UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOLOGÍA

Obtención, Aislamiento e Identificación de Cepas Bacterianas Presuntas Productoras de Poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs)

T E S I S

TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL

QUE PRESENTA:

ELIZABETH ORTIZ GARCÍA

DIRECTOR:

Biol. S. Augusto Hernández Rivera

Xalapa, Ver. 2009

i

D e d i c a t o r i a

Me gustaría dedicar esta Tesis a toda mi familia, ya que el esfuerzo y dedicación que he puesto en

esta Tesis va con mucho cariño hacia ellos. Principalmente a mis padres, los más importantes y

los verdaderos responsables de que hoy esté aquí, este es buen momento para dejar en claro mi

más profundo agradecimiento a mi madre por los sacrificios y esfuerzos que realizó a lo largo

de…… siempre, porque me ayudo a seguir adelante frente a cada una de las adversidades

presentadas… a mi hermana y hermanos, así como los demás integrantes de mi familia.

Muchas gracias a todos

ii

A g r a d e c i m i e n t o s

Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que de distintas maneras han

contribuido a que culmine esta tesis de licenciatura.

Agradezco especialmente a mi director de Tesis el Biólogo S. Augusto Hernández Rivera por el

apoyo brindado y por la confianza depositada.

Agradezco de forma especial también, a mi comité revisor; a la Dra. Beatriz Palmeros Sánchez

por la ayuda y apoyo brindado a los largo del desarrollo y conclusión de mi trabajo, así como a la

Dra. Ma. Carmen Ramírez por cada una de las sugerencias valiosas, que fueron de gran ayuda.

Al laboratorio de Toxicología Ambiental especialmente a la Dra. Ma. del Socorro por permitir

utilizar su equipo.

También me gustaría agradecer a la maestra Guille por todos los consejos recibidos durante mi

estancia en la Facultad y por todo su apoyo brindado.

A mis amigas a las cuales agradezco su motivación y optimismo en momentos críticos y por su

sincera amistad.

Y una vez más agradezco a mi Familia.

iii

Í N D I C E

Pág.

Índice de tablas v

Índice de figuras vi

Índice de anexos ix

Indice de Abreviaturas x

Resumen xiii

I.-Introducción 1

II.- Antecedentes:

2.1.- Organismos productores de polímeros biológicos 5

2.2.-Material de almacenaje 6

2.3.-Estructura Química y Tipos de PHAs 7

2.4.- Propiedades fisicoquímicas y características de los PHAs 9

2.5.- Tipos de PHAs más importantes 10

2.6.- Organismos productores de PHAs 12

2.7.-Biosíntesis de Poli-β-hidroxialcanoatos 13

2.7.1.- Descripción de las enzimas que intervienen en la biosíntesis de PHAs 15

2.7.2.- Biosíntesis de PHAs-ssc 17

2.7.3.- Biosíntesis de PHAs-msc 19

2.7.4.-Formación de PHAs-msc por Pseudomonas a partir de ácidos grasos 19

2.7.5.- PHAs-msc formados a partir de carbohidratos 19

2.8.- Características de los gránulos 21

2.8.1.- Modelos para la formación del gránulo de PHAs 22

2.8.2.- Formación in vivo de partículas de poliésteres 22

2.9.- Degradación de los PHAs 26

2.10.- Biodegradabilidad 27

2.11.- Sobrevivencia de bacterias productoras de PHAs 27

2.12.- Aplicación de los Poli-β-hidroxialcanoatos 28

2.13.- Sustratos y costos 30

III.-Justificación 33

IV.-Objetivo 35

V.-Material y Métodos

5.1.- Obtención de muestras 36

5.2.- Procesamiento de muestras de tejido vegetal 36

5.3.- Procesamiento de muestras de suelo 37

5.4.- Obtención y Aislamiento de cultivos puros por método de siembra en placa 37

iv

5.5.-Producción de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) 39

5.6.-Determinación cuantitativa de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) 40

5.7.- Evaluación cualitativa de la acumulación de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) 41

5.8.- Análisis de crecimiento celular 41

5.9.-Caracterización química y bioquímica de cepas bacterianas 43

5.10.-Caracterización química y bioquímica de Fermentadores 43

5.11.- Caracterización química y bioquímica para no fermentadores 47

VI.-Resultados 51

6.1.- Aislamiento de cepas bacterianas 50 6.2.- Caracterización química y bioquímica de las cepas productoras de PHAs y

cuantificación de PHAs 53

6.3.- Concentración de PHAs de las cepas aisladas de Saccharum officinarum 57

6.4.- Concentración de PHAs de las cepas aisladas de Musa paradisiaca 58 6.5.- Concentración de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Lycopersicum

esculentum 59

6.6.- Concentración de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Citrullus lanatus 5.9

6.7.- Curvas de crecimiento de cepas productoras de PHAs 60

6.8.- Evaluación cualitativa de la acumulación de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) 70

VII.- Discusión 72

VIII.- Conclusiones 76

IX.- Anexos 78

X.- Referencias Bibliográficas 84

v

Índice de tablas

Pag. Tabla 1. Principales características del polihidroxibutirato, polihidroxialcanoato y el propileno (Tomada de Carminatti et al., 2006) 9 Tabla. 2. Tiempo que tardan los PHAs en degradarse en diferentes ambientes (Tomada de Luzier, 1992) 27 Tabla 3. Componentes del MSM suplementado con sacarosa 38 Tabla 4. Solución de microelementos 38 Tabla 5. Componentes del medio de cultivo para la producción de PHAs 39 Tabla 11. Número de cepas bacterianas seleccionadas de cada cultivo 51 Tabla 12. Las 20 cepas seleccionadas de los cultivos, elegidas por sus valores óptimos en cuanto a la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm 51 Tabla 13. Cepas bacterianas identificadas como productoras de PHAs 54 Tabla 14. Concentración de PHAs de cepas bacterianas aisladas de Saccharum

officinarum

57 Tabla 15. Concentración de PHAs de cepas bacterianas aisladas de Musa paradisiaca

58 Tabla 16. Concentración de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Lycopersicum

esculentum

59 Tabla 17. Concentración de PHAs de cepas bacterianas aisladas del cultivo de Citrullus

lanatus

60 Tabla 18. Cepas con mayor producción de PHAs de cada cultivo 69 Tabla 19. Cepas seleccionadas como mejores productoras, analizando su producción y curva de crecimiento 69

vi

Índice de figuras

Pag. Fig. 1. Estructura química general de los PHAs, generalmente están compuestos de (R )-β-ácidos grasos hidroxi, donde el grupo R puede variar desde metil hasta un tridecil 7 Fig. 2. Polihidroxialcanoatos más conocidos (Tomada de Segura et al., 2007) 8 Fig. 3. Micrografías de transmisión electrónica de gránulos de PHB. A y B, producidos por R. esphaeroides (Cetin et al., 2006); C, PHB producidos por W. eutropha (Tomada de Tian et al., 2005) 11

Fig. 4. Proteínas requeridas para la homeostasis de PHA (Tomada de Stubbe y Tian 2003) 13 Fig. 5. Biosíntesis y degradación de PHB. En condiciones de exceso de energía, el NADH inhibe la despolimerización de PHB y el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA). La disminución de la concentración de CoA-SH aumenta la inhibición de la acetil-Co-aciltransferasa que cataliza la condensación del acetil-CoA en acetoacetil-CoA y la síntesis de PHB. En deficiencia de energía, el control actúa en el otro sentido. Los signos (+) y (-) corresponden a una regulación positiva o negativa (Tomada de Cabello, 2007) 18 Fig. 6. Ruta biosintetica para PHAs-msc a partir de hidratos de carbono. Esta vía está ligada a la biosíntesis de los ácidos grasos, puesto que la biosíntesis de estos procede de la vía (R)-3-hidroxiacil-ACP. El (R)-3-hydroxyacyl-ACP es convertido (R)-3-hidroxiacil-CoA por un acil-ACP:CoA transacilasa codificado por el gene phaG (Tomada de Madison y Huisman, 1999) 21 Fig. 7. Modelo Micela, la formación de gránulo PHB, las esferas coloreadas mostradas sobre PHB amorfo representan las proteínas que están asociadas a la superficie del gránulo. Esferas grises PhaC; esferas azules PhaP; esferas rojas PhaR esferas verdes, PhaZ1a, esfera púrpura, PhaZ1b, esfera de naranja, PhaZ1c. (Tomada de Tian et al., 2005) 24 Fig. 8. Modelo “Budding”, donde se puede observar la formación del gránulo (Tomada de Tian et al., 2005) 25 Fig. 9. Degradación de P (3HB-3HV) en aguas residuales bajo condiciones aeróbicas. Las botellas hechas de P (3HB-3HV) fueron incubadas durante el verano (temperatura promedio de 20°C). El progreso de degradación es demostrado con las botellas que han sido sujetas a este tratamiento para 0, 2, 4, 6, 8, y 10 semanas (de la izquierda a la derecha) (Tomada de Madison y Hiusman, 1999) 27 Fig. 10. Productos elaborados utilizando los polihidroxialcanoatos como materia prima (Tomada de Segura et al., 2007) 29 Fig. 11. La gráfica muestra el número de aislados bacterianos de los diferentes cultivos de donde se obtuvieron las cepas bacterianas 50 Fig. 12. Distribución porcentual de cepas bacterianas aisladas de los cultivos de Musa 50

vii

paradisiaca, Saccharum officinarum, Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus y Nicotina tacabum L

Fig. 13. Porcentaje de aislamiento de cepas bacterianas de cada cultivo 53 Fig. 15. Pruebas básicas realizadas a las cepas bacterianas; a) Prueba de movilidad, b) prueba de catalasa, c) prueba de oxidasa 55 Fig. 16. a) Prueba de Indol, el primer tubo es un reacción negativa, fue observado en todas las cepas caracterizadas, el segundo tubo reacción positiva característica de E. coli que fue seleccionado como control positivo b) Prueba RM el primer tubo muestra una reacción positiva característico de algunos organismos fermentadores, el segundo tubo es reacción negativa característica de organismos no fermentadores c) Prueba VP, en el primer tubo reacción positiva, la reacción negativa se puede apreciar en el segundo tubo característico de organismos no fermentadores 55 Fig. 17. Es un tubo de TSI, donde se puede observar claramente la producción de H2S; una característica fundamental para identificar a Shewanella putrefaciens, además se observa la reacción Alc/Alc característico de un organismo no fermentador a 24 h de incubación a 35°C 56 Fig. 18. a) Placa de Miuller-Hington, se puede apreciar el pigmento piocianina producido por P. aeuroginosa; b) Placa de Agar sangre, se observa la pigmentación amarilla de las colonias pertenecientes a P. cepacia; c) Prueba de acides de hidratos de carbono y alcoholes de P. cepacia 56 Fig. 19. Curva de crecimiento de E. gergoviae (IIBUV-ECP61) aislada de Citrullus lanatus 61 Fig. 20. Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ECP60), aislada del cultivo de Citrullus lanatus 61 Fig. 21. Curva de crecimiento de la cepa identificada como Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), aislada del cultivo de Musa paradisiaca

62 Fig. 22. Curva de crecimiento de E. aerogenes (IIBUV-EMP57) aislada del cultivo de Musa

paradisiaca

62 Fig. 23. Curva de crecimiento de P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), aislada del cultivo de Lycopersicum esculentum

63 Fig. 24. Curva de Crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ELP27), aislada de L. esculentum

64 Fig. 25. Curva de crecimiento de Pseudomona aeruginosa (IIBUV-ESP5), aislada de Saccharum officinarum, además podemos observar las concentraciones de PHAs obtenidas a las 24, 48 y 72 horas 64 Figura 26.- Curva de crecimiento de E. spp. (IIBUV-ESP6) aislada del cultivo de Saccharum

officinarum

65 Fig. 27. Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ESP3) aislada del cultivo de Saccharum officinarum 65

viii

Fig. 28. Curva de crecimiento de la cepa S. putrefaciens (IIBUV-ESP1), aislada del cultivo de S. officinarum 66 Fig. 29. Curva de crecimiento de la cepa identificada como P. cepacia (IIBUV-EMP 28) aislada de Musa paradisiaca 67 Fig. 30 Curva de crecimiento de Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), aislada del cultivo de Musa paradisiaca 67 Fig. 31. Curva de crecimiento de la cepa bacteriana identificada como P. pseudomallei (IIBUV-ESP2), aislada del cultivo de Saccharum officinarum 68 Fig. 32. Curva de crecimiento de la cepa A. latus (IIBUV-EMP30), aislada del cultivo de Musa paradisiaca 68 Fig. 33. Tinción lipofilica con Sudán negro. Se observan gránulos PHA a un aumento de 100X, en la cepa bacteriana P. cepacia en un cultivo de 24 hrs 70 Fig. 34. Tinción lipofilica con Sudán negro, se observan gránulos PHA a un aumento de 100 x, en la cepa bacteriana Enterobacter hormaechei en un cultivo de 72 hrs 71

ix

Índice de anexos

Pag Tabla 6. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 15 cepas bacterianas aisladas Saccharum officinarum, las 6 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombreadas) para su determinación cuantitativa y cualitativa en cuanto a producción de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica 78 Tabla 7. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 12 cepas bacterianas aisladas Lycopersicum esculentum, las 2 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombreadas) para la determinación cuantitativa y cualitativa de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica 79 Tabla 8. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 30 cepas bacterianas aisladas Musa paradisiaca, las 8 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombredas) para determinar cuantitativa y cualitativa la producción de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica 79 Tabla 9. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 11 cepas bacterianas aisladas Citrullus lanatus, las 3 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombreadas) para la determinación cuantitativa y cualitativa de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica 81 Tabla 10. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 2 cepas bacterianas aisladas N. tabacum, las 2 cepas aisladas de este cultivo presentaron valores muy bajos por lo cual no se seleccionaron para determinar cuantitativa y cualitativamente a PHAs, así como su caracterización química y bioquímica 82 Tabla 20.-Cepas bacterianas no seleccionadas debidoa su baja concentracin de PHAs, además de que su cinetica de crecimiento mostró que concentraciones relativamente mayores de PHAs fue hasta las 72 h por lo cual no es factible. 82 Fig. 14. a. Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa E. hormaechei, aislada de S.

officinarum utilizados para la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm, por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., 2004 Figura 14.b.Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa IIBUV-EMP 31 aislada de M.

paradisiaca ( no seleccionada), utilizados para la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS A 214 nm, por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., 2004 82

x

Abreviaturas

AMC

B. megaterium

C/N

CO2

C-3

C1

C13

Da

EDP

EDTA

Fig.

h

H2O

H2O2

H2S

ICI

KCN

kDa

Kg

Kg/km2

ml.

MSM

Mw

NADH

NAD+

NH4

nm

mM

Acetil-metilcarbinol

Bacillus megaterium

Relación carbono- nitrógeno

Dióxido de carbono

Tercer átomo de carbono

Metil

Tridecil

Daltons

Ruta metabólica de Entner- Doudoroff

Ácido-etilen-diamino-tetra-acético

Figura

Hora

Agua

Peróxido de hidrogeno

Ácido sulfurico

Industrias Química Imperial

Cianuro de Potasio

Kilodalton

Kilogramo

Kilogramo/kilometro cuadrado

mililitro

Medio de sales minerales

Peso molecular

Nicotinamida adenín dinucleótido reducida

Nicotinamida adenina dinucleótido oxidada

Amonio

Nanómetro

milimolar

xi

O2

pH

PhaC

PhaP

CoA

PHAs

PHAsSCL

PHAsMCL

Pha P

PhaC

Pha Z

PHB ó P (3HB)

PHV

PHB-V

P(HHX-co-HO)

PHO

R

R. eutropha

RM

rpm

spp.

TCA

(Tg)

TSA

TSI

TTC

UV

VP

Zn

µg

Oxígeno molecular

Potencial de hidrógeno

Sintasa

Fasinas

Coenzima A

Poli-β-hidroxialcanoatos

Polihidroxialcanoatos de cadena de longitud corta

Polihidroxialcanoatos de cadena de longitud media

Fasina

Sintasa

Depolimerasa

Poli- β-hidroxibutirato ó poli-3-hidroxibutirato

Polihidroxivalerato

Poli(hidroxibutirato-co-valerato)

Poli-β-hidroxihexanoato-co-octanoato

Poli-β-hidroxioctonoato

Radical

Ralstonia eutropha

Prueba de Rojo de Metilo

Revoluciones por minuto

Especie

Ciclo de los ácidos tricarboxilicos ó Ciclo de Krebs

Temperatura de transmisión vítrea

Agar de Soya y Tripticaseina

Agar Triple azúcar y hierro

2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio

Ultravioleta

Prueba de Vogues-Proskauer

Zinc

Microgramo

xii

µl

µm

°C

3HO

3HD

Microlitro

Micrometro

Grados centígrados

3-hydroxioctonoato

3-hidroxidecanoato

xiii

Resumen

Actualmente, varios estudios han demostrado la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) por

una variedad amplia de procariotas, así como también por varias plantas y animales. Sin

embargo, sólo los microorganismos acumulan PHAs de peso molecular alto; la capacidad de

acumular PHAs favorece su establecimiento y sobrevivencia bajo condiciones de estrés. Estos

polímeros son considerados como buenos candidatos para remplazar a los plásticos obtenidos a

partir de hidrocarburos.

Las investigaciones más recientes en esta área centran su atención hacia dos objetivos: la

optimización de los parámetros de cultivo de organismos productores de PHAs, y la selección de

linajes bacterianos con la capacidad de producir altas concentraciones de PHAs. En este trabajo a

partir de muestras de cultivos de Musa paradisiaca, Saccharum officinarum, Lycopersicum

esculentum, Citrullus lanatus y Nicotina tabacum se aisló un total de 70 cepas bacterianas, las

cuales fueron caracterizadas para la producción de PHAs mediante el método espectrofotométrico

reportado por Law y Slepecky (1961) y modificado por Martínez et al., (2004).

Concluida la primera etapa, se seleccionaron 20 cepas bacterianas que presentaron

concentraciones óptimas de PHAs, las cuales fueron caracterizadas por tinción de Gram y análisis

bioquímicos y se les realizo la prueba de Tinción Lipofílica con Sudán Negro. Los análisis

bioquímicos de las cepas bacterianas productoras de PHAs permitieron establecer que estos

aislados pertenecen a los géneros de Pseudomonas, Citrobacter, Enterobacter y Alcaligenes.

Además de la identificación de los aislados bacterianos, se determinó su cinética de crecimiento y

el análisis de las curvas de crecimiento permitió establecer que cepas producían PHAs en menor

tiempo. Al final de este estudio se concluyo que el 10% de las 70 cepas bactaerianas aisladas de

los cultivos presentan concentraciones elevadas de PHAs.

1

I.- I n t r o d u c c i ó n.

La basura generada por las actividades humanas hasta mediados del siglo XX consistía

principalmente de desechos biodegradables o reciclables (Frías et al., 2003). Los polímeros

sintéticos se han hecho significativos desde los 40’s, y desde entonces han ido substituyendo al

cristal, la madera y otros materiales de construcción, y aún a metales en muchos usos industriales,

domésticos y ambientales (Caín, 1992; Poirier et al., 1995). Al incorporarse el plástico a la vida

cotidiana e ir aumentando su utilización en diferentes áreas, una parte considerable de los

desechos producidos comenzó a acumularse en el ambiente, debido a la resistencia de estos

materiales a la corrosión, a la intemperie (Segura et al., 2007) y por el carácter recalcitrante a la

degradación de la mayoría de los polímeros sintéticos (Lasala et al., 2004a). Además, el

crecimiento exponencial de la población humana ha llevado a la acumulación de enormes

cantidades de material de desecho no degradables en nuestro planeta, y trayendo como

consecuencia que las condiciones de vida en la biosfera estén cambiando drásticamente (Arshad

et al., 2007; Zinn et al., 2001).

En el pasado inmediato, era importante descubrir materiales cada vez más durables para su uso

diario; entre estos están los plásticos debido a que por sus propiedades son utilizados en una gran

cantidad de aplicaciones, además de que su costo es bajo. Por lo anterior, el uso de los plásticos

sigue en aumento en todo el mundo (más de 100 millones de toneladas/año de plásticos

producidos). El aumento en su consumo no solo se debe a sus propiedades mecánicas y térmicas

favorables, sino principalmente a la estabilidad y durabilidad de los mismos (Rivard et al., 1995).

En consecuencia, el uso indiscriminado de estos materiales tiene como consecuencia que una

grande cantidad de residuos de plástico sean descartados al medio ambiente, aproximadamente el

20% del volumen total. Actualmente, en promedio el consumo de plásticos per capita en el

mundo es de 19kg, pero estos valores se modifican si se toman en cuenta determinadas regiones,

así en EUA es de 80kg, en Europa de 60 kg y en India de 2 kg (Franchetti y Marconato, 2006). A

causa de su persistencia en nuestro ambiente, los ecosistemas son ahora más sensibles al impacto

de plástico desechado sobre el ambiente, incluyendo efectos deletéreos sobre la fauna y sobre las

calidades estéticas de ciudades y bosques (Frías et al., 2003).

2

La degradación de los plásticos sintéticos es muy lenta, por ejemplo, la descomposición de

productos orgánicos tarda 3 ó 4 semanas, la de las telas de algodón 5 meses, mientras que la del

plástico puede tardar hasta 500 años o más dependiendo de su tipo. Además, en buena medida la

“degradación” de estos plásticos simplemente genera partículas más pequeñas que, a pesar de ya

no ser evidentes, se acumulan en los ecosistemas; al respecto, recientemente se han realizado

estudios sobre la presencia de “microplásticos” o fragmentos de plástico de tamaño inferior a 5

milímetros, y han demostrando que éstos se están acumulando de forma considerable en los

mares, en la arena de las playas y estuarios. Los más abundantes son los microfragmentos de

acrílico, polipropileno, polietileno, poliamida (nylon), poliéster, polimetacrilato, etc. (Frías et al.,

2003); la presencia de estos polímeros en los mares es variable, pero hay reportes de que su

abundancia va de 3 a 5 kg/km2 hasta 30 kg/km2, lo que sí es seguro es que esa cantidad aumenta

considerablemente cada año.

En el norte del océano Pacífico se ha determinado que la cantidad de microplásticos se ha

triplicado en la última década, y cerca de la costa de Japón la cantidad se multiplica por diez cada

2 o 3 años. Se calcula que cientos de miles de las muertes de mamíferos marinos al año se deben

a esta causa; también se determinó que 82 de 144 especies en aves estudiadas contenían

fragmentos de plástico en sus estómagos, y en algunas de estas especies hasta el 80% de los

individuos de una población los presentan (Frías et al., 2003). Además, se ha demostrado que los

plásticos acumulan compuestos químicos tóxicos como los bifenilos policlorados, el

diclorodifenil dicloroeteno y los nonifenoles, que no son muy solubles en agua y por lo tanto se

adhieren y acumulan en los plásticos. Así, los fragmentos de plástico funcionan como

transportadores de contaminantes a los mares y otros cuerpos de agua (Frías et al., 2003).

En la actualidad, y dado a que la acumulación de plásticos se ha incrementado de manera

alarmante en los últimos años, se están implementando medidas dirigidas a enfrentar esta

problemática. Una de las estrategias que se ha utilizando para deshacerse de los plásticos

derivados del petróleo es la incineración, pero la quema de estos materiales es altamente

contaminante y causa efectos negativos en el ambiente, tales como el incremento de CO2 en la

atmósfera y la liberación de compuestos químicos muy peligrosos, como las dioxinas, el cloruro

y el cianuro de hidrógeno. Otra estrategia es reciclar, en lo posible, la mayor variedad y cantidad

de plásticos, algunos de los principales inconvenientes de esta alternativa son que para su

3

reciclaje los plásticos deben ser manejados adecuadamente, no sólo en su recolección y

procesamiento, sino en la limpieza, selección y separación adecuada de los diferentes materiales a

reciclar, lo cual en la mayoría de los casos no sucede. Aunado a lo anterior, los artículos plásticos

no se pueden reciclar indefinidamente, sólo se pueden reciclar tantas veces como lo permitan las

condiciones físicas y químicas en las que queda el material después de su procesamiento. En

México se estima que del total de los plásticos que son desechados, únicamente se colecta el 12%

(Segura et al., 2007). En países como México y algunos otros de América Latina el reciclado de

plásticos aún se encuentra en su primera etapa, pero en países como Alemania, Japón y Estados

Unidos de América se han desarrollado programas de recolección de residuos que han tenido

éxito después de varios años (Frías et al; 2003).

De acuerdo con el Instituto Nacional de Recicladores, A.C. (INARE), uno de los mayores

problemas a los que se enfrenta nuestro país en materia ambiental, es el consumo de plástico;

(Frías et al; 2003). La contaminación ambiental por los plásticos sintéticos es un problema con

repercusión mundial muy grande, como una solución adecuada a estos problemas se plantea la

sustitución de estos materiales, que además de ser de naturaleza química se obtienen por procesos

industriales altamente contaminantes, por polímeros de tipo natural (Carballo et al., 2003).

Actualmente los polímeros naturales más utilizados son las mezclas de almidón, como los ácidos

polilácticos y los polihidroxialcanoatos (PHAs). El potencial que presentan los PHAs se debe a

que son poliésteres de origen natural, producidos por bacterias, y por lo tanto son biodegradables

(Lasala et al., 2004a); se caracterizan por ser compuestos biocompatibles, con propiedades físicas

similares a los termoplásticos sintéticos y a los elastómeros actualmente en uso, como el

polipropileno y el caucho sintético (Rojas et al., 2006). Los PHAs en una gran variedad de

especies bacterianas constituyen materiales de reserva no nitrogenados (Carballo et al., 2003).

La degradación de estos biopolímeros, en primera instancia se lleva a cabo por acción de

microorganismos tales como hongos, bacterias y algas, generando bióxido de carbono (CO2),

concentraciones no significativas de gas metano, diferentes componentes celulares y otros

productos, según lo establecido por la “American Standard for Testing and Methods” (ASTM-D-

833). De forma similar, estos materiales se degradan en CO2, H2Oy biomasa como resultado de la

acción de organismos vivos, como se acaba de mencionar, o de sus enzimas (Franchetti y

Marconato, 2006). La producción de polímeros no contaminantes al medio ambiente

4

(biopolímeros), se ha impulsado de forma significativa en ciertos países desarrollados mediante la

aprobación de leyes que obligan a que se reemplace cierta cantidad de materiales construidos a

partir de polietileno y poliestireno, por plásticos degradables (Lasala et al., 2004a).

5

II.- A n t e c e d e n t e s

2.1.- Organismos productores de polímeros biológicos.

Los procariotas han desarrollado numerosos mecanismos de resistencia bajo condiciones de

estrés. Por ejemplo, muchos microorganismos en su ciclo biológico tienen la capacidad inherente

de permanecer en etapas de “reposo” (cistos o esporas) que les permiten sobrevivir en ambientes

desfavorables para llevar a cabo su ciclo de vida, por lo general condiciones de falta de agua

(disecados) o la falta de algún nutriente. Otros como la espiroqueta Spirosymplokos deltaiberi

aumenta y forma cuerpos refráctales resistentes a la exposición al aire; alternativamente, otras

bacterias exhiben una versatilidad metabólica amplia que les permite hacer frente a fluctuaciones

químicas que se presentan en su ambiente.

Por otro lado, en algunos otros casos la acumulación de polímeros almacenados intracelularmente

es otra estrategia bacteriana que incrementa la supervivencia de muchos microorganismos en un

ambiente cambiante (Berlanga et al., 2006). Consecuentemente, la necesidad de algunos

organismos de adaptarse a fluctuaciones ambientales extremas da como resultado la producción y

utilización de componentes sintetizados y almacenados dentro de los mismos organismos; esto,

puede explicar la acumulación in situ de Poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) en muchos organismos

presentes en diferentes ambientes (Berlanga et al., 2006; Navarrete et al., 2000). Los PHAs en los

microorganismos sirven como una fuente endógena de carbono y energía durante etapas de

inanición-hambre (Berlanga et al., 2006). Varios estudios han demostrado la producción de

PHAs por una variedad amplia de procariotas, así como también por varias plantas y animales.

Sin embargo, solo los procariotas acumulan PHAs de peso molecular alto en gránulos

citoplasmáticos; además, las bacterias que producen PHAs tienen la ventaja de almacenar

nutrientes a un costo de mantenimiento relativamente bajo y con la seguridad de obtener el aporte

de energía cuando sea necesario (Berlanga et al., 2006). Rrecientemente, la explotación

comercial de estos poliésteres biodegradables se ha convertido en un área sumamente interesante

(Moreno et al., 2007; Page et al., 1992).

6

2.2.-Material de almacenaje

Los poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) representan una de las ocho clases de biopolímeros que son

producidos y acumulados en una gran variedad de bacterias y archae (Ewering et al., 2002); los

microorganismos que capaces de acumular PHAs, normalmente son bacterias de tipo Gram-

negativas y Gram-positivas que se encuentran en diferentes ecosistemas, como: agua de mar,

suelo, efluentes, etc. (Carminatti et al., 2006).

Estos biopolímeros son almacenados intracelularmente en gran cantidad por una gran variedad de

microorganismos sin afectar la presión osmótica de las células (Carminatti et al., 2006), ya sea

como material de reserva de energía y de carbono o como equivalentes de reducción (Aldor y

Keasling, 2003; Choi y Lee, 1999; Quagliano y Miyasaki, 1997; Moreno et al., 2007; Rojas et

al., 2006; Steinbüchel y Füchtenbusch, 1998). Los PHAs al ser depositados intracelularmente en

formas de cuerpos de inclusión, pueden llegar a representar más del 90% del peso seco celular

(De Almeida et al., 2004).

La síntesis de estos biopolímeros se induce cuando se presentan condiciones de crecimiento no

balanceado durante el ciclo de crecimiento de algunos organismos, las cuales son principalmente

ocasionadas por la ausencia de algún o algunos nutrientes en el medio, como por ejemplo

nitrógeno, fosforo o magnesio, y por un exceso en la fuente de carbono principal (Aldor y

Keasling, 2003; Choi y Lee ,1999; Quagliano y Miyasaki, 1997; Moreno et al., 2007; Rojas et

al., 2006; Steinbüchel y Füchtenbusch, 1998). La síntesis de estos compuestos, generalmente

involucra reacciones catalizadas por enzimas o reacciones de crecimiento de la cadena del

polímero a partir de monómeros activados que son formados dentro de las células por procesos

metabólicos complejos (Franchetti y Marconato, 2006).

Cuando la fuente de carbono externa se agota o si el nutriente limitante se suministra

nuevamente, el PHA es depolimerizado y posteriormente metabolizado como fuente de carbono y

energía (Park et al., 2001). La degradación de PHAs cumple un papel muy importante en la

supervivencia bacteriana y en los mecanismos de resistencia al estrés, en condiciones de baja

concentración de nutrientes, la utilización de dicho polímero se considera una estrategia

desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes cambiantes y

adversos (De Almeida et al., 2004).

7

2.3.- Estructura Química y Tipos de PHAs.

Los PHAs, primariamente, son moléculas lineales largas formadas por monómeros de un ácido

graso 3-hidroxilo unidos entre si por enlaces ésteres (Madison y Huisman, 1999). Así, los PHAs

son poliésteres de ácidos 3-hidroxi-alcanoicos formados por la policondensación del grupo

carboxilo de un primer monómero con el grupo hidroxilo ubicado en el carbono β de un segundo

monómero (Rojas et al., 2006). La mayoría de estos monómeros poseen el grupo hidroxilo en la

posición 3 (C3) ó carbono β, aunque en algunos PHAs este grupo sustituido fue encontrado en las

posiciones 4, 5 ó 6 (Carminatti et al., 2006).

El átomo de carbono del hidroxilo sustituido es de configuración R, excepto en algunos casos

especiales donde no hay quilaridad; Además, en este carbono está posicionado un grupo alquilo,

el cual puede variar desde un metil (C1) hasta un tridecil (C13) (figura 1) (Madison y Huisman,

1999). La cadena principal de los PHAs presenta centros quirales con un radical R, así si este

radical es un metilo (CH3-) se forma el polihiroxibutirato (PHB), si es un etilo (C2H5-) se trata del

polihidroxivalerato (PHV), etc. (Hermida y Díaz, 2004). La quilaridad del carbono β de la cadena

lineal de estos poliésteres permite que presenten actividad óptica y que se comporten de forma

isotáctica (Moreno et al., 2006).

Figura 1. Estructura química general de los PHAs, generalmente están compuestos de (R )-β-ácidos grasos hidroxi, donde el grupo R puede variar desde metil hasta un tridecil.

8

Basándose en el número de átomos de carbonos y las unidades monoméricas, los PHAs se

pueden dividir en dos grupos:

1. PHAs de cadena corta (HAsSCL – del inglés HydroxiAcids of Short-Chain-Lenght) que

contienen de tres a cinco átomos de carbono en su cadena principal.

2. PHAs de cadena media (HasMCL – del inglés HydroxiAcids of Medium-Chain-Lenght),

que comprenden de seis a dieciséis átomos de carbono en su cadena principal (Ojumu et

al., 2003).

A la fecha, se han identificado alrededor de 130 tipos diferentes de PHAs (Niamsiri et al., 2004;

Sheu et al., 2000). Los PHAs más conocidos son el PHB, PHV, y el polihidroxibutirato-

covalerato (PHB-V) (Franchetti y Marconato, 2006) y el poli-β-hidroxihexanoato-co-octanoato

(PHHX-co-HO) (Moreno et al., 2006), ver figura 2.

Figura 2. Polihidroxialcanoatos más conocidos (Segura et al., 2007).

2.4.- Propiedades fisicoquímicas y características de los PHAs

Debido a que los PHAs son polímeros alifáticos, dependiendo de la composición del polímero y

del tamaño de los grupos alquilos ramificados, muestran una gran variedad de propiedades desde

comportarse como materiales rígidos y quebradizos a plásticos con propiedades de impacto como

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elastómeros resistentes. Debido a las diversas propiedades que presentan, en años recientes los

PHAs han atraído la atención, no solo porque poseen propiedades similares a los plásticos

convencionales sino porque son completamente biodegradables (Tabla 1).

Tabla 1: Principales características de los polímeros polihidroxibutirato P(3HB), polihidroxioctanoato

(PHO) y el propileno (PP). (Carminatti et al., 2006).

Las propiedades físicas y mecánicas de estos materiales dependen de su composición

monómérica, peso molecular y la distribución del peso molecular del polímero, siendo las dos

últimas características las más importantes para su comercialización adecuada. El peso molecular

de estos polímeros, varía de 2x105 a 6x103 Dalton (Da), y en consecuencia sus características

físicas dependen de los microorganismos que los producen, de las condiciones de crecimiento, de

la posición del radical R o del grupo hidroxilo (n), así como del grado de polimerización.

Dentro de las propiedades termoplásticas destacan: el elevado punto de fusión, baja rigidez,

resistencia alta a la presión, además de propiedades como la temperatura de transición vítrea (Tg),

cristalinidad y tiempo de cristalización. Los polímeros de cadena de longitud media, PHAsMCL,

difieren de los de cadena de longitud corta, PHAsSCL, posen menor nivel de cristalinidad y son

más elásticos (Carminatti et al., 2006).

En la década de los 60’s se descubrieron las propiedades termoplásticas de estos materiales por lo

que el interés sobre el plástico biodegradable aumento, y así se produjo a nivel comercial P(3HB)

por la empresa W.R. Grace Co. Durante la época de los 70’s se presentó la primera crisis del

petróleo y la British Chemical Giant e Industrias Química Imperial (ICI) iniciaron la

10

investigación formal de las propiedades del polímero presente en las bacterias para poder

moldearlo (Katircioglu et al., 2003). A partir de 1974, se descubrieron otros hidroxialcanoatos y

en 1976 la empresa ICI inició el desarrollo de metodologías para la producción y aplicación de

P(3HB); esta misma empresa producía PHAs con el nombre comercial de Biopol®. En Alemania,

en 1990, fue lanzado al mercado un embase de “shampoo” fabricado a partir de plásticos

biodegradables; en 1991 en se iniciaron las investigaciones para producir P(3HB) a partir de

procesos fermentativos (Carminatti et al., 2006).

La gran mayoría de los microbios sintetizan PHAs-ssc conteniendo primariamente unidades de

3HB o PHAs-msc conteniendo 3-hydroxioctonoato (3HO) y 3-hidroxidecanoato (3HD) (Madison

y Huisman, 1999).

2.5.- Tipos de PHAs más importantes

En 1926 en el Instituto Pasteur, el microbiólogo Maurice Lemoigne obtuvo por vez primera a

partir de Bacillus megaterium un compuesto determinado como PHAs. Fue el primer polímero de

este tipo que se aisló y se le denominó ácido 3-hidroxibutirico (P[3HB]); en 1958, Macre y

Wilkinson estudiando Bacillus megaterium verificaron que este microorganismo almacena este

homopolimero, y concluyeron que el P(3HB) era una fuente de reserva de carbono y energía

(Katircioglu et al., 2003).

El poli-β-hidroxibutirato (PHB) es uno de los PHAs más abundantes, y es el que se ha estudiado

más extensamente (Berlanga et al., 2006; Cetin et al., 2006; Floccari et al., 1995). Es un poliéster

de almacenaje que se produce como cuerpo de inclusión insoluble en el citoplasma. Las

inclusiones de PHB aparecen como cuerpos transparentes y refringentes al observar y explorar

por medio de microscopia de transmisión electrónica secciones delgadas de bacterias conteniendo

PHB, ver figura 3 (Cetin et al., 2006). Reusch y Sadoff (1983) demostraron que el PHB es una

molécula importante en el citoplasma y la pared celular (Katircioglu et al., 2003); puede ser

sintetizado por muchas bacterias a partir de diferentes fuentes de carbono (Haywood et al., 1990).

11

Figura 3. Micrografías de transmisión electrónica de gránulos de PHB. A y B, producidos por R. esphaeroides (Cetin et al., 2006); C, gránulos producidos por W. eutropha (Tian et al., 2005).

El homopolímero P(3HB) posee unidades monómericas con una configuración D(-) debido a la

esteroespecificidad de las enzimas involucradas en su síntesis (Moreno et al., 2007); es un

polímero lineal y cristalino acumulado intracelularmente por muchas especies de

microorganismos en respuesta a un exceso de carbón y energía, y como un mecanismo de

almacenaje (Ramsay et al., 1988), por lo que tiene un papel fisiológicamente importante. Desde

el punto de vista aplicativo ha sido valorado como un termoplástico biodegradable natural (Page

et al., 1997). Dentro de la célula el P(3HB) existe en estado fluido y amorfo, pero después de

extraerlo de la célula con solventes orgánicos es altamente cristalino, en este estado es rígido por

lo cual es un material quebradizo.

Las propiedades físicas y químicas del PHB son similares a las del polipropileno, sin embargo,

otros PHAs pueden tener subunidades de β-hidroxiácidos de cadena larga, ordenados de C5 a C10.

La adición de un porcentaje pequeño de subunidades laterales de cadena larga dentro del PHB

causa un incremento en la flexibilidad de estos copolímero, marcando esta opción como un

substituto para la mayoría de los termoplásticos (Page et al., 1992).

Desafortunadamente, el proceamiento del homopolimero del PHB presenta dos inconvenientes: el

primero de ellos es que la fusión se lleva a cabo a temperaturas suficientemente altas que

A B C

12

provocan una disminución en su peso molecular volviéndolo frágil (Ramsay et al., 1988), lo cual

limita el procesamiento del homopolímero (Galindo, 2007). Sin embargo, el PHB es un

termoplástico que presenta muchas propiedades deseables, por ejemplo: se le pueden adicionar

facilmente fibras de vidrio para incrementar su potencia. Además tiene la ventaja de ser

ópticamente activo, por ejemplo contiene esteroisómeros idénticos como monómeros por lo que

tiene propiedades piezoeléctricas; también, inmunológicamente es compatible con el tejido

humano. Por otra parte, como el PHB es biodegradable es probable que permita que otros

polímeros que generalmente no son considerados como biodegradables, adquieran parcialmente

esta propiedad al ser mezclados con el PHB. Estudios realizados mostraron que algunas bacterias

en ambientes naturales, como sedimentos estuarinos, pueden acumular copolímero de ácidos poli-

3-hidroxialcanoatos, este tipo de polímeros tienen una fusión baja y son más flexibles que el

homopolimero PHB (Ramsay et al., 1988).

Otros tipos de PHAs, como los PHAs-msc, se diferencian del P(3HB) por su nivel de

cristalinidad bajo, y como además son más elásticos presentan un rango diferente de aplicaciones

(Galindo, 2007), ejemplos de este tipo de PHAs son: poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)

(PHBV), poliéster de origen bacteriano de creciente importancia por ser biodegradable y

biocompatible, y aunque puede sustituir a polímeros petroquímicos aún no es económicamente

competitivo (Hermida y Díaz, 2004). Otro PHAs importante es el poli-β-hidroxioctonoato (PHO),

el cual se caracteriza por tener una temperatura de transición vítrea de -35°C por lo cual es un

elastómero, amorfo y pegajoso a temperatura ambiente, lo cual si bien es cierto dificulta su

procesamiento permite que pueda ser usado como látex, además es muy estable debido a que

tiene una densidad muy cercana a la del agua. La temperatura de fusión reportada para los PHAs-

mcl está entre 39 y 61°C; el peso molecular depende de la fuente de carbono, el método de

recuperación y la cepa empleada (Moreno et al., 2006).

2.6.- Organismos productores de PHAs

La acumulación de estos polímeros se ha reportado que se lleva a cabo en una larga lista de

géneros (Quagliano y Miyasaki, 1997). Estos poliésteres son sintetizados por varios

microorganismos, tales como R. eutropha (Carminatti et al., 2006), Alcaligenes latus (Page et al.,

13

1997), bacterias del género Azotobacter (Lakshman y Ramachandriah, 2003), bacterias

Metilotróficos (Carminatti et al., 2006; Choi y Lee, 1999), Comamonas acidovorans y P. putida

(Franchetti y Marconato, 2006), y P. oleovorans (Haywood et al., 1990), entre otras.

Bacterias del género Pseudomonas pueden producir PHAs de cadena media o larga a partir de

substratos conteniendo alcanos o ácidos alcanoicos (Carminatti et al., 2006; Haywood et al.,

1990). Algunas especies de Pseudomonas spp. pueden incorporar tanto monómeros de PHAs-ssc

como PHAs-mss en la misma cadena polimérica, normalmente, estos PHAs se forman cuando

estas cepas son cultivadas con una fuente de carbono no relacionada, como lo son los

carbohidratos o 1,3-butaneidol; en este tipo de PHAs mezclados la acumulación de ellos es

individual, es decir, hay gránulos compuestos de P(3HB) y gránulos compuestos de otro tipo de

PHAs (Madison y Huisman,1999).

2.7.-Biosíntesis de Poli-β-hidroxialcanoatos

La producción de PHAs competitivamente económicos y con propiedades nuevas ha sido la

motivación para que muchos grupos de investigación estudien la síntesis, degradación y

homeostasis de PHAs en microorganismos (Tian et al., 2005). La regulación de la producción de

PHAs es considerablemente compleja, se lleva cabo en diferentes niveles fisiológicos a través de

la inhibición de cofactores de las enzimas y la disponibilidad de metabolitos, a nivel genético a

través de factores-σ alternativos, sistemas reguladores de dos componentes, y moléculas de

autoinducción (Fig. 4). Otro nivel de regulación relaciona el tamaño del gránulo y el control del

peso molecular por medio de las polimerasas de PHA y las fasinas (Madison y Huisman, 1999).

Figura 4. Proteínas requeridas para la homeostasis de PHA (Stubbe y Tian 2003).

14

La mayoría de los PHAs sintetizados vía microbiana están constituidos por monómeros

intermediarios de rutas bioquímicas establecidas, como el ciclo de biosíntesis o β-oxidación de

ácidos grasos, el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA) o a través de la biosíntesis de

aminoácidos polimerizados por una clase especial de enzimas llamadas polimerasas (Rojas et al.,

2006). Las vías de biosíntesis y degradación de PHAs incluyen las enzimas clave de estos

procesos, las PHA-sintasas (PhaCs síntesis de PHA), y PHA-depolimerasas (PhaZs degradación

de PHA). Ambos grupos de enzimas han sido estudiadas por muchos grupos de investigación por

cerca de tres décadas (Jendrossek et al., 2006), todos los microorganismos que sintetizan PHAs

contienen un sistema de depolimerasa intracelular que consiste de un dímero de una PHA-

depolimerasa y una hidrolasa (Stubbe y Tian, 2003).

La síntesis de PHAs requiere de la PHA-sintasa (PhaC), la cual usa β-hidroxiacil-CoA como

substrato para la polimerización; la producción de tales substratos puede ocurrir a través de varias

rutas metabólicas incluyendo: la simple que utiliza la enzima β-cetiolasa (codificada por phaA) y

acetoacetil-CoA reductasa (codificada por phaB), la β-oxidación, y una ruta de síntesis de ácidos

grasos de novo (Sheu et al., 2000).

En general, los mecanismos de iniciación, elongación y terminación de la cadena en la mayoría

de los sistemas, aún no son comprendidos adecuadamente, y quedan muchas preguntas por

contestar: ¿La función de las proteínas involucra la homeostasis del polímero?, ¿Cómo estos

modulan la fase de transición y el flujo del unión monomerica?, ¿Interceptan fuera del

metabolismo central bajo diferentes estados metabólicos? (Stubbe y Tian, 2003).

A partir del acetil-CoA obtenido del catabolismo de carbohidrato, diversas bacterias sintetizan el

homopolimero 3-hidroxibutirato (3HB) que incluye la acción de tres enzimas. Inicialmente, se

condensan dos moléculas de acetil-CoA por acción de la 3-cetotiolasa, generando acetoacetil-

CoA que sufre una reducción para formar 3-hidroxibutiril-CoA que se une a la cadena polimérica

en crecimiento (Floccari et al., 1995). La sintasa (PhaC) y fasina (PhaP) son proteínas que juegan

un papel importante en la producción de PHB y la formación del gránulo (Stubbe y Tian, 2003).

15

2.7.1.- Descripción de las enzimas que intervienen en la biosíntesis de PHAs

PHA-Sintasa. Las PHA-sintasas son enzimas cruciales en todos las vías para la síntesis de PHAs,

estas sintasas se pueden clasificar bajo diferentes criterios, como son secuencia de aminoácidos y

la especificidad por su substrato in vivo (Sheu et al., 2000). Los grupos principales son:

• Clase I/Clase II. Estas sintasas de poliésteres comprenden enzimas que constan de un sólo

tipo de subunidad (PhaC), con pesos moleculares (MW) entre 61 y 73 kDa (Qi y Rehm,

2001).

• Clase III. Grupo de poliéster-sintasas que comprende las enzimas que consta de dos

diferentes tipos de subunidades: la subunidad PhaC (Mw de alrededor de 40 kDa) que

muestran una similitud a nivel de secuencia del 21-28% con las enzimas clase I y II; y por

la subunidad PhaE (Mw de alrededor de 40 kDa) sin similitud con otras poliéster-sintasas.

• Clase IV. Estos sintasas son similares a las enzimas que pertenecen a la clase III, pero la

subunidad PhaE se sustituye por PhaR (Mw de aproximadamente 20 kDa) (McCool y

Cannon, 2001).

β-cetoacil-CoA tiolasa. La enzima β-cetoacil-CoA tiolasa cataliza el primer paso en la formación

de P(3HB); esta tiolasa biosintetica (acetil-CoA: acetil-CoA-acetil transferasa) es miembro de

una familia de enzimas que participan en la divison tiolitica de sustratos en acil-CoA más acetil-

CoA. Estas β-cetoacil-CoA tiolasas se encuentran representadas en toda la naturaleza, y están

presentes desde eucariotas superiores hasta levaduras y procariotas.

En base a su especificidad por el sustrato se dividen en dos grupos:

• El primero agrupa a las tiolasas con una amplia especificidad de β-cetoacil-CoA que van

desde cadenas de cuatro a dieciséis carbones (C4 a C16). Esta clase de enzimas están

involucradas principalmente en la degradación de los ácidos grasos y se encuentra en el

citoplasma de procariotas, en la mitocondria y en los peroxisomas de los mamíferos y las

células de plantas.

16

• El segundo grupo de β-cetoacil-CoA tiolasas se considera biosintético y tiene una

especificidad estrecha por la longitud de la cadena, de C3 a C5.

En la naturaleza, estos tiolasas biosintéticas están especializadas en diversas funciones, entre las

que se encuentran la formación de cetonas, esteroides, isoprenoides, síntesis y biosíntesis de

P(3HB). La tiolasa que participan en la formación de P(3HB) principalmente es una tiolasa

biosintetica con la especificidad de acetoacetil-CoA.

Acetoacetil-CoA reductasa. La acetoacetil-CoA reductasa es una (R)-3-hidroxiacil-CoA

deshidrogenasa que cataliza el segundo paso en la vía biosintetica de P(3HB) mediante la

conversión de acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA (Madison y Huisman, 1999)

PHA-polimerasa. En general, las polimerasas tienen masas moleculares de alrededor de 63,000

Da a excepción de las polimerasas de C. vinosum, T. violace y Synechococcus spp. que se

componen de dos subunidades con una masa molecular de 40 y 45 kDa (Madison y Huisman,

1999).

Fasinas. Las proteínas PhaP desempeñan su papel como proteínas estructurales, se encuentran

conectadas no-covalentemente al corazón de poliéster de gránulos por su dominio amino terminal

(N-terminal), además promueven la biosíntesis de PHAs y su número de copia tiene impacto

sobre el tamaño del gránulo de PHA. La simulación de la cinética del proceso de autoensamblaje

mostró que las fasinas tienen impacto con la cinética de formación de los gránulos reduciendo la

fase de retraso (Jurasek y Marchessault, 2004). PhaP es una proteína abundante asociada al

gránulo y puede tener también una función de protección para reducir la adherencia de proteínas

citoplasmáticas a la superficie del gránulo (Madison y Huisman, 1999).

Con el desarrollo de la genética de estas vías a partir de 1987, se amplió el conocimiento sobre el

metabolismo, la bioquímica y la fisiología de los PHAs. Se cree que cuando la primera bacteria

formadora de PHAs usó esta vía, el objetivo de la ruta probablemente era diferente a la de la

síntesis de un material de almacenaje, la formación de PHAs probablemente era una ruta

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metabólica menor en estos organismos, posiblemente como resultando de un sólo lado de la

reacción. Cuando la formación de PHAs se convirtió en benéfico para el microorganismo, la

evolución la seleccionó para mejorar las condiciones de supervivencia de los microorganismos

(Floccari et al., 1995). No todas las bacterias usan la misma ruta biológica para la biosíntesis de

PHAs, ya que sus tipos metabólicos indudablemente varían. Sin embargo, organismos como R.

eutropha y Z. ramigera, de manera generalizada utilizan tres pasos para la biosíntesis de PHAs

que incluyen las reacciones catalizadas por la tiolasa, reductasa y las polimerasas (Madison y

Huisman, 1999).

2.7.2.- Biosíntesis de PHAs-ssc

Aunque la acumulación de P(3HB) esta ampliamente distribuida entre los procariotas, las

investigaciones bioquímicas referentes a los mecanismos enzimáticos de la β-cetoacil-CoA

tiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y P(3HB) polimerasa se han centrado en sólo dos de los

productores naturales, Zoogloea ramigera (Mandon et al., 1998) y Ralstonia eutropha,

anteriormente conocida como Alcaligenes eutrophus (Peoples y Sinskey, 1989).

La ruta biosintética para PHB en Alcaligenes eutrophus (Fig. 5) es muy semejante a la síntesis de

PHB en otras bacterias (Mandon et al., 1998; Carminatti et al., 2006), el proceso inicia con la

condensación de dos moléculas acetil-CoA (Peters y Rehm, 2005). Sin embargo, en estas

bacterias el acetil-CoA se a dirigido hacia la síntesis de PHAs y no al TCA, este es un efecto de

las condiciones ambientales, especialmente cuando la limitación por oxígeno hace que la relación

NADH+/NAD+ aumente. El NADH+ inhibe las enzimas citrato sintasa e isocitrato

deshidrogenasa, logrando que el acetil-CoA no entre en TCA (Cabello, 2007) y entonces es

convertido a acetoacetil-CoA catalizado por la enzima β-cetotiolasa. Posteriormente, el

acetoacetil-CoA se reduce a (R)-3-hidroxibutiril-CoA por medio de la actividad de la acetoacetil-

CoA reductasa NADPH-dependiente, estas enzimas han sido encontradas y estudiadas en varias

bacterias acumuladoras de PHB (Peters y Rehm, 2005). Finalmente, la PHB-sintasa, codificada

por el gen phbC polimeriza los residuos de β-hidroxibutiril a una molécula poliéster.

La molécula PHB puede ser depolimerizada y convertida de vuelta a la vía del acetil-CoA por

acción de una PHB-depolimerasa y una β-hidroxibutirato dehidrogenasa NAD-dependiente. La

18

regulación de la síntesis de PHB y la degradación esta controlada a nivel de β-cetotiolasa y de β-

hidroxibutirato dehidrogenasa, permitiendo una modulación rápida del nivel de poder reductor en

la célula. La adecuada sincronización del poder reductor puede prevenir la inhibición de varias

enzimas de TCA (Mandon et al., 1998; Carminatti et al., 2006, Peters y Rehm, 2005).

Figura 5. Biosíntesis y degradación de PHB. En condiciones de exceso de energía el NADH inhibe la despolimerización de PHB y el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA). La disminución de la concentración de CoA-SH aumenta la inhibición de la acetil-Co-aciltransferasa que cataliza la condensación del acetil-CoA en acetoacetil-CoA y la síntesis de PHB. En deficiencia de energía, el control actúa en el otro sentido. Los signos (+) y (-) corresponden a regulación positiva o negativa (Cabello, 2007).

19

2.7.3.- Biosíntesis de PHAs-msc

PHAs-msc no fueron descubiertos hasta 1983, cuando Witholt et al. encontraron que creciendo a

P. oleovorans en octano al 50% se formaba un material flexible. La composición de estos PHAs

y su relación directa con la estructura del sustrato de crecimiento sugiere que la ruta de

biosíntesis de PHA-msc es una rama directa de la ruta de oxidación los ácidos grasos. En esta

ruta los ácidos grasos son degradados para remover unidades de C2 que forman el acetil-CoA

(Madison y Huisman, 1999).

2.7.4.-Formación de PHAs-msc por Pseudomonas a partir de ácidos grasos

Se han probado sustratos baratos para la producción de PHAs por especies de Pseudomonas, un

ejemplo de lo anterior es el sebo, una grasa barata con potencial de sobrecapacidad de producción

ya que es una mezcla de triglicéridos con ácidos oleico, esteárico, y palmítico como componentes

principales de ácidos grasos, el sebo representa un sustrato interesante para la producción de

PHAs. En este sentido, algunas de las cepas caracterizadas como Pseudomonas convierten el

sebo hidrolizado a PHAs en niveles entre 15 y 20% de su peso seco; estos organismos no

secretan una enzima lipasa para facilitar la hidrólisis del sebo, sin embargo P. resinovorans

proporciona tanto actividad de lipasa como de PHA-sintasa (Madison y Huisman, 1999).

2.7.5.- PHAs-msc formados a partir de carbohidratos

Inicialmente, fue sorprendente observar que cepas de P. putida fueron capaces de acumular PHAs

a partir de glucosa y otros azúcares siendo esta especie la primera productora de PHA-msc, a

diferencia de P. oleovorans que es incapaz de sintetizar este tipo de PHAs debido quizá a que la

ruta de PHA-msc podría estar basada exclusivamente en la ruta metabólica de los ácidos grasos.

Varios estudios mostraron que cepas de P. putida y P. aeuroginosa son capaces de convertir

acetil-CoA a monómeros de cadena de longitud media para la síntesis de PHAs; de hecho, ahora

la regla es que, P. oleovorans es la excepción entre Pseudomonas por su incapacidad para

sintetizar PHAs a partir de azúcares.

20

Los PHAs formados a partir de gluconato o azúcares relacionados tienen una composición

diferente a los PHAs formados a partir de ácidos grasos, es decir el 3-hidroxioctanoato es el

componente principal de los PHAs formados a partir de ácidos grasos, mientras que a partir de

azúcares se acumulan PHAs en los cuales el 3-hidroxidecanoato es el monómero principal y

pequeñas cantidades de monómero insaturado están presentes.

Cuando P. fluorescentes es cultivada en azúcares, el PHA formado consiste principalmente de

monómeros de C10 y C8. Algunas pruebas sugieren que estos monómeros son derivados de los

intermediarios de la biosíntesis de los ácidos grasos, y que la composición de PHAs es

probablemente una reflexión del fondo de los intermediarios biosintéticos de la ruta de los ácidos

grasos. Además, la corroboración de la participación de la biosíntesis de ácidos grasos en la

formación de PHAs por glucosa y la β-oxidación desde los ácidos grasos se obtuvo mediante

experimentos de inhibición.

P. putida es capaz de sintetizar PHAs ya sea a partir de glucosa o de ácidos grasos cuando están

presentes como fuentes de carbono en exceso. Sin embargo, cuando la cerulina (un ácido graso

inhibidor de síntesis) es añadido a esas suspensiones de células los PHAs no se forman a partir de

la glucosa, lo que sugiere que los PHAs se siguen sintetizando a partir de ácidos grasos. Del

mismo modo el ácido acrílico, bloqueador de la β-oxidación, impide la formación de PHAs desde

octanoato pero no a partir de la glucosa. Estos experimentos confirmaron que la formación de

PHAs a partir de la glucosa está ligada a la biosíntesis de los ácidos grasos, y puesto que la

biosíntesis de ácidos grasos procede de la vía (R)-3-hidroxiacil-ACP se requiere una actividad

enzimática nueva para convertir este intermediario a (R)-3-hidroxiacil-CoA; recientemente,

Rehm et al. (1998) determinaron que el producto génico de phaG es el responsable de esta

conversión (Fig. 6) (Madison y Huisman, 1999).

21

Fig. 6. Ruta biosintetica para PHA-msc a partir de hidratos de carbono. Esta vía está ligada a la biosíntesis de los ácidos grasos, puesto que la biosíntesis de éstos procede de la vía (R)-3-hidroxiacil-ACP. El (R)-3-hydroxyacyl-ACP es convertido a (R)-3-hidroxiacil-CoA por una acil-ACP:CoA transacilasa codificado por el gene phaG (Madison y Huisman, 1999).

2.8.- Características de los gránulos

Debido a que los PHAs son de naturaleza lipídica, estos bioplásticos se acumulan como

materiales de almacenamiento en forma de gránulos líquidos amorfos y móviles. El número y

tamaño de los gránulos, la composición del monómero, la estructura macromolecular y las

propiedades físico-químicas varían dependiendo de la especie del organismo productor (Arshad

et al., 2007).

Según Byrom (1994), se han observado aproximadamente de 8 a 13 gránulos por célula de

Alcaligenes latus, los cuales presentan un diámetro de 0.2 a 0.5µm (Jendrossek et al., 2006;

Ojumu et al., 2003). Hay muchos métodos de detección fenotípica para los gránulos

22

intracelulares de PHA los cuales son aplicados para identificar los PHAs producidos, incluyen la

tinción de Sudán Negro y tinción con Azul Nilo A (Ojumu et al., 2003; Sheu et al., 2000).

Los gránulos de PHAs están rodeados por una membrana de fosfolipidos con una serie de

proteínas integradas (Berlanga et al., 2006; Pötter y Steinbüchel, 2005) o están unidos a una

poliéster-sintasa, Pha-depolimerasa intracelular, fasinas, proteínas anfipáticas, proteínas PHA-

reguladoras especificas y proteínas adicionales con función desconocida. Además requieren

depolimerasas intracelulares para la movilización del poliéster de reserva y están conectados a la

superficie del gránulo; el dominio carboxilo terminal (C-terminal) une estas proteínas al corazón

de poliéster por interacción hidrófoba (Jurasek y Marchessault, 2004).

2.8.1.- Modelos para la formación del gránulo PHAs

Existen varias proteínas involucrada en la regulación de la biosíntesis del polímero y en la

formación de los gránulos intracitoplasmáticos, una de ellas son las fasinas que se encuentran

asociados a los gránulos de PHA; estas proteínas podrían afectar el tamaño y la pureza de los

gránulos, ya que son importantes para la forma que el gránulo adquiere intracelularmente e

impide que otras proteínas pueden asociarse a el inespecíficamente, lo cual simplifica la

purificación del polímero (De Almeida et al., 2004).

Gerngross y Martin (1995) demostraron por primera vez la síntesis in vitro de PHAs (Hezayen et

al., 2002; Madison y Huisman, 1999) y el autoensamblaje de los gránulos utilizando únicamente

poliéster sintasa purificada y su substrato. Este estudio definió que la poliéster sintasa posee todas

las características requeridas para la auto-reorganización en partículas esféricas (Hezayen et al.,

2002).

2.8.2.- Formación in vivo de partículas de poliésteres

La biosíntesis de PHA in vivo empieza cuando el sustrato, tioesteres de (R)-3-hidroxiacil-CoA,

está disponible intracelularmente y la poliéster sintasa se está expresando de forma constitutiva

aún a niveles bajos, por lo que la disponibilidad del sustrato favorece que esta enzima comience a

catalizar la polimerización de poliésteres de alto de peso molecular (n> 1000). Por otro lado, el

23

crecimiento de la cadena del poliéster, cuyos residuos están covalentemente ligados a la enzimas

(Hezayen et al., 2002), se da cuando la enzima inicialmente soluble se convierte en una molécula

anfipática.

Actualmente se han descrito dos modelos de formación de gránulos de PHA: el modelo micela y

el modelo en ciernes “budding”. Ambos modelos consideran la posición definida de la poliéster

sintasa, y en cierta medida la proteína fasina, sobre la superficie del gránulo. El modelo de micela

es apoyado por la formación de gránulos de PHA in vitro y en ausencia de membranas (Fig. 7).

En primer lugar, un aumento de la concentración de 3-hidroxibutiril-CoA en el citoplasma

promueve la interacción con la P(3HB)-polimerasa, teniendo como resultando el cebado de la

enzima por un mecanismo desconocido.

Durante una primera fase, los oligomeros de HB son formados lentamente y extruidos por la

enzima. A continuación estos oligomeros forman micelas con otros oligómeros incrementando la

longitud e hidrofobicidad, en consecuencia, la enzima rápidamente procede con la síntesis de

P(3HB), una mayor extrusión del P(3HB) incrementando el tamaño del gránulo. Finalmente, se

cree que las micelas se unen en grandes gránulos y estos pueden ser visualizados por medio de

microscopía (Tian et al., 2005). Cuando la activación de la PHA-polimerasa se reduce en el

proceso de cebado, se combina con una polimerización rápida y la actividad enzimática que

forman las estructuras de micelas, con lo cual se asegura la formación de materiales "de alto peso

molecular” (Madison y Huisman, 1999). Los PHAs se consideran como macromoléculas

osmóticamente inertes cuya relevancia depende su peso molecular alto (Stubbe, 2003; Tian et al.,

2005).

24

Figura 7. Modelo de Micela para la formación de gránulos de PHB, las esferas coloreadas mostradas sobre PHB amorfo representan las proteínas que estan asociadas a la superficie del gránulo. Esferas grises PhaC; esferas azules PhaP; esferas rojas PhaR; esferas verdes, PhaZ1a; esfera púrpura, PhaZ1b; esfera de naranja, PhaZ1c (Tian et al., 2005).

El modelo budding o “ciernes” fue propuesto recientemente, los primeros estudios de

microscopia electrónica mostraron la presencia de un material parecido a una membrana rodeado

a los gránulos de PHAs en células intactas o gránulos aislados (Fig. 8). Estas observaciones son

las que se pruebas que sustentan el modelo en ciernes ó “Budding”, en el cual se postula que la

sintasa hidrofóbica está ligada a la cara interior de la membrana plasmática, provocando se

desarrolle una membrana que cubre la superficie del gránulo, está cubierta de una capa lipídica;

en este modelo, la biología del sistema y las propiedades físicas del polímero son requeridas para

la formación del gránulo (Stubbe, 2003; Tian et al., 2005). En general, estudios in vivo apoyan el

modelo en ciernes localizando la formación del gránulo cerca de la membrana citoplasmática de

la célula (Gerngross et al., 1993).

25

Fig. 8. Modelo “Budding”, donde se puede observar la formación del gránulo (Tian et al., 2005)

En los dos modelos que se han propuesto para explicar la formación de los gránulos de PHAs, la

poliéster sintasa es convertida en una molécula anfipática durante la síntesis de la cadena del

poliéster, y el proceso de autoensamblaje ocurre en la membrana o en el citosol, de tal forma que

pequeñas inclusiones insolubles en agua y esféricas forman el núcleo del poliéster amorfo con la

poliéster sintasa conectada covalentemente a la superficie (Gerngross et al., 1993).

Varios reguladores PHA-especificos como PhbR de C. necátor, PhaF de Pseudomonas y PhaR de

Paracoccus denitrificans fueron encontrados unidos de forma no-covalente a los gránulos de

PHA. Además, se han localizado proteínas adicionales asociadas a los gránulos en Pseudomonas,

cuya función aún no es clara, pese a que la expresión de sus genes es co-regulada con otros genes

de la biosíntesis de PHA, estas proteínas (PhaI, PhaD, PhaS) son consideradas como proteínas

estructurales también implicadas en la biosíntesis y la movilización, aunque no son esenciales

para la formación del gránulo PHA, la regulación de genes para la biosíntesis y la movilización

de PHA. Sin embargo, sólo las poliéster sintasas conectadas covalentemente son integradas o

asociadas con una monocapa de fosofolípidos que rodea el corazón del gránulo de PHA según un

modelo, mientras que el otro modelo perfila una estructura mucho más compleja con dos

membranas formadas de fosfolípidos (Rehm, 2003).

26

2.9.- Degradación de los PHAs

Puesto que el origen de los PHAs es biológico, estos son completamente degradables (Niamsiri et

al., 2004; Sudesh et al., 2000). En la naturaleza un consorcio amplio de microorganismos son

capaces de degradar los PHAs hasta CO2, H2O y humus en condiciones aeróbicas (Carminatti et

al., 2006; De Almeida et al., 2004; Madison y Huisman, 1999), en condiciones anaerobias

también se produce metano (Carminatti et al., 2006; Madison y Huisman, 1999; Moreno et al.,

2007) mediante la acción de PHA-depolimerasas y PHA-hidrolasas extracelulares (Carminatti et

al., 2006; De Almeida et al., 2004; Madison y Huisman, 1999). Las actividades de estas enzimas

pueden variar y dependen de la composición del polímero, su forma física (amorfa o cristalina),

las dimensiones de la muestra son importantes y las condiciones ambientales (Fig. 9) (Carminatti

et al., 2006; Madison y Huisman, 1999; Moreno et al., 2007).

Figura 9. Degradación de P(3HB-3HV) en aguas residuales bajo condiciones aeróbicas. Las botellas hechas de P(3HB-3HV) fueron incubadas durante el verano (temperatura promedio de 20°C). El progreso de degradación es demostrado con las botellas que han sido sujetas a este tratamiento para 0, 2, 4, 6, 8, y 10 semanas (de izquierda a derecha) (Madison y Hiusman, 1999).

Las velocidades de biodegradación dependen de una serie de factores, incluyendo área

superficial, actividad microbiana, ambiente propicio, pH, temperatura, nivel de la mezcla y

presencia de otros nutrientes (Tabla 2). La degradación de estos materiales suministra a los

microorganismos degradadores precursores de componentes celulares y de energía (Carminatti et

al., 2006), además de que la producción de PHAs se basa en la utilización de recursos renovables

27

(Carminatti et al., 2006; De Almeida et al., 2004). Lo anterior contraste con los residuos

termoplásticos sintéticos que se acumulan en grandes cantidades en el ambiente y su degradación

es lenta; adicionalmente, estos plásticos derivados de los hidrocarburos utilizan las escasas

reservas petroquímicas del planeta (De Almeida et al., 2004).

2.10.- Biodegradibilidad

Aparte de las propiedades poliméricas típicas, una característica importante de los PHAs es su

Biodegradibilidad (Madison y Huisman, 1999), por lo que han sido extensamente estudiados por

la academia y la industria (Sheu et al., 2000). Los polihidroxialcanoatos se consideran buenos

sustitutos de los plásticos derivados del petróleo por ser completamente biodegradables después

de desecharlos una vez de haber sido utilizados (Cho et al., 1997; Park et al., 2001). Los tiempos

de permanencia de los PHAs en diferentes ambientes naturales se resumen en la tabla 2.

Tabla. 2. Tiempo que tardan los PHAs en degradarse en diferentes ambientes (Luzier, 1992).

2.11.- Sobrevivencia de bacterias productoras de PHAs

Trabajos relacionados en el laboratorio con cepas silvestres y cepas deficientes (mutantes) en la

síntesis de PHB de R. eutropha y B. megaterium, demostraron que las que eran capaces de

sintetizar el polímero de reserva tenían mayor sobrevivencia en agua de río y mayor capacidad de

competencia con las bacterias autóctonas, que sus correspondientes mutantes. Estos experimentos

sugirieron que la síntesis y la utilización del polímero aumentaban la sobrevivencia y la

28

capacidad de competencia bacteriana en ambientes cambiantes naturales. Los PHAs juegan un

papel importante en la supervivencia bacteriana ante condiciones de estrés. Sin embargo, aunque

ya se ha establecido que estos polímeros se utilizan como fuente de carbono cuando los

microorganismos que los producen se enfrentan a condiciones de inanición, se conoce poco

acerca de los mecanismos mediante los cuales la utilización de PHAs favorece la supervivencia

bacteriana en condiciones desfavorables.

En un trabajo realizado con R. eutropha en 1967, se sugirió que existía una asociación entre la

utilización de los PHAs y la fosforilización oxidativa (De Almeida et al., 2004). Se sabe que ante

condiciones adversas, las bacterias son capaces de responder con diversos mecanismos de control

activos que les permiten hacer frente a dichas condiciones, uno de estos mecanismos es la

respuesta general a estrés que se induce en bacterias Gram-negativas ante condiciones de estrés

ambiental, tales como las provocadas por escasez de nutrientes, estrés osmótico, estrés oxidativo

y cambios bruscos de temperatura.

Dado que los PHAs son un reservorio de carbono, energía y equivalentes de reducción, tanto su

síntesis como su degradación tienen un efecto importante sobre el metabolismo central de la

célula procariota (De Almeida et al., 2004), ya que evolutivamente la bacteria no desarrolló la

capacidad de producir PHAs como medio para la síntesis de plásticos útiles a la humanidad, la

producción y acumulación de PHAs por la bacteria debe haberse desarrollado de un fenotipo

ventajoso relacionado con la deposición de estos materiales, y además como material de

almacenaje de carbono y equivalentes de reducción (Madison y Huisman, 1999).

2.12.- Aplicación de los Poli-β-hidroxialcanoatos

En general estos biomateriales se caracterizan por ser biocompatibles y biodegradables; estas

propiedades les confieren un potencial industrial grande para ser utilizados como sustitutos de los

plásticos sintéticos, además de utilizarse en un espectro amplio de aplicaciones biotecnológicas

(Niamsiri et al., 2004; Rojas et al., 2006, Sheu et al., 2000). La producción actual de PHAs vía

fermentación microbiana todavía no puede competir con los métodos utilizados para la

producción comercial de plásticos, por lo que lograr el aprovechamiento de los PHAs en esta y

otras aplicaciones es de importancia crucial.

29

La gama tan amplia de propiedades físicas de la familia de los polímeros biológicos,

específicamente PHAs, aunado a la posibilidad de obtener buenos rendimientos por la

composición y mezcla, proporcionan una gama mur extensa de posibles aplicaciones finales, tal

como se describe en numerosas patentes. Los esfuerzos iníciales se centraron en las aplicaciones

de moldeo, particularmente para los consumidores de envases tales como botellas, envases

cosméticos, plumas, etc. (Fig. 10).

Figura 10. Productos elaborados utilizando polihidroxialcanoatos como materia prima (Segura et al., 2007).

Una de las áreas de aplicación de PHAs es su monómero quiral como intermediario para la

síntesis de algunos productos farmacéuticos y pesticidas. Sin embargo el proceso de producción

es complicado y la eficiencia baja, por estos motivos se buscan otras alternativas más atractivas

(Madison y Huisman, 1999).

Como ya se mencionó líneas arriba, el monómero P(3HB) se ha encontrado en gran variedad de

plantas y tejidos de origen animal, así como en el plasma humano y también se ha encontrado

asociado con lipoproteínas de baja densidad pero no con lipoproteínas de alta densidad.

Adicionalmente, una parte significativa de P(3HB) se ha encontrado asociada con la albúmina del

suero; se piensa que dichas moléculas de lípido y albumina que actúan como transportadores de

P(3HB) en la sangre, específicamente con la albumina que es el portador principal (Madison y

Huisman, 1999). Según Sotavento (1996) el producto de degradación del PHB es el D(-)-3-

hidroxibutirato, el cual se ha encontrado en cantidades relativamente grandes en el plasma de la

sangre humana, por lo tanto, es sumamente plausible que la implantación de PHB en tejidos de

mamíferos no sería tóxico (Ojumu et al., 2003). Otras aplicaciones médicas son utilizarlo para la

30

liberación controlada de medicamentos (Carminatti et al., 2006), aunque la gama de aplicaciones

industriales para utilizarlo en el empaquetamiento de fármacos es muy baja (Quagliano y

Miyasaki, 1997). Estos materiales se han utilizado en implantes re-absorbidos y en la ingeniería

de tejidos; el uso de PHAs en el área biomédica es común en suturas quirúrgicas como

monómeros que se degradan en el cuerpo humano formando productos que son reabsorbidos por

los organismos.

Además, en la agricultura los PHAs pueden ser utilizados como productos de liberación de

reguladores de crecimiento de plantas ó pesticidas; los PHAs también puede utilizarse para

sustituir polímeros petroquímicos en el tóner ó como conductores de iones de polímeros; también

pueden ser utilizados como un látex, por ejemplo, para el revestimiento de aplicaciones de papel

o puede ser utilizado para producir sustitutos lácteos o agentes de sabor en los alimentos.

Además de la amplia gama de propiedades de estos materiales y las consiguientes aplicaciones,

los PHAs prometen ser una nueva fuente de moléculas pequeñas que pueden ser hidrolizados

químicamente y los monómeros se pueden convertir en productos comercialmente atractivos,

tales como moléculas de β-hidroxiácidos, ácido 2-alkenoico, β-hidroxialcanoles, β-acilactonas, β-

aminoácidos, ésteres y β-hidroxiácido; la última clase de productos químicos está recibiendo

mucha atención por sus posibles aplicaciones como disolventes biodegradables (Madison y

Huisman, 1999).

2.13.- Substratos y costos

Debido a los problemas ambientales que ha ocasionado la acumulación de plásticos no

biodegradables, los PHAs como polímeros biodegradables han cobrado mucha importancia. Sin

embargo, presentan una gran desventaja en cuanto a su comercialización, lo que deriva en su

costo de producción muy elevado comparado con materiales plásticos sintéticos de origen

petroquímico (Wang y Lee, 1997; Choi y Lee, 1999) como el polipropileno, polietileno (Chen y

Page, 1997) u otros polímeros biodegradables como el ácido poliláctico (Wang y Lee, 1997).

Últimamente, el interés por estos polímeros ha aumentado en todo el mundo, a pesar de su alto

costo en relación a los polímeros convencionales, basta comparar el costo de producción de PHB

estimando en US $2.65/kg para una planta de 100.000 ton/año utilizando sacarosa como substrato

31

y el valor del propileno US $ 1.00/kg (Franchetti y Marconato, 2006). Sin embargo, el precio alto

de los PHAs comparado con el plástico obtenido a base de petróleo es justificado por sus grandes

ventajas (Arshad et al., 2007); además, los PHAs se pueden procesar con el mismo equipamiento

que se emplea para los termoplásticos sintéticos de uso convencional (Hermida y Díaz, 2004). La

producción comercial de Bioplásticos PHAs ha sido conducida por Zeneca BioProductos en

Billingham, Reino Unido (Chen y Page, 1997).

En los últimos años gran parte de las investigaciones realizadas sobre los PHAs se han

concentrado en reducir los costos de producción y aumentar la productividad utilizando diversas

estrategias, entre ellas se encuentra el rastreo de nuevas cepas productoras (De Almeida et al.,

2004). Para esto, es importante la selección de microorganismos que permitan la producción

industrial de PHAs y además cumplan con otras consideraciones importantes como: competencia

celular, habilidad para usar fuentes de carbono de precio bajo, velocidad de crecimiento,

habilidad para la síntesis del polímero y el porcentaje de acumulación del polímero (Khanna y

Srivastava, 2005; Moreno et al., 2005).

Nuevas cepas que puedan usar substratos económicos y con alto porcentaje de acumulación

deben ser aisladas para resolver estos problemas. En este punto, el interés se ha centrado en

bacterias Gram-negativas presente en muestras de suelo donde es cultivada la caña de azúcar

debido a la riqueza microbiana presente, y a la presión selectiva causada por el desbalance de la

proporción carbono/nitrógeno generada por la descomposición de residuos en el suelo,

principalmente por un exceso de carbono y una limitación de nitrógeno (De Lima et al., 1999;

Moreno et al., 2007).

Se ha demostrado que uno de los principales factores que afectan e impactan el costo final de los

PHAs son los costos del substrato, principalmente la fuente de carbono (Moreno et al., 2007;

Khana y Srivastava, 2005; Arshad et al., 2007). Varios estudios han demostrado que los residuos

de la agricultura y comida pueden ser utilizados como substratos para reducir costos (Niamsiri et

al., 2004). Se pueden utilizar los carbohidratos, sobretodo los provenientes de fuentes naturales

renovables como glucosa, sacarosa o bien desechos de la industria alimenticia como mosto de

uva u olivo, melaza de caña de azúcar, etc. (Chen y Page, 1997).

32

Actualmente, en un esfuerzo para reducir el costo de P(3HB) el interés industrial ha iniciado

programas para desarrollar sistemas de producción de este polímero en plantas de cosecha, por lo

que las perspectivas de producir P (3HB) son alentadoras, ahora que varios estudios han descrito

la síntesis de PHAs en la levaduras, células de insecto y varias especies de plantas. Aunque la

síntesis de P(3HB) se ha alcanzado en plantas, los resultados obtenidos hasta ahora, claramente

indican que es un camino largo en contraste con la utilización de microorganismos como las

bacterias, debido aque el metabolismo en las plantas es categorizado y esto complica las tareas

extras (Madison y Huisman, 1999).

En conclusión, la reducción de los costos de producción de los poli-β-hidroxialcanoatos, depende

de la obtención de linajes altamente eficientes, la conversión del substrato al producto deseado, la

utilización de substrato de bajo costo, y el desarrollo de procesos de extracción-purificación para

la obtención y recuperación del producto (Carminatti et al., 2006).

33

III.- JUSTIFICACIÓN

Actualmente en el mundo y específicamente en nuestro país, existe un problema relevante,

relacionado con la contaminación presente en agua, aire y suelo, mismo que se agrava puesto que

la basura contiene gran cantidad de materia orgánica e inorgánica que generalmente se mezcla

durante el proceso de recolección, lo que dificulta el manejo final. La contaminación ambiental se

debe principalmente a las enormes cantidades de plástico que se generan diariamente y que

reciben un tratamiento inadecuado.

En México, la cifra anual para consumo de artículos de plásticos terminados es de 4,809 miles de

ton (ANIPAC, 2006), estas cifras se reportaron en el 2006 y se presume que han aumentado en

los dos últimos años, lo que sugiere un incremento importante en la acumulación de este material

dando lugar a problemas ambientales serios. Por lo tanto, muchas de las ventajas de estos

polímeros como la facilidad de que pueden ser trabajados o moldeados, su impermeabilidad, su

baja densidad y conductividad eléctrica, así como la resistencia a la corrosión, intemperie y a

diversos factores químicos y biológicos, se convierten en una gran desventaja en el momento en

que se desechan, reflejándose como un problema de magnitud considerable al contaminar el

medio ambiente.

Lo anterior a despertado el interés de quienes laboran en la investigación, dando origen a la

búsqueda de alternativas que lleven al desarrollo de un producto con características similares a

las que presenta el plástico pero que no impacte negativamente al ambiente; es decir, que sea

preferentemente biodegradable y que su producción sea de recursos renovables y no a través de

un recurso finito, como los hidrocarburos que sirven de materia prima para la producción de

plásticos sintéticos.

La producción y obtención de un “plástico natural” al precio y costo adecuados, recae en la

familia de los polihidroxialcanoatos (PHAs), poliésteres que por sus características parecen ser el

sustituto perfecto para el plástico. Sin embargo, su utilización no se ha dado ampliamente debido

a lo difícil del aislamiento de las cepas bacterianas que los sintetizan y a los altos costos de

producción, ya que las bacterias para generar algún tipo de polihidroxialcanoatos necesitan de

una fuente de carbono y esta es costosa, por lo cual en este trabajo se pretende obtener, aislar y

caracterizar cepas bacterianas prometedoras en la producción de PHAs.

34

Lo anterior, nos lleva a reflexionar que una vez que sean superados los obstáculos que se

presentan en el campo de la investigación con respecto a la producción de PHAs, en cuanto a su

producción en masa y abatimiento de costos, la utilización de los plásticos actuales se verán

reducidos con lo cual podremos observar efectos positivos en el medio ambiente, puesto que los

desechos de los PHAs podrán ser degradados y absorbidos sin afectar nuestros ecosistemas.

35

IV.- OBJETIVOS

4.1.- Objetivo General

Obtener, aislar y seleccionar cepas bacterianas autóctonas capaces de producir poli-β-

hidroxialcanoatos (PHAs).

4.2.- Objetivos particulares

a. Obtener y aislar cepas bacterianas a partir de muestras obtenidas de cultivos de

Saccharum officinarum, Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus, Nicotina

tacabum L. y Musa paradisiaca.

b. Seleccionar cepas bacterianas capaces de producir poli-β-hidroxialcanoatos

(PHAs).

c. Cuantificar los PHAs producidos por las cepas bacterianas encontradas.

d. Caracterizar mediante pruebas químicas y bioquímicas las cepas bacterianas

seleccionadas.

36

V.- MATERIALES Y MÉTODOS.

5.1.- Obtención de muestras

Se procesaron muestras de diferentes tipos de tejido vegetal afectado, es decir que presentaran

necrosis. Las muestras seleccionadas fueron de hoja y seudotallo provenientes de plantas de

Musa paradisiaca; además, se colectaron muestras de suelo del área de la rizosféra adyacente al

cultivo de plátano, en la localidad de Xalapa, Ver. Aparte de las muestras colectadas de Musa

paradisiaca, también se colectaron muestras provenientes del suelo de cultivos de Saccharum

officinarum, Lycopersicon esculentum y Citrullus lanatus en la localidad de Tamarindo, Ver. y

muestras de suelo pertenecientes a cultivos de Nicotina tabacum L. en la región de San Andrés

Tuxtla, Ver.

Las muestras de los diferentes tipos de tejido vegetal afectado (seudotallo, hoja) se seleccionaron

de la planta, teniendo la precaución de tomar fragmentos que presentaran los síntomas iniciales

de alguna enfermedad, acompañados de tejido sano con el fin de disminuir la presencia de

microorganismos saprófitos presentes en la planta; Los fragmentos de tejido se obtuvieron con

ayuda de bisturí y pinzas previamente esterilizados. Las muestras de suelo se colectaron en el

área cercana a la rizósfera a una profundidad de 15-20 cm. Las muestras tanto de suelo como de

tejido vegetal se colocaron en bolsas plásticas etiquetadas y se conservaron a 4°C, al final de la

colecta las muestras fueron transferidas al Laboratorio de Microbiología en el Instituto de

Investigaciones Biológicas para su posterior procesamiento.

5.2.- Procesamiento de muestras de tejido vegetal.

Los fragmentos de tejido que se utilizaron fueron de un tamaño de 1 x 1cm, se lavarón en un vaso

de precipitado de 250 ml conteniendo agua destilada durante 30 minutos y en agitación.

Posteriormente los cortes se trasladaron a un matraz Erlenmeyer de 250 ml conteniendo solución

de hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto para evitar la contaminación externa.

A continuación, se realizó u n lavado con agua destilada estéril en un vaso de precipitado de 250

ml y enseguida el tejido se sumergió durante un minuto en una solución de etanol al 70%.

Finalmente, los cortes se enjuagaron una vez con agua destilada estéril para remover los residuos

de los desinfectantes utilizados. Este procedimiento se llevó a cabo con material esterilizado y en

condiciones estériles.

37

Con el fin de obtener las bacterias presentes en el tejido vegetal, los fragmentos de tejido tratados

fueron macerados en un mortero con una solución buffer de fosfatos (23.0 g KH2PO4, 43.2,

Na2HPO4·7 H20, en 1000 ml de H2O). La suspensión obtenida del macerado de los tejidos se

sembró en condiciones estériles con un asa estéril en placas de Agar Soya Triptocaseina (TSA).

5.3.-Procesamiento de muestras de suelo

Se prepararon suspensiones de las muestras de suelo adicionando 3gr de suelo en 30 ml de buffer

de fosfatos mezclando muy bien con el vortex. Se tomo 1ml de esta suspensión y se sembró en

placas de TSA. Las cajas se incubaron a 30°C durante 24 h para obtener el ccrecimiento de

colonias de bacterias (Gómez, 2005).

5.4.- Obtención y Aislamiento de cultivos puros por métodos de siembra en placa

Una vez crecidas las colonias, obtenidas tanto de las muestras de tejido vegetal como de suelo, se

efectuó la siembra individual de cada colonia obtenida en medio TSA para lograr la purificación

de las bacterias. Se utilizó la siembra por estría (Koneman et al., 1998), ya que por lo general es

el método más útil de siembra en placa. Este procedimiento se realizó en repetidas ocasiones

hasta purificar las colonias.

Una vez obtenidas las cepas purificadas, fue necesario sembrarlas por duplicado en tubos

inclinado conteniendo medio TSA para su conservación y posterior utilización.

5.5.-Producción de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs)

Una vez aisladas y purificadas las cepas se procedió a iniciar la etapa de cultivo para realizar las

pruebas de la determinación cuantitativa de PHAs. La cuantificación se realizó con el método

espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificada por Martínez et al. (2004).

Determinación de la Producción de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) por cada cepa bacteriana.

Condiciones del medio de crecimiento para la obtención de biomasa.

Primera etapa: Las cepas bacterianas aisladas se cultivaron en 50 mL de medio MSM (Tabla 3),

el cual se caracteriza por no presentar un desbalance en las cantidades de Nitrógeno/Carbono.

Este medio permitió aumentar la cantidad de biomasa a partir de la cual se extrajo un inóculo que

38

se utilizó en la siguiente etapa, la de producción de PHAs. El medio utilizado es una

modificación del medio usado por Barbosa et al.,. (2005) donde la fructosa fue remplazada por

sacarosa.

Tabla 3. Componentes del medio MSM suplementado con sacarosa

Reactivo: Cantidad:

Fuente de carbono Sacarosa 10 g/L

NH4SO4 2.75 g/L

K2HPO4 2.0 g/L

NaH2PO4 1.6 g/L

MgSO4 .7 H2O 0.5 g/L

Solución de microelementos (Tabla 4) 2.0 ml/L

Tabla 4. Solución de microelementos

Reactivo Cantidad

FeSO4 2.0 g/L

MnCl2 4 H20 0.03 g/L

CaCl22 H20 2.0 g/L

CuCl 2 H20 0.01 g/L

ZnSO4 7 H20 0.1 g/L

CoCl 6 H20 0.2 g/L

NiCl2 6 H20 0.02 g/

Na2MoO4 2 H2O en HCl 0.1 N 0.03 g/L

El medio de cultivo se inoculó con la cepa bacteriana en estudio y se incubó a 28-30ºC y 200rpm

durante 24 h (Barbosa et al., 2005).

Segunda etapa: Para determinar la producción de PHAs se utilizó medio MSM pero con un

desbalance en las cantidades de C/N; se utilizó “Sacarosa” como fuente de carbono a una

39

concentración de 40 g/l y el nutriente limitado fue NH4SO4, del cual se utilizó una concentración

de 1.11 g/L, consultar Tabla 5 (Haywood et al., 1990)

Tabla 5: Componentes del medio de cultivo para la producción de PHAs.

Reactivo Cantidad

Fuente de carbono a evaluar: Sacarosa 40 g/L

NH4SO4 1.11 g/L

K2HPO4, 4.3 g/L

KH2PO4 1.6 g/L

MgSO4·7H2O 1.2 g/L

Ácido Cítrico 1.7 g/L

Solución de microelementos (Tabla 4) 10 ml/L

Barbosa et al., 2005.

Condiciones de las Fermentaciones para la producción de PHAs.

Para cada experimento se usó 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL con 47.5 mL de medio MSM con

el cociente C/N antes mencionado y al cual se le agregaron 2.5 mL de inoculo (representando el

5% del cultivo total) para llegar a un volumen de 50 mL. Las condiciones de cultivo fueron: 28 a

30ºC, pH de 7 y agitación de 225 rpm durante 72 horas.

A los tiempos de 24, 48 y 72 horas se tomaron muestras para los análisis de crecimiento celular y

determinación cuantitativa de PHA (Martínez et al., 2004).

5.6.-Determinación cuantitativa de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) por el método

espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificada por Martínez et al. (2004)

Para cuantificar el PHA producido y acumulado por cada cepa bacteriana, se tomaron 3 muestras

de 1 ml cada una a las 24, 48 y 72 horas y se midió la densidad óptica a 600nm.

Cada muestra de 1 ml se centrifugó a 10,000 x g durante 5 min en una microcentrífuga

Eppendorf, la pastilla de células se lavó con tampón fosfato y se digirió en solución de

hipoclorito de sodio al 5% (Cl-) + EDTA 10mM, incubando durante 1.5 h a 37ºC. Posteriormente

se centrifugó y se lavó con 0.2 ml de agua destilada y después con acetona (0.2ml). Finalmente,

40

el sedimento se lavó con 0.2 ml de etanol y se dejo secar. Cada muestra se digirió con ácido

sulfúrico al 80% durante 30 minutos a 90ºC y se determinó la absorbancia a 214nm en un

espectrofotómetro UV/VIS (Martínez et al., 2004).

Realización de la curva patrón para la cuantificación de PHAs

La curva patrón utilizada como referencia en la determinación de PHAs producidos por las cepas

bacterianas, es realizada a partir de una solución estándar de 1mg/ml del homopolimero PHB

disuelto en H2SO4 al 80%; a partir de esta solución concentrada se hicieron las diluciones. La

absorbancia de cada dilución se determinó en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm.

Después de evaluar la producción de PHAs por el método espectrofotométrico de Law y

Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., (2004), se seleccionaron las cepas bacterianas

con mayor producción. A estas se les determinó cualitativamente la acumulación de PHAs

mediante la técnica de tinción lipofílica con Negro Sudán B (Diario Oficial de la Unión Europea

1997; Pandolfi y Pons, 2007), cinéticas de crecimiento y caracterización mediante pruebas

químicas y bioquímicas.

5.7.- Evaluación cualitativa de la acumulación de PHAs mediante de tinción lipofílica con

Negro Sudán B.

Las cepas bacterianas seleccionadas fueron sembradas en los medios utilizados para determinar la

producción de PHAs, MSM sin desbalance de C/N y MSM con desbalance de C/N, con las

mismas condiciones y parámetros.

Después de obtener cultivos a las 24, 48 y 72 h, se preparon frotis de cada cepa seleccionada. Los

frotis se dejaron secar y se pasaron varias veces con rapidez sobre la llama hasta que el frotis este

fijado. Cada preparación se baño con una solución de Negro Sudán B al 0.3% en etanol del 70%,

y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Se escurrió la solución de tinción y las

preparciones se lavaron suavemente con agua destilada; el agua sobrante se eliminó con un

pañuelo de papel (Pandolfi y Pons, 2007). Los frotis se sumergieron brevemente en xilol, se

secaron con un pañuelo, y finalmente se cubrieron con safranina acuosa al 0.5% (p/v) dejando

incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar ligeramente con agua destilada 1 vez,

secar y tapar con un portaobjetos (Diario Oficial de la Unión Europea 1997). Cada preparación se

examinó con Microscopio Óptico Nikon a un aumento 100x y bajo aceite de inmersión.

41

5.8.- Análisis de crecimiento celular

Las curvas de crecimiento de las 14 cepas bacterianas seleccionadas aleatoriamente de un total de

20 se hicieron durante 108 h y se les dio seguimiento por medio de espectrofotometría a 600nm

(Spectronic 20, Milton Roy Company).

5.9.-Caracterización química y bioquímica de cepas bacterianas presuntas productoras de

PHAs.

A las cepas bacterianas aisladas y que fueron positivas para la producción de PHAs, se les

realizaron las siguientes pruebas químicas y bioquímicas: Tinción de Gram, Movilidad, Catalasa,

Citocromooxidasa, Prueba Oxidativa-Fermentativa de acuerdo al manual de Bergey´s (Hendricks

y Holt, 1994), para determinar a que grupo pertenecen.

Tinción de Gram. Permitió catalogar el grupo al que pertenecen las bacterias aisladas y

purificadas. Esta prueba además de determinar si se trata de bacterias Gram negativas o Gram

positivas, permite observar la morfología celular que presenta cada cepa seleccionada, ya sean

bacilos o cocos.

Movilidad. Esta prueba se realizó utilizando el medio de cultivo con TTC (2,3,5-cloruro de

trifeniltetrazolio) que permite determinar si la cepa presenta movilidad. Un resultado positivo

(célula móvil) produce una nube turbia rosa que difunde en todo el medio ya que el TTC actúa

como un aceptor artificial de electrones para las enzimas ligadas al nucleótido piridina en la

cadena biológica oxidativa. El TTC es un compuesto incoloro, soluble en agua que es tomado por

las células bacterianas que lo reducen enzimáticamente con la liberación de ácido formazán, un

compuesto rojo altamente pigmentado, por lo que la pigmentación permite observar

macroscópicamente la movilidad de la cepa. Se utilizó este medio debido a que en el medio MIO,

la turbidez que representa la movilidad en algunos casos es difícil de interpretar.

Catalasa. La presencia de la enzima catalasa se realizó por el método del portaobjeto y a

temperatura ambiente (22-25°C). Para ello, con una aguja de inoculación se recogió el centro de

una colonia pura de 18 a 24 h de crecimiento y se colocó sobre un portaobjeto, con una pipeta

42

Pasteur se agregó una gota de peróxido de hidrogeno (H2O2) al 3% sobre los microorganismos

colocados en el portaobjeto. La reacción positiva se determina por el burbujeo inmediato que se

produce por la formación de O2, actividad de la enzima.

Citocromooxidasa. Los citocromos, hemoproteínas que contiene hierro, actúan como el último

vínculo de la cadena respiratoria aerobia transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con la

formación de agua. El sistema de citocromos se halla en microorganismos aerobios, o

microaerófilos, y anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para

identificar microorganismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba es

muy útil para evaluar colonias que se sospecha pertenecen a la familia Enterobacteriaceae (todas

negativas) y para identificar colonias que se sospecha pertenecen a otros géneros como el de

Pseudomonas.

La prueba se realizó por medio del procedimiento indirecto con tira de papel filtro, en el cual se

agrega 1 gota del reactivo de Reactivo de Kovac (clorhidrato de tetrametil-p-fenildiamina). Las

colonias bacterianas que tienen actividad de citocromooxidasa desarrollan un color morado en el

sitio de inoculación en 10 segundos; el resultado negativo se caracteriza por no presentar el color

o por el desarrollo de color después del tiempo establecido.

Prueba Oxidativa-Fermentativa (Hugh y Leifson). Esta prueba determina si los

microorganismos en estudio degradan los azúcares por la vía fermentativa u oxidativa. Para la

prueba OF se requieren dos tubos, cada uno inoculado con el microorganismo desconocido, un

tubo se cubre con aceite mineral y el otro tubo se deja expuesto al aire; ambos tubos se incuban a

35°C y la producción de ácidos orgánicos se detecta por la aparición de un color amarillo. En el

caso de microorganismos oxidativos, la producción de ácidos se lleva a cabo en el tubo abierto,

sin aceite mineral, y en los microorganismos que degradan el carbohidrato por la vía fermentativa

el color amarillo se aprecia en el tubo cubierto con aceite mineral (Koneman et al., 1998).

Conforme al manual de Cowan y Steel´s (1993), Diagnóstico microbiológico clínico de Koneman

et al. (1998), Bacterial Identification de Cullimore (2000), Libro de pruebas bioquímicas de

Identificación Bacteriana de MacFaddin et al. (2003), se prosiguió con la la realización de las

pruebas diferenciales para determinar el género y en algunas casos la especie a la cual pertenecen

43

los aislados obtenidos de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomononadaceae,

Alcaligeneaceae y el género, Shewanella.

5.10.-Caracterización química y bioquímica de Fermentadores

Pruebas diferenciales para la familia Enterobacteriaceae. Las pruebas diferenciales permitieron

determinar diferentes géneros de la familia, incluso algunas especies.

Pruebas en Agar con hierro de Kligler (KIA)/Triple azúcar y hierro (TSI). El medio KIA y TSI

son medios de cultivo diferenciales en tubo que cumplen un doble propósito: a) la determinación

de la fermentación de hidratos de carbono y b) la determinación de H2S. Un microorganismo

puede utilizar varios sustratos incorporados en el medio, y el patrón de sustratos metabolizados se

usa para diferenciar entre los diversos grupos, géneros o especies de la familia

Enterobacteriaceae. El KIA contiene dos hidratos de carbono (glucosa y lactosa) y el TSI

(glucosa, lactosa y sacarosa), la fermentación tiene lugar tanto en aerobios (en el pico de flauta)

como en anaerobiosis (en el fondo del tubo), este medio se siembra por punción y estría

superficial.

Reducción de nitratos. La realización de esta prueba permitió observar la capacidad de las

bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae de reducir nitratos a nitritos. Para esto, se

empleó el medio nitrato de potasio, en la variante de caldo nitrato, el cual fue inoculado con el

cultivo puro que se estaba caracterizando. Se incubó a 35°C durante 24 h. Para determinar la

reducción de nitratos fue necesario agregar primero los reactivos A y B de Griess, un resultado

positivo se caracteriza porque se produce un color rosa a rojo obscuro en 1-2 min, y un resultado

negativo se caracteriza por la falta de color. En este punto es necesario agregar una cantidad

pequeña de polvo de Zn puro, la ausencia de desarrollo de color significa que el microorganismo

redujo el nitrato a nitrito y posteriormente redujo el nitrito a productos no gaseosos. La

desnitrificación, un resultado negativo que se caracteriza por el desarrollo de color naranja a rojo

obscuro en 5-10 min confirmando el resultado negativo de la prueba, esto es que el nitrato está

presente y no es reducido por el microorganismo (Koneman et al., 1998; MacFadin, 2003).

44

Prueba de Indol. La prueba de Indol se basa en la formación de un complejo de color rojo

cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehido, que es la

sustancia química activa de los reactivos de Kovacs y Erlich.

Se utilizó el medio de caseína, el cual se inoculó con un cultivo puro y se incubó a 35°C por 24h;

después del tiempo de incubación se agregó el reactivo de Kovacs directamente al tubo antes de

interpretar los resultados. Una reacción positiva presenta un anillo rojo en la interface del medio

con la porción inferior de la fase alcohólica, sobre el medio, y es negativa cuando no hay ningún

desarrollo de color en la capa de alcohol (MacFadin, 2003).

Prueba de Rojo de Metilo (RM). Esta es una prueba cuantitativa para determinar la producción

de ácidos, pero requiere que los microorganismos produzcan ácidos fuertes (láctico, acético,

fórmico) a partir de glucosa a través de la vía de fermentación de ácidos mixtos; dado que

muchas especies de Enterobacteriaceae pueden producir una cantidad de ácidos fuertes

suficientes como para que sea posible detectarlos por medio de RM durante las fases iniciales de

incubación. El medio empleado fue el caldo rojo de metilo-Vogues-Proskauer, según la fórmula

de Clark y Lubs, el cual se inoculó con un cultivo puro del microorganismo en estudio, y se

incubó durante 72h a 35°C. Concluido el tiempo de incubación se agregaron directamente en el

caldo 5 gotas del reactivo de rojo de metilo; sólo los microorganismos capaces de mantener el pH

bajo (aparición de un color rojo estable) después de una incubación prolongada, superando el

sistema amortiguador del pH del medio, pueden denominarse rojo de metilo-positivos (Koneman

et al., 1989).

Prueba de Vogues-Proskauer (VP). El medio utilizado fue caldo rojo de metilo-Vogues-

Proskauer, según la fórmula de Clark y Lubs; el caldo se inoculó con un cultivo puro del

microorganismo en estudio, se incubo a 35°C durante 72 horas y después de este lapso se

agregaron 0.6 ml de α-naftol al 5% seguidos por 0.2 ml de KOH al 40%. El tubo se sacude

suavemente para exponer el medio al oxígeno atmosférico (O2) y luego se dejó reposar durante

15 min.

Esta prueba determina la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto final

neutro, acetil-metilcarbinol (AMC, acetoína), a partir de la fermentación de glucosa.

45

Microorganismos como Enterobacter spp. producen acetoína como producto final principal del

metabolismo de la glucosa y forman cantidades menores de ácidos mixtos. En presencia de O2 y

KOH al 40%, en una reacción positiva la acetoína se convierte en diacetilo y el α-naftol sirve

como catalizador para producir un complejo de color rojo; una reacción negativa se caracteriza

por un color amarillo en la superficie (Koneman et al., 1998).

Utilización de Citrato. El citrato de sodio es una sal de ácido cítrico, un compuesto orgánico

simple hallado como uno de los metabólicos en el ciclo del ácido tricarboxilicos (Ciclo de

Krebs), algunas bacterias pueden obtener energía de una forma que no es la fermentación de

hidratos de carbono utilizando citrato como única fuente de carbono. La evaluación de esta

característica es importante en la identificación de muchas Enterobacteriaceae, la utilización de

citrato se detecta en un medio con citrato por la producción de productos intermedios alcalinos.

El medio de Citrato utilizado fue conforme la fórmula de Simmons, se toma una colonia aislada

del medio y se inocula estriando sobre la placa de citrato, se incuba durante 24 a 48 horas a 35°C;

una prueba positiva está representada por la aparición de un color azul oscuro, también puede ser

positiva en ausencia de color azul pero si hay crecimiento de colonias visibles (Koneman et al.,

1998).

Prueba de ureasa. Determina la capacidad de un microorganismo de hidolizar la urea en dos

moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa, con la resultante alcalinidad.

Se utilizó el medio Agar con urea de Christensen, se utiliza un inóculo denso proveniente de un

cultivo puro de 18 a 24 h, se estría toda la superficie del pico de flauta, no se debe de punzar el

medio, se incuba a 35°C, el tiempo de incubación puede ser por periodos prolongados

(MacFadin, 2003).

Descarboxilasas (lisina y ornitina). Las descarboxilasas son un grupo de enzimas específicas

capaces de reaccionar con la porción carboxilo (COOH) de aminoácidos formando aminas de

reacción alcalina. Esta reacción, conocida como descarboxilacion, forma dióxido de carbono

como producto secundario, cada descarboxilasa es específica para un aminoácido; lisina y

ornitina fueron evaluadas.

46

El medio de Falkow fue la base empleada para determinar la capacidad de descarboxilacion de

las Enterobacteriaceae, el aminoácido a evaluar se agrego a la base antes de la inoculación con el

microorganismo a estudio, de manera paralela debe disponerse de otro tubo que consiste solo en

la base sin el aminoácido, ambos tubos se incuban de forma anaerobia cubriéndolos con parafina

a 35°C durante 24 horas. Durante los estadios iniciales de incubación, los dos tubos se vuelven

amarillos debido a la fermentación de la pequeña cantidad de glucosa en el medio, si el

aminoácido es descarboxilado se forman aminas alcalinas y el medio revierte a su color purpura

original es una reacción positiva (Koneman et al., 1998).

Crecimiento en KCN. Utilizado en la diferenciación de bacilos sobre la base de su capacidad de

desarrollarse rápidamente en presencia de cianuro. Se utilizo la base de caldo KCN de Moeller

adicionado una solución al 1% de TTC para facilitar la observación del desarrollo bacteriano, se

inocula el caldo y se incuba a 35°C durante 24-48 horas, en caso positivo el caldo obtiene un

color rosa, que comprueba la capacidad del microorganismo de desarrollarse en presencia de

KCN (Cowan y Stell´s 1993, Cullimure, 2000).

Prueba de fermentación de hidratos de carbono. La fermentación es un proceso metabólico

anaerobio de oxidación-reducción, en el cual un sustrato orgánico actúa como un aceptor final de

hidrógeno (aceptor de electrones), en lugar de oxígeno, la fermentación de sustratos orgánicos

como los hidratos de carbono y alcoholes da por resultados productos finales reducidos y

oxidados. El medio base liquido estándar con rojo fenol como indicador fue el empleado, en esta

prueba se utilizaron distintos azúcares y alcoholes (Sacarosa, Dulcitol, Sorbitol, Lactosa,

Celobiosa, Inositol, Maltosa, Manitol, Trehalosa, D-xilosa), el medio es inoculado con el

microorganismo, se incuba a 35°C durante 18 a 24 h, las reacciones son; positiva el medio vira a

un color amarillo, negativo cuando se presenta un color rosa rojizo esto quiere decir que las

peptonas son utilizadas con la resultante alcalinidad (MacFaddin, 2003).

Prueba de Licuefacción de gelatina a 22°C. Determina la capacidad de un microorganismo de

producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que licúan/hidrolizan la gelatina o muestran

cambios característicos debido a los productos de degradación. La producción de gelatinasa se

47

usa como ayuda taxonómica para la identificación y la clasificación de bacterias fermentadoras y

no fermentadoras.

El medio de gelatina nutriente en placa fue el que se empleó, la inoculación fue por estría, se

incubo a 22°C de 18 a 24 horas, la licuefacción se presenta como una turbidez en la zona

alrededor del desarrollo, el resto del medio permanece límpido, el resultado positivo muestra un

precipitado de color blanco lechoso, el halo es de 3 a 6 mm de ancho (MacFaddin, 2003).

5.12.- Caracterización química y bioquímica para no fermentadores

Las bacterias no fermentadoras se les realizó las Pruebas en Agar con hierro de Kligler (KIA)/

Triple azúcar y hierro (TSI) para asegurar que estas cepas no son fermentadoras, ya que al ser

oxidativas estas bacterias no pueden obtener sus nutrientes a partir de los hidratos de carbono de

manera fermentativa, entonces, dependen de la peptona del medio, por lo cual producen dos

reacciones ya sea en medio KIA/TSI, alcalino/alcalino o alcalino/ sin cambios, así como la

prueba de RM/VP se realizaron obteniendo resultados negativos, característico de este grupo de

microorganismos.

Además se utilizó el medio Agar diferencial de Sellers para estudiar determinadas características

bioquímicas útiles en la identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores, el medio de

Sellers se siembra por picadura hasta el fondo del tubo y por estría en la superficie, se incuba

durante 24 horas a 35°C y se observa el color de la superficie, color del fondo, color de la banda,

fluorescencia en la superficie, gas nitrógeno (MacFaddin, 2003)

Pruebas diferenciales para la determinación de Pseudomonas

Crecimiento en Agar PIA (Pseudomonas Isolation Agar): Utilizado para el aislamiento de

Pseudomonas, se sembró en placa las bacterias caracterizadas como no fermentadoras para

diferenciar las cepas que pertenecen al grupo de las Pseudomonas y a las que pertencen a otros

géneros no fermentadores que no crecen en este medio.

Prueba de Indol: Se utilizó el mismo medio utilizado para Enterobacterias a diferencia de que el

reactivo no fue el de Kovacs, sino el reactivo de Ehrlich, ya que este es más sensible para probar

bacilos no fermentadores ya que tienen un producción mínima de Indol (MacFaddin, 2003)

48

Producción de pigmento piocianina en Agar Miuller-Hington a 22°C: Las cepas bacterianas

caracterizadas como Pseudomonas fueron crecidas en este medio para poder diferencia si

producían el pigmento piocianina, se incubo a 22°C durante 48 horas (Merino, 2007).

Descarboxilasas(lisina y ornitina): Determina la capacidad de un microorganismo de

descarboxilar un aminoácido para formar una amina con la resultante alcalinidad; se decidió

utilizar para la prueba de Ornitina descarboxilasa el método de Fay y Barry, este medio de

descarboxilasa está modificado es decir “sin glucosa”, la inoculación es a partir de un cultivo

puro de 18 a 24 h, los tubos inoculados son cubiertos con parafina estéril, se incuba a 37°C

durante 2-4 h, una interpretación positiva se determina por el color purpura y un resultado

negativo por un color amarillo.

Para el caso de lisina descarboxilasa se utilizó el Método de Brooker, Lund y Blazevic, la

inoculación es de una ansada densa en el medio, se cubre de parafina y se incubaron a 35°C

durante 4 h, un resultado positivo se interpreta por un color verde o azul y un resultado negativo

por la presencia de un color amarillo.

Estos métodos son recomendados para la identificación de no fermentadores, ya que son más

sensibles que el medio de Falkow (MacFaddin, 2003).

Arginina dihidrolasa: Para detectar la presencia de arginina dihidrolasa se empleó el caldo

para arginina descarboxilasa de Falkow, pero para determinar la arginina dihidrolasa se necesita

agregar el reactivo de Nessler, después de agregarlo vira el medio a un color castaño e indica que

la degradación de la arginina se llevó a cabo por el sistema de arginina dihidrolasa (Cowan y

Steel´s, 1993).

Prueba de Oxido-Fermentación: Es el mismo medio realizado para las pruebas preliminares, la

diferencia son los azúcares utilizados, los cuales fueron: sacarosa, lactosa, maltosa, xilosa,

manitol, inositol y trehalosa.

Reducción de nitratos y desnitrificación de nitratos y nitritos, utilización de citrato, prueba de

ureasa, crecimiento en KCN, prueba de licuefacción de gelatina a 22°C: Igualmente se

49

emplearon los medios ya descritos en la sección de pruebas diferenciales para

Enterobacteriaceae.

Prueba de hidrólisis de almidón: Determina la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el

almidón por medios enzimáticos, el medio para almidón empleado fue en la variante de caldo; el

caldo inoculado es incubado a 35°C durante 24 h o hasta que ocurra suficiente desarrollo,

después se agrega el reactivo Yodo acuoso de Lugol para poder interpretar, y se registran los

resultados inmediatamente, un resultado positivo es representado por la ausencia de color, esto

significa que el almidón ha sido hidrolizado a glucosa con ácidos, si se presenta un color azul en

el medio es negativo, es decir, el almidón no es hidrolizado (MacFaddin, 2003).

Crecimiento a 5°C y 42°C: El medio TSA fue inoculado, e incubado a temperaturas de 5°C y 42°

C para observar si hay crecimiento de los microorganismos catalogados como Pseudomonas a

estas temperaturas, ya que esto ayuda a la identificación de especies de este grupo (Pichardo et

al., 1981).

Agar base sangre: Es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 %

de sangre humana, el agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento, se usa también

para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de

virulencia).

Pruebas diferenciales para la especie Shewanella putrefaciens.

Se realizaron las pruebas de Indol, reducción de nitratos, desnitrificación, descarboxilasas (lisina,

ornitina), ureasa, prueba de Oxidativa-Fermentativa (xilosa, manitol, lactosa, sacarosa, maltosa),

se emplearon los mismos medios para estas pruebas ya explicados anteriormente.

Pruebas diferenciales para la familia Alcaligeneceae

Las pruebas realizadas fueron reducción de nitratos, desnitrificación de nitratos, licuefacción de

gelatina a 22°C, prueba Oxidativa- Fermentativa a partir de manitol, xilosa.

50

VI.- RESULTADOS

6.1.- Aislamiento de cepas bacterianas

Un total de 70 cepas bacterianas Gram negativas fueron aisladas de los cultivos, de las cuales 30

cepas fueron aisladas de Musa paradisiaca, 15 cepas de Saccharum officinarum, 12 cepas de

Lycopersicon esculentum, 11 cepas de Citrullus lanatus y sólo 2 cepas Nicotina tacabum L. (Fig.

11, 12).

Figura 11.-La gráfica muestra el número de aislados bacterianos de los diferentes cultivos de donde se obtuvieron las

cepas bacterianas.

Figura 12.- Distribución porcentual de cepas bacterianas aisladas de los cultivos de Musa paradisiaca, Saccharum

officinarum, Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus y Nicotina tacabum L.

43%

21%

17%

16%3%

Musa paradisiaca

Saccharum officinarum

Lycopersicon esculentum

Citrullus lanatus

Nicotina tacabum L.

0

5

10

15

20

25

30

35

51

Las 70 cepas bacterianas aisladas fueron utilizadas en el proceso para determinar si producen

poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) conforme al método espectrofotométrico de Law y Slepecky

(1961) modificado por Martínez et al., 2004 (Anexo I) de las cuales sólo 20 cepas bacterianas se

seleccionaron por presentar valores óptimos en cuanto a la lectura en el espectrofotómetro

UV/VIS para producir PHAs, los resultados de la selección fue: 8 cepas bacterianas del cultivo de

Musa paradisiaca; del cultivo de Saccharum officinarum 6 cepas fueron elegidas, para el cultivo

de Lycopersicon esculentum se seleccionaron 3 cepas, de Citrullus lanatus también se

seleccionaron 3 cepas y en el caso de las cepas aisladas del cultivo de Nicotina tacabum L. no se

seleccionó ninguna cepa ya que los valores de producción resultaron muy bajos (Tabla 11 y Tabla

12).

Tabla 11: Número de cepas bacterianas seleccionadas de cada cultivo.

Cultivo al que pertenecen los

aislados bacterianos

Número de cepas

bacterianas aisladas de

los cultivos

Número de cepas aisladas

que producen PHAs

considerablemente

Musa paradisiaca 30 8

Saccharum officinarum 15 6

Lycopersicon esculentum 12 3

Citrullus lanatus 11 2

Nicotina tacabum L. 2 0

Tabla 12: Las 20 cepas seleccionadas de los cultivos, elegidas por sus valores óptimos en cuanto a la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm (las cepas aisladas de S. offisanarum sombreadas en morado, L. esculentum en rosa, M. paradisiaca en azul y C. lanatus en verde)

Cepa Dilución Lectura a

214nm (24 h)

Dilución Lectura a

214nm(48h)

Dilución Lectura a 214

nm( 72h)

IIBUV-ESP1 .422 .989 1:100 .028

IIBUV-ESP2 1:10 1.036 .995 .750

IIBUV-ESP 3 1:20 .825 1:20 .847 1:10 .622

52

De acuerdo a estos resultados, el cultivo de S. officinarum, fue de donde se obtuvo el mayor

porcentaje de aislamiento bacteriano, es decir, el 40% del total de las cepas fueron seleccionadas.

En cuanto a las cepas elegidas de M. paradisiaca equivalen a un 26.66%, en el caso de L.

esculentum un 25% de los aislados fueron seleccionados, para C. lanatus solo el 18.18% fueron

elegidas y como se menciono anteriormente en el caso de N. tabacum no se selecciono ninguna

cepa debido a sus bajos niveles (Fig.13).

IIBUV-ESP 4 .952 1:10 .465 1:10 .677

IIBUV-ESP 5 1:20 .670 1:20 .757 1:20 .521

IIBUV-ESP 6 .655 1:10 .359 1:10 .588

IIBUV-ELP 25 1:10 .677 1:100 .106 1:100 .123

IIBUV-ELP 26 .597 .991 .813

IIBUV-ELP 27 1:10 .080 .672 .882

IIBUV-EMP28 .993 1:20 .897 1:20 .718

IIBUV-EMP 29 .345 1:20 .453 1:20 .548

IIBUV-EMP 30 1:20 .894 1:20 .720 1:10 1.004

IIBUV-EMP 52 .530 .532 .625

IIBUV-EMP 53 .383 .592 .598

IIBUV-EMP 54 .535 1:10 .085 1:10 .416

IIBUV-EMP 56 .993 1.078 .730

IIBUV-EMP 57 .561 .736 1:10 .308

IIBUV-ECP 58 .990 1:10 .151 1:10 .288

IIBUV-ECP 60 1:10 .156 1:10 .255 1:10 .486

IIBUV-ECP 61 1:10 .120 .598 1:10 .698

53

Figura 13.- Porcentaje de aislamiento de cepas bacterianas de cada cultivo

6.2.- Caracterización química y bioquímica de las cepas productoras de PHAs y

cuantificación de PHAs

Se realizó la caracterización química y bioquímicamente de las cepas seleccionadas y los

resultados son:

Las cepas caracterizadas de S. officinarum fueron identificadas como Shewanella putrefaciens,

Pseudomonas pseudomallei, Enterobacter hormaechei, Alcaligenes spp., Pseudomonas

aeruginosa y Enterobacter spp.; para el caso de L. esculentum las cepas aisladas corresponden a

Enterobacter spp., Shewanella putrefaciens, Enterobacter hormaechei: las cepas

correspondientes a Musa paradisiaca fueron Pseudomonas cepacia, Enterobacter spp.,

Alcaligenes latus, Citrobacter sp., Alcaligenes spp., Citrobacter spp., Pseudomona aeruginosa,

Enterobacter aerogenes y por último las cepas identificadas para C. lanatus fueron Alcaligenes

desnitrificans, Enterobacter hormaechei y Enterobacter gergoviae (Tabla 13) (Fig. 15, 16,17,

18).

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

S.

officinarum

M.

paradisiaca

Lycopersicon

esculentum

Citrullus

lanatus

Nicotina

tacabum L.

54

Tabla 13: Cepa bacterianas identificadas como productoras de PHAs

Tipo de cultivo Clasificación de la cepa Cepas bacterianas productoras de

PHAs

S. officinarum IIBUV-ESP1

IIBUV-ESP2

IIBUV-ESP 3

IIBUV-ESP 4

IIBUV-ESP 5

IIBUV-ELP 6

Shewanella putrefaciens

Pseudomonas pseudomallei

Enterobacter hormaechei,

Alcaligenes spp.

Pseudomonas aeruginosa,

Enterobacter spp.

L. esculentum IIBUV-ELP 25

IIBUV-ELP 26

IIBUV-ELP 27

P. pseudomallei.

Shewanella putrefaciens,

E. hormaechei

M. paradisiaca IIBUV-EMP 28

IIBUV-EMP 29

IIBUV-EMP 30

IIBUV-EMP 52

IIBUV-EMP 53

IIBUV-EMP 54

IIBUV-EMP 56

IIBUV-EMP 57

Pseudomonas cepacia,

Enterobacter spp.

Alcaligenes latus,

Citrobacter spp.

Alcaligenes spp.

Citrobacter spp.

Pseudomonas aeruginosa,

Enterobacter aerogenes

C. lanatus IIBUV-ECP 58

IIBUV-ECP 60

IIBUV-ECP 61

Alcaligenes desnitrificans,

Enterobacter hormaechei

Enterobacter gergoviae

55

a b c

Figura 15.- Pruebas básicas realizadas a las cepas bacterianas; a) Prueba de movilidad, b) prueba de catalasa, c)

prueba de oxidasa

a b c

Figura 16.- a) Prueba de Indol, el primer tubo es un reacción negativa, fue observado en todas las cepas

caracterizadas, el segundo tubo reacción positiva característica de E. coli que fue seleccionado como control

positivo b) Prueba RM el primer tubo muestra una reacción positiva característico de algunos organismos

fermentadores, el segundo tubo es reacción negativa característica de organismos no fermentadores c) Prueba VP, en

el primer tubo reacción positiva, la reacción negativa se puede apreciar en el segundo tubo característico de

organismos no fermentadores.

a) Tubo no inoculado

+ Movilidad

b) Reacción positiva a la prueba de catalasa

c) Prueba de oxidasa: izquierda reacción negativa, derecha positiva

56

Figura 17.- Es un tubo de TSI, donde se puede observar claramente la producción de H2S; una característica

fundamental para identificar a Shewanella putrefaciens, además se observa la reacción Alc/Alc característico de un

organismo no fermentador a 24 h de incubación a 35°C.

a b c

Figura 18: a) Placa de Miuller-Hington, se puede apreciar el pigmento piocianina producido por P. aeuroginosa, b)

Placa de Agar sangre, se observa la pigmentación amarilla de las colonias pertenecientes a P. cepacia, c) Prueba de

acides de hidratos de carbono y alcoholes de P. cepacia

H2S

C - - + + +

57

6.3.- Concentración de PHAs de las cepas aisladas de Saccharum officinarum

Los resultados obtenidos, en cuanto a la producción de PHAs, de las cepas aisladas de S.

officinarum determinados con la ayuda de la curva patrón nos permite observar que, la cepa

IIBUV-ESP3 identificada como E. hormaechei presenta la mayor concentración de PHAs dentro

de este grupo, siendo constante durante las primeras 48 horas, al cabo de las 72 horas desciende

la concentración, sin embargo es una concentración óptima comparándolas con las otras cepas

aisladas de este cultivo, los géneros P. aeruginosa. y Alcaligenes spp. también presentan

concentraciones aceptables de PHAs pero estos valores están por debajo de los observados en E.

hormaechei. En cuanto a P. pseudomallei es hasta las 72 horas cuando se presenta una

concentración relativamente alta y por último S. putrefaciens que presentó muy baja

concentración de PHA durante las 72 horas (Tabla 14)

Tabla 14: Concentración de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Saccharum officinarum

Cepa Género/

especie

Concentración

final de PHAs a

las 24h (µg/µl)

Concentración

final de PHAs a

las 48h (µg/µl)

Concentración

final de PHAs a

las 72 h (µg/µl)

IIBUV-ESP1 S.

putrefaciens

3.2 8.54 8.8

IIBUV-ESP2 P.

pseudomallei

86 8.55 8.15

IIBUV-ESP3 E.

hormaechei

166 167 76

IIBUV-ESP4 Alcaligenes

spp.

8.5 39 80.8

IIBUV-ESP5 P.

aeruginosa

80.7 40.0 45

IIBUV-ESP6 Enterobacter

sp.

8.0 26 70.5

58

6.4.- Concentración de PHAs de las cepas aisladas de Musa paradisiaca

En este cultivo la cepa aislada que produce considerablemente mayor cantidad de PHAs es

Alcaliges latus, seguida de Pseudomona cepacia, en esta la mayor producción de PHAs fue a

partir de las 48 horas al contrario de Alcaligenes latus que a las 24 horas presentó una

concentración elevada, otra de las cepas que presento una concentración alta es Enterobacter

spp., sin embargo fue hasta las 72 horas de cultivo; en el caso de Alcaligenes spp., Citrobacter

spp. y Enterobacter aerogenes los niveles de concentración son muy bajos en comparación con

las cepas ya mencionadas (Tabla 15).

Tabla 15: Concentración de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Musa paradisiaca

Cepa Género/especie Concentración

final de PHAs a

las 24h (µg/µl)

Concentración

fina de PHAs a

las 48h (µg/µl)

Concentración

final de PHAs a

las 72 h (µg/µl)

IIBUV-

EMP28

P. cepacia 8.54 168 162

IIBUV-

EMP29

Enterobacter spp. 2.55 75 121

IIBUV-

EMP30

A. latus 167.8 163 85.8

IIBUV-

EMP52

Citrobacter spp. 5.45 5.50 7.70

IIBUV-

EMP53

Alcaligenes spp. 2.8 7.15 7.25

IIBUV-

EMP54

Citrobacter spp. 5.75 8.5 31

IIBUV-

EMP56

P. aeruginosa 8.56 8.62 8.15

IIBUV-

EMP57

E. aerogenes 4.45 8.18 23.5

59

6.5.- Concentración de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Lycopersicum esculentum

La cepa con mayor concentración de PHAs para este cultivo fue P. pseudomallei, pero fue hasta

las 72 horas de cultivo, al contrario de cepas encontradas en otros cultivos que presentaron

concentraciones considerables a partir de las 24 h de cultivo, como fue el caso de E. hormaechei

aislada de S. officinarum , además podemos observar que esta cepa fue aislada de este cultivo,

pero presentando muy bajas concentraciones de PHA en comparación a la cepa aislada de S.

officinarum. En cuanto S. putrefaciens las concentraciones de PHAs son muy bajas, esto también

es observado en la cepa aislada de S. officinarum (Tabla 16).

Tabla 16: Concentración de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Lycopersicum esculentum

6.6.- Concentración de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Citrullus lanatus

La cepa con mayor concentración de PHA en este cultivo fue Enterobacter hormaechei, otra cepa

identificada como Enterobacter gergovice también produce PHAs pero no en la proporción de E.

hormaechei, ya que la concentración mayor se observa hasta las 72 horas y en el caso de A.

desnitrificans es la cepa con menor concentración de PHAs (Tabla 17).

Cepa Género/especie Concentración

final de PHAs a

las 24h (µg/µl)

Concentración

final de PHAs a

las 48h (µg/µl)

Concentración

final de PHAs a

las 72 h (µg/µl)

IIBUV-

ELP25

P. pseudomallei 8.5 20.5 42.5

IIBUV-

ELP26

S. putrefaciens 7.20 8.52 8.25

IIBUV-

ELP27

E. hormaechei .8 8.08 8.39

60

Tabla 17.- Concentración de PHAs de cepas bacterianas aisladas del cultivo de Citrullus lanatus

6.7.- Curvas de crecimiento de cepas productoras de PHAs

Se realizaron las curvas de crecimiento a 14 cepas elegidas aleatoriamente del total de cepas

bacterianas seleccionadas durante un periodo de 108 horas a una temperatura de 28°C a 30°C.

Las cepas bacterianas son: E. gergoviae (IIBUV-ECP61), E. hormaechei (IIBUV-ECP60),

Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), E. aerogenes (IIBUV-EMP57), P. pseudomallei (IIBUV-

ELP25), E. hormaechei (IIBUV-ELP27), P. aeruginosa (IIBUV-ESP5), Enterobacter spp.

(IIBUV-ESP6), E. hormaechei (IIBUV-ESP3), S. putrefaciens (IIBUV-ESP1), P. cepacia

(IIBUV-EMP 28), Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), P. pseudomallei (IIBUV-ESP2) y

Alcaligenes latus (IIBUV-EMP30).

Los resultados obtenidos nos mostraron que durante la fase exponencial, E. gergovice (IIBUV-

ECP61), presentó las menores concentraciones, es decir, de 4.5µg/µl a las 24 h, y de 7.25 µg/µl

a las 48 h de cultivo y al momento de iniciar la fase estacionaria aumentó la concentración de

PHA a 80.9µg/µl a las 72 h (Fig.19).

Cepa Género/especie Concentración

final de PHAs

a las 24h

(µg/µl)

Concentración

final de PHAs

a las 48h

(µg/µl)

Concentración

final de PHAs

a las 72 h

(µg/µl)

IIBUV-ECP58 Alcaligenes

denitrificans

8.45 7.5 22.5

IIBUV-EMC60 E. hormaechei 161 164 99.0

IIBUV-EMC61 E. gergoviae 4.5 7.25 80.9

61

Figura 19.- Curva de crecimiento de E. gergoviae (IIBUV-ECP61) aislada de Citrullus lanatus.

Por otro lado, E. hormaechei (IIBUV-ECP 60) presentó una concentración de 161 µg/µl de PHAs a

las 24 h y de 164 µg/µl a las 48 h durante la fase estacionaria, a las 72 h inicio la fase de

muerte y con ello una disminución en la concentración, obteniendo sólo 99 µg/µl (Fig. 20)

Figura 20.- Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ECP60), aislada del cultivo de Citrullus lanatus.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

4.5 µg/µl

7.25 µg/µl80.9 µg/µl

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

161 µg/µl 164 µg/µl

99 µg/µl

62

La cepa identificada como Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), almacena PHAs en una

concentración de 31 µg/µl a las 72 h en su fase estacionaria, en cambio durante la fase

exponencial las concentraciones son muy bajas (Fig. 21). Al igual que en Citrobacter spp., para

E. aerogenes (IIBUV-EMP57) su mayor concentración de PHAs es a las 72 h durante fase

estacionaria, sin embargo es menor la acumulación de PHAs en esta cepa (Fig. 22).

Figura 21.- Curva de crecimiento de la cepa identificada como Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), aislada del cultivo

de Musa paradisiaca.

Figura 22.- Curva de crecimiento de E. aerogenes (IIBUV-EMP57) aislada del cultivo de Musa paradisiaca.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

31µg/µl

8.5 µg/µl

5.75 µg/µl

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

4.45µg/µl

8.18

µg/µl

23.5 µg/µl

63

Interesantemente P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), presentó una concentración superior de

PHAs de 85 µg/µl durante fase de no crecimiento a las 24h, sin embargo a las 72 h vuelve a

aumentar tanto la concentración celular y como de PHAs, después de este período inicia fase de

muerte, pero esta concentración es baja en comparación a la obtenida a las 24h (Fig.23).

Figura 23.- Curva de crecimiento de P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), aislada del cultivo de Lycopersicum

esculentum.

Para E. hormaechei (IIBUV-ELP27) aislada de L. esculentum y al igual que P. pseudomallei ,

su mayor concentración de PHAs es de 8.39 µg/µl y ocurre durante la misma fase, sin embargo

esta es muy baja (Fig. 24), destaca el hecho de que en E. hormaechei la fase estacionara inicia

hasta las 72 h, además de que también fue aislada de C. lanatus, no obstante, la cepa asilada de

C. lanatus presenta concentraciones muy favorables y altas durante las 72 h (Fig. 20), en

comparación con la cepa aislada de L. esculentum.

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

60

0 n

m

Tiempo (h)

85µg/µl

20.5µg/µl42.5µg/µl

64

Figura 24.- Curva de Crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ELP27), aislada de L. esculentum. Los datos correspondientes a P. aeruginosa (IIBUV-ESP5), es que su mayor concentración de

PHAs es de 80.7 µg/µl a las 24h fase estacionaria, presentando menores concentraciones en las

posteriores horas, además podemos observar que a las 48 h entra en fase de muerte, pero a las 72

h vuelve aumentar un poco la concentración de PHAsy celular comparando con la concentración

obtenida a las 48 h (Fig. 25) esto también fue observado en P. pseudomallei (IIBUV-ELP25),

aislada de L. esculentum (Fig. 23).

Figura 25.- Curva de crecimiento de Pseudomona aeruginosa (IIBUV-ESP5), aislada de Saccharum officinarum, además podemos observar las concentraciones de PHAs obtenidas a las 24, 48 y 72 horas.

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

.8 µg/µl

8.08

µg/µl8.39

µg/µl

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

80.7

µg/µl 40µg/µl

45 µg/µl

65

Concerniente a Enterobacter spp. (IIBUV-ESP6), se puede observar que la mayor concentración

de PHAs es a las 72 h de cultivo en fase estacionaria, y las menores concentraciones es durante la

fase exponencial (Fig. 26)

Figura 26.- Curva de crecimiento de E. spp. (IIBUV-ESP6) aislada del cultivo de Saccharum officinarum.

En el caso de E. hormaechei (IIBUV-ESP3) también inicia la fase estacionaria a las 24h y

termina después de las 48 h, durante esta fase, se obtuvieron las mayores concentraciones, con lo

cual podemos mencionar que E. hormaechei acumula PHAs considerablemente (Fig. 27).

Además esta cepa aislada de S. officinarum también presenta concentraciones óptimas en

comparación con la cepa obtenida de C. lanatus identificada también como E. hormaechei

(IIBUV-ECP60) (Fig. 20).

Figura 27.- Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ESP3) aislada del cultivo de Saccharum officinarum.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 20 40 60 80 100 120

8.0µg/µl

26µg/

µl

70.5µg/

µl

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

166 µg/µl167

µg/µl76

µg/µl

66

Otra de las cepas a las que también se realizó su curva de crecimiento fue S. putrefaciens

(IIBUV-ESP1), que al igual que las cepas anteriores, su mayor concentraciones de PHAs fue

durante la fase estacionaria hasta las 72 h (Fig.28), sin embargo las concentraciones obtenidas,

al igual que en E. hormaechei aislada de L. esculentum son de las más bajas.

Figura 28.- Curva de crecimiento de la cepa S. putrefaciens (IIBUV-ESP1), aislada del cultivo de S. officinarum

Las siguientes cepas se diferencian de las anteriores debido a que las concentraciones de PHAs

más altas son durante la fase exponencial, es el caso de P. cepacia (IIBUV-EMP 28) quien

presentó la mayor concentración de PHAs a las 48 h fue de 168 µg/µl, sin embargo también

presentó una buena concentración a las 72 h de cultivo, momento en que entra en fase

estacionaria (Fig. 29).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

3.2 µg/µl

8.54µg/µl

8.8 µg/µl

67

Figura 29.- Curva de crecimiento de la cepa identificada como P. cepacia (IIBUV-EMP 28) aislada de Musa

paradisiaca

Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), presentó su mayor concentración a las 24h fase exponencial

pero tan sólo es de 24µg/µl, en las siguientes horas descendió la concentración (Fig. 30)

Figura 30.- Curva de crecimiento de Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), aislada del cultivo de Musa paradisiaca

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

8.54 µg/µl

168 µg/µl

162 µg/µl

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

28µg/µl

7.15µg/µl 7.25µg/µl

68

P. pseudomallei (IIBUV-ESP2) presenta su mayor concentración a las 24 h durante fase

exponencial y durante las 48 h siguientes la concentración descendió (Fig. 31).

Figura 31.- Curva de crecimiento de la cepa bacteriana identificada como P. pseudomallei (IIBUV-ESP2), aislada del cultivo de Saccharum officinarum. Por último, Alcaligenes latus presentó las mayores concentraciones de PHAs durante la fase

exponencial, ya que al iniciar la fase estacionaria a las 72 h, los niveles de PHAs descendieron

hasta en 50% (Fig. 32).

Figura 32.- Curva de crecimiento de la cepa A. latus (IIBUV-EMP30), aislada del cultivo de Musa paradisiaca

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

86 µg/µl

8.55 µg/µl 8.15 µg/µl

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

a 6

00

nm

Tiempo (h)

m

167.8 µg/µl

163 µg/µl

85.8 µg/µl

69

En la tabla 18 se muestran las cepas con mayor producción de PHAs para cada cultivo, en la tabla

19 se muestran las cepas a las que se les realizó la curva de crecimiento con las mejores

concentraciones de PHA, conforme a la etapa y tiempo de producción de PHA si se comparan

con las 13 cepas no seleccionadas por presentar menores concentraciones de PHAs (Anexo1,

Tabla 20)

Tabla 18: Cepas con mayor producción de PHAs de cada cultivo

Cultivo Cepas con mejores

concentraciones de PHA

S. officinarum E. hormaechei, E. spp. P.

pseudomallei, E. aeruginosa

L. esculentum P. pseudomallei

C. lanatus E. hormaechei, E. gergoviae

M. paradisiaca A. lanatus, P. cepacia, C. spp.

Tabla 19: Cepas seleccionadas como mejores productoras, analizando su producción y curva de crecimiento

Cepa seleccionada Concentraciones de PHA durante las 72 h (µg/µl)

Fase de crecimiento con mayor [ PHA]

Cultivo

P. aeruginosa 80.7,40, 45 estacionaria S. officinarum

E. hormaechei 166,167,76 estacionaria S. officinarum

P. pseudomallei 86.8.55,8.15 exponencial S. officinarum

P. pseudomallei 85,20.5,42.5 estacionaria L. esculentum

E. hormaechei 161,164,99 estacionaria C. lanatus

P. cepacia 8.54, 168, 162 exponencial M. paradisiaca

A.latus 167.8, 163, 85.8 exponencial M. paradisiaca

70

6.8.- Evaluación cualitativa de la acumulación de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs)

mediante la técnica de tinción lipofílica con Negro Sudán B

Se logró visualizar los gránulos de PHAs de las 20 cepas seleccionadas que presentaron valores

óptimos de concentración, con lo cual se confirma uno de los objetivos de este trabajo, que fue

aislar cepas bacterianas capaces de producir poli-β- hidroxialcanoatos. Las cepas en que se

observaron más gránulos fueron A. latus y E. hormaechei aisladas tanto de los cultivo de

Saccharum officinarum y Citrullus lanatus, P. pseudomallei, P. cepacia, y P. aeruginosa (Fig.

32, Fig. 33).

Figura 33: Tinción lipofílica con Sudán negro. Se observan gránulos PHA a un aumento de 100X, en la cepa bacteriana P. cepacia en un cultivo de 24 hrs.

Gránulos PHA

71

Figura 34: Tinción lipofílica con Sudán negro, se observan gránulos PHA a un aumento de 100 x, en la cepa bacteriana Enterobacter hormaechei en un cultivo de 72 hrs.

Gránulos PHA

72

VII.- DISCUSIÓN

De acuerdo a los conceptos vertidos por Wang y Lee (1997), quien considera a los Poli-β-

hidroxialcanoatos producidos por bacterias como buenos candidatos para reemplazar los plásticos

obtenidos de hidrocarburos y debido a que los PHAs poseen propiedades similares a los plásticos

convencionales y que tienen la propiedad de ser completamente biodegradables y como Page y

colaboradores (1997) que establecieron que los biopolímeros producidos por diferentes

microorganismos tienen amplia importancia en diversas áreas de la ciencia, (economía,

agricultura, etc.), así, los datos obtenidos en este estudio cobran relevancia en cuanto a la

caracterización química y bioquímica de las cepas bacterianas capaces de producir PHAs.

De un total de 70 cepas aisladas y estudiadas, de las especies vegetales M. paradisiaca, S.

officinarum, L. esculentum C. lanatus; se seleccionaron 20 aislados bacterianos por presentar las

mayores lecturas en el espectrofotómetro UV/VIS, determinando los siguientes géneros y

especies: Pseudomonas cepacia (IIBUV-EMP28), Enterobacter spp. (IIBUV-EMP29),

Alcaligenes latus (IIBUV-EMP30), Citrobacter spp. (IIBUV-EMP52), Alcaligenes spp. (IIBUV-

EMP53), Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), Pseudomonas aeruginosa (IIBUV-EMP56),

Enterobacter aerogenes (IIBUV-EMP57), Shewanella putrefaciens (IIBUV-ESP1),

Pseudomonas pseudomallei (IIBUV-ESP2), Enterobacter hormaechei (IIBUV-ESP3),

Alcaligenes spp. (IIBUV-ESP4) Pseudomonas aeruginosa (IIBUV-ESP5), Enterobacter spp.

(IIBUV-ELP6), P. pseudomallei. (IIBUV-ELP25), Shewanella putrefaciens (IIBUV-ELP26), E.

hormaechei (IIBUV-ELP27), Alcaligenes desnitrificans (IIBUV-ECP 58), Enterobacter

hormaechei (IIBUV-ECP60), y Enterobacter gergoviae (IIBUV-ECP 61).

Aun cuando Moreno y colaboradores (2007) mencionan que no se ha reportado que la Familia

Enterobacteriaceae sea acumuladora de PHAs, estudios realizados por Arshad y colaboradores

(2007) mostraron recientemente la caracterización bioquímica de cepas productoras de PHA

pertenecientes a los géneros Citrobacter y Enterobacter, lo cual viene a ser confirmado por

nuestros resultados al demostrar la producción de PHA en especies de los géneros Enterobacter,

Citrobacter, esto cobra relevancia y sustenta los resultados obtenidos en este estudio referente a

estos géneros, como productoras de PHAs;

73

En cuanto a las especies pertenecientes al género Pseudomonas aisladas en este estudio se pudo

confirmar que pueden producir PHAs en medios de cultivo conteniendo sacarosa, lo cual es

apoyado por Madison y Huisman (1999) ya que ellos señalan que las Pseudomonas son capaces

de convertir Acetil-CoA a monómeros de cadena de longitud media para la síntesis de PHA, con

la única excepción de P. oleovorans, que presenta la incapacidad para sintetizar PHAs a partir de

azúcares, además indican que los PHAs formados a partir de azúcares, como es el caso de la

sacarosa, fuente de carbono utilizada en este estudio, tienen una composición diferente de los

PHAs formados a partir de ácidos grasos, pero son igual de eficientes; mientras que los PHAs

obtenido de ácidos grasos tienen 3-hidroxioctanoato como el componente principal.

En este contexto, en los PHAs obtenidos a partir de azucares el monómero principal es 3-

hidroxidecanoato, además algunas Pseudomonas spp. pueden incorporar tanto monómeros de

PHAs-ssc como PHAs-mss en la misma cadena polimérica. Normalmente, estos PHAs se forman

cuando estas cepas son cultivadas con una fuente de carbono no relacionada, como son los

carbohidratos, en el caso de este tipo de PHAs mezclados, se ha demostrado que el resultado

final es la acumulación individual de gránulos compuestos de P (3HB) y otros tipos de PHAs,

por tanto las Pseudomonas aisladas en esta investigación resultan ser eficientes en la producción

de PHAs.

Los resultados obtenidos con las cepas A. latus y A. spp. coinciden con los reportados por

Madison y Huisman (1999), quienes reportan a la especie Alcaligenes latus como un productor

de biopolímeros que se encuentran asociados a su crecimiento. Este comportamiento es

fehacientemente observado en las cepas aisladas, ya que se puede observar que la mayor

concentración de PHAs es durante la fase exponencial. En cuanto al género Shewanella

putrefaciens no se tienen reportes que señalen a esta como productoras de PHAs; sin embargo

debe mencionarse que esta cepa fue anteriormente clasificada como Pseudomonas putrefaciens

según el esquema de Weaver-Hollis, Koneman y colaboradores (1998), ya que el grupo de las

Pseudomonas son catalogadas como productoras de PHAs, lo que concuerda con los resultados

que se reportan.

Con respecto al comportamiento de las cepas aisladas, en cuanto a las concentraciones de PHAs,

hay que mencionar que difiere de una especie a otra, este comportamiento es similar al reportado

por Mandon y colaboradores (1998), quienes señalan que la acumulación de PHAs en bacterias,

en presencia de un exceso de fuente de carbono difiere marcadamente de una especie a otra. Así

74

también se pudo observar que la mayor acumulación de PHA se presenta en algunas cepas

bacterianas en fase estacionaria y en otras en fase exponencial; de acuerdo a esto, Rojas y

colaboradores (2006) menciona que cuando no existe crecimiento (fase estacionaria) debido a la

ausencia total de nitrógeno en el medio, la cantidad de carbono excedente es utilizada en la

síntesis de PHAs, esto fue observado en las cepas bacterianas a las que se le determinó su cinética

de crecimiento; E. gergoviae (IIBUV-ECP61), E. hormaechei (IIBUV-ECP60) aisladas de C.

lanatus, Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), E. aerogenes (IIBUV-EMP57) aisladas de Musa

paradisiaca, P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), E. hormaechei (IIBUV-ELP27) aislada de L.

esculentum, y P. aeuroginosa (IIBUV-ESP5), E. hormaechei (IIBUV-ESP3), S. putrefaciens

(IIBUV-ESP1) aisladas de S. officinarum.

En el caso de P. pseudomallei (IIBUV-ELP25) y P. aeruginosa (IIBUV-ESP5) se pudo observar

un crecimiento inestable, en ciclos de incremento y pérdida de PHA, esto también es señalado por

estudios realizados por Lasala y colaboradores (2004b) con la cepa Mezorhizobium plurifarum

que establecieron que esto es debido a una oxigenación elevada, que desvía el metabolismo hacia

cuotas de respiración más altas, mayor oxidación del sustrato y por tanto menor disponibilidad de

Acetil-CoA para la producción de PHAs. Por lo tanto a bajos niveles de oxigenación y exceso

de fuente de carbono, el metabolismo energético genera elevadas concentraciones de NADH+ y

Acetil-CoA que deben ser convertidos en formas osmóticamente neutras que no afecten el

balance redox de la célula y esto conlleva a la síntesis de PHAs.

En el caso de las cepas que produjeron mayor concentración de PHAs, durante la fase

exponencial por ejemplo: P. cepacia (IIBUV-EMP 28) aislada de Musa paradisiaca y P.

pseudomallei aislada de S. officinarum (IIBUV-ESP2), Durner y colaboradore(2001) y Klinke y

colaboradores (2000) confirmaron lo reportado, es decir, que algunas especies del género

Pseudomonas acumulan PHAs durante el crecimiento exponencial. Rojas y colaboradores (2006)

explican que en esta fase, la disponibilidad de carbono intracelular se realiza por la ruta

metabólica Entner- Doudoroff (EDP), ya que la ruta oxidativa de las pentosas fosfato no está

activa y las reacciones para la generación de Ribosa-5-fosfato (R5P) participan de acuerdo al

sentido inverso de la ruta de las pentosa fosfato (PP), por este motivo la generación de Fructosa-

6-fosfato (F6P) se lleva a cabo por la enzima fosfoglucosa isomerasa de la ruta glucolítica para

cumplir con los requerimientos de biosíntesis de precursores donde el flujo de Acetil-CoA se

dividen en tres fracciones: síntesis del polímero, síntesis de citrato en el TCA y en las rutas

75

anabólicas involucradas en la conversión de precursores a bloques de construcción como

aminoácidos, lípidos, etc., que forman las macromoléculas de acuerdo a la composición celular

fija. En este esquema la fracción mayor de Acetil-CoA es utilizada para la generación de PHAs,

lo cual disminuye el flujo hacia el ciclo TCA y hacia las rutas anabólicas que lo consumen.

En cuanto a Alcaligenes spp. y A. latus también presentaron la mayor producción durante la fase

exponencial, estos resultados concuerdan con lo mencionado por Martínez y colaboradores

(2004) para A. latus ya que según el, las mayoría de la especies bacterianas producen muy poco

PHB durante la fase exponencial de crecimiento, con excepción del género ya mencionado, lo

que fue confirmado en el presente trabajo, al presentar la mayor producción de PHAs durante

esta etapa de crecimiento. Además de otras especies como Azotobacter vinelandi, Azotobacter

chrococcum y algunas Pseudomonas que producen PHAs durante fase exponencial.

Por último, Gómez y colaboradores (1996) validaron la eficiencia de producción de PHAs, por

diversas bacterias Gram negativas aisladas de suelo de plantaciones de caña de azúcar, resultados

que fueron positivos también para en este estudio, ya que de las 7 cepas seleccionadas que

presentaron mayor producción de PHAs, 3 de estas fueron aisladas de plantas de Sacharum

officinarum.

76

VIII. CONCLUSIONES

1. En este trabajo se logró obtener, aislar y purificar géneros y especies bacterianas

productoras de PHAs aisladas de Citrullus lanatus, Lycopersicum esculentum, Musa

paradisiaca y Saccharum officinarum

.

2. La metodología aplicada permitió seleccionar las cepas bacterianas con capacidad de

producir PHAs, así como cuantificar la concentración de los mismos para cada aislado.

3. La aplicación de pruebas químicas y bioquímicas permitieron la caracterización de cepas

bacterianas y cuyo comportamiento se desglosa posteriormente.

4. Los géneros y especies bacterianas aisladas en el presente estudio, pertenecientes a

Pseudomonas y Alcaligenes presentaron concentraciones óptimas de PHAs, además de

ser bacterias ampliamente estudiadas; con respecto a los géneros y especies aisladas a la

Familia Enterobacteriaceae, arrojan resultados favorables y novedosos, debido a que

existen pocos datos sobre esta familia en cuanto a la producción, esto abre un nuevo

campo para estudios futuros sobre este tema.

5. Se pudo observar que E. hormaechei aisladas de los cultivos de S. officinarum, C. lanatus,

y L. esculentum, no acumulan PHAs en la misma concentración durante su curva de

crecimiento, mientras que la cepa aislada de L. esculentum presentó concentraciones muy

bajas en comparación con las cepas aisladas de C. lanatus y S. officinarum.

6. Lo anterior, es debido a que las mayores concentraciones de PHAs en E. hormaechei

aislada de C. lanatus y S. officinarum, se da por la presión selectiva que enfrenta en su

ambiente, causada por el desbalance de la cantidad de carbono/ nitrógeno y por la

descomposición de residuos en el suelo, que da como resultado un exceso de carbono y

una limitación de nitrógeno.

77

7. Las cepas con mayor concentración son: Alcaligenes latus aislada de M. paradisiaca, que

presentó mayor concentración de PHAs de las cepas bacterianas seleccionadas,

obteniendo las mayores concentraciones en fase exponencial de 167. 8 µg/µl y 163 µg/µl

durante las primeras 48 h, a las 72 h fase estacionaria acumulando 85.8 µg/µl. E.

hormaechei aislada de C. lanatus mostro concentraciones favorables durante las 72 h las

cuales fueron de 161 µg/µl y 164 µg/µl durante fase estacionaria, alcanzando los 99 µg/µl

durante fase de muerte. P. cepacia aislada de M. paradisiaca mostro PHAs

considerablemente hasta las 48 h con 168 µg/µl y 162 µg/µl en fase exponencial. P.

pseudomallei aislada de L. esculentum logró biosintetizar 85 µg/µl en fase estacionaria,

20.5 µg/µl y 42.5 µg/µl y finalmente P. pseudomallei aislada de S. officinarum mostró

una concentración favorable a las 24 h de 86 µg/µl en fase exponencial.

8. Pseudomonas pseudomallei (IIBUV-ESP2) resultó sensible a la concentración de

aeración, ya que presentó disminución y aumento de PHAs durante las 72 h.

9. La determinación cualitativa mediante la tinción lipofilica con Sudán Negro resultó

satisfactoria y permitió demostrar la acumulación de PHAs por las cepas bacterianas en

estudio.

10. En general, podemos decir que el porcentaje final de aislamientos bacterianos que

presentaron concentraciones de PHAs favorables, son el 10 % de las el 70 cepas

aisladas de los Cultivos.

11. Finalmente concluimos que de los 70 aislados bacterianos, 7 aislados son consideradas

de amplio aprovechamiento por sus concentraciones y análisis concernientes a curvas de

crecimiento, ya que esto nos permitió observar cuales cepas acumulan PHAs en menor

tiempo, así como sus altas concentraciones, las cepas son : P. aeruginosa (IIBUV-ESP 5),

E. hormaechei (IIBUV-ESP 3 ), P. pseudomallei IIBUV-ESP 2) aisladas de S.

officinarum, P. pseudomallei (IIBUV-ELP 25) aislada de L. esculentum, P. cepacia

(IIBUV-EMP 28)y Alcaligenes latus (IIBUV-EMP 30)y E. hormaechei (IIBUV-ECP 60)

aislada de C. lanatus.

78

IX.- ANEXOS

Anexo I.- Promedio de la lectura en espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 70 cepas

bacterianas aisladas a las cuales se le aplico el método de Law y Slepecky (1961)

modificada por Martínez et al. (2004):

Tabla 6: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 15 cepas

bacterianas aisladas Saccharum officinarum, las 6 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (se

encuentran sombreadas) para su determinación cuantitativa y cualitativa en cuanto a producción de PHAs, así como

su caracterización química y bioquímica.

Cepas aisladas de

Saccharum officinarum

Dilución P( tubo 1,2,3)

a 24 horas de

cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a

48 horas de

cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a

72 horas de

cultivo

IIBUV-ESP1 .422 .989 1:100 .028

IIBUV-ESP2 1:10 1.036 .995 .750

IIBUV-ESP 3 1:20 .825 1:20 .847 1:10 .622

IIBUV-ESP 4 .952 1:10 .465 1:10 .677

IIBUV-ESP 5 1:10 .677 1:100 .106 1:100 .123

IIBUV-ESP 6 .655 1:10 .359 1:10 .588

IIBUV-ESP 7 .718 .282 .168

IIBUV-ESP 8 .368 .258 .228

IIBUV-ESP 9 .127 .341 .468

IIBUV-ESP 10 .315 .324 .358

IIBUV-ESP 11 .354 .388 .263

IIBUV-ESP 12 .262 .419 .532

IIBUV-ESP 13 .293 .249 .264

IIBUV-ESP 14 .578 .540 .186

IIBUV-ESP 15 .179 .688 .775

79

Tabla 7: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 12 cepas

bacterianas aisladas Lycopersicum esculentum, las 3 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (

se encuentran sombreadas) para la determinación cuantitativa y cualitativa de PHAs, así como su caracterización

química y bioquímica.

Tabla 8: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 30 cepas

bacterianas aisladas Musa paradisiaca, las 8 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (

sombredas) para determinar cuantitativa y cualitativa la producción de PHAs, así como su caracterización química y

bioquímica.

Cepas aisladas de

Lycopersicum

esculentum

Dilución P( tubo 1,2,3)

a 24 horas de

cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a

48 horas de

cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a

72 horas de

cultivo

IIBUV-ELP16 .193 .512 .425

IIBUV-ELP 17 .214 .284 .125

IIBUV-ELP 18 .026 .085 .094

IIBUV-ELP 19 .071 .084 .100

IIBUV-ELP 20 .275 .415 .435

IIBUV-ELP 21 .459 .227 .187

IIBUV-ELP 22 .196 .124 .028

IIBUV-ELP 23 .343 .381 .270

IIBUV-ELP 24 .375 .420 .123

IIBUV-ELP 25 1:20 .670 1:20 .757 1:20 .521

IIBUV-ELP 26 .597 .991 .813

IIBUV-ELP 27 1:10 .080 .672 .882

Cepas aisladas de Musa

paradisiaca

Dilución P( tubo 1,2,3)

a 24 horas de

cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a 48

horas de cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a

72 horas de

cultivo

IIBUV-EMP28 .993 1:20 .897 1:20 .718

IIBUV-EMP 29 .345 1:20 .453 1:20 .548

80

IIBUV-EMP 30 1:20 .894 1:20 .720 1:10 1.004

IIBUV-EMP 31 .093 .078 .130

IIBUV-EMP 32 .537 .567 .617

IIBUV-EMP 33 .315 .404 .095

IIBUV-EMP 34 .912 .462 .493

IIBUV-EMP 35 .039 .339 .443

IIBUV-EMP 36 .356 .184 .137

IIBUV-EMP 37 .693 .275 .105

IIBUV-EMP 38 .584 .401 .632

IIBUV-EMP 39 .241 .212 .312

IIBUV-EMP 40 .565 .161 .086

IIBUV-EMP 41 .512 .075 .118

IIBUV-EMP 42 .212 .214 .320

IIBUV-EMP 43 .400 .170 .121

IIBUV-EMP 44 .404 .228 .430

IIBUV-EMP 45 .459 .132 .301

IIBUV-EMP 46 .282 .107 .100

IIBUV-EMP 47 .614 .154 .569

IIBUV-EMP 48 .705 .169 .222

IIBUV-EMP 49 .811 .221 .334

IIBUV-EMP 50 .643 .309 .559

IIBUV-EMP 51 .415 .414 .316

IIBUV-EMP 52 .530 .532 .625

IIBUV-EMP 53 .383 .592 .598

IIBUV-EMP 54 .535 1:10 .085 1:10 .416

IIBUV-EMP 55 .249 .271 .286

81

Tabla 9: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 11 cepas

bacterianas aisladas Citrullus lanatus, las 3 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas

(sombreadas) para la determinación cuantitativa y cualitativa de PHAs, así como su caracterización química y

bioquímica.

IIBUV-EMP 56 .993 1.078 .730

IIBUV-EMP 57 .561 .736 1:10 .308

Cepas aisladas de

Citrullus lanatus

Dilución P( tubo 1,2,3)

a 24 horas de

cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a

48 horas de

cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a

72 horas de

cultivo

IIBUV-ECP 58 .990 1:10 .151 1:10 .288

IIBUV-ECP 59 .275 .255 .210

IIBUV-ECP 60 1:10 .156 1:10 .255 1:10 .486

IIBUV-ECP 61 1:10 .120 .598 1:10 .698

IIBUV-ECP 62 .322 .352 .362

IIBUV-ECP 63 .423 .322 .288

IIBUV-ECP 64 .403 .222 .230

IIBUV-ECP 65 .192 .338 .355

IIBUV-ECP 66 .573 .257 .182

IIBUV-ECP 67 .993 1.078 .730

IIBUV-ECP 68 .561 .736 1:10 .308

82

Tabla 10: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 2 cepas

bacterianas aisladas N. tabacum, las 2 cepas aisladas de este cultivo presentaron valores muy bajos por lo cual no se

seleccionaron para determinar cuantitativa y cualitativamente a PHAs, así como su caracterización química y

bioquímica.

Tabla 20.-Cepas bacterianas no seleccionadas debidoa su baja concentracin de PHAs, además de que su cinetica de crecimiento mostró que concentraciones relativamente mayores de PHAs fue hasta las 72 h por lo cual no es factible.

Cepa Género/

especie

Concentración final

de PHAs a las 24h

(µg/µ l)

Concentración final

de PHAs a las 48h

(µg/µl)

Concentración final

de PHAs a las 72 h

(µg/µ l)

IIBUV-ESP1 S. putrefaciens 3.2 8.54 8.8

IIBUV-ESP4 Alcaligenes spp. 8.5 39 80.8

IIBUV-ESP6 E. spp 8.0 26 70.5

IIBUV-EMP29 Enterobacter spp. 2.55 75 121

IIBUV-EMP52 Citrobacter spp. 5.45 5.50 7.70

IIBUV-EMP53 Alcaligenes spp. 2.8 7.15 7.25

IIBUV-EMP54 Citrobacter spp. 5.75 8.5 31

IIBUV-EMP56 P. aeuroginosa 8.56 8.62 8.15

IIBUV-EMP57 E. aerogenes 4.45 8.18 23.5

IIBUV-ELP25 P. pseudomallei 8.5 20.5 42.5

IIBUV-ELP26 S. putrefaciens 7.20 8.52 8.25

IIBUV-ELP27 E. hormaechei .8 8.08 8.39

IIBUV-ECP58 A.denitrificans 8.45 7.5 22.5

IIBUV-EMC61 E. gergovice 4.5 7.25 80.9

Cepas aisladas de

Nicotina tabacum L.

Dilución P( tubo 1,2,3)

a 24 horas de

cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a 48

horas de cultivo

Dilución P( tubo 1,2,3) a

72 horas de

cultivo

IIBUV-ENP 69 .090 .118 .130

IIBUV-ENP 70 .098 .103 .123

83

Figura 14 a. Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa E. hormaechei , aislada de S. officinarum utilizados para la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS A 214 nm, por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., 2004 .

Figura 14.b.Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa IIBUV-EMP 31 aislada de M. paradisiaca ( no seleccionada), utilizados para la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS A 214 nm, por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., 2004

84

X.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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