sean escasas por un aumento del roce entre ellas.

44

3. Evaluación de la cesión del activo:

3.1. Cinética de Liberación de α-tocoferol en n-hexano:

El estudio de liberación de α-tocoferol desde las microcápsulas óptimas se realizó

en un equipo de disolución USP/NF 1, utilizando n-hexano como medio de

disolución. Los resultados se presentan en la figura Nº25 (anexo Nº7).

Figura Nº25: Perfil de liberación de AT para las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas, para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2, utilizando n-hexano como medio de disolución.

El perfil de liberación de AT en n-hexano para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-

InE2, mostró un comportamiento limitante, donde en la primera fase (0-30 min) se

produce una liberación rápida de AT de alrededor de un 10%, correspondiente al

AT superficial. En la segunda fase (30-540 min) no se observó liberación de AT,

manteniéndose un valor constante a través del tiempo. Gráficos bifásicos reportó

Duclairoir et al. (2002) en el perfil de liberación de nanopartículas de α-tocoferol-

gliadina en decano. Sin embargo, en la segunda zona observó una dependencia en

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

Po

rcen

taje

AT

liber

ado

(%

)

Tiempo (min)

Mcps InN

Mcps INE1

Mcps InE2

45

el tiempo, debido a la difusividad del componente activo desde la matriz hacia el

medio. En el presente trabajo no se observó liberación de AT en la segunda fase,

debido a que la inulina tanto nativa, como entrecruzada en hexano adquieren una

conformación ovillada debido a la baja interacción polímero-solvente evitando la

entrada de solvente al interior de las microcápsulas e impidiendo la difusión de α-

tocoferol desde el interior hacia el medio de disolución.

El perfil de liberación de AT desde las microcápsulas obtenidas bajo condiciones

óptimas para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2, se ajustaron a cinéticas de

orden cero y orden uno. Las constantes de liberación calculadas hasta los 30

minutos se presentan en la tabla Nº9.

Tabla Nº9: Constantes de orden cero y uno para la liberación de AT superficial desde las microcápsulas óptimas para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2 en n-hexano.

Sistema (k ± DS) x 10-2

orden cero

([µg/ml] min-1)

R2

orden cero

(k ± DS) x 10-3

primer orden

(min-1)

R2

primer orden

AT-InN 3,95 ± 1,5 (a) 0,883 1,35 ± 0,1 (a) 0,886

AT-InE1 16,03 ± 2,2 (b) 0,932 2,15 ± 0,1 (b) 0,935

AT-InE2 13,50 ± 6,3 (c) 0,949 1,80 ± 0,1 (c) 0,950

Letras distintas entre sistemas indican diferencias significativas (p<0,05).

3.2. Cinética de Liberación de α-tocoferol en agua-tween 80:

Antes de realizar la cinética de cesión del activo, se realizó un screening para

observar el comportamiento de liberación de α-tocoferol desde las microcápsulas

utilizando agua-tween 80 como medio de disolución (0,5% de tween 80, para

mejorar la solubilidad del AT liberado). Para esto se escogió de forma aleatoria las

microcápsulas del sistema InE2 obtenidas bajo condiciones óptimas. El perfil de

liberación, se muestra en la figura Nº26.

46

Figura Nº 26: Perfil de liberación del AT frente al tiempo para las microcápsulas de InE2 obtenidas bajo condiciones óptimas en agua-tween-80 como medio de disolución.

De la figura Nº26 se puede concluir que el porcentaje liberado de α-tocoferol entre

0-500 min alcanzó un 12% aproximadamente, luego entre 500-1500 min

permaneció relativamente constante en este valor y luego de los 1500 min se

presenta una caída en la concentración de AT en el medio. Resultados similares

mostró Duclairoir et al. (2002), con una caída en la concentración de AT observada

a partir de las 20 horas, atribuida a la formación de micelas, las cuales actuarían

como reservorios de AT (enmascarándolo). Además la caída de AT a partir de las

20 horas en este estudio se debería a la degradación que sufre el AT frente a la luz

y oxígeno (Kamal-Eldin y Appelqvist, 1996), en el equipo de disolución. De acuerdo

con estos resultados, se procedió a realizar las cinéticas de liberación hasta los 540

minutos (figura Nº27 y Anexo Nº8).

-1,0

1,0

3,0

5,0

7,0

9,0

11,0

13,0

15,0

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Po

rce

nta

je A

T lib

era

do

(%

)

Tiempo (min)

InE1

47

Figura Nº27: Perfil de liberación de AT para las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas, para los sistemas AT-InN, AT-InE1, AT-InE2, utilizando agua-tween 80 como medio de disolución.

La liberación en medio acuoso presenta un gráfico bifásico, en donde la primera

fase comprendida entre 0-90 min se ajustó mejor a una cinética de primer orden

(tabla Nº10). La segunda fase sugeriría el comienzo de la liberación del AT

encapsulado, pero debido a lo lento de esta y a la caída en la concentración de AT

en el medio no fue posible ajustar a los modelos matemáticos utilizados en este

estudio.

En forma general se puede apreciar bajos porcentaje de liberación en los tres

sistemas en estudio debido, entre otras cosas, a la baja solubilidad del AT en medio

acuso. Además podemos concluir que el porcentaje de liberación de AT para las

inulinas entrecruzadas superan al de la nativa, específicamente la curva de cesión

de las microcápsulas óptimas de AT-InE2 está por sobre las demás; esto se debería

a que las inulinas entrecruzadas presentan una mayor interacción con el medio de

disolución, lo que les permite lograr una mayor cesión con respecto a la nativa.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

Po

rcen

taje

de

AT

lib

erad

o (

%)

Tiempo (min)

InN

InE1

InE2

48

Tabla Nº10: Constantes de liberación de AT en agua-tween 80 a 25 ºC para modelos de orden cero y uno.

Mcps óptimas

sistema

(k ± DS) x 10-3

orden cero

([µg/ml] min-1)

R2

orden

cero

(k ± DS) x 10-4

primer orden

(min-1)

R2

primer orden

AT-InN 9,2±0,01 (a) 0,929 3,0±0,01 (a) 0,932

AT-InE1 45,8±0,2 (b) 0,926 6,0±0,01 (b) 0,933

AT-InE2 54,6±0,3 (c) 0,916 9,0±0,01 (c) 0,921

Letras distintas entre sistemas indican diferencias significativas (p<0,05).

Las constantes de liberación de AT desde las microcápsulas con inulina

entrecruzada fueron significativamente mayores (p<0,05) con respecto a la de

inulina nativa, de tal forma que un aumento en el grado de entrecruzamiento

aumentó significativamente (p<0,05) la constante de liberación de AT (tabla Nº10).

Este comportamiento se puede explicar debido a que un aumento en el grado de

entrecruzamiento aumenta la capacidad de retención de agua (WBC), facilitando la

difusión de AT. Estos resultados muestran el efecto del tipo de agente encapsulante

sobre la constante de liberación.

Al comparar las magnitudes de las constantes de liberación de AT de la primera

fase en medio acuoso con respecto a las obtenidas en medio apolar se puede

apreciar que estas son alrededor de 10 veces menores en magnitud, lo que denota

que la cesión en medio acuoso es más lenta, sugiriendo que la solubilidad de AT en

el medio de disolución juega un rol importante sobre la velocidad de liberación.

49

Tabla Nº11: Ajuste de los perfiles de liberación de α-tocoferol.

Sistema Higuchi Korsmeyer & Peppas

(k ± DS) x 10-3

(min-1/2) Ordenada origen

R2 (k ± DS) x 10-3

(min-n) n R2

AT-InN 2,4 ± 0,01 (a) 0,0004 0,968 9,7 ±0,28 (a) 0,3148 0,982

AT-InE1 3,3 ± 0,01 (b) 0,0177 0,889 8,3 ± 0,02 (b) 0,3976 0,930

AT-InE2 4,6 ± 0,01 (c) 0,0003 0,921 8,4 ± 0,11 (b) 0,4421 0,940

Letras distintas entre sistemas indican diferencias significativas (p<0,05).

Al aplicar los modelos matemáticos propuestos por Higuchi y Korsmeyer & Peppas

al perfil de liberación de AT desde las micropartículas obtenidas bajo condiciones

óptimas de los sistemas de AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2 (tabla Nº11), se puede

apreciar que estas se ajustan tanto al modelo propuesto por Higuchi como al de

Korsmeyer & Peppas. El coeficiente de correlación cuadrático, se utilizó como

parámetro para determinar el ajuste a los modelos (Robert et al., 2003) y en el caso

del modelo de Higuchi el valor de la ordenada al origen cercana a cero, también se

utiliza como herramienta de ajuste (Aragón Fernández at al., 2009). De acuerdo a

estos resultados el mecanismo de cesión de AT, para los tres sistemas, sería a

través de un proceso difusivo. Específicamente en los sistemas AT-InN y AT-InE1,

el mecanismo estaría compuesto por varios procesos simultáneos al fenómeno de

difusión, debido a que al aplicar el modelo de Korsmeyer & Peppas, el exponente n

(que representa el mecanismo de cesión) es menor a 0,43 (Aragón Fernández et

al., 2009). Para las micropartículas óptimas elaboradas con InE2 el valor del

exponente n presenta un valor muy cercano a 0,43, lo que indicaría que la

liberación es debida a un mecanismo de difusión Fickiana (Siepmann y Peppas,

2001).

50

VII. CONCLUSIONES

1. Se logró la modificación de la inulina en dos grados de entrecruzamiento

(0,052 y 0,091), siendo este proporcional a la cantidad de tricloruro de

fosforilo utilizada para llevar a cabo la reacción.

2. El porcentaje de encapsulación de AT aumentó significativamente (p<0,05)

con el aumento del grado de entrecruzamiento de la inulina, mejorando la

interacción AT-polímero.

3. El perfil de liberación de AT desde las microcápsulas de los sistemas AT-

InN, AT-InE1 y AT-InE2 en n-hexano mostró un comportamiento limitante y

en agua-tween 80 mostró un perfil bifásico. En ambos casos se alcanzó una

liberación alrededor de un 10% que correspondió a la cesión del AT

superficial.

4. El perfil de liberación de AT de los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2 en

medio acuoso (agua-tween 80) mostró que en la medida que aumenta el

grado de entrecruzamiento de la inulina, también aumenta el porcentaje de

AT liberado y la constante de liberación de AT.

5. La liberación de AT desde el sistema AT-InE2 es a través de un mecanismo

de difusión Fickiana, que obedece a la segunda ley de Fick. Mientras que

en los sistemas AT-InN y AT-InE1 es a través de varios procesos

simultáneos al fenómeno de difusión.

6. Se demostró la factibilidad de encapsular AT, por la técnica de secado por

atomización, utilizando tanto inulina nativa como entrecruzada. Estás

micropartículas permitirían la funcionalización de alimentos hidrofóbicos

(grasas y aceites) e hidrofílicos (sopas, yogurt, jugos, etc).

51

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57

IX. GLOSARIO

AT : alfa tocoferol.

csp : cantidad suficiente para.

DP : grado de polimerización.

EPI : epiclorhidrina.

InE1 : inulina entrecruzada con tricloruro de fosforilo al 0,3%.

InE2 : inulina entrecruzada con tricloruro de fosforilo al 1,0%.

InN : inulina nativa.

FT-IR : espectroscopia infrarroja.

MCPs : microcápsulas.

p : p-value.

p.a. : para análisis.

STMP : trimetafosfato de sodio.

POCl3 : tricloruro de fosforilo.

WBC : capacidad de unir agua.

58

X. ANEXOS

1. Anexo Nº1: Formulaciones para los distintos diseños.

A. Diseño inulina nativa:

Relación/Temp Secado (ºC)

α-tocoferol

(g)

Caseinato

(g)

InN (g) Agua

(g)

1:10/160ºC 0,5037 0,8055 5,002 93,689

1:10/180ºC 0,5042 0,8030 5,005 93,688

1:10/200ºC 0,5020 0,8000 5,002 93,696

1:20/160ºC 0,5001 0,8179 10,008 88,674

1:20/180ºC 0,5025 0,8099 10,0138 88,674

1:20/180ºC 0,5023 0,8102 10,0138 88,674

1:20/200ºC 0,5023 0,8102 10,018 88,670

1:30/160ºC 0,5053 0,8034 15,015 83,676

1:30/180ºC 0,5021 0,8089 15,008 83,681

1:30/200ºC 0,5047 0,8011 15,001 83,693

B. Diseño inulina entrecruzada con POCl3 al 0,3%

Relación/Temp Secado (ºC)

α-tocoferol

(g)

Caseinato (g)

InE1 (g) Agua (g)

1:10/160ºC 0,5086 0,8055 5,005 93,681

1:10/180ºC 0,5014 0,8030 5,001 93,695

1:10/200ºC 0,5048 0,8001 5,012 93,683

1:20/160ºC 0,5041 0,8041 10,004 88,688

1:20/180ºC 0,5086 0,8030 10,007 88,681

1:20/180ºC 0,5004 0,8043 10,000 88,695

1:20/200ºC 0,5028 0,8076 10,021 88,669

1:30/160ºC 0,5002 0,8047 15,003 83,692

1:30/180ºC 0,5046 0,8040 15,009 83,682

1:30/200ºC 0,5056 0,8034 15,103 83,588

59

C. Diseño inulina entrecruzada con POCl3 al 1%

Relación/Temp Secado (ºC)

α-tocoferol

(g)

Caseinato (g)

InE2 (g) Agua (g)

1:10/160ºC 0,5086 0,8079 5,000 93,684

1:10/180ºC 0,5017 0,8001 5,000 93,698

1:10/200ºC 0,5012 0,8053 5,002 93,692

1:20/160ºC 0,5084 0,8103 10,023 88,658

1:20/180ºC 0,5063 0,8096 10,002 88,682

1:20/180ºC 0,5031 0,8039 10,010 88,683

1:20/200ºC 0,5024 0,8099 10,001 88,687

1:30/160ºC 0,5026 0,8074 15,005 83,685

1:30/180ºC 0,5039 0,8000 15,020 83,676

1:30/200ºC 0,5073 0,8100 15,001 83,682

2. Anexo Nº2: Curva de Calibración para la determinación del contenido de α-

tocoferol a través de un cromatógrafo HPLC con detector de

fluorescencia.

Se prepararon estándares de concentración conocida de α-tocoferol, los cuales

fueron inyectados en un cromatógrafo HPLC con detector de fluorescencia (AOCS,

1993). El equipo estaba compuesto de una bomba Merck-Hitachi L-6200 A (Merck,

Darmstadt, Alemania), inyector Rheodyne 7725i, loop 20 µL, detector de

fluorescencia Merck-Hitachi F-1050 acoplado a un computador con el software

Clarity 2.4.1.43. La detección se realizó a 290 nm (longitud de onda de excitación) y

330 nm (longitud de onda de emisión). Se utilizó una columna LiChrocart

Superspher Si60 (250 mm x 4 mm d.i., 5µm, Merck, Alemania). La fase móvil

correspondió a 2-propanol en hexano (0,5: 99,5 v/v) con un flujo de 1 mL/min. La

estimación se llevó a cabo por duplicado y los resultados fueron promediados

agregar referencia del método.

60

Concentración (ug/ml) Área Área Duplicado Promedio

1,05 752,432 749,700 751,066 2,1 1592,921 1588,543 1590,732

3,15 2594,455 2595,221 2594,838 4,2 3449,146 3385,742 3417,444

5,25 4303,798 4300,954 4302,376

Se obtuvo la siguiente curva de calibración:

; = 850,4 ∙ A − 147,5

Donde Y corresponde al área y x a la concentración expresada en µg/mL

3. Anexo Nº3: Curva de Calibración para la determinación del contenido de α-

tocoferol a través de un cromatógrafo HPLC con detector de arreglo de

diodos.

Se prepararon estándares de concentración conocida de α-tocoferol en metanol

HPLC, los cuales fueron inyectados en un cromatógrafo HPLC compuesto por

bomba Mera – Hitachi L-6200 con detector de arreglo de diodos (Waters 996),

acoplado a un computador con software Millenium 32. Se utilizó la columna Atlantis

C18 (3µm, 250 mm x 4,6 mm d.i.). La fase móvil correspondió a metanol-acetonitrilo

(30: 70 v/v) con un flujo de 1 mL/min (Sánchez-Machado et al., 2002). La

estimación se llevó a cabo por duplicado y los resultados fueron promediados.

y = 850,41x - 147,51R² = 0,9992

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

0 2 4 6

Áre

a

Concentración (µg/mL)

Series1

Linear (Series1)

61

Concentración (ug/ml) Área Área Duplicado Área Promedio

100,3608 1067276 1024960 1046118

80,136 842623 853825 848224

60,2928 630382 644836 637609

40,068 427322 427526 427424

20,07216 210435 212337 211386

10,03608 105061 105363 105212

Se obtuvo la siguiente curva de calibración:

; = 10482 ∙ A + 2355

Donde Y corresponde al área y x a la concentración expresada en µg/mL

y = 10482x + 2355,2R² = 0,9998

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 20 40 60 80 100 120

Áre

a

Concentración (µg/mL)

Area Promedio

Linear (Area Promedio)

62

4. Anexo Nº4: Optimización microcápsulas de inulina nativa.

Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:Temperatura 1,90407 1 1,90407 1,39 0,3033

B:Relacion 1,77127 1 1,77127 1,30 0,3186 AA 0,112201 1 0,112201 0,08 0,7887 AB 14,2129 1 14,2129 10,40 0,0321 BB 0,318201 1 0,318201 0,23 0,6547 Error total 5,46817 4 1,36704 Total (corr.) 23,8639 9

R-cuadrada = 77,086 porciento

R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 48,4435 porciento

Error estándar del est. = 1,16921

Error absoluto medio = 0,669667

Estadístico Durbin-Watson = 1,20418 (P=0,2238)

Auto-correlación residual de Lag 1 = 0,317124

Optimizar Respuesta Meta: maximizar Valor óptimo = 89,6614

Factor Bajo Alto Óptimo

Temperatura 160,0 200,0 200,0

Relacion 10,0 30,0 30,0

63

5. Anexo Nº5: Optimización microcápsulas de inulina entrecruzada con

POCl3 0,3%

Análisis de Varianza

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:Temperatura 6,08027 1 6,08027 3,25 0,1458

B:Relacion 7,23802 1 7,23802 3,87 0,1206

AA 4,18973 1 4,18973 2,24 0,2089

AB 3,01023 1 3,01023 1,61 0,2735

BB 0,246458 1 0,246458 0,13 0,7350

Error total 7,48504 4 1,87126 Total (corr.) 28,7249 9

R-cuadrada = 73,9423 porciento R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 41,3702 porciento Error estándar del est. = 1,36794 Error absoluto medio = 0,7215 Estadístico Durbin-Watson = 2,69705 (P=0,9874) Auto-correlación residual de Lag 1 = -0,357108 Optimizar Respuesta Meta: maximizar Valor óptimo = 88,4369

Diagrama de Pareto Estandarizada para Porc Encapsulacion

0 1 2 3 4

Efecto estandarizado

AA

BB

B:Relacion

A:Temperatura

AB +-

64

Factor Bajo Alto Óptimo

Temperatura 160,0 200,0 181,043

Relación 10,0 30,0 10,0

6. Anexo Nº6: Optimización microcápsulas inulina entrecruzada con POCl3

1%.

Análisis de Varianza

Fuente Suma de Cuadrados

Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:Temperatura 1,43082 1 1,43082 1,48 0,2902

B:Relacion 10,8273 1 10,8273 11,22 0,0286 AA 0,237868 1 0,237868 0,25 0,6455 AB 10,0806 1 10,0806 10,45 0,0319 BB 7,94888 1 7,94888 8,24 0,0454

Error total 3,8583 4 0,964575 Total (corr.) 34,1462 9

R-cuadrada = 88,7007 porciento R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 74,5765 porciento Error estándar del est. = 0,982128 Error absoluto medio = 0,521643

Diagrama de Pareto Estandarizada para Porc Encapsulacion

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Efecto estandarizado

BB

AB

AA

A:Temperatura

B:Relacion +-

65

Estadístico Durbin-Watson = 1,70173 (P=0,6015) Auto-correlación residual de Lag 1 = 0,10317 Optimizar Respuesta Meta: maximizar Valor óptimo = 89,5327

Factor Bajo Alto Óptimo

Temperatura 160,0 200,0 160,0

Relación 10,0 30,0 10,0

Diagrama de Pareto Estandarizada para Porc Encapsulacion

0 1 2 3 4

Efecto estandarizado

AA

A:Temperatura

BB

AB

B:Relacion +-

66

7.

An

exo

Nº7

: C

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52

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5

,26

6648

5

2,6

6648

2

63

3,3

24

222

,95

65

28

56

,28

7,1

9

2,9

120

,00

58

022

5

,76

0065

5

7,6

0065

2

88

0,0

32

275

,62

297

3

155

,65

5 7

,8

92

,2

150

,00

60

632

6

,00

9063

6

0,0

9063

3

00

4,5

32

333

,22

362

3

337

,75

5 8

,3

91

,7

180

,00

63

405

6

,27

3612

6

2,7

3612

3

13

6,8

06

393

,31

425

3

53

0,1

2 8

,8

91

,2

240

,00

67

637

6

,67

7352

6

6,7

7352

3

33

8,6

76

456

,05

037

3

794

,72

6 9

,4

90

,6

300

,00

6799

0

6,7

110

28

67

,110

28

33

55

,514

5

22,8

238

9

387

8,3

38

9,6

9

0,4

360,00

360,00

360,00

360,00

6980

2

6,8

838

96

68

,838

96

34

41

,948

5

89,9

341

7

403

1,8

82

10

,0

90

,0

420

,00

70

527

6

,95

3062

6

9,5

3062

3

47

6,5

31

658

,77

313

4

135

,30

4 1

0,3

8

9,7

480

,00

71

005

6

,99

8664

6

9,9

8664

3

49

9,3

32

728

,30

376

4

227

,63

6 1

0,5

8

9,5

75

Tabla resumen: Valores de porcentajes de liberación de AT desde las microcápsulas obtenidas en condiciones óptimas para los tres sistemas en estudio. Utilizando Agua-Tween 80 como medio de disolución.

Tiempo (min) % Disuelto* AT

Mcps InN % Disuelto* AT

Mcps InE1 % Disuelto* AT

Mcps InE2

0 0,00±0,00 0,00±0,00 0±0,00 5 0,36±0,51 1,15±0,00 1,15±0,02 10 1,71±0,04 1,71±0,00 2,19±0,01 15 2,22±0,04 2,30±0,06 2,63±0,06 20 2,59±0,04 2,96±0,00 3,41±0,03 25 2,75±0,01 3,40±0,03 3,79±0,03 30 2,98±0,04 3,50±0,02 4,45±0,00 45 3,29±0,00 4,44±0,04 5,3±0,01 60 3,67±0,09 5,38±0,01 6,21±0,01 90 4,36±0,01 6,08±0,00 7,13±0,07

120 4,38±0,02 6,53±0,01 7,82±0,02 150 4,59±0,03 6,78±0,01 8,35±0,10 180 4,80±0,01 6,89±0,01 8,78±0,03 240 5,40±0,02 7,31±0,00 9,39±0,03 300 5,67±0,11 7,59±0,08 9,61±0,01 360 6,29±0,03 7,81±0,01 9,96±0,06 420 6,56±0,03 8,09±0,02 10,24±0,02 480 6,67±0,00 8,30±0,00 10,5±0,02 540 6,50±0,01 8,39±0,01 -

* Valores expresados como media ± DS.