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PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y DIVERSIDAD DE GENES RELEVANTES EN EL TRACTO DIGESTIVO DE INSECTOS DESCORTEZADORES DEL GENERO DENDROCTONUS SIP 20070651 INFORME FINAL I. INTRODUCCION I.1. MICROORGANISMOS DEL INTESTINO En el tracto digestivo de los insectos se albergan una gran variedad de microorganismos; algunos de cuales habitan cavidades concretas, están rodeados por las células de tejido epitelial o se mantienen como simbiontes intracelulares (endosimbiontes). Los microorganismos del intestino están compuestos por una amplia variedad de especies, que incluyen bacterias, arqueas y eucariotes. En particular, la región del proctodeo es la más densamente poblada y con mayor diversidad de especies de microorganismos asociados (Anklin-Mϋhlemann et al., 1995; Bignell et al., 1980; Cazemier et al., 1997; Cruden y Markovetz, 1987; Werner, 1926; Wiedenmann, 1930). El proctodeo de termitas, grillos y cucarachas; que sobreviven a base de dietas de difícil asimilación y limitadas en nutrientes, tienen poblaciones de bacterias firmemente adheridas al integumento (Breznak y Pankrast, 1977; Cruden y Markovetz, 1979; Fogelsong et al., 1975; Ulrich et al., 1981). Sin embargo, otros microorganismos del intestino de insectos, como los protozoarios y las espiroquetas, establecen grandes y persistentes poblaciones sin estar adheridos a las superficies del canal alimentario (Breznak, 2000). La dieta influye claramente en la densidad y proporción de los diferentes microorganismos que podemos encontrar en el canal alimentario de mamíferos y artrópodos (Hungate, 1966; Kauffman et al., 2000). Mientras que algunas bacterias de los tractos digestivos son capaces de utilizar una amplia variedad de nutrientes, otras sólo sobreviven empleando nutrientes específicos. El crecimiento y

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PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y DIVERSIDAD DE GENES RELEVANTES EN EL TRACTO DIGESTIVO DE INSECTOS

DESCORTEZADORES DEL GENERO DENDROCTONUS SIP 20070651

INFORME FINAL I. INTRODUCCION I.1. MICROORGANISMOS DEL INTESTINO En el tracto digestivo de los insectos se albergan una gran variedad de

microorganismos; algunos de cuales habitan cavidades concretas, están rodeados

por las células de tejido epitelial o se mantienen como simbiontes intracelulares

(endosimbiontes). Los microorganismos del intestino están compuestos por una

amplia variedad de especies, que incluyen bacterias, arqueas y eucariotes. En

particular, la región del proctodeo es la más densamente poblada y con mayor

diversidad de especies de microorganismos asociados (Anklin-Mϋhlemann et al.,

1995; Bignell et al., 1980; Cazemier et al., 1997; Cruden y Markovetz, 1987;

Werner, 1926; Wiedenmann, 1930).

El proctodeo de termitas, grillos y cucarachas; que sobreviven a base de

dietas de difícil asimilación y limitadas en nutrientes, tienen poblaciones de

bacterias firmemente adheridas al integumento (Breznak y Pankrast, 1977; Cruden

y Markovetz, 1979; Fogelsong et al., 1975; Ulrich et al., 1981). Sin embargo, otros

microorganismos del intestino de insectos, como los protozoarios y las

espiroquetas, establecen grandes y persistentes poblaciones sin estar adheridos a

las superficies del canal alimentario (Breznak, 2000).

La dieta influye claramente en la densidad y proporción de los diferentes

microorganismos que podemos encontrar en el canal alimentario de mamíferos y

artrópodos (Hungate, 1966; Kauffman et al., 2000). Mientras que algunas bacterias

de los tractos digestivos son capaces de utilizar una amplia variedad de nutrientes,

otras sólo sobreviven empleando nutrientes específicos. El crecimiento y

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supervivencia de diferentes especies microbianas está en función de las

condiciones ambientales que se pueden encontrar en el tracto digestivo de los

huéspedes. Estas condiciones pueden variar temporal y espacialmente dentro del

mismo individuo o entre diferentes individuos (Nardi et al., 2002).

La naturaleza facultativa u obligatoria de las interacciones insecto-

microorganismo es dinámica y compleja. La interrelación entre las funciones

microbianas y la fisiología de los insectos es una área aún pobremente estudiada

de la biología de los insectos. De los microorganismos del intestino de los

insectos, sólo los de las termitas se han estudiado ampliamente y la

interdependencia obligada de esta asociación se ha reconocido (Breznak, 1982).

Otros insectos en los cuales también se ha estudiado con cierta profundidad a los

microorganismos del intestino son las cucarachas y los áfidos (Cruden y

Markovetz, 1979; Douglas, 1998).

Así por ejemplo, el tiempo de vida de las termitas superiores se puede

reducir de 250 a 13 días si son eliminadas las bacterias y espiroquetas de su

intestino empleando algunos antibióticos (Eutick et al., 1978). Aunque las células

del mesenterón de las termitas superiores son capaces de digerir la lignocelulosa

sin necesitar la cooperación directa de los microorganismos de su intestino se ha

propuesto que la producción de estas celulasas endógenas no es suficiente para

abastecer a las termitas de la energía que ellas necesitan para su desarrollo y

reproducción. (Bignel, 2000; Tokuda y Watanabe, 2007) Las células de ningún

insecto son capaces de fijar nitrógeno ni de convertir el dióxido de carbono en

acetato; todos estos procesos anaeróbicos son exclusivos de los microorganismos

del intestino. En particular, la acetogénesis microbiana provee, al menos, la

tercera parte de la energía requerida por las termitas (Breznak, 2000).

Asimismo, la mayoría de las especies de cucarachas se alimentan de

cualquier material orgánico disponible, incluso de los residuos celulósicos de las

plantas, los cuales son pobres en nitrógeno. Si las poblaciones microbianas

asociadas al tracto alimentario de las cucarachas se eliminan, se observa un

efecto negativo sobre el peso del adulto, el volumen del proctodeo, la producción

de metano y el tiempo de generación (Gijzen y Barugahare, 1992).

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Finalmente, las bacterias del intestino de los áfidos mantienen un sutil

balance entre ellas y el insecto huésped. Erwinia aphidicola puede mostrarse

como un patógeno en su relación con los insectos, sin embargo generalmente

mantiene un equilibrio con otras poblaciones de enterobacterias que suprimen su

crecimiento excesivo. Si esto sucede, se inhibe el cambio del exoesqueleto

(ecdisis) y causa una mayor mortalidad en los insectos adultos (Harada y

Ishikawa, 1997).

I.2. ESCARABAJOS DESCORTEZADORES Los escarabajos descortezadores se encuentran en la subfamilia

Scolytinae, éstos típicamente se alimentan de sustratos pobres. Ellos colonizan y

se alimentan de una gran variedad de tejidos de las plantas que incluyen los

tejidos de la madera (corteza y floema), frutos y la médula de las ramas.

Solamente los escarabajos de la ambrosia no se alimentan de los tejidos de las

plantas, sino de sus hongos asociados. Los escolítidos se pueden agrupar en tres

categorías con base en sus estrategias de alimentación: saprófagos, los cuales se

alimentan exclusivamente de tejidos de árboles muertos o decaídos; fitófagos, que

se alimentan de de tejidos de plantas vivas o recientemente muertas y los

micetófagos, que viven en la madera ó en otros tejidos de las plantas donde

cultivan hongos, de los que se alimentan (Six, 2003).

1.3 SIMBIOSIS EN Dendroctonus

Los escarabajos descortezadores comprenden un grupo económicamente y

ecológicamente importante que habita en los tejidos subcorticales de los árboles,

especialmente en el floema y la corteza externa (Wood, 1982). Algunas especies

de descortezadores se alimentan de árboles enfermos ó muertos y juegan un

papel ecológico benéfico, debido a que participan en la descomposición y el

reciclaje de nutrientes, además de proveer de alimento a algunas aves y otros

animales silvestres (Schowalter, 1981; Raffa et al., 1993), como es el caso de

Dendroctonus valens. Sin embargo, otras especies de escarabajos

descortezadores son importantes plagas forestales que se pueden extender a

millones de hectáreas contiguas de bosque y que causan pérdidas a gran escala

(Coulson, 1979; Wallin y Raffa, 2004).

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Dada la pobre composición de nutrientes que tienen la albura (parte más

externa del xilema secundario) y el floema de los cuales se alimentan los

escarabajos del género Dendroctonus, parece probable que los microorganismos

asociados provean de algunos nutrientes que suplementan su dieta o les facilitan

su asimilación.

La mayoría del conocimiento de los microorganismos asociados al género

Dendroctonus involucra a los hongos, particularmente a aquellos que son

transportados externamente sobre el exoesqueleto o en estructuras

especializadas conocidas como micangios (Hsiau y Harrington, 2003; Krokene y

Solhein, 1998; Lim et al., 2004, 2005; Paine et al., 1997). El micangio es una

invaginación del integumento que posee glándulas o células secretoras que

alberga hongos simbióticos, entre los que se encuentran Entomocorticium spp.,

Ceratocystiopsis ranaculosus, etc. (Batra, 1963; Levieux et al., 1991; Six, 2003).

Se ha sugerido que los hongos micangiales proveen de compuestos nitrogenados,

vitaminas, esteroles y otros factores de crecimiento a escarabajos del género

Hypothenemus (Beaver, 1986).

Algunos hongos micangiales de D. frontalis pertenecientes al género

Entomocorticium concentran y transportan compuestos nitrogenados de la savia

(proteínas y aminoácidos) a la cámara de alimentación de las larvas del insecto, lo

cual favorece el crecimiento de las poblaciones de los insectos (Ayres, 2000). Las

poblaciones de D. frontalis que se desarrollan en presencia de Entomocorticium

poseen un alto contenido lipídico, lo que disminuye el tiempo de desarrollo mínimo

de las larvas de ~40 a ~18 días (Barras y Hodges, 1973; Wagner et al., 1984).

Los hongos micangiales parecen beneficiarse de la simbiosis al recibir

nutrientes producidos por las glándulas asociadas al micangio, al ser

transportados e inoculados a otros árboles durante los periodos de dispersión y

colonización del insecto (Paine y Birch, 1983) y posiblemente también reciben una

protección física contra la luz UV y la desecación (Six, 2003).

Otros hongos como Pichia pinus y Kuraishia capsulata asociados a D.

ponderosae convierten el trans-verbenol, una feromona de agregación, a

verbenona, una feromona de antiagregación. Esta conversión posiblemente juega

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un papel muy importante en la terminación del ataque masivo al árbol por este

insecto (Hunt y Borden, 1990).

En D. terebrans, D. frontalis e Ips avulsus se han aislado constantemente

cepas de Pantoea agglomeras (anteriormente clasificada como Enterobacter

agglomerans) y Enterobacter spp. las cuales son bacterias fijadoras de nitrógeno

potenciales y posiblemente suplementan la dieta de estos insectos con

compuestos nitrogenados (Bridges, 1981). Por otra parte, Penicillium

chrysogenum que tiene la capacidad de degradar la carboximetil-celulosa se aisló

en una ocasión del tracto digestivo de D. frontalis, aunque no se lograron aislar

bacterias celulolíticas, por lo que se mantuvo la duda acerca del impacto que tiene

la microbiota asociada al intestino de este insecto sobre la degradación de la

celulosa (Delalibera et al., 2005).

A pesar de la gran importancia económica y ecológica de los escarabajos

en general y en particular del género Dendroctonus, se conoce poco sobre la

diversidad de la microbiota de su intestino.

II. DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO

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III. MATERIAL Y METODOS III.1. COLECTA DE INSECTOS

Los insectos se colectaron en bosques de pinos de diferentes localidades

de la República Mexicana, se extrajeron de árboles infestados y se colocaron en

recipientes de plástico, con un papel húmedo, debidamente etiquetados indicando

fecha y localidad. Los insectos se mantuvieron a 4ºC y se transportaron al

laboratorio donde se procedió a su disección.

En el cuadro 1 se muestran los lugares donde se realizaron las colectas de

insectos. Todos los ejemplares se mantuvieron a 4ºC y se transportaron al

laboratorio. Los insectos se disectaron para obtener su tracto digestivo, el cual se

seccionó en mesenterón anterior (MP), mesenterón posterior (MP) y proctodeo

(P), estas partes se colocaron en tubos de 1.5 ml que contenían 200 μl de medio

de cultivo líquido cuando la muestra se procesó para el cultivo de

microorganismos ó 200 μl de agua para la muestras a las cuales se les extrajo

DNA metagenómico

Cuadro 1. Escarabajos descortezadores colectados en este estudio.

Especie Estado Localidad Coordenadas geográficas

Fecha de colecta

San Juanito 27o55’22’’ N 107º55’47’’ O

25 de Octubre 2005 Chihuahua

Casas Grandes 30º09’76’’ N 108 º 57’03’’ O

28 de Octubre de 2005

Jalisco Los Pozos, Gómez Farias

19º88’20’’ N 103º40’40’’ O

25 de Junio de 2006

Dendroctonus valens

Distrito Federal CICS, Milpa Alta 19º 04’ N 98º 58’ O

25 de Marzo de 2006

III.2 DISECCIÓN Y EXTRACCIÓN DEL TUBO DIGESTIVO DE LOS INSECTOS

Los escarabajos se limpiaron superficialmente con etanol al 96%, se

expusieron durante 10 minutos a luz UV y se lavaron en una solución reguladora

de fosfatos (50 mM, pH 7.2), en esta solución se sacrificaron por ahogamiento.

Una vez sacrificado el insecto, se colocó en una caja Petri con regulador de

fosfatos y se inició la disección quitando los élitros y las alas, posteriormente se

cortó la parte abdominal y se separó el cuerpo graso del tubo digestivo. Una vez

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obtenido el tubo digestivo se pasó a otra caja Petri con PBS, se separó en las

distintas secciones: mesenterón anterior, mesenterón posterior y proctodeo y cada

sección se colocó en tubos Eppendorf estériles con 100 μL de PBS 120 mM pH 8.

Se almacenaron a -20ºC hasta su posterior uso.

III.3 ANÁLISIS BASADOS EN MÉTODOS MOLECULARES III.3.1 EXTRACCIÓN DEL DNA TOTAL

Se descongelaron los tubos conteniendo las partes del tubo digestivo y se

agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

0.5 mm previamente esterilizadas. Se agitaron con Vortex hasta el rompimiento

total del tejido y se centrifugaron 10 min a 14,000 rpm. Se hicieron extracciones

del sobrenadante con 200 μL de fenol-cloroformo 25:25, el DNA de la fase acuosa

se precipitó con un volumen de isopropanol e incubación a -20ºC por 30 min.

Finalmente, el DNA se lavó con 0.5 mL de etanol 70% y se resuspendió en 50 μL

de agua desionizada estéril y se almacenó a -20ºC hasta su uso.

III.4 CUANTIFICACIÓN Y VISUALIZACIÓN DEL DNA

Para cuantificar y determinar la pureza el DNA, se empleó un espectrofotómetro

de UV y se tomaron lecturas de absorbencia a 260 y 280 nm del DNA en la

muestra (Sambrook et al., 2002). También se visualizó el DNA extraído por

electroforesis en gel de agarosa al 0.7% en amortiguador TAE 1X.

III.5 CONSTRUCCIÓN DE LA LIBRERÍA DE GENES RIBOSOMALES III.5.1 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES 16S rRNA

Se amplificó un fragmento de aproximadamente 1,500 pb del gen 16S rRNA

con un protocolo e iniciadores descritos previamente en la literatura (Relman,

1993). Los iniciadores utilizados fueron: Derecho 8 (5’GCG GAT CCG CGG CCG

CTG CAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG3’) y Reverso 1492 (5’GGC TCG AGC

GGC CGC CCG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T3’)

III.5.2 CLONACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR Se purificaron los productos de PCR para la clonación con el kit de

purificación “PCR Purification Kit” (Qiagen, Valencia, CA). El amplificado purificado

se clonó en el vector pCR2.1-TOPO de 3.9 Kb del kit TOPO TA Cloning

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(Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. La tranformación

se realizó en células quimiocompetentes de la cepa DH10b de Escherichia coli. El crecimiento de las clonas se efectuó en medio LB con ampicilina (50

μg/mL), X-gal (40 μg/ mL) e IPTG (0.5 mM). Las clonas con los plásmidos

recombinantes se reconocieron por la coloración blanca de las colonias y por su

resistencia a la ampicilina.

III.5.3 CULTIVO DE LAS CLONAS SELECCIONADAS Y OBTENCIÓN DEL DNA PLASMÍDICO

Las clonas seleccionadas se picaron con palillos de madera estériles y se

sembraron en tubos con tapón de rosca con 5 mL de medio LB con ampicilina (50

μg/mL) durante 24 h a 37°C.

El DNA plasmídico se obtuvo por medio de la técnica de lisis alcalina

(Sambrook et al., 2002).

III.5.4 BÚSQUEDA DE CLONAS POSITIVAS Se identificaron las clonas que contenían el inserto por liberación del mismo

con la endonucleasa de restricción EcoRI (Invitrogen, Carlsbad, CA) cuyas

secuencias de corte flanquean el sitio de inserción en el plásmido.

III.6 SECUENCIACIÓN Para priorizar los esfuerzos de secuenciación se realizó un análisis RFLP

con la enzima HpaII y se secuenció una clona de cada perfil representativo. La

secuenciación de los plásmidos purificados se realizó de manera automatizada

con un secuenciador ABI PRISM 310 Genetic Analyzer PE (Applied Biosystems).

Se realizaron reacciones de secuenciación por clona representativa a partir del

extremo 5’ y 3’ con los iniciadores M13-F (5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’) y M13-R

(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’).

III.7 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS OBTENIDAS Las secuencias obtenidas de los diferentes microorganismos fueron

analizadas con el programa CHIMERA-CHECK del Ribosomal Database Project

(http://rdp8.cme.msu.edu/htm/analyses.html) para descartar las posibles

secuencias quiméricas. Posteriormente las secuencias obtenidas se sometieron a

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una búsqueda de secuencias similares en GenBank por medio del programa

BLASTN versión 2.2.3 (Altschul et al., 1997) en la página de la NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Una vez determinada la identidad, las secuencias

relacionadas se seleccionaron considerando los niveles jerárquicos y linaje

taxonómico descrito en la base de datos TaxBrowser del NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=taxonomy). Para obtener el mejor

alineamiento, múltiples alineamientos de las secuencias se hicieron con el

programa CLUSTAL X versión 2.0 (Thompson, 1997); los parámetros usados

fueron los de lento/seguro, 15.5 para apertura de gaps, 6.6 para extensión de los

mismos, eliminación de secuencias divergentes en 30% o más, peso de 0.5 para

las transiciones y la matriz IUB para peso del DNA, no se utilizó matriz negativa.

Los alineamientos se terminaron de editar manualmente con el programa

“Seaview” (Galtier et al., 1996).

Las relaciones filogenéticas entre las secuencias se establecieron por

métodos de distancia. El modelo de sustitución nucleotídica para estimar las

distancias evolutivas (ED) se eligió tomando en cuenta las frecuencias

nucleotídicas determinadas con el programa DAMBE (Xia y Xie, 2001), que por

medio de una tabla de contingencia de Χ2 indica si las proporciones nucleotídicas

corresponden a lo esperado y si esto es significativo estadísticamente; el índice de

transiciones y transversiones se calculó con el programa MEGA versión 2.1. Para

obtener los árboles filogenéticos se empleó el paquete de programas

computacionales MEGA versión 4.0, se empleó el método de agrupamiento de

Neighbor Joining y se realizó un análisis de remuestreo (“bootstrap”) con 1000

aleatorizaciones.

III.8 ANÁLISIS DE RAREFACCIÓN E ÍNDICES DE DIVERSIDAD Para efectuar los analisis de rarefacción y calcular el estimador de la

riqueza Chao 1, las secuencias de las clonas obtenidas a partir de la librería de

genes ribosomales del tracto digestivo de 3-5 hembras de D. valens se alineron,

con el programa Clustal X 2.0 (Thompson et al., 1997). Una matriz de distancia fue

calculada empleando la paquetería PHYLIP 3.67 apartir del modelo de sustitucion

de Kimura-2-Parámetros (Felsestein, 1993). La determinacion de la riqueza y

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unidades taxonómicas operativas se llevo a cabo con en el programa DOTUR. Las

curvas de rarefación se construyeron a niveles de distancia genética de 20, 10, 5,

3 y 1%, las cuales corresponden a los niveles taxonómicos de phylum, clase,

género, especie y cepa respectivamente (Scholoss y Handelsman, 2005).

En nuestro caso, los análisis de rarefacción fueron útiles para estimar el

grado en que el muestreo cubrió la diversidad presente en el intestino de D. valens

a partir de la librería de genes. Las curvas de rarefacción son construidas

mediante el trazado del número total de OTUs encontradas versus el número total

de secuencias analizadas. Generalmente, la inclinación de una curva de

rarefacción es alta al inicio y gradualmente disminuye, provocando que la curva

alcance un punto máximo y se vuelva asintótica; en este punto, el muestreo se

considera adecuado. En este trabajo, solo se presentan las curvas de rarefacción

para las OTUs con una distancia genética no mayor de 20, 5 y 3%, la cuales

indicativas de las diferencias nivel de phylum, género y especie respectivamente.

A pesar de que los análisis de rarefacción son útiles para estimar si el

muestreo fue adecuado, éstos no son adecuados para estimar la riqueza de una

comunidad. Por lo tanto el estimador de la riqueza Chao 1 fue también calculado

con la paquetería DOTUR (Scholoss y Handelsman, 2005). Chao 1 es en

estimador no paramétrico que determina la diversidad de una comunidad

basándose en el numero de “singletons” (OTUs representadas por sólo una

secuencia) y “doubletons” (OTUs representadas por dos secuencias) encontrados

en una muestra (Bohannan y Hughes, 2003). La riqueza terminal de Chao 1 se

reporta para secuencias con diferencias no mayores al 3% entre ellas.

El estimador de la riqueza terminal Chao 1 se calcula empleando la

siguiente relación:

SChao1 = Sobs +[n2(n1-1)/2(n2+1) ], cuando n1>0 y n2≥0 y cuando n1=0 y n2=0

SChao1 = Sobs + (n1²/ 2n2), cuando n1=0 y n2≥0

Donde,

S Chao1 = Riqueza estimada

Sobs= Número de especies observadas

n1 = Número de OTUs con sólo una secuencia

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n2 = Número de OTUs con sólo dos secuencias

III.9 ANÁLISIS MEDIANTE DGGE DE LA REGIÓN V3 DEL GEN 16S rRNA III.9.1 AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN V3 DEL GEN 16S rRNA

Para amplificar la región variable 3 del gen 16S rRNA se usaron los

iniciadores Derecho 2 (5’GCG CCG CCG CGC GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG3’) (en negritas se destaca el broche

de GC) y Reverso 3 (5’ATT ACC GCG GCT GCT GG3') (Muyzer et al., 1993).

La mezcla de reacción fue la siguiente:

Reactivo Concentración final DNA

Regulador Oligonucleótidos

DNTPs Taq polimerasa

MgCl2 Agua

4 ng 1 X

0.4 pM 0.2 mM

1 unidad 3 mM

Hasta completar 25 μL Las condiciones para la PCR fueron las siguientes:

Temperatura Tiempo (°C) (seg)

No. de ciclos

Desnaturalización inicial 92 300 1

Cic

los Desnaturalización

Hibridación Polimerización

92 45 55 30 72 45

35

Extensión final 72 420 1 III.9.2 ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DESNATURALIZANTE (DGGE) Para la DGGE se prepararon las siguientes soluciones madre:

Solución A Solución B Capacidad relativa de desnaturalización 100 % 0 % Reactivo Acrilamida-Bis acrilamida (37.5:1) 40% 50 mL 50 mL TAE 50X 2.5 mL 2.5 mL Glicerol 5.0 mL 5.0 mL Urea 105.4 g 0 Formamida 100 mL 0

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Agua desionizada hasta completar 250 mL

Las soluciones se guardaron en frascos ámbar a 4°C. La solución A se

diluyó con la solución B para obtener los porcentajes de desnaturalización relativa

del 60% y 30%. Se prepararon dos tubos con 12 mL de las soluciones de alto y

bajo porcentaje, se agregaron 13 μL de TEMED y 40 μL de persulfato de amonio

al 10% (APS). El gradiente de desnaturalización se formó con un gradientador de

vasos comunicantes al tiempo que se introdujo la mezcla para llenar el espacio

entre los vidrios que contienen el gel, a los que previamente se les colocó un

cuadro de “gel bond”. Finalmente se preparó un tubo con 7 mL de solución B, 7 μL

de TEMED y 20 μL de APS al 10% con el cual se formó el gel de carga. Se dejó

polimerizar la poliacrilamida durante hora y media.

La cámara de electroforesis se llenó con amortiguador TAE 1X, se montó el

gel y se calentó a 60°C. Se colocaron las muestras en el gel (aproximadamente 20

μL con 4 μL del amortiguador de carga). Se corrió el gel a 200 V durante 5 min

para introducir las muestras al gel de carga. Para separar las muestras, el gel se

corrió a 85 V durante 16 h.

III.9.3 TINCIÓN Y OBSERVACIÓN DE PERFILES

La tinción con sales de plata se realizó en cuatro etapas:

1. Fijación. El gel se colocó en 200 mL de solución de fijación y se mantuvo en

agitación durante 3 min a 26 rpm.

2. Tinción. Posteriormente, el gel fijado se colocó en 200 mL de solución de

tinción y se mantuvo en agitación durante 10 min a 26 rpm. Después se

lavó con agua destilada durante 2 min.

3. Revelado. El gel se colocó en otra charola, que previamente se lavó con

aproximadamente 10 mL de la solución de revelado para eliminar las sales

contaminantes que pudieran precipitar la plata. Los geles se mantuvieron

en 200 mL de la solución de revelado y en agitación hasta la aparición de

las bandas. La reacción de revelado se detuvo añadiendo con 200 mL de

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solución de fijación durante 5 min. Después se lavó con 200 mL de agua

destilada durante 5 min.

4. Preservación: En seguida el gel se colocó en 200 mL de solución de

preservación en agitación durante 10 min.

Finalmente, el gel se colocó en un transiluminador de luz blanca y se digitalizó

en un Eagle Eye o con ayuda de una cámara forográfica. El análisis de los perfiles

obtenidos se realizó manualmente.

El análisis de DGGE se llevó a cabo para comparar la fracción bacteriana

cultivable con los amplificados de genes ribosomales provenientes del DNA

metagenómico, que teóricamente se aproxima a la comunidad bacteriana total. El

DNA metagenómico se aisló de las diferentes partes del tracto digestivo de 3-5

individuos (hembras y machos) de D. valens colectados en el campo. Las cepas

aisladas a partir de los tractos digestivos se crecieron en medio LB durante toda la

noche y posteriormente se les extrajo el DNA. Los productos de PCR se

obtuvieron a partir de la amplificación de la región 3 variable del gen 16S rRNA y

se separaron por electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante. La

población mínima de una especie detectable por PCR-DGGE usualmente debe

constituir al menos el 1% de la total de poblaciones que componen la comunidad

en estudio. Asimismo, las especies con poblaciones más abundantes forman las

bandas más intensas (Muyzer y Smalla, 1998).

III.9.4 DETECCIÓN POR PCR DE LOS GENES REPRESENTATIVOS DEL CICLO DEL NITRÓGENO.

Los genes que codifican para la amonio monooxigenasa (amoA), nitrito

reductasa dependiente de cobre (nirK) y citocromo cd1 (nirS), óxido nítrico

reductasa (nosZ) y 16S rRNA del género Nitrobacter se amplificaron por

procedimientos previamente descritos, cuyos oligonucleótidos iniciadores se

describen en el Cuadro 1.

Debido a que existen varias familias del gen que codifica para la

dinitrogenasa (nifH) y éstas mantienen una conservación a nivel de nucleótidos

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relativamente baja, fue necesario diseñar 4 juegos de iniciadores para PCRs

específicas que nos permitieran abarcar la mayoría de los miembros de cada una

de las familias de este gen. En la medida de lo posible se evitó incluir nucleótidos

degenerados para mantener una especificidad relativamente alta. Los

oligonucleótidos se diseñaron a partir de alineamientos múltiples de las

secuencias completas de los genes nifH disponibles en el banco de genes

(GeneBank). Cada par de iniciadores amplifica uno de los cuatro grupos o familias

de genes nifH reconocidos en el alineamiento (Cuadro 2).

Cuadro 2. Oligonucleótidos utilizados para amplificar los genes importantes en el ciclo del nitrógeno.

Gen Nombre del iniciador Secuencia (5’ →3’) Posición

Organismo (número de acceso del

gen en GenBank) Referencia

AmoA amoA1F

amoA2R

GGGGTTTCTACTGGTGGT

CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC

N 332-N349

N802-N822 Nitrosomonas europea Rotthauwe et al.,

1997

16S Rrna Nitrobacte

r

FGPS1269

FGPS872

TTTTTTGAGATTTGCTAG

CTAAAACTCAAAGGAATTGA Nitrobacter Degrande y

Bardin, 1995

NirK nirK1

nirK5

GGMATGGTKCCSTGGCA

GCCTCGATCAGRARCCAGGTTTCC

N526-N542

N1023-N1040 Alcaligenes faecalis Braker et al., 1998

NirS nirS1

nirS6

CCTAYTGGCCGCCRCART

CGTTGAACTTRCCGGT

N763-N780

N1638-N1653 Pseudomonas stutzeri Braker et al., 1998

NosZ

CAMP-Nos661

CAMP-

Nos1773

CTACTACTACTACGGCTGGGGGCTGACCAA

CATCATCATCATATRTCGATCARCTG

BTCG TT

N661-N691

N1773-N1803 Pseudomonas stutzeri Scala et al., 1999

NifH

nifHEnter-F

nifHEnter-R

nifHAzo-F

nifHAzo-R

nifHClo-F

nifHClo-R

nifHRFZ-F

nifHRFZ-R

ACACCATTATGGAGATGG

CTGATGGAGTTCGGCATC

GACTCCACCCGCCTGATCCT

ATGACCGTGATCGAATACGATC

GCTATTTAYGGAAARGTTG

ATGATGGCAHTRTATGC

TYGGCAAGTCCACCACC

TCCGGYGAGATGATGGCGC

N167-N184

N805-N822

N130-N152

N676-N697

N13-N26

N454-N470

N41-N57

N454-N472

Klebsiella pneumonie (43874)

Azotobacter vinelandii (M11579)

Clostridium pasteurianum (AY603957)

Azospirillum brasilense

(M64344)

Este trabajo

NifD nifD-F

nifD-R

CGCGGCTGCGCCTAYGCMGG

GARTGCATCTGRCGGAAMGG Este trabajo

La mezcla de reacción para las amplificaciones fue la siguiente.

Reactivo Concentración final DNA Regulador Oligonucleótidos

10-100 ng 1 X 1 pM

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dNTPs Polimerasa MgCl2 Agua

0.2 mM 1 unidad 3 mM Hasta completar 25 μL

Nota: Las cantidades de los reactivos pudieron variar dependiendo del protocolo descrito para cada gen en particular.

Las condiciones de la PCR para los genes nifH fueron las siguientes:

Temperatura Tiempo (°C) seg

No. de ciclos

Desnaturalización inicial 94 600 1

Cic

los Desnaturalización

Hibridación Polimerización

94 60 TMºC 60 72 60

35

Extensión final 72 600 1

Las temperaturas, los tiempos y el número de ciclos pueden variar dependiendo

del protocolo descrito para la amplificación de cada gen.

III.10 MÉTODOS BASADOS EN EL CULTIVO III.10.1 CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS HETERÓTROFAS De 5 a 10 partes del tubo digestivo de D. valens se colocaron en tubos con

PBS y se maceraron suavemente con perlas de vidrio. Posteriormente, se

hicieron diluciones decimales hasta 10-5 en regulador de fosfatos y se sembraron y

extendieron por duplicado 100 μL de cada dilución en cajas de Petri con medio de

gelosa nutritiva. Las cajas se incubaron a 28ºC durante 72 h. Los

microorganismos heterótrofos aerobios, cultivables y viables se reportaron en

UFC/tracto digestivo.

III.10.2 OBTENCIÓN DE DNA POR EL MÉTODO DE CULLEN Y HIRSCH Se cosechó la biomasa de un cultivo de 72 h, el DNA genómico de cada

cepa se obtuvo con una técnica previamente descrita (Cullen y Hirsch, 1988).

III.10.3 ANÁLISIS RAPD COMO PRUEBA TAMIZ PARA SECUENCIACIÓN Se desarrollaron PCR-RAPD’s (amplificación aleatoria del DNA polimórfico)

para distinguir entre los diferentes aislados de las cepas de bacterias aisladas de

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los insectos adultos colectados en el estado de Chihuahua y para dar prioridad a

los esfuerzos de identificación basada en el análisis de la secuencia del gen 16S

rRNA. De este modo se partió del supuesto que las cepas que desplegaron

perfiles de RAPD iguales pertenecen a la misma especie, mientras que perfiles

diferentes pertenecen es altamente improbable que pertenezcan a la misma

especie. Se empleó el iniciador OPB-01 (Williams et al., 1990) y la siguiente

mezcla de reacción.

Reactivo Concentración final DNA 5 ng

Regulador 1 X Iniciador 0.4 pM dNTPs 0.2 mM

Polimerasa 1 U MgCl2 3 mM Agua Hasta los 25 μL

Las condiciones generales para efectuar el RAPD fueron las siguientes:

1) Un ciclo de desnaturalización inicial a 94oC durante 5 minutos.

2) 40 ciclos con las siguientes condiciones:

i) Desnaturalización a 94oC durante 1 minuto.

ii) Hibridación a 38oC durante 1 minuto.

iii) Polimerización a 72oC durante 1 minuto.

3) Un ciclo final de

i) Polimerización a 72oC durante 1 minuto.

III.10.4 IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS AISLADAS.

Se realizaron infiriendo las relaciones filogenéticas utilizando la secuencia

del gen 16S rRNA. Se consideraron los criterios de Roselló-Mora que definen los

límites de especie (similitud >97%) y género (similitud entre 95% y <97%)

respectivamente (Rosello-Mora y Amann, 2002).

III.10.5 ENSAYO DE LA ACTIVIDAD CELULOLÍTICA La capacidad de degradar celulosa fue probada en los microorganismos

aislados pertenecientes al phylum Actinobacteria. Se emplearon cajas de agar

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Rojo Congo celulosa y la degradación de la celulosa se observó como un halo

amarillo o anaranjado alrededor de la colonia. La actividad de la enzima se definió

como el diámetro del halo claro dividido entre el diámetro de la colonia. Dos

mediciones de cada colonia fueron tomadas y al menos se les efectuó la medición

a dos colonias de cada microorganismo probado.

III.10.6 REDUCCION DE ACETILENO

Para estimar la fijación de nitrógeno, se llevaron a cabo ensayos de

reducción del acetileno. El acetileno fue producido mediante la disolución de

carburo de calcio en agua empleando una trampa de agua para capturar el

acetileno formado en la reacción. El acetileno fue inyectado en viales (10 mL) a

una concentración del 1% por reemplazo de un volumen idéntico de aire. El

ensayo se realizó en frascos viales que contenían un individuo (larva o adulto),

insectos esterilizados por calor húmedo fueron utilizados como testigos. Los

insectos se mantuvieron en este sistema cerrado durante de 68 h a 25°C. La

reducción de acetileno se midió por cromatografía de gases utilizando un detector

de ionización de flama (Varian 3300 gas chromatograph). Se realizó una ANOVA

de un factor para comprobar estadísticamente si existían diferencias significativas

entre todos los tratamiento formados y posteriormente si hubo diferencias

significativas se realizó la prueba secuencial de Tukey HSD con el programa

estadístico OpenStat4 ver 7 (Miller, 2005).

IV. RESULTADOS. (NO SE INCORPORARON LAS IMÁGENES POR MOTIVOS DE ESPACIO) IV.1 ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA ASOCIADA AL TRACTO DIGESTIVO DE Dendroctonus valens IV.1.1 DIVERSIDAD DETECTADA POR MÉTODOS BASADOS EN EL CULTIVO IV.1.1.1 CULTIVO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE LAS DIFERENTES REGIONES DEL TRACTO DIGESTIVO DE Dendroctonus valens

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La población total de bacterias heterótrofas aerobias cultivables en medio

gelosa nutritiva del tracto digestivo de D. valens fue de 2.11 x 106 UFC/intestino

aproximadamente. El proctodeo es la región que posee el mayor porcentaje (63%)

de la población total de bacterias heterótrofas aerobias, seguido del mesenterón

anterior y posterior (Cuadro 3.).

Cuadro 3. Número de bacterias por sección de tracto digestivo. Población de Bacterias heterótrofas aerobias (106

UFC/sección)a Especie Mesenterón anterior

Mesenterón posterior Proctodeo

Dendroctonus valens

0.41 ± 0.0621 0.34 ± 0.056 1.35 ± 0.067

a Los valores son la media de dos cuentas viables en medio gelosa nutritiva ± D. E.

Se aislaron 98 cepas provenientes de las diferentes secciones del tracto

digestivo de individuos de D. valens de las diferentes localidades geográficas.

La mayoría de las cepas fueron bacilos Gram negativos anaerobios

facultativos, también se aislaron algunos microorganismos Gram positivos. Tal es

el caso de las cepas MA1B, MA3A, MA2, PL2 y PL5 cuya identificación basada en

el gen 16S rRNA arrojó la presencia de las especies Janibacter melonis,

Cellulosimicrobium celulans, Leifsonia sp., Cellulomonas xylanilytica y

Cellulosimicrobium celulans.

IV.1.1.2 Análisis RAPD La PCR-RAPD con el oligonucleótido OPB-01 produjo 4 patrones de

bandas diferentes en las 22 cepas de bacterias aisladas del tracto digestivo de

insectos adultos de D. valens obtenidos en la localidad de San Juanito Chihuahua

(Fig. 4). La cepa 1.10E resultó ser una levadura por lo que su patrón desplegado

no fue considerado. Figura 4. Patrones obtenidos por la técnica de RAPD con el oligonucleótido OPB-01 del DNA genómico de las cepas aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de Dendroctonus valens, de la localidad de San Juanito Chihuahua (M. Marcador de talla molecular).

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Este mismo oligonucleótido produjo 8 patrones diferentes en las 17 cepas

de bacterias aisladas del tracto digestivo de larvas de D. valens de la localidad del

CICS, Milpa Alta, Distrito Federal (Fig. 5).

Figura 5. Patrones obtenidos por la técnica de RAPD con el oligonucleótido OPB-01 del DNA genómico de las cepas aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de Dendroctonus valens, del CICS, Milpa Alta, Distrito Federal (M. Marcador de talla molecular y TN Testigo negativo)

Tomando como molde el DNA de las 33 cepas de la localidad de El Wicle,

Casas Grandes, Chihuahua el oligo desplegó 4 patrones diferentes (Fig. 6). La

cepa P6W no fue considerada para secuenciación por tratarse de un posible

contaminante. Figura 6. Patrones obtenidos por la técnica de RAPD con el oligonucleótido OPB-01 del DNA genómico de las cepas aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de Dendroctonus valens, de El Wicle, Casas Grandes, Chihuahua (M. Marcador de talla molecular)

Para los insectos provenientes de la localidad de Los Pozos, Gómez Farias,

Jalisco se procedió a aislar microorganismos en gelosa nutritiva y en el medio

propuesto por Bridges para el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno, así

se obtuvieron un total de 26 cepas las cuales desplegaron 8 patrones diferentes

(Fig. 7). Figura 7. Patrones obtenidos por la técnica de RAPD con el oligonucleótido OPB-01 del DNA genómico de las cepas aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de Dendroctonus valens, de los Pozos, Gómez Farías, Jalisco (M. Marcador de talla molecular)

En resumen, todas las cepas consideradas se agruparon de acuerdo al

perfil RAPD desplegado y de ahí se seleccionaron entre 1 y 3 cepas de cada perfil

para su identificación molecular mediante el análisis de la secuencia del gen 16S

rRNA (Cuadro 4).

Cuadro 4. Clasificación de las cepas aisladas del tracto digestivo de Dendroctonus valens de acuerdo a los patrones que desplegaron con la técnica de

PCR-RAPD empleando el oligonucleótido OPB-01.

PATRÓN CEPAS 1 3J, 12EF, 8EF, 11J, 8J, 10EF, 1.7E, 6EF, 7EF, 13EF,

1.4E y 17EF 2 5EF y 1EF 3 15EF y 5EFB S

an

Juan

ito,

Chi

huah

ua

4 2EF LOC

ALI

DA

D

C I C I 1L

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II 2LA, 6L, 7L, 17LA, 17LB y 3L III 2LB IV 3LA, 12L y 19LB V 8L VI 4L y 9L VII 16L y 5L VIII 19LA A 1WB B 2WA, 2WC, 4WD, 4WB, 6WD, 8WB y 8WA C 3WB, 3WD, 9WA, 9WB, 10WA y 10WC

El W

icle

, Cas

as

Gra

ndes

, C

hihu

ahua

.

D 5WA, 5WB, 7WB, 7WD, 11WA, 11WD, 12WA, 12WB, 13WD, 13WC, 14WC, 14WD, P1W, P2W, P3W, P5W,

P7W y P8W

a MA1B, MA1A, PL3B Y PL3A b MA2, MA4, PL1 c MA3A d MA3B, MA1Bfx, PL4, MP3A Y MP3B e MP1 f MP3AB, PL5, MA1Afx, MPABfx, P1Afx, P1Bfx, P2fx,

P3Afx y P3Bfx g PL2 Lo

s P

ozos

, Góm

ez

Faría

s, J

alis

co.

h MP1Afx y MP2fx

5.1.1.3 AMPLIFICACIÓN DEL GEN 16S rRNA. El gen 16S rRNA se amplificó a partir del DNA genómico de las cepas

aisladas del tracto digestivo de insectos adultos de D. valens que desplegaron

patrones de RAPD diferentes, los fragmentos del tamaño esperado (1,500 pb

aproximadamente) se muestran en la Fig. 8.

Figura 8. Amplificación del 16S rRNA de las cepas aisladas del tracto digestivo de Dendroctonus valens. (M. Marcador de talla molecular)

IV.1.1.4 ANÁLISIS FILOGENÉTICO

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El cultivo de bacterias heterótrofas aerobias hemos mostró 11 géneros

bacterianos asociados al tracto digestivo de larvas y adultos de D. valens. El

análisis de las secuencias del gen 16S rRNA de estos microorganismos indicó que

el 54.5% correspondieron a géneros del phylum γ-Proteobacteria y el 45.5% al

phylum Actinobacteria (Cuadro 5).

El tamaño de las secuencias de cepas representativas de los diferentes

patrones de RAPD varió entre 1268 y 1449 nucleótidos y el alineamiento final

consto de 1521 nucleótidos, los gaps no fueron considerados en el análisis. La

topología de estas secuencias y las obtenidas del GenBank se muestra en la

figura 9.

Cuadro 5. Aislados bacterianos obtenidos del tracto digestivo de Dendroctonus

valens identificados mediante el análisis de la secuencia del 16S rRNA.

Aislado Porcentaje

de similitud

(%)

Organismo conocido más cercano (No. de acceso) Phylum

13EF 97.9 17EF 98

3J 98 6J 97.8 7J 98 9J 97.8

2LB 98.1 2WA 98 3WB 97.7

Rahnella aquatilis (U90757)

1EF 99.2 2EF 99.7 15EF 99.7 19LA 99.2

Serratia liquefaciens (AJ306725)

2LA 99.8 3LA 99.7

Serratia proteamaculans (AY040208)

1WB 98.8 5WA 98.6 11WA 98.9 P7W 98.8

Enterobacter aerogenes (AJ251468)

16L 99.4 Pantoea cedenensis (AF130971) 1L 96

MP1Afx 97 Erwinia mallotivora (AJ233414)

γ-Proteobacteria

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MP1 96.9 8L 98.8 Acinetobacter lwoffii (DQ328322)

MA3B 97.8 Acinetobacter haemolyticus (AM184255) 4L 99.4 Stenotrophomonas maltophilia (DQ424872)

MA2 98.8 Leifsonia shinshuensis (DQ232614) MA1B 99.6 Janibacter melonis (AY522568) PL5 98.5 Cellulosimicrobium cellulans (AY665978)

MA3A 98.6 PL2 99.2

Cellulomonas xylanilytica (AY303668)

Actinobacteria

Figura 9. Relaciones filogenéticas de las secuencias del gen 16S rRNA de las cepas aisladas del tracto digestivo de Dendroctonus valens. El árbol se construyó a partir de un alineamiento múltiple de secuencias de 1521 nucleótidos de γ-proteobacterias y actinobacterias empleando el modelo de Jukes-Cantor y el método de agrupamiento de Neighbor-joining.

En el Cuadro 5 se muestra la asignación de las clonas a nivel de especie y

la ubicación en los correspondientes Phyla bacterianos. De este modo se

identificaron nueve especies de γ-proteobacterias y 4 de actinobacterias. Por otra

parte, en el Cuadro 6 se correlacionan los patrones desplegados por las cepas

mediante la técnica de RAPD-PCR y su afiliación taxonómica de las cepas

representativas de cada patrón de RAPD.

En la topología las cepas 2WA, 3WB, 2LB, 3J, 7J, 6J, 9J, 13EF, y 17EF se

asociaron con secuencias de microorganismos asociados a cepas de Rahnella

aquatilis aisladas del tracto digestivo de larvas y adultos de Dendroctonus frontalis

(Vasanthakumar et al., 2006).

Las cepas 1EF, 2EF, 15EF, 2LA, 3LA, y 19LA se asociaron con especies

del género Serratia; las cepas 1WB, 5WA, 11WA y P7W se agruparon con

Enterobacter aerogenes, la cepa 16L se agrupa con Pantoea cedenensis y las

cepas MP1Afx, MP1 y 1L se agruparon con secuencias de cepas obtenidas de D.

frontalis (Vasanthakumar et al., 2006), todas ellas se agruparon con la secuencia

de una Erwinia mallotivora.

La cepa 4L se agrupó con Stenotrophomonas maltophilia, la cual ha sido

reportada como un organismos capaz de fijar nitrógeno (Park et al., 2005), la cepa

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MA3B se agrupó con Acinetobacter haemolyticus y la cepa 8L con Acinetobacter

lwoffii.

Las cepas MA1B y MA2 se asociaron con Janibacter melonis y Leifsonia

shinshuensis respectivamente; las cepas MA3A y PL5 se asociaron con

Cellulomicrobium cellulans y la cepa PL2 con Cellulomonas xylanilytica.

Los porcentajes de similitud de las secuencias obtenidas con aquellas de

microorganismos reportadas en el banco de genes se muestran en el cuadro 5.

Las cepas 2LB, 3J, 9J, 13EF, 7J, 6J y 17EF tienen una similitud del 97.7-98.1%

con la secuencia de Rahnella aquatilis (U90757), las cepas 1EF, 2EF, 15EF y

19LA tuvieron una similitud de 99.2-99.7% con la secuencia de Serratia

liquefaciens (AJ306725). Mientras que las secuencias 2LA y 3LA tuvieron una

similitud del 99.8 y 99.7% con la secuencia de Serratia proteamaculans

(AY040208); no obstante todas ellas también tuvieron porcentajes de similitud muy

altos con otras cepas del genero Serratia (Datos no mostrados). Las cepas1WB,

5WA, 11WA y P7W presentaron una similitud del 98.6-98.9% con la secuencia de

Enterobacter aerogenes (AJ251468), la cepa 16L del 99.4% con la secuencia de

Pantoea cedenensis (AF130971) y las cepas 1L, MP1Afx y MP1 presentaron una

similitud del 96-97% con la secuencia de Erwinia mallotivora (AJ233414). La cepa

8L se asoció con un 98.8 con Acinetobacter lwoffii (DQ328322), la cepa MA3B

presentó una similitud del 97.8% con Acinetobacter haemolyticus (AM184255) y la

cepa 4L posee un similitud del 99.4% con Stenotrophomonas maltophilia

(DQ424872). Todos estos organismos pertenecen al phylum γ-Proteobacteria.

En éste mismo cuadro podemos observar que la cepa MA2 tuvo una

similitud del 98.8% con Leifsonia shinshuensis (DQ232614), la cepa MA1B del

99.6% con Janibacter melonis (AY522568), la cepa PL5 tuvo un 98.5% de similitud

con Cellulosimicrobium cellulans (AY665978) y la cepa MA3A y PL2 del 98.6-

99.2% con Cellulomonas xylanilytica (AY303668). Todos estos microorganismos

pertenecen al phylum Actinobacteria.

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Cuadro 6. Afiliación filogenética de las secuencias de los genes 16S rRNA de las cepas aisladas del tracto digestivo de D. valens.

Relación filogenética Localidad

Estadio del

Insecto colectado

Patrón desplegado

de PCR-RAPD

Aislado representativo

Especie más cercana reportada en GenBank

(No. de acceso) Similitud

(%) Grupo microbiano de

afiliación

1 3J, 13EF, 17EF Rahnella aquatilis (U90757)

98, 97.9, 98

Rahnella aquatilis

2 1EF Serratia liquefaciens (AJ306725)

99.2 Serratia liquefaciens

3 15EF Serratia liquefaciens (AJ306725)

99.7 Serratia liquefaciens

San Juanito, Chihuahua 27o55’22’’ N

107º55’47’’ O

Adultos

4 2EF Serratia liquefaciens (AJ306725)

99.7 Serratia liquefaciens

I 1L Erwinia mallotivora (AJ233414)

96 Erwinia sp. o Pantoea sp.

II 2LA Serratia proteamaculans (AY040208)

99.8 Serratia proteamaculans

III 2LB Rahnella aquatilis (U90757)

98.1 Rahnella aquatilis

IV 3LA Serratia proteamaculans (AY040208)

99.7 Serratia proteamaculans

V 8L Acinetobacter lwoffii (DQ328322)

99.8 Acinetobacter lwoffii

VI 4L Stenotrophomonas maltophilia

(DQ424872)

99.4 Stenotrophomonas maltophilia

VII 16L Pantoea cedenensis (AF130971)

99.4 Pantoea cedenensis

CICS, Milpa Alta, Distrito

Federal 19º 04’ N 98º 58’ O

Larvas

VIII 19LA Serratia liquefaciens (AJ306725)

99.2 Serratia liquefaciens

A 1WB Enterobacter aerogenes (AJ251468)

98.8 Enterobacter aerogenes

B 2WA Rahnella aquatilis (U90757)

98 Rahnella aquatilis

C 3WB Rahnella aquatilis (U90757)

97.7 Rahnella aquatilis

El Wicle, Casas Grandes,

Chihuahua 30º09’76’’ N

108 º 57’03’’ O

Adultos

D 5WA, 11WA, P7W

Enterobacter aerogenes (AJ251468)

98.6, 98.9, 98.8

Enterobacter aerogenes

a MA1B Janibacter melonis (AY522568)

99.6 Janibacter melonis

b MA2 Leifsonia shinshuensis (DQ232614)

98.8 Leifsonia shinshuensis

c MA3A Cellulomonas xylanilytica (AY303668)

98.6 Cellulomonas xylanilytica

d MA3B Acinetobacter haemolyticus (AM184255)

97.8 Acinetobacter haemolyticus

e MP1 Erwinia mallotivora (AJ233414)

96.9 Erwinia sp. o Pantoea sp.

f PL5 Cellulosimicrobium cellulans

(AY665978)

98.5 Cellulosimicrobium cellulans

g PL2 Cellulomonas xylanilytica (AY303668)

99.2 Cellulomonas xylanilytica

Los Pozos, Gómez Farías,

Jalisco 19º88’20’’ N

103º40’40’’ O

Adultos

h MP1AFx Erwinia mallotivora (AJ233414)

97 Erwinia mallotivora

IV.1.1.5 ACTIVIDAD CELULOLÍTICA Al observar que algunos de las cepas aisladas se identificaron como

Cellulomonas xylanilytica y Cellulosimicrobium cellulans, especies en las que se

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ha reportado la capacidad de degradar la celulosa (Schumann, 2001; Rivas 2004),

se decidió hacer un ensayo para evaluar la actividad celulolítica de las cepas del

phylum Actinobacteria empleando agar rojo congo celulosa (Cuadro 7 y Fig. 10).

La población de bacterias celulolíticas aerobias asociadas al tracto digestivo de D.

valens fue de 9 x 102 ± 2.1 x 102 UFC/tracto digestivo.

Cuadro 7. Actividad celulolítica de las cepas pertenecientes al phylum Actinobacteria asociadas al canal alimentario de Dendroctonus valens.

Insecto de procedencia

Clave del aislado

Grupo microbiano de afiliación

Actividad enzimáticaa

PL2 Cellulomonas xylanilytica 2.7

PL5 Cellulosimicrobium cellulans 2.9

MA1B Janibacter melonis 3

MA2 Leifsonia shinshuensis 3.1

Dendroctonus valens

(Adulto)

MA3A Cellulomonas xylanilytica 2.4 aLa actividad enzimática se definió como el diámetro del halo claro dividido entre el diámetro de la colonia.

Figura 10 Actividad celulolítica de algunas de las cepas aisladas en agar rojo congo. A. MA1B Janibacter melonis, B. PL2 Cellulomonas xylanilytica, C. PL5 Cellulosimicrobium cellulans.

La capacidad de algunas de las cepas de degradar la celulosa es una

evidencia indirecta de la posible participación de los microorganismos asociados al

canal alimentario de D. valens en la digestión de la celulosa.

IV.1.1.6 REDUCCIÓN DE ACETILENO EN LOS INSECTOS La reducción de acetileno fue detectada en larvas e insectos adultos vivos

(15.96 ± 2.22; 12.59 ± 3.39 nmol de etileno/h/insecto; promedio ± ES), mientras

que en larvas e insectos adultos muertos y esterilizados, y en el testigo sin

insectos no se encontró actividad (1.12 ± 0.47; 0.34 ± 0.22; 0 ± 0 nmol de

etileno/h/insecto; promedio ± ES) (ANOVA de un factor: F= 15.09; P < 0.05). Estos

resultados indican que la fijación de nitrógeno ocurre in vivo en D. valens (Fig. 11)

y nos permite deducir que algún miembro de la comunidad procariótica asociada al

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insecto realizó esta actividad, dado que es conocido que ninguna célula u

organismo eucariote tiene la capacidad para fijar nitrógeno molecular.

Figura. 11 Actividad de la nitrogenasa in vivo en larvas y adultos de D. valens. (LV, Larvas vivas; AV, Adultos vivos; LM, Larvas muertas esterilizadas; AM, Adultos muertos esterilizados; T, Testigos con papel.) (Las barras representan el error estándar).

Al efectuar la prueba de Tukey HSD encontramos que no existen

diferencias significativas entre la cantidad de etileno producido por las larvas y los

adultos (q= 1.645; P > 0.05) y si se encuentra una diferencia significativa entre los

experimentos efectuados con individuos vivos y los realizados con individuos

muertos y esterilizados, como ya se mencionó anteriormente (L.V.-L.M.: q=7.251;

A.V.-A.M.: q=5.99; P < 0.05; nomenclatura como en la figura 11).

IV.1.2 DIVERSIDAD DETECTADA POR MÉTODOS MOLECULARES IV.1.2.1 ANÁLISIS RFLP DE LAS CLONAS POSITIVAS Para evitar la secuenciación excesiva de las clonas de la librería de genes

ribosomales de las diferentes partes del tracto digestivo de hembras de D. valens

se efectuó una prueba de polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción

(RFLP) empleando la enzima HpaII (Moyer et al.,1996). Un total de 12 patrones

diferentes fueron observados. El mesenterón anterior y el proctodeo desplegaron

10 y 6 patrones diferentes respectivamente (Fig. 12 y Fig. 13). Ambas regiones

anatómicas del canal alimentario compartieron 4 patrones RFLP.

Figura 12. Perfiles de restricción de la enzima HpaII de las clonas de la librería de genes ribosomales del mesenterón anterior de hembras de D. valens. Cada color representa un patrón diferente. Los patrones que son iguales en este despliegue, pero que muestran un color diferente, fueron distinguidos a partir de su patrón desplegado con EcoRI.

Figura 13. Perfiles de restricción de la enzima HpaII de las clonas de la librería de genes ribosomales del proctodeo de hembras de D. valens. Cada color representa un patrón diferente. Los patrones que son iguales en este despliegue, pero que muestran un color diferente, fueron distinguidos a partir de su patrón desplegado con EcoRI.

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IV.1.2.2 ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS DE LAS CLONAS DE LAS LIBRERIAS DE GENES RIBOSOMALES. Mediante la construcción de librerías de genes ribosomales logramos

asociar cuatro géneros bacterianos al mesenterón anterior y proctodeo de

hembras adultas de D. valens y ambas librerías se analizaron conjuntamente. El

análisis de las secuencias con el programa CHIMERA-CHECK permitió reconocer

que varias clonas correspondían a quimeras, posiblemente formadas durante la

amplificación de los genes ribosomales a partir del DNA metagenómico. En el

resto de las secuencias (n=9) se identificaron hasta especie miembros de los

géneros Rahnella, Erwinia o Pantoea, Lactococcus y Acinetobacter (Fig. 14).

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Figura 14. Relaciones filogenéticas de las secuencias del gen 16S rRNA de las clonas obtenidas de las librerías de genes ribosomales del DNA metagenómico del tracto digestivo de Dendroctonus valens. El árbol se construyó a partir de un alineamiento de 1593 bases de secuencias de γ-proteobacterias y firmicutes empleando el modelo de sustitución de Kimura 2 Parámetros y el método de agrupamiento de Neighbor-joining.

En el Cuadro 8 se correlacionan los patrones desplegados por las clonas

mediante la técnica de RFLP y su afiliación taxonómica obtenida a partir de la

secuenciación del gen 16S rRNA.

Cuadro 8. Afiliación filogenética de las secuencias de los genes 16S rRNA de las clonas obtenidas

a partir de las librerías de genes ribosomales del DNA metagenómico del tracto digestivo de D. valens.

Relación filogenética

Localidad Estadio

del Insecto

colectado

Patrón desplegado por RFLP

(número de clonas)

Clona representativa

Especie más cercana reportada en GenBank

(No. de acceso) Similitud

(%) Grupo microbiano de

afiliación

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A (8)

MAF16 PF1

Lactococcus lactis (EU104368)

99.5 99.5

Lactococcus lactis

B (7)

PF4 Lactococcus lactis (EU104368)

99.5 Lactococcus lactis

C (1)

PF23 Acinetobacter schindleri (AJ275041)

99.1 Acinetobacter schindleri

El Wicle, Casas

Grandes, Chihuahua 30º09’76’’ N

108 º 57’03’’ O

Adultos

(Hembras)

D (1)

MAF20 Quimera ---- ----

E (8)

MAF2 Rahnella aquatilis (U90757)

96.8 Rahnella sp.

F (4)

MAF7

PF20

Rahnella aquatilis (U90757)

Pantoea dispersa (AB273743)

97.7

97.6

Rahnella aquatilis

Pantoea dispersa G (9)

PF22 Quimera ---- ----

H (3)

MAF4 Rahnella aquatilis (U90757)

97.5 Rahnella aquatilis

I (1)

MAF15 Rahnella aquatilis (U90757)

97.8 Rahnella aquatilis

J (1)

MAF26 Quimera ---- ----

K (1)

MAF34 Quimera ---- ----

L (1)

MAF35 Quimera ---- ----

IV.1.2.3 ANÁLISIS DE RAREFACCIÓN E ÍNDICES DE DIVERSIDAD

Las curvas de rarefacción de las librerias construidas a partir de DNA

metagenómico del canal alimentario de hembras adultas de D. indican que existe

una comunidad bacteriana relativamente simple, es decir con una riqueza de

especies baja (Fig. 15, 16 y 17). Aunque no se obtuvo una forma asintótica en la

curva de rarefracción de la librería de genes ribosomales a nivel de especie, es

decir con un máximo de 3% de disimilitud, la gráfica adquiere una tendencia

asintótica cuando analizamos las secuencias a nivel de género y phylum, lo que

implica considerar las secuencias con una diferencia no mayor al 5% y 20%

respectivamente (Fig. 16 y 17). Esto sugiere que logramos reconocer la mayoría

de los géneros y phyla asociados al tracto digestivo de este insecto.

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Figura 15. Análisis de rarefacción de la librería del gen 16S rRNA construida a partir del DNA del tracto digestivo de 3 individuos hembra adultos de D. valens. La curva de rarefacción se construyó con base a análisis hecho en DOTUR empleando el algoritmo de asignación del vecino más lejano. La curva de rarefacción representa a las secuencias con una similitud del 97% entre ellas, lo cual corresponde al nivel taxonómico de especie.

Figura 16. Análisis de rarefacción de la librería del gen 16S rRNA construida a partir del DNA del tracto digestivo de 3 individuos hembra adultos de Dendroctonus valens. La curva de rarefacción se construyó con base en un análisis hecho en DOTUR empleando el algoritmo de asignación del vecino más lejano. La curva de rarefacción representa a las secuencias con una similitud del 95% entre ellas, lo cual corresponde al nivel taxonómico de género.

Figura 17. Análisis de rarefacción de la librería del gen 16S rRNA construida a partir del DNA del tracto digestivo de 3 individuos hembra adultos de D. valens. La curva de rarefacción se construyó con base a análisis hecho en DOTUR empleando el algoritmo de asignación del vecino más lejano. La curva de rarefacción representa a las secuencias con una similitud del 80% entre ellas, lo cual corresponde al nivel taxonómico de phylum.

Para determinar si se había analizado un número suficiente de secuencias

de la librería de genes ribosomales construida se calculó el estimador no

paramétrico de la riqueza de especies Chao 1. La curva de colector para el

estimador Chao 1 con una diferencia del 3% entre las secuencias muestra una

línea asintótica, lo cual indica que la mayoría de las especies ya han sido

analizadas (Datos no mostrados). La riqueza de Chao1 terminal estimada para la

librería ribosomal analizada fue de 5 OTUs, en la cual una OTU fue definida como

un grupo de secuencias que no difieren más del 3% entre ellas, es decir a nivel

de especie.

IV.1.2.4 PCR-DGGE DE LA REGIÓN V3 DE GENES RIBOSOMALES El número mayor de bandas (n=12) fue desplegado en el mesenterón

anterior y el proctodeo de hembras adultas de D. valens. En el caso de los machos

las regiones que desarrollaron el mayor número de bandas fue el mesenterón

anterior y el proctodeo con 8 bandas cada uno. Si consideramos a cada una de las

bandas desplegadas en el DGGE como una especie diferente de microorganismo

podemos asumir que la comunidad bacteriana asociada a las diferentes partes del

tracto digestivo es relativamente simple (12 especies) y que mantiene cierta

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homogeneidad a lo largo del canal alimentario (6 especies en común),

presentándose la mayor diversidad en el proctodeo (Fig. 18).

En total se comparten 6 bandas en todas las regiones del canal alimentario

tanto de hembras como de machos y solamente la banda No. 9 es exclusiva del

tracto digestivo de los machos (Fig. 18).

Durante las repeticiones del DGGE se observó que en la mayoría de los

geles la región que constantemente mostraba el mayor número de bandas era el

proctodeo tanto en las hembras como en los machos (Datos no mostrados).

También se observó que algunas bandas aparecían esporádicamente y existían

pequeñas variaciones en el patrón desplegado por las diferentes secciones del

canal alimentario tanto de hembras como de machos, lo que posiblemente indica

que la estructura poblacional que albergan estos insectos puede cambiar durante

el transcurso del tiempo o que hay un cierto grado de variación en la comunidad

de especies bacterianas en este hábitat (Datos no mostrados).

Al comparar los patrones desplegados por los amplificados de la región 3V

del 16S rDNA de las diferentes secciones del tracto digestivo y algunas de las

cepas aisladas podemos observar que la banda No. 5 puede corresponder a

Rahnella aquatilis y la banda No. 6 a Enterobacter aerogenes, dado que estas

bandas comigraron a la misma altura en ambos casos (Fig. 19).

Las banda No. 5 es muy evidente en el proctodeo de machos, lo cual nos indica

que la población de E. aerogenes es una de la más abundantes en esta sección.

Por otro lado, la banda No. 6 se presenta con gran intensidad en todas las

secciones del canal alimentario de hembras y machos. Lo anterior nos indica que

R. aquatilis es una bacteria que se encuentra ampliamente distribuida en el tracto

digestivo de este insecto.

Figura 18. PCR-DGGE de la región 3 variable de los genes 16S rRNA obtenidos a partir del DNA metagenómico de las diferentes partes del tracto digestivo de individuos colectados en el campo de D. valens. Los productos fueron separados por electroforesis en un gradiente de urea formamida del 30 al 60%.

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Figura 19. PCR-DGGE de la región 3 variable de los genes 16S rRNA obtenidos a partir del DNA metagenómico de las diferentes partes del tracto digestivo de individuos de D. valens y algunas cepas aisladas. Los productos fueron corridos en un gradiente urea formamida (30-60%). La flecha No. 5 representa a una de las bandas que despliega Rahnella aquatilis y la flecha No. 6 representa a una de las bandas que despliega Enterobacter aerogenes, estos dos organismos fueron aislados e identificados mediante la secuenciación del gen 16S rRNA.

IV.1.2.5 DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA AMPLIFICAR EL GEN nifH. Debido a la falta de resultados positivos al tratar de amplificar el gen nifH

con los oligonucleótidos originalmente propuestos para efectuar éste trabajo, se

diseñaron nuevos. Los iniciadores se diseñaron a partir del alineamiento de

secuencias completas del gen nifH obtenidas del banco de genes de la NCBI, la

secuencia de los oligonucleótidos propuestos, la temperatura de alineamiento, el

tamaño del amplificado esperado y al grupo de microorganismos a los cuales van

dirigidos se resumen en el cuadro No. 9. Ahora que se tienen identificadas las

bacterias que posiblemente fijen nitrógeno se diseñaran oligos específicos para

amplificar el gen nif H con base a las secuencias de este gen ya reportadas en la

literatura.

Cuadro 9. Oligonucleótidos diseñados para la amplificación del gen nifH Grupo

microbiano Oligonucleótidos Secuencia (5´- 3´) Tm

(oC) Tamaño

esperado (pb)

Fentero ACACCATTATGGAGATGG Enterobacterias Rentero GATGCCGAACTCCATCAG

54 650

Fazoto GACTCCACCCGCCTGATCCT Azotobacter spp. Razoto GATCGTATTCGATCACGGTCAT

65 550

Fclos GCTATTTAYGGAAARGTTG Clostridium spp. Rclos GCATAYADTGCCATCATT

51 450

FFRA TYGGCAAGTCCACCACC Frankia-Rhizobium-Azospirillum

RFRA GCGCCATCATCTCRCCGGA 55 400

5.1.2.6 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES IMPORTANTE EN EL CICLO DEL NITRÓGENO Hasta el momento sólo hemos logrado amplificar el gen nifH de

enterobacterias en el mesenterón anterior del macho (Fig 20.) y el gen nifD en

todas las partes del tubo digestivo de hembras (Fig. 21). La presencia de estos

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genes, el aislamiento de bacterias capaces de reducir el acetileno y la reducción

de acetileno que llevaron a cabo larvas y adultos de D. valens in vivo son

evidencias de que existen poblaciones de microorganismos asociados al tracto

digestivo del descortezador que son capaces de fijar nitrógeno y estarían

participando activamente en el suplemento de la dieta de este insecto con

compuestos nitrogenados asimilables.

Figura 20. Amplificación del gen nifH de enterobacterias a partir del DNA metagenómico de las diferentes partes del canal alimentario de D. valens.

Figura 21. Amplificación del gen nifD a partir del DNA metagenómico de las diferentes partes del canal alimentario de D. valens.

Otros genes bacterianos asociados al ciclo del nitrógeno (amonio

monooxigenasa (amoA), nitrito reductasa dependiente de cobre (nirK) y citocromo

cd1 (nirS), óxido nítrico reductasa (nosZ) y los genes 16S rRNA del género

Nitrobacter) no han sido amplificado, a pesar de que se han ensayado diferentes

condiciones de amplificación por PCR (Datos no mostrados).

DISCUSION Los insectos son unas de las formas de vida más exitosas sobre el planeta.

Uno de los factores más importantes del éxito de los insectos es que se han

adaptado a una amplia variedad de dietas. La flexibilidad de los hábitos

alimentarios de los insectos está asociada, de manera muy significativa, a la

contribución que llevan a cabo los microorganismos del intestino. Por otro lado,

poco se sabe acerca de la diversidad, fisiología y ecología de los microorganismos

asociados al tracto digestivo de los escarabajos que se desarrollan dentro de la

madera y la corteza de los árboles (Brand et al., 1975; Bridges, 1981; Bridges et

al., 1984; Delalibera et al., 2005; Moore 1972a, b; Vasanthakumar et al., 2006).

Por lo que el presente trabajo pretende contribuir al conocimiento de la diversidad

de bacterias y genes bacterianos relevantes asociados al tracto digestivo de D.

valens. Para lograr entender las posibles contribuciones que tienen los

microorganismos del intestino en la digestión y nutrición de su huésped es

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necesario identificarlos y asociarlos a un nicho ecológico. Este es el primer trabajo

que estudia la microbiota asociada al canal alimentario de D. valens empleando

métodos basados en el cultivo y métodos independientes del cultivo.

El tracto digestivo de D. valens está constituido por las regiones estomodeo,

mesenterón y proctodeo que poseen estructuras tisulares bien diferenciadas y las

cuales están separadas por dos estrechamientos parecidos a una válvula (Díaz et

al., 1998). En este trabajo, inicialmente se encontró que el número de bacterias

cultivables asociadas al proctodeo es un orden de magnitud mayor al observado

en las otras dos secciones del mesenterón (Cuadro 3). Este resultado coincide con

otros trabajos realizados con otros artrópodos como termitas, cucarachas y grillos,

en los cuales se ha determinado que el proctodeo alberga un mayor número de

bacterias cultivables que otras partes del tracto digestivo (Breznak, 1982; Cruden

y Markovetz, 1984; Ulrich et al., 1981). La misma conclusión fue alcanzada

empleando técnicas basadas en la microscopía de fluorescencia donde se

determinó que el número de bacterias que residen en el proctodeo de las

cucarachas Periplaneta americana, Periplaneta australasia, Pynoscelus

surinamensis, Blaberus fuscus y Gromphadorhina portentosa era diez veces

mayor al número encontrado en el estomodeo y mesenterón. En este mismo

trabajo se reportó que los proctodeos del miliápodo (Chicobulus sp), del grillo

(Acheata domestica) y del escarabajo (Pachnoda marginata) presentan un mayor

número de bacterias (Cazemier et al., 1997). El elevado número de bacterias

asociadas al proctodeo de D. valens sugiere, que esta parte del tubo alimentario

juega un papel muy importante en el proceso digestivo de este insecto.

Los resultados reportados en este trabajo demuestran que el mesenterón y

proctodeo de D. valens albergan una comunidad bacteriana poco diversa. Los

métodos basados en el cultivo y los independientes de éste permitieron reconocer

e identificar tan sólo 17 especies bacterianas (Cuadros 6 y 8) pertenecientes a los

grupos de γ-Proteobacteria, Actinobacteria y Firmicutes (Fig. 9 y 14). Esta

aparente baja diversidad observada se hace evidente cuando la comparamos con

la diversidad bacteriana observada en los intestinos de las termitas, los cuales

albergan 50 filotipos (Okhuma et al., 1996). En trabajos realizados en otros

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coleópteros (Pachnoda ephippiata y Melolontha melolonta) se reportó que la

comunidad microbiana asociada a sus tractos digestivos pertenece a los

Firmicutes (Lactobacillales, Clostridiales y Bacillales), Actinobacteria, γ−, β− y

δ−Proteobacteria, Bacteroidetes, y Actinobacteria (Egert et al., 2003 y 2005). Los

trabajos antes mencionados poseen un número amplio de microorganismos

identificados, lo cual contrasta con nuestros resultados y pone en evidencia la

escasa diversidad de microorganismos que se encuentran alojados en el canal

alimentario de D. valens. El único trabajo previo que explora la diversidad

microbiana en el tracto digestivo de una especie del género Dendroctonus, es el

de D. frontalis, en donde los microorganismos se afiliaron a los grupos α,

γ−Proteobacteria y Firmicutes (Vasanthakumar et al., 2006), lo cual concuerda con

los resultados que se obtuvieron en este trabajo.

Particularmente, no hemos encontrado microorganismos anaerobios

estrictos (Clostridiales y Bacteroidetes) que comúnmente se encuentran asociados

al canal alimentario de otros insectos (Egert et al. 2005; Moran et al., 2005;

Ohkuma et al., 1996), esto posiblemente es debido a que en el tracto digestivo de

D. valens no se alcanzan niveles de potencial de óxido-reducción suficientemente

bajos como los que se observan en los intestinos de termitas y otros insectos.

Entre las bacterias cultivables que se identificaron en este trabajo se

encuentran Rahnella aquatilis, Enterobacter aerogenes, Stenotrophomonas

maltophilia, Pantoea sp., Acinetobacter sp. y Serratia sp. Estos microorganismos

también se han detectado en D. frontalis. Sin embargo, en D. valens no se logró

documentar la presencia de bacterias como Pseudomonas fluorescens, Bacillus

sp., Microccocus sp., Mycoplasma sp., Rhodobacter sp, Leuconostoc

mesenteroides, Enterococcus sp. y Lactobacillus sp. (Bridges et al., 1984; Moore,

1972a, b; Vasanthakumar et al., 2006). Algunas de estas variaciones pueden ser

debidas a la diferente ecología y hábitos que tienen ambas especies ó a las

estrategias para el aislamiento de bacterias practicadas en cada uno de los

trabajos.

Muchos de los géneros bacterianos asociados al canal alimentario de D.

valens se han aislado de los intestinos de otros invertebrados. El género Rahnella

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ha sido frecuentemente aislado del tracto digestivo de larvas y adultos de D.

valens y D. frontalis (Vasanthakumar et al., 2006). En particular, Rahnella aquatilis

o alguna de sus genomoespecies se han aislado del tracto digestivo del

escarabajo xilófago, Saperda vestita y del intestino de caracoles, babosas y

lombrices de tierra (Delalibera et al., 2005; Muller et al.; 1995a, b). Asimismo, este

género se ha identificado como un endófito de coníferas y se le ha reportado

como una endobacteria de ectomicorrízas (Cankar et al., 2005; Izumi et al., 2006),

lo cual sugiere que esta bacteria puede estar siendo ingerida constantemente por

el insecto al alimentarse del floema de su huésped. Investigaciones futuras podrán

revelar si las cepas de Rahnella en el tracto digestivo de Dendroctonus spp, son

las mismas que las que se encuentran en el floema de las coníferas o si se trata

de poblaciones o ecotipos independientes. Asimismo, será muy interesante

averiguar si estas bacterias, que tienen la capacidad potencial de fijar nitrógeno,

están activas reproductiva y metabólicamente y si llevan a cabo la fijación de

nitrógeno en el tracto digestivo del insecto. Para estos propósitos convendría

averiguar si los miembros de este género aparecen en una librería de cDNA de

genes ribosomales construida a partir de rRNA y estimar la expresión de alguno

de los genes de la nitrogenasa a partir del contenido del tracto digestivo de

miembros de Dendroctonus.

Otro género aislado frecuentemente en este trabajo fue Serratia. Las

secuencias generadas a partir de nuestros aislados se asociaron principalmente

con Serratia liquefaciens y Serratia proteomaculans, pero mantuvieron una alta

similitud con otras especies de Serratia. Esto obliga a realizar una caracterización

fenotípica que complemente la identificación molecular ensayada hasta este

momento (Holt et al., 1994). Miembros del género Serratia son comúnmente

aislados del canal alimentario de otros insectos (Brand et al., 1975; Broderick et

al., 2004; Lundgren et al., 2007). Serratia marcescens, Serratia entomophila,

Serratia proteamaculans se han descrito como entomopatógenos facultativos

(Hurts et al., 2007; Steinhaus, 1956). Asimismo, Serratia se reportó como un

patógeno de D. frontalis (Moore, 1972a). El constante aislamiento de estas

bacterias a partir de individuos aparentemente sanos y colectados en el campo de

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D. valens, sugiere que estos microorganismos forman parte de la microbiota

normal del insecto y mantienen un balance con otras poblaciones bacterianas que

impiden el desarrollo de su potencial patogénico, como sucede con otras bacterias

entomopatógenas (Harada e Ishikawa, 1997).

En adultos y larvas del modelo de estudio de este trabajo se aislaron

microorganismos que se asociaron al grupo Erwinia/Pantoea. El género Erwinia se

ha asociado a diversos insectos como arañuelas, áfidos, escarabajos pepino y la

mosca del olivo (Capuzzo et al., 2005; de Vries et al., 2004; Ferrari et al., 2007;

Harada e Ishikawa, 1997). En algunos casos, las especies de este grupo actúan

como entomopatógenos (Grenier et al., 2006; Harada e Ishikawa, 1997) y en otros

aceleran el proceso de desarrollo y aumentan el número de huevos que ponen los

insectos (de Vries et al., 2004). El género Pantoea también se ha encontrado en

varios insectos como las arañuelas, mosquitos, áfidos, moscas y escarabajos

(Delalibera et al., 2005; Mramba et al., 2006; Straif, et al., 1998; Vorwerk et al.,

2007; Wells et al., 2002). En particular en el género Dendroctonus se ha reportado

la presencia de la bacteria fijadora de nitrógeno Pantoea agglomerans (Bridges,

1981; Bridges et al., 1984; Vasanthakumar et al., 2006). La baja similitud que

presentan las secuencias de genes ribosomales de los aislados obtenidos con los

diferentes especies del grupo Erwinia/Pantoea impide asociarlos a una especie en

particular, debido a ello, es complicado sugerir una función dentro de la comunidad

bacteriana o en la simbiosis con D. valens.

A partir de los tractos digestivos de insectos colectados en Casas Grandes,

Chihuahua se aislaron constantemente cepas de Enterobacter aerogenes. Esta

especie y otras del mismos género se han aislado también del canal alimentario

de las crisopas pardas, de termitas, de la polilla gitana y de escarabajos

barrenadores de la madera, entre otros insectos (Broderick et al., 2004; Eutick, et

al., 1978; Schloss et al., 2006; Woolfolk y Inglis, 2003). Previamente, Enterobacter

aerogenes también se aisló en D. frontalis. Las especies del género Enterobacter

son una de las principales poblaciones bacterianas que se albergan en el tracto

digestivo de varias termitas, entre ellas Coptotermes acinaciformis (Adams y

Boopathy, 2005; Eutick, et al., 1978). Enterobacter es una bacteria anaerobia

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facultativa que se ha descrito como un “pepenador de oxigeno” y se ha sugerido

que elimina el oxígeno que se permeabiliza a través del exoesqueleto y que puede

afectar los procesos anaeróbicos (acetogénesis, hidrogénesis, metanogénesis,

reducción del sulfato, y fijación de nitrógeno) que son fundamentales para la

supervivencia de las termitas. La glucosa, sacarosa y xilosa son carbohidratos

fermentables que se forman durante la degradación de la celulosa y que pueden

ser metabolizados por varias especies del género Enterobacter (Adams et al.,

2005). La xilosa no se encuentra comúnmente en la naturaleza en un estado libre,

sino como un polímero denominado xilano, el cual se puede encontrar en

asociación con la celulosa de las plantas (Jeffries y Jin, 2000). Por lo que canal

alimentario del insecto ofrece un lugar en el cual estos polímeros del floema y la

albura de las plantas pueden ser degradados para su asimilación. E. aerogenes

dentro del canal alimentario de D. valens podría estar generando microambientes

anóxicos, que favorezcan la fijación de nitrógeno y participando en los pasos

finales de la degradación de la celulosa y el xilano.

Acinetobacter lwoffi y A. haemolyticus forman parte de los microorganismos

que se detectaron dentro del canal alimentario de D. valens. Especies del género

Acinetobacter se han encontrado en los tractos digestivos de diversos artrópodos

(Dunn y Stabb, 2005; Schäfer, 1996; Schloss et al., 2006; Sezen et al., 2007;

Xiang et al.; 2006). En D. frontalis se reportó la presencia de bacterias del género

Acinetobacter lo que coincide con los resultados para D. valens. Miembros de

Acinetobacter tienen la capacidad potencial de degradar celulosa y han sido

aislados del canal alimentario de las termitas y de otros ambientes (Ekperigin,

2006; Schfäer et al., 1996; Vimala et al., 2004). Con base en lo antes mencionado,

se puede inferir que las cepas de Acinetobacter podrían estar participando en la

degradación de la celulosa en el tubo digestivo de D. valens.

Stenotrophomonas maltophilia es otra bacteria que hemos identificado

como miembro de la comunidad bacteriana asociada a D. valens. El género

Stenotrophomonas también ha sido encontrado en otros insectos y en D. frontalis

(Campbell et al., 2004; Monttlor Curley et al., 2007; Schloss et al., 2006;

Vasanthakumar et al., 2006). Particularmente, S. maltophilia se ha reportado como

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una bacteria fijadora de nitrógeno (Park et al., 2005) que podría estar

suministrando compuestos nitrógenados asimilables a D. valens.

El phylum Actinobacteria está representado por cuatro especies dentro de

la comunidad bacteriana asociada al tracto digestivo de D. valens, las cuales

fueron identificadas como Cellulosimicrobium cellulans, Cellulomonas xylanilytica,

Leifsonia shinshuensis y Janibacter melonis. Bacterias del phylum Actinobacteria

se han encontrado frecuentemente dentro de los canales alimentarios de diversos

insectos incluyendo a insectos que se alimentan de la madera y del floema de las

plantas (Bridges, 1981; Bridges et al., 1984; Broderick et al., 2004; Egert et al.,

2003 y 2005; Schäfer et al., 1996; Schloss et al., 2006; Vasanthakumar et al.,

2006).

En particular, Cellulosimicrobium cellulans secreta un complejo de enzimas

líticas capaces de degradar la pared celular de levaduras (varias preparaciones

comerciales de glucanasas se obtienen a partir de este microorganismo) (Ferrer,

2006). Se ha identificado y aislado a este microorganismo y creemos que puede

estar jugando un papel muy importante en el control de las poblaciones de

levaduras asociadas al canal alimentario de D. valens.

Todas las actinobacterias que se identificaron en este trabajo fueron

capaces de degradar la celulosa (Fig. 10 y Cuadro 7). Los resultados anteriores

son una evidencia indirecta de la posible participación de los microorganismos

asociados al canal alimentario de D. valens en la digestión de la celulosa

contenida en el floema de la plantas. Esta asociación ha sido ampliamente

estudiada en insectos como las termitas (Saxena et al., 1993; Schäfer et al., 1996;

Varma et al., 1994; Wenzel et al., 2002) y las cucarachas comedoras de madera

(Cruden y Markovetz, 1979) y se ha visto el impacto negativo que tiene la carencia

de estos microorganismos sobre el desarrollo y reproducción de los insectos. La

capacidad de degradar la carboximetilcelulosa (CMC) de Cellulomonas xylanilytica

y C. cellulans se ha reportado previamente (Rivas et al., 2004; Schumann et al.,

2001). Sin embargo, hasta nuestro conocimiento en el caso de Janibacter melonis

y Leifsonia shinshuensis no existen reportes previos en los cuales se les asocié

con dicha capacidad.

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La densidad de bacterias celulolíticas aerobias asociadas a D. valens

determinada en este trabajo fue de 900 ± 210 UFC/tracto digestivo, lo que equivale

al 0.04% de la población total de bacterias cultivables en medio Gelosa Nutritiva.

En la cucaracha Eublaberus posticus se reportó que las bacterias capaces de

degradar la CMC constituyen alrededor del 1% de las bacterias cultivables

asociadas a su tracto digestivo (Cruden y Markovetz 1979). La aparente baja

proporción de bacterias celulolíticas asociadas al trato digestivo de D. valens

podría deberse, al menos parcialmente, a que nosotros empleamos como sustrato

celulosa en polvo y no CMC. La CMC es un derivado de la celulosa que

frecuentemente se usa en los ensayos de actividad de endoglucanasas (Karlsson

et al., 2002). La mayoría de los trabajos que caracterizan a los microorganismos

celulolíticos emplean la sal disódica de la CMC debido a que posee una alta

solubilidad en agua. Sin embargo, existen evidencias de que la capacidad de

degradar la celulosa se encuentra distribuida en un menor número de

microorganismos que la capacidad de degradar alguno de sus derivados como la

CMC (Reese et al., 1950).

Los nichos ecológicos en los cuales se encuentran involucradas las

bacterias asociadas a los intestinos de los insectos se ha estudiado en muy pocas

especies (Dillon y Dillon, 2004). Particularmente, la capacidad de degradar la

celulosa sólo se ha descrito en las termitas, cucarachas y algunos barrenadores

de la madera (Cruden y Markovetz, 1979; Delalibera et al., 2005; Saxena et al.,

1993; Schäfer et al., 1996; Varma et al., 1994; Wenzel et al., 2002). En este

trabajo identificamos y cuantificamos a las bacterias celulolíticas aerobias

asociadas al trato digestivo de D. valens e inferimos que conjuntamente con otras

poblaciones bacterianas (Serratia, Enterobacter y Acinetobacter) y de levaduras

pueden estar contribuyendo en la digestión completa de la celulosa y al

aprovechamiento de este polisacárido como fuente de carbono. Esta

interdependencia cometabólica también se ha documentado ampliamente en las

termitas (Schäfer et al., 1996).

Los métodos independientes del cultivo revelan comúnmente una mayor

diversidad de especies bacterianas en comparación con los métodos basados en

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el cultivo (Broderick et al., 2004; Eckburg et al., 2005; Paster et al., 2001). En

nuestro caso, reconocimos 13 especies de bacterias de 11 géneros y dos phyla;

mientras que en las librerías de genes ribosomales solamente logramos

caracterizar 4 especies incluidas en 4 géneros y dos phyla (Fig. 9 y 14) (Cuadros 6

y 8). Este resultado no es inusual y se ha observado en otros ambientes (Dumbar

et al., 1999). Particularmente, los aislados bacterianos del phylum Actinobacteria

no se encontraron en las librerías de genes ribosomales. Sin embargo, el género

Lactobacillus solamente fue encontrado mediante el uso de métodos moleculares.

Una posible explicación para las diferencias observadas es el sesgo que pueden

introducir por una parte las técnicas de extracción de DNA y la amplificación por

PCR, y por otra parte los métodos de cultivo utilizados (medios y condiciones de

incubación). En particular los métodos basados en el cultivo sobre representan las

especies que crecen fácil y rápidamente en los medios sintéticos y no

necesariamente son los mas abundantes de una comunidad. En este caso, se

podrían aislar especies presentes en muy bajos números, lo cual los hace

indetectables por métodos moleculares. Por estos motivos, los estudios que

intentan describir de manera amplia la diversidad de especies en un ambiente

deben incluir métodos basados en el cultivo e independientes del cultivo; dado que

ambas estrategias se complementan y confirman.

Los análisis de rarefacción de nuestros datos sugieren que la riqueza de

especies presente en el tracto digestivo de D. valens es relativamente baja, sin

embargo, todavía falta por analizarse parte de la comunidad presente en este

ambiente ( Fig. 15, 16 y 17). Para poder llegar a una conclusión fiable de la

riqueza de especies de una comunidad los análisis de rarefacción deben ser

combinados con estimadores de la riqueza de especies (Hughes et al., 2001). Por

lo tanto, también calculamos el estimador de la riqueza de especies no

paramétrico Chao1, el cual es concordante con las curvas de rarefacción (Chao 1=

5 OTUs y Fig. 15). Estos datos coinciden con los obtenidos para D. frontalis en los

cuales el estimador Chao 1 tuvo un valor de 1-3 OTUs en las librerías de larvas y

de 3 y 6 OTUs en las librerías de adultos (Vasanthakumar et al., 2006)

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La PCR-DGGE de la región 3 variable del 16S rRNA demostró que la

comunidad bacteriana presente en las diferentes partes del tracto digestivo de las

hembras y de los machos de D. valens fue homogénea; sin embargo, se observan

bandas comunes entre ellos y bandas exclusivas entre machos y hembras. La

región con mayor diversidad microbiana fue el proctodeo de las hembras (Fig. 18),

lo que sugiere que la comunidad bacteriana presente en el insecto no sobrepasa

12 especies bacterianas, lo cual de algún modo corrobora los resultados obtenidos

mediante el cultivo y la librería de genes ribosomales. Asimismo, estos datos son

consistentes con lo reportado en D. frontalis (Vasanthakumar et al., 2006). La

comparación del patrón e intensidad de las bandas observadas en el DGGE de la

comunidad total de las diferentes partes del canal alimentario y las cepas aisladas

(Fig. 19), permite inferir que E. aerogenes es una población abundante en el

proctodeo de las hembras y que R. aquatilis es una bacteria que se encuentra

ampliamente distribuida en el tracto digestivo de D. valens.

Durante las repeticiones del DGGE se observó que en la mayoría de los

geles la región que constantemente mostraba el mayor número de bandas era el

proctodeo tanto en hembras como en machos. También se observó que algunas

bandas aparecían esporádicamente y existían pequeñas variaciones en el patrón

desplegado por las diferentes secciones del canal alimentario tanto de hembras

como de machos, lo que posiblemente indica que la estructura poblacional que

albergan estos insectos puede cambiar durante el transcurso del tiempo o que hay

un cierto grado de variación en la comunidad de especies bacterianas en este

hábitat (Datos no mostrados). Sin embargo, en general no se observaron

diferencias substanciales en la comunidad bacteriana total de las diferentes partes

del canal alimentario, sexos y localidades de muestreo.

En la librería de genes ribosomales identificamos las siguientes especies

bacterianas: R. aquatilis, Pantoea dispersa, Acinetobacter schindleri y Lactococcus

lactis (Fig. 14 y Cuadro 8). Solamente las bacterias del género Lactococcus no se

encontraron mediante técnicas basadas en el cultivo. La presencia de bacterias

del género Lactococcus se ha documentado en diversos artrópodos (Bauer et al.,

2000; Peloquin y Greenberg, 2003). La presencia de bacterias lácticas, entre ellas

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las del género Lactococcus, se ha demostrado extensamente en el proctodeo de

las termitas (Eutick et al., 1978; Tholen et al., 1997; Schultz y Breznak, 1978). En

el canal alimentario de los mamíferos las bacterias lácticas son importantes

colonizadores del epitelio intestinal (Tannock, 1997) y gracias a su actividad

antagonista contra otras bacterias se ha descrito que participan en la defensa del

tejido epitelial contra la invasión de patógenos (Rolfe, 1997). En las termitas las

bacterias lácticas reducen el oxígeno y desplazan los procesos de fermentación

hacia lactato y potencialmente pueden aumentar la obtención de energía (Condon,

1987). Otra ventaja selectiva de las bacterias lácticas asociadas a las termitas es

su capacidad de metabolizar el ácido úrico (Potrikus y Breznak; 1980, 1981). Con

las evidencias anteriormente mencionadas, se puede proponer que posiblemente

los microorganismos del género Lactococcus participan en el mantenimiento del

equilibrio entre las poblaciones bacterianas del tracto digestivo y en la mejora de la

ganancia energética producto de la fermentación de los azúcares liberados de la

degradación de la celulosa. Asimismo, esta bacteria puede contribuir en el

reciclaje del ácido úrico, lo cual aumenta la eficiencia del uso de los compuestos

nitrógenados, los cuales constituyen uno de los factores limitantes para el

desarrollo de los insectos que se alimentan de la albura y el floema de las plantas.

El contenido de nitrógeno en el tejido de las plantas es muy bajo si lo

comparamos con el de los tejidos de los herbívoros. Como consecuencia, el

nitrógeno de la dieta puede limitar el crecimiento y reproducción de los herbívoros

y seleccionar los atributos que incrementen su adquisición (Mattson, 1980). La

supervivencia y crecimiento de muchos artrópodos con dietas que presentan una

relación C:N muy alta sugiere que estos insectos no obtienen suficiente nitrógeno

de su alimento y que deben obtener compuestos nitrogenados de otras fuentes.

Particularmente, los insectos del género Dendroctonus se alimentan del floema de

las plantas, un sustrato que posee un bajo contenido de compuestos nitrogenados.

Debido a lo anterior los escarabajos de éste género requieren de 16 a 26 veces

más nitrógeno que el presente en los tejidos vegetales de los cuales se alimentan.

Uno de los posibles mecanismos mediante el cual los insectos pueden subsanar

esta deficiencia es la capacidad de fijar nitrógeno asociada a las bacterias de su

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canal alimentario. Lo anterior se ha demostrado en una amplia variedad de

insectos como termitas, cucarachas, escarabajos descortezadores, escarabeidos,

la mosca mediterránea de la fruta y el escarabajo venado (Behar et al., 2005;

Benemann, 1973; Breznak et al., 1973; Breznak et al., 1974; Bridges, 1981;

Citernesi et al., 1977; Kuranouchi et al., 2006).

La presencia de las bacterias que potencialmente tienen capacidad para

fijar nitrógeno dentro del canal alimentario del insecto, como R. aquatilis,

Stenotrophomonas maltophilia y Pantoea spp.; la reducción de acetileno in vivo de

larvas e insectos adultos y de las bacterias aisladas del tracto digestivo (Datos no

mostrados); y la presencia de los genes nifH y nifD en el DNA metagenómico del

canal alimentario de D. valens apunta a que la fijación biológica de nitrógeno se

lleva acabo en el tracto digestivo de D. valens.

En la literatura se reporta que R. aquatilis, Serratia, Pantoea agglomerans,

Enterobacter spp. y S. maltophilia poseen la capacidad de fijar nitrógeno (Asis et

al., 2004; Berge et al., 1991; Gyaneshwar 2001; Heulin et al., 1994; Park et al.,

2005; Sandhiya et al., 2005; Wright et al., 1981), lo que sugiere de manera

indirecta que posiblemente estos microorganismos contribuyen al aporte de

nitrógeno a los insectos.

La capacidad de reducir el acetileno se demostró in vivo en larvas e

insectos adultos de D. valens (16.0 ± 2.2; 12.6 ± 3.4 nmol de etileno/h/insecto

respectivamente), si se compara este valor con lo obtenido para otros coleópteros

como el escarabajo venado, Dorcus rectus, en el cual se reporta 1.76 ± 0.52 nmol

de etileno/h/larva (Kuranouchi, 2006), se tiene que la capacidad de reducir el

acetileno de las larvas de D. valens es 9 veces mayor con respecto a la capacidad

de reducir el acetileno de las larvas de Dorcus rectus. Ambos insectos se

alimentan de sustratos pobres en nitrógeno. También estimamos que el nitrógeno

que pueden fijar las larvas y los adultos de nuestro modelo de estudio equivale a

5.6 y 4.4 μg de proteína/día/insecto respectivamente. Los datos anterior son muy

cercanos a lo reportado para la mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata,

a la cual se le estimó que puede fijar el nitrógeno equivalente a 6 μg de

proteína/día/insecto. El resultado anterior debe tomarse con cautela debido a que

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en repeticiones posteriores se obtuvieron magnitudes variables (Datos no

mostrados). La fijación de nitrógeno se ha demostrado después de la ingesta

masiva de bacterias fijadoras de nitrógeno como Klebsiella y Enterobacter spp. en

insectos mantenidos por un periodo prolongado de tiempo en condiciones del

laboratorio (Murphy et al., 1994). La alta variación en la magnitud de la reducción

del acetileno podría deberse a la composición de la comunidad bacteriana

asociada al canal alimentario del insecto; a la edad y actividad fisiológica de los

adultos colectados; al lugar y temporada de muestro; a la etapa particular del ciclo

de vida del insecto; al alimento tomado; y al propio árbol huésped del que

provienen los insectos, entre otras variables.

También hemos demostrado la presencia de los genes nifH y nifD en el

DNA metagenómico de las diferentes regiones anatómicas del canal alimentario

de D. valens (Ueda et al., 1995; Zerh y McReynolds, 1989). Ambos genes son

ampliamente utilizados como marcadores que demuestran la presencia y permiten

estimar la presencia, diversidad y filogenia de estos genes, y por ende de

bacterias fijadoras de nitrógeno, en diferentes entornos.

Los datos obtenidos son evidencias directas e indirectas de que la fijación

biológica de nitrógeno se está llevando a acabo in vivo en algunos momentos del

ciclo de vida de D. valens. Para elucidar totalmente la capacidad de fijación de

nitrógeno in vivo asociada a D. valens son necesarios estudios diseñados para

específicamente resolver las preguntas que se mantienen vigentes.

CONCLUSIONES

Se identificaron 14 bacterias heterótrofas aerobias cultivables Cuyas

especies son: Rahnella aquatilis, Serratia liquefaciens, S. proteamaculans,

Acinetobacter lwoffii, A. haemolyticus, Stenotrophomonas maltophilia, Pantoea

cedenensis, Erwinia mallotivora, Erwinia/Pantoea sp., Enterobacter aerogenes,

Janibacter melonis, Leifsonia shinshuensis, Cellulomonas xylanilytica y

Cellulosimicrobium cellulans.

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En las librerías de genes ribosomales identificamos 4 especies bacterianas

cuya identificación correspondió a: Lactococcus lactis, Acinetobacter schindleri,

Rahnella aquatilis y Pantoea dispersa.

Los genes nifH y nifD fueron detectados en el DNA metagenómico de las

diferentes regiones anatómicas del canal alimentario de D. valens

Los genes amoA, 16S rRNA de Nitrobacter, nirK, nirS y nosZ no fueron

detectados en el DNA metagenómico de las diferentes regiones anatómicas del

canal alimentario de D. valens

Las larvas e insectos adultos de D. valens llevan a cabo fijación de

nitrógeno.

Cellulosimicrobium cellulans, Cellulomonas xylanilytica, Leifsonia

shinshuensis y Janibacter melonis tienen capacidad de degradar la celulosa como

única fuente de carbono.

IMPACTO Este trabajo es estrictamente básico, su trascendencia principal será en la

aportación de información científica y formación de estudiantes de licenciatura y

posgrado. Sin embarbo, el entender el papel de la simbiosis de Dendroctonus con

sus simbiontes microorganismos puede contribuir al entendimiento del ciclo de

vida, adaptación y sobrevivencia de este insecto descortezados que se constituye

en una plaga de los bosques de pinos en México, con el consecuente impacto

económico y ecológico. No se derivarán directamente de los resultados

informados aquí estrategias claras de control de la plaga, pero si revelamos la

importancia que tienen, en la biología del insecto, las bacterias simbiontes.

Posiblemente estos microorganismos contribuyen a que el insecto sobreviva en un

ambiente químicamente hostiles, a que su comunicación química ocurra de

manera eficiente y a que complemente su dieta que sabemos es muy pobre.

Cualquier factor o estrategia que limite o afecte la comunidad bacteriana del

insecto tendrá graves consecuencias sobre la sobrevivencia de este insecto y se

constituirá en una herramienta para de control de este insecto plaga.

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BIBLIOGRAFIA 1. Adams, L. y R. Boopathy 2005 Isolation and characterization of enteric bacteria from the

hindgut of Formosan termite. Bioresour. Technol. 96: 1592-1598. 2. Ahmadjian, V., y S. Paracer. 1986. Symbiosis: An introduction to biological associations.

University Press of New England. 3. Altschul, S.F., T.L. Madden, A.A. Schäffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, y D.J. Lipman. 1997.

Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

4. Anklin-Mϋhlemann, R., D.E. Bignell, P.C. Veivers, R.H Leuthold y. M. Slaytor. 1995. Morphological, microbiological and biochemical studies of the gut flora in the fungus-growing termite Macrotermes subhyalinus. J. Insect Physiol. 41:929–940.

5. Asis C.A. Jr y K. Adachi. 2004. Isolation of endophytic diazotroph Pantoea agglomerans and nondiazotroph Enterobacter asburiae from sweetpotato stem in Japan. Lett. Appl. Microbiol. 38:19-23.

6. Ayres, M.P. y S.F. MacLean, Jr. 1987. Development of birch leaves and the growth energetics of Epirrita autumnata (Geometridae). Ecology 68:558-568.

7. Ayres, M.P., R.T. Wilkens, C.J. Ruel, M.J. Lombardero y E. Vallery. 2000. Nitrogen budges of phloem-feeding bark beetles with and without symbiotic fungi. Ecology. 81:2198-2210.

8. Batra, L.R. 1963. Ecology of ambrosia fungi and their dissemination by beetles. Trans. Kansas. Acad. Sci. 66:213-236.

9. Barras, S.J. 1973. Reduction of progeny and development in the southern pine beetle following removal of symbiotic fungi. Can. Entomol. 105:1295-1299.

10. Barras, S.J. y T.J. Perry. 1975. Interrelationships among microorganisms, bark or ambrosia beetles, and woody plant tissue: an annotated bibliography, 1965-1974. United States Department of Agriculture Forest Service, Southern Forest Experiment Station, General Technical Report SO-10.

11. Bauer, S., A. Tholen, J. Overmann y A. Brune. 2000. Characterization of abundance and diversity of lactic acid bacteria in the hindgut of wood- and soil-feeding termites by molecular and culture- dependent techniques. Arch Microbiol 173:126-137.

12. Beaver, R.A. 1986. The taxonomy, mycangia, and biology of Hypothenemus curtipennis (Schedl), the first know cryphaline ambrosia beetle (Coleoptera: Scolytinae). Entomol. Scand. 17: 131-135.

13. Becker, G. 1971. Physiological influences on wood-destroying insects of wood compounds and substances produced by microorganisms. Wood Sci. Tech. 5:236-246.

14. Behar, A., B. Yuval, y E. Jurkevitch. 2005. Enterobacteria-mediated nitrogen fixation in natural populations of the fruit fly Ceratitis capitata. Mol. Ecol. 14:2637-2643.

15. Benemann J.R. 1973. Nitrogen fixation in termites. Science 181: 164-165. 16. Berge, O., T. Heulin, W. Achouak, C. Richard, R. Bally y J. Balandreau. 1991.

Rahnella aquatilis, a nitrogen-fixing enteric bacterium associated with the rhizosphere of wheat and maize. Can. J. Microbiol. 37:195-203.

17. Bignell, D.E., H. Oskarsson y J.M Anderson.1980. Distribution and abundance of bacteria in the gut of a soil-feeding termite Procubitermes aburiensis (Termitidae, Termitinae). J. Gen. Microbiol. 117:393–403.

18. Bignell, D.E. 2000 Introduction to symbiosis. In: Abe, T., D.E. Bignell, M. Higashi (Eds), Termites: Evolution, Sociality, Symbioses, Ecology. Kluwer Academic. Dordrect, Netherlands.

19. Bishop, P.E. y R.D. Joerger. 1990. Genetics and molecular-biology of alternative nitrogen-fixation systems. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41:109–125.

20. Bohannan, B.J.M. y J. Hughes. 2003. New approaches to analyzing microbial biodiversity data. Curr. Opin. Microbiol. 6:282-287.

Page 48: PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070651_5409.pdf · agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

21. Braker, G., A. Fesefeldt y K.P. Witzel. 1998. Development of PCR primer systems for amplification of nitrite reductase genes (nir K and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 64:3769-3775.

22. Brand, J.M., J.W. Bracke, A.J. Markovetz, D.L. Wood y L.E. Browne. 1975. Production of verbenol pheromone by a bacterium isolated from bark beetles. Nature 254:136–137.

23. Breznak, J.A., W.J. Brill, J.W. Mertins y H.C. Coppel. 1973. Nitrogen fixation in termites. Nature 244:577-580.

24. Breznak J.A., J.W Mertins y H.C. Coppel. 1974. Nitrogen fixation and methane production in wood-eating cockroach, Cryptocercus punctulatus Scudder (Orthoptera: Blattidae). Univ. Wis. For. Res. Notes 184, Madison, WI.

25. Breznak, J.A. y H.S: Pankratz. 1977. In situ morphology of the gut microbiota of wood-eating termites [Reticulitermes flavipes (Kollar) and Coptotermes formosamus Shiraki]. Microbiol. 33: 406-426.

26. Breznak, J.A. 1982 Intestinal microbiota of termites and other xylophagous insects. Ann. Rev. Microbiol. 36: 323-343.

27. Breznak, J.A. 2000 Ecology of prokaryotic microbes in the guts of wood- and litter-feeding termites. In: Abe, T., D.E. Bignell, M. Higashi (Eds), Termites: Evolution, Sociality, Symbioses, Ecology. Kluwer Academic. Dordrect, Netherlands. 209-231.

28. Bridges, J.R. 1981. Nitrogen-Fixing Bacteria Associated with Bark Beetles. Microb. Ecol. 7:131-137.

29. Bridges, J.R., J.E. Marler y B.H. McSparrin. 1984. A quantitative study of the yeasts and bacteria associated with laboratory-reared Dendroctonus frontalis Zimm. (Coleopt., Scolytidae). Sonderdruck aus Bd. 97:261-267.

30. Broderick N.A., K.F. Raffa, R.M. Goodman y J. Handelsman. 2004. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70: 293–300.

31. Boucher, D.H., S. James y K.H. Keeler. 1982. The ecology of mutualism. A. Rev. Ecol. Syst. 13:315-347.

32. Buchner, P. 1965. Endosymbionts of animals with plant microorganisms. John Wiley y Sons, Inc., New York, N.Y.

33. Bürgmann, H., F. Widmer, W.V. Sigler, y J. Séller. 2004 New molecular screening tools for analysis of free-living diazotrophs in soil. Appl. Environ. Microbiol. 70:240-247.

34. Campbell, B.C. 1989. On the role of microbial symbiotes in herbivorous insects. En E. Bernays (ed.), Insect-plant interactions. CRC Press, Boca Raton, Fla.

35. Campbell, C.L., D.L. Mummey, E.T. Schmidtmann y W.C. Wilson. 2004. Culture-independent analysis of midgut microbiota in the arbovirus vector Culicoides sonorensis (Diptera: Ceratopogonidae). J. Med. Entomol. 41:340–348.

36. Cankar, K., H. Kraigher, M. Ravnikar y M. Rupnik. 2005. Bacterial endophytes from seeds of Norway spruce (Picea abies L. Karst). FEMS Microbiol. Lett. 244: 341-345.

37. Capuzzo, C., G. Firrao, L. Mazzon, A. Squartini y V. Girolami. 2005. ‘Candidatus Erwinia dacicola’, a coevolved symbiotic bacterium of the olive fly Bactrocera oleae (Gmelin). Int J. Syst Evol Microbiol 55: 1641–1647.

38. Cazemier, A.E., J.H.P. Hackstein, H.J.M. OpdenCamp, J. Rosenberg y C. van der Drift. 1997. Bacteria in the intestinal tract of different species of arthropods. Microb. Ecol. 33:189-197.

39. Cibrián, D.T., J.T. Mendez, R. Campos, H.O. Yates, y J.E. Flores. 2000. Insectos forestales de México. Universidad Autónoma Chapingo.

40. Citernesi U, R. Neglia, A. Seritti, A.A. Lepidi, C. Gilippi, G. Bagnoli, M.P. Nuti y R. Galluzzi. 1977. Nitrogen fixation in the gastro-enteric cavity of soil animals. Soil Biol. Biochem. 9:71–72.

41. Clancy, K.M. 1992. Response of western spruce budworm (Lepidoptera: Tortricidae) to increased nitrogen in artificial diets. Environ. Entomol. 21:331-344.

Page 49: PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070651_5409.pdf · agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

42. Clancy, K.M., M.R. Wagner y R.W. Tinus. 1988. Variation in host foliage nutrient concentrations in relation to western spruce budworm herbivory. Can. J. For. Res. 18:530-544.

43. Condon, S. 1987. Responses of lactic acid bacteria to oxygen. FEMS Microbiol Rev 46:269–280.

44. Coulson, R.N. 1979. Population dynamics of bark beetles. Annu. Rev. Entomol. 24:417-477. 45. Cruden, D.L. y A.J. Markovetz. 1979. CarboxymethylCellulose decomposition by intestinal

bacteria of cockroaches. Appl. Eviron. Microbiol. 38:369-372. 46. Cruden, D.L. y A.J. Markovetz. 1984. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Arch

Microbiol. 138:131-139. 47. Cruden, D.L. y A.J. Markovetz. 1987. Microbial ecology of the cockroach gut. Ann. Rev.

Microbiol. 41:617–643. 48. Cullen D.W. y P.R. Hirsch. 1988. Simple and rapid method for direct extraction of microbial

DNA from soil to PCR. Soil Biol Biochem 30:983-993. 49. de Bary, A.H. 1878 Vortrag: Über Symbiose. En Versammlung deutscher naturforscher und

arzte En Cassel Kassel: Baier & Lewalter. 50. de Vries, E.J., G. Jacobs, M.W. Sabelis, S.B.J. Menken y J.A.J. Breeuwer. 2004 Diet-

dependent effects of gut bacteria on their insect host: the symbiosis of Erwinia sp. and western flower thrips. Proc. R. Soc. Lond. 271:2171-2178.

51. Delalibera, I., J. Handelsman y K.F. Raffa. 2005. Contrasts in cellulolytic activities of gut microorganisms between the wood borer, Saperda vestita (Coleoptera : Cerambycidae), and the bark beetles, Ips pini and Dendroctonus frontalis (Coleoptera : Curculionidae). Environ. Entomol. 34:541-547.

52. Díaz, E., R. Cisneros, G. Zuñiga y E. Uria-Galicia. 1998 Comparative anatomical and histological study of the alimentary canal of Dendroctonus parallelocollis, D. rhizophagus, and D. valens (Coleoptera: Scolytidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 91:479-487.

53. Díaz, E., O. Arciniega, L. Sánchez, R. Cisneros y G. Zúniga. 2003 Anatomical and histological comparison of the alimentary canal of Dendroctonus micans, D. ponderosae, D. pseudotsugae pseudotsugae, D. rufipennis, and D. terebrans (Coleoptera: Scolytidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96:144-152.

54. Dillon, R.J. y V.M. Dillon. 2004. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49:71-92.

55. Douglas, A.E. 1989. Mycetocyte symbiosis in insects. Biol. Rev. 64:409-434. 56. Douglas, A.E. 1998. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their

symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol 42:17-37. 57. Douglas A. E. 2006. Phloem-sap feeding by animals: problems and solutions. J. Exp. Bot.

57:747–754. 58. Dunbar, J., S. Takala, S.M. Barns, J.A. Davis y C.R. Kuske. 1999. Levels of bacterial

community diversity in four arid soils compared by cultivation and 16S rRNA gene cloning. Appl. Environ. Microbiol. 65:1662-1669.

59. Dunn, A.K. y E.V. Stabb. 2005. Culture-independent characterization of the microbiota of the ant lion Myrmeleon mobilis (Neuroptera: Myrmeleontidae). Appl. Environ. Microbiol. 71:8784-8794.

60. Eckburg, P.B., E.M. Bik, C.N. Bernstein, E. Purdom, L. Dethlefsen, M. Sargent, S.R. Gill, K.E. Nelson y D.A. Relman. 2005. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 308:1635-1638.

61. Egert, M., B. Wagner, T. Lemke, A. Brune y M.W. Friedrich. 2003 Microbial community structure in midgut and hindgut of the humus-feeding larva of Pachnoda ephippiata (Coleoptera: Scarabaeidae). Appl. Environ. Microbiol. 69:6659–6668.

62. Egert, M, U. Stingl, L.D. Bruun, B. Pommerenke, A. Brune y M.W. Friedrich. 2005 Structure and topology of microbial communities in the major gut compartments of Melolontha melolontha larvae (Coleoptera: Scarabaeidae). Appl. Environ. Microbiol. 71:4556-4566.

Page 50: PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070651_5409.pdf · agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

63. Ekperigin, M.M. 2007 Preliminary studies of cellulase production by Acinetobacter anitratus and Branhamella sp. Afr. J. Biotechnol. 1: 028-033.

64. Eutick, M.L., P. Veivers, R.W. O’Brien y M. Slaytor. 1978. Dependence of the higher termite, Nasutitermes exitiosus and the lower termite, Coptotermes lacteus on their gut flora. J. Insect Physiol. 24:363-368.

65. Falcon, L.I., F. Cipriano, A.Y. Chistoserdov y E.J. Carpenter. 2002. Diversity of diazotrophic unicellular cyanobacteria in the tropical North Atlantic Ocean. Appl. Environ. Microbiol. 68: 5760–5764.

66. Felsestein J. 1989. PHYLIP-Phylogeny inference package version 3.5c. Cladistic 5:164-166. 67. Ferrari, M.J., D. Du, J.A. Winsor y A.G. Stephenson. 2007. Inbreeding depression of plant

quality reduces incidence of an insect-borne pathogen in a wild gourd. Int. J. Plant Sci. 168:603–610.

68. Ferrer, P., T. Halkier, L. Hedegaard, D. Savva, I. Diers y J.A. Asenjo. 2006. Nucleotide

sequence of a 13-1,3-glucanase Isoenzyme II(A) gene of Oerskovia xanthineolytica LL G109 (Cellulomonas cellulans) and initial characterization of the recombinant enzyme expressed in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 178:4751-4757.

69. Fogelsong, M.A., D.H. Walker, F.S. Puffer y A.J. Markovetz. 1975. Ultrastructural morphology of some prokaryotic microorganisms associated with the hindgut of cockroaches. J. Bacteriol. 123:336-345.

70. Forcella, F. 1981. Twig nitrogen content and larval survival of twig girdling beetles Oncideres cingulata (Coleoptera: Cerambycidae). Coleopterists Bulletin 35:211-212.

71. Francis C.A., J.M. Beman y M.M.M. Kuypers. 2007. New processes and players in the nitrogen cycle: the microbial ecology of anaerobic and archaeal ammonia oxidation. ISME J. 1:19-27.

72. Galtier, N., M. Gouy, y C. Gautier. 1996. SEAVIEW and PHILO_WIN: two graphic tools for sequence alignment and molecular phylogeny. Comput. Appl. Biosci. 12:543-548.

73. Gill, S.R., M. Pop, R.T. DeBoy, P.B. Eckburg, P.J. Turnbaugh, B.S. Samuel, J.I. Gordon, D.A. Relman, C.M. Fraser-Liggett y K. E. Nelson. 2006. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312:1355-1359.

74. Gil, R., A. Latorre y A. Moya 2004. Bacterial endosymbionts of insects: insights form comparative genomics. Environ. Microbiol. 6:1109-1122.

75. Gijzen, H.J. y M. Barugahare. 1992. Contribution of anaerobic protozoa and methanogens to hindgut metabolic activities of the American cockroach, Periplaneta Americana. Appl. Environ. Microbiol. 58:2565-2570.

76. Grenier, A.M., G. Duport, S. Pagès, G. Condemine y Y. Rahbé. 2006 The phytopathogen Dickeya dadantii (Erwinia chrysanthemi 3937) is a pathogen of the pea aphid. Appl. Environ. Microbiol. 72:1956-1965.

77. Gyaneshwar P, E.K. James, N. Mathan, P.M. Reddy, B. Reinhold-Hurek y J.K. Ladha. 2001

Endophytic colonization of rice by a diazotrophic strain of Serratia marcescens. J. Bacteriol.183:2634-45.

78. Harada, H. y H. Ishikawa. 1997. Experimental pathogenicity of Erwinia aphidicola to pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Gen. Appl. Microbiol. 43:349-354.

79. Henry, S.M. 1962. The significance of microorganisms in the nutrition of insects. Transactions of the New York Academy of Sciences, Series II 24:676-683.

80. Heulin, T., O. Berge, P. Mavingui, L. Gouzou, K.P. Hebbar y J. Balandreau. 1994. Bacillus polymyxa and Rahnella aquatilis, the dominant N2-fixing bacteria associated with wheat rhizosphere in French soils. Eur. J. Soil. Biol. 30:35-42.

81. Hodges, J.E. y P.L. Lorio, Jr. 1969. Carbohydrate and nitrogen fractions of the inner bark of loblolly pines under moisture stress. Can. J. Bot. 47:1651-1657.

Page 51: PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070651_5409.pdf · agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

82. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley y S.T. Williams. 1994. Bergey’s manual of determinative. Bacteriology. 9th ed. Editors.Williams and Wilkins. Baltimore, Maryland USA.

83. Hsiau, P.T-W. y T.C. Harrington. 2003. Phylogenetics and adaptations of basidiomycetous fungi fed upon by bark beetles (Coleoptera:Scolytidae). Symbiosis. 34:111-131.

84. Hughes, J.B., J.J. Hellmann, T.H. Ricketts y B.J.M. Bohannan. 2001. Counting the uncountable: statistical approaches to estimating microbial diversity. Appl. Environ. Microbiol. 67:4399-4406.

85. Hungate, R.E. 1966. The rumen and its Microbes. Academic Press, New York. 86. Hunt, D.W.A. y J.H. Borden. 1990. Conversion of verbenols to verbenone by yeasts isolated

from Dendroctonus ponderosae (Coleoptera: Scolytidae). J. Chem. Ecol. 16:1386-1397. 87. Hurst, M.R.H., Jones S.M., B. Tan y T.A. Jackson. 2007 Induced expression of the Serratia

entomophila Sep proteins shows activity towards the larvae of the New Zealand grass grub Costelytra zealandica. FEMS Microbiol. Lett. 275:160-167.

88. Ishikawa, H. 2003. Insect simbiosis: An introduction. En Insect symbiosis. Bourtzis, K., and T.A. Miller. CRS Press.

89. Izumi, H., I.C. Anderson, I.J. Alexander, K. Killham y E.R.B. Moore. 2006 Endobacteria in some

ectomycorrhiza of Scots pine (Pinus sylvestris) FEMS Microbiol. Ecol. 56:34-43. 90. Jeffries, T.W. y Y.-S. Jin. 2000. Ethanol and thermotolerance in the bioconversion of xylose by

yeasts Adv. Appl. Microbiol. 47:221-268. 91. Kadavy D.R., B. Plantz, C.A. Shaw, J. Myatt, T.A. Kokjonh y K.W. Nickerson. 1999.

Microbiology of the oil fly, Helaeomyia petrolei. Appl. Environ. Microbiol. 65: 477-1482. 92. Karlsson, J., D. Momcilovic, B. Wittgren, M. Schϋlein. F. Tjerned y G. Brinkmalm. 2002.

Enzymatic degration of carboxymethyl cellulose hydrolyzed by the endoglunases Cel5A, Cel7B, and Cel45Acore from Trichoderma reesei. Biopolymers. 63:32-40.

93. Kaufman, M.G., E.D. Walker, D.A. Odelson y M.J. Klug. 2000. Microbial community ecology and insect nutrition. Am. Entomol. 46:173-184.

94. Kneip C., P. Lockhart, C. Voss y U.G. Maier. 2007 Nitrogen fixation in eukaryotes – New models for symbiosis BMC Evol. Biol. 7:55-66.

95. Krokene, P. y H. Solheim. 1998. Pathogenicity of four blue stain fungi associated with aggressive and nonaggressive bark beetles. Phytopathology. 88:39-44.

96. Kuranouchi, T., T. Nakamura, S. Shimamura, H. Kolima, K. Goka, K. Okabe y A. Mochizuki. 2006 Nitrogen fixation in the stag beetle, Dorcus (Macrodorcus) rectus (Motschulsky) (Col., Lucanidae). J. Appl. Entomol. 130:471-472.

97. Lammers, P.J. y R. Haselkorn. 1984. Sequence of the nifD geneogy coding for the alpha subunit of dinitrogenase from the cyanobacterium Anabaena. Cell 44:905–911.

98. Levieux, J., P. Cassier, L. Guillaumin y A. Roques. Structures implicated in the transportation of pathogenic fungi by the European bark beetle, Ips sexdentatus Boerner: ultrastructure of a mycangium. Can. Entomol. 123:245-254.

99. Lim, Y.W., S.M. Alamounti, J.J. Kim y C. Breuil. 2004. Multigene phylogenies of Ophiostoma clavigerum and closely related species from bark beetle-attacked Pinus in North America. FEMS Microbiol. Lett. 237:89-96.

100. Lim, Y.W., J.J. Kim, M. Lu y C. Breuil. 2005. Determining fungal diversity on Dendroctonus ponderosae and Ips pini affecting lodgepole pine using cultural and molecular methods. Fungal Divers. 19:79-94.

101. Liu, X., S.M. Tiquia, G. Holguin, L. Wu, S.C. Nold, A.H. Devol, K. Luo, A.V. Palumbo, J.M. Tiedje, y J. Zhou. 2003. Molecular diversity of denitrifying genes in continental margin sediments within the oxygen-deficient zone off the Pacific coast of Mexico. Appl. Environ. Microbiol. 69:3549-3560.

102. Lundgren, J.G., R.M. Lehman y J. Chee-Sanford. 2007 Physiology, biochemistry, and topology: Bacterial communities within digestive tracts of ground beetles (Coleoptera: Carabidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 100:275-282.

103. Maier, R.M., I.L. Pepper y C.P. Gerba. 1999 Environmental microbiology. Academic Press.

Page 52: PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070651_5409.pdf · agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

104. Martin, M.M. 1979. Biochemical implications of insect mycophagy. Biol. Rev. 54:1-21. 105. Mazur, B.J. y C.F. Chui, 1982. Sequence of the gene coding for the beta-subunit of

dinitrogenase from the blue-green alga Anabaena. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79:6782-6786. 106. Mattson, W.J. 1980. Herbivore in relation to plant nitrogen content. Ann. Rev. Ecol. Syst.

11:119-161. 107. Mevarech, M., D. Rice y R. Haselkorn. 1980. Nucleotide sequence of a cyanobacterial nifH

gene coding for nitrogenase reductase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77:6476–6480. 108. Miller, B. 2005. OpenStat user's manual, portable data file (OS2MANUAL.PDF),

http://statpages.org/miller/openstat/ , 2003. 109. Mittler, T.E. 1988. Applications of artificial feeding techniques for aphids. En A.K. Minks and

P. Harrewijn (ed.), Aphids: their biology, natural enemies, and control. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, TheNetherlands.

110. Monttlor Curley, C., E.L Brodie, M.G. Lechner y A.H. Purcell. 2007 Exploration for facultative endosymbionts of glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 100:345-349.

111. Moore, G.E. 1972 (a). Microflora from the alimentary tract of healthy southern pine beetles, Dendroctonus frontalis (Scolytidae), and their possible relationship to pathogenicity. J. Invertebr. Pathol. 19:72-75.

112. Moore, G.E. 1972 (b). Pathogenicity of ten strains of bacteria to larvae of the southern pine beetle [Dendroctonus frontalis]. J. Invertebr. Pathol. 20:41-45.

113. Moran, N.A., P. Tran y N.M. Gerardo. 2005 Symbiosis and insect diversification: an ancient symbiont of sap-feeding insects from the bacterial phylum Bacteroidetes. Appl. Environ. Microbiol. 12:8802-8810.

114. Mramba, F., A. Broce y L Zurek 2006. Isolation of Enterobacter sakazakii from stable flies, Stomoxys calcitrans L. (Diptera: Muscidae). J. Food. Prot. 69:671-673.

115. Mulder A, A.A. Graaf, L.A. Robertson y J.G. Kuenen. 1995. Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluized bed reactor. FEMS Microbiol. Ecol. 16:177-184.

116. Muller, H.E., G.R. Fanning y D.J. Brenner. 1995a. Isolation of Ewingella americana from mollusks. Curr. Microbiol. 31:287-290.

117. Muller, H.E., G.R. Fanning, y D.J. Brenner. 1995b. Isolation of Serratia fonticola from mollusks. Syst. Appl. Microbiol. 18:279-284.

118. Murphy K.M., D.S. Teakle y I.C. Macrae. 1994. Kinetics of colonization of adult Queensland fruit-flies Bactrocera tryoni by dinitrogenfixing alimentary-tract bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 60:2508–2517.

119. Muyzer G., E.C. De Waall y A.G. Vitterlinden. 1993 Profiling of complete microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of poliymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rDNA. Appl Environ Microbiol 59:695-700.

120. Muyzer, G. y K. Smalla 1998 Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)

and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antoine van Leeuwenhoek. 73:127-141.

121. Nardi, J.B., R.I. Mackie y J.O. Dawson. 2002. Could microbial symbionts of arthropod guts contribute significantly to nitrogen fixation in terrestrial ecosystems? J. Insect Physiol. 48:751-763.

122. Noda, S., M. Ohkuma, R. Usami, K. Horikoshi, y T. Kudo. 1999. Culture-independent characterization of a gene responsible for nitrogen fixation in the symbiotic microbial community in the gut of the termite Neotermes koshunensis. Appl. Environ. Microbiol. 65:4935-4942.

123. Ohkuma, M., S. Noda y T. Kudo. 1999. Phylogenetic diversity of nitrogen fixation genes in the symbiotic microbial community in the gut of diverse termites. Appl. Environ. Microbiol 65:4926-4934.

Page 53: PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070651_5409.pdf · agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

124. Ohkuma, M. y T. Kudo. 1996. Phylogenetic diversity of the intestinal bacterial community in the termite Reticulitermes speratus. Appl. Environ. Microbiol. 62:461-468.

125. Paine, T.D. y M.C. Birch. 1983. Acquisition and main tenance of mycangial fungi by Dendroctonus brevicomis (Coleoptera Scolytidae). Environ. Entomol. 12:1384-1386.

126. Paine, T.D., K.F. Raffa, y T.C. Harrington. 1997. Interactions among scolytid bark beetles, their associated fungi, and live host conifers. Annu. Rev. Entomol. 42:179-206.

127. Park M., C. Kim, J.Yang, H. Lee, W. Shin., S. Kim y T. Sa. 2005. Isolation oand characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops of Korea. Microbiol. Res. 160:127-33.

128. Peloquin, J.J. y L. Greenberg. 2003. Identification of midgut bacteria from fourth instar red imported fire ant larvae, Solenopsis invicta buren (Hymenoptera: Formicidae) J. Agric. Urb. Entomol. 20:157-164.

129. Potrikus, C.J. y J.A. Breznak. 1980. Uric acid-degrading bacteria in guts of termites [Reticulitermes flavipes (Kollar)]. Appl Environ Microbiol 40:117-124.

130. Potrikus C.J. y J.A. Breznak. 1981. Gut bacteria recycle uric acid nitrogen in termites: a strategy for nutrient conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4601-4605.

131. Purkhold, U., A. Pommerening-Röser, S. Juretschko, M.C. Schmid, H.P. Koops y M. Wagner. 2000. Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16S rRNA and amoA sequence analysis: Implications for molecular diversity surveys. Appl. Environ. Microbiol. 66:5368-5382.

132. Paster, B.J., S.K. Boches, J.L. Galvin, R.E. Ericson, C.N. Lau, V.A. Levanos, A. Sahasrabudhe y F.E. Dewhirst. 2001. Bacterial diversity in human subgingival plaque. J. Bact. 183:3370-3383.

133. Raffa, K.F., T.W. Phillips y S.M. Salom. 1993. Strategies and mechanisms of host colonization by bark beetles. EN T. Schowalter and G. Filip (eds.), Beetle pathogen interactions in conifer forests. Academic, San Diego, CA.

134. Raymond, J., J.L. Siefert, C.R. Staples y R.E. Blankenship. 2004. The natural history of nitrogen fixation. Mol. Biol. Evol. 21:541–554.

135. Reese, E.T., R.G.H. Siu y H.S. Levison. 1950. The biological degradation of soluble

cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. J. Bacteriol. 59:485-497.

136. Relman, D.A. 1993. Universal bacterial 16S rRNA amplification and sequencing. En American Society of Microbiology (ed) Diagnostic molecular microbiology: principles and applications. Nueva York.

137. Rivas, R., M.E. Trujillo, P.F. Mateos, E. Martínez-Molina y E. Velázquez. Cellulomonas xylanilytica sp. nov., a cellulolytic and xylanolytic bacterium isolated from a decayed elm tree. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54:533-536.

138. Robbins, C.T. 1983. Wildlife feeding and nutrition. Academic Press, New York, New York,

USA. 139. Rolfe, R.D. 1997. Colonization resistance. En: Mackie R.I. y White B.A. (eds)

Gastrointestinal microbiology, vol 2. Chapman and Hall, New York, USA. 140. Rosello-Mora R. y R. Amann. 2001. The species concept for prokaryotes. FEMS-Microbiol.

Rev. 25:39-67. 141. Rotthauwe, J.H, K.P. Witzel y W. Liesack. The ammonia monooxigenase structural gene

amoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations. Appl. Environ. Microbiol. 63:4704-4712.

142. Sandhiya G.S., T.C. Sugitha, D. Balachandar y K. Kumar. 2005 Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a diazotrophic Serratia sp. in rice. Indian J Exp Biol. 43:802-807.

143. Sambrook J. y D.W. Russell. 2001. Molecular Cloning: a laboratory manual ·3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.

Page 54: PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070651_5409.pdf · agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

144. Saxena, S., J. Bahadur y A. Varma. 1993. Cellulose and hemicelluloses degrading bacteria from termite gut and mound soils of India. Indian J. Microbiol. 33:55-60.

145. Scala, D., y L.J. Kerkhof. 1999. Diversity of nitrous oxide reductase (nosZ) genes in continental shelf sediments Appl. Environ. Microbiol. 65:1681-1687.

146. Schäfer, A. 1996. Hemicellulose-degrading bacteria and yeasts from the termite gut. J. Appl. Bacteriol. 80:471–478.

147. Schloss, P.D. y J. Handelsman. 2005. Introducing DOTUR, a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness. Appl. Environ. Microbiol. 71:1501-1506.

148. Schloss, P.D., I. Delalibera, Jr., J. Handelsman y K.F. Raffa. 2006. Bacteria associated with the guts of two wood boring beetles: Anoplophora glabripennis and Saperda vestita (Cerambycidae). Environ. Entomol. 35:625-629.

149. Schowalter, T.D. 1981. Insect herbivore relationship to the state of the host plant: biotic regulation of ecosystem nutrient cycling through ecological succession. Oikos 37:126-130.

150. Schultz, J.E. y J.A. Breznak. 1978. Heterotrophic bacteria present in hindguts of wood eating termites [Reticulitermes flavipes (Kollar)]. Appl. Environ. Microbiol. 35:930-936.

151. Schumann, P., N. Weiss y E. Stackebrandt. 2001. Reclassification of Cellulomonas

cellulans (Stackebrandt and Keddie 1986) as Cellulosimicrobium cellulans gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1007-1010.

152. Scriber, J.M. y F. Slansky, Jr. 1981. The nutritional ecology of immature insects. Annu. Rev.

Entomol. 26:183-211.

153. Sezen, K., I. Demir y Z. Demirbag. 2006. Identification and pathogenicity of

entomopathogenic bacteria from common cockchafer, Melolontha melolontha (Coleoptera: Scarabaeidae). New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 35:79-85.

154. Six, D.L. 2003. Bark beetle-fungus symbiosis. En Insect symbiosis. Bourtzis, K., and T.A. Miller. CRS Press.

155. Slansky, E 1993. Nutritional ecology - the fundamental quest for nutrients. En Caterpillars. N.E. Stamp y T.M. Casey, editors. Chapman & Hall, New York, New York, USA.

156. Slansky, F., Jr. y J.M. Scriber. 1985. Food consumption and utilization. En Comprehensive insect physiology. G.A. Kerkut y L.I. Gilbert, editors, biochemistry, and pharmocology. Pergamon, Oxford, UK.

157. Slansky, F. y G.S. Wheeler. 1992. Caterpillars compensatory feeding response to diluted nutrients leads to toxic allelochemical dose. Entomol. Exp. Appl. 65:171-186.

158. Steinhaus, E.A. 1959. Serratia marcescens Bizio as an insect pathogen. Hilgardia 28:351-380.

159. Straif, S.C., C.N.M. Mbogo, A.M. Toure, E.D. Walker, M. Kaufman, Y.T. Toure y J.C. Beier. 1998. Midgut bacteria in Anopheles gambiae and An. funestus (Diptera: Culicidae) from Kenya and Mali. J. Med. Entomol. 35:222-6.

160. Tabashnik, B.E. 1982. Responses of pest and nonpest Colias butterfly larvae to intraspecific variation in leaf nitrogen and water content. Oecologia 55:389-394.

161. Tannock, G.W. 1997. Probiotic properties of lactic-acid bacteria: Plenty of scope for fundamental R and D. Trends. Biotechnol. 15:270–74.

162. Tholen, A., B. Schink y A. Brune. 1997. The gut microflora of Reticulitermes flavipes, its relation to oxygen, and evidence for oxygen-dependent acetogenesis by the most abundant Enterococcus sp. FEMS Microbiol. Ecol. 24:137-149.

Page 55: PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070651_5409.pdf · agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

163. Thompson, J.D., T.J. Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin y D.G. Higgins. 1997. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 24:4876-4882.

164. Treusch A.H., S. Leininger, A. Kletzin, S.C. Schuster, H-P. Klenk y C Scheleper 2005 Novel genes for nitrite reductase and Amo-related proteins indicate a role of uncultivated mesophilic crenarchaeota in nitrogen cycling. Environ. Microbiol. 7:1985-1995.

165. Trier, T.M. y W.J. Mattson. 1997. Needle mining by the spruce budworm provides sustenance in the midst o f privation. Oikos 79:241-246.

166. Tokuda, G. y H. Watanabe 2007 Hidden cellulases in termites: revision of an old hypothesis. Biol. Lett. 3:336-339.

167. Ueda, T., Y. Suga, N. Yahiro y T. Matsuguchi. 1995. Remarkable N2-fixing bacterial diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis of nifH gene sequences. J. Bacteriol. 177:1414-1417.

168. Ulrich, R., D. Buthula y M. Klug. 1981. Microbiota associated with the gastrointestinal tract of the common house cricket, Anacheta domestica. Appl. Environ. Microbiol. 41:246-254.

169. Varma, A., B.K. Kolli, J. Paul, S. Saxena y H. König. 1994. Lignocellulose degradation by microorganisms from termite’s hills and termite guts: a survey the present state of art. FEMS Microbiol. Rev. 15:9-28.

170. Vasanthakumar A., I. Delalibera, Jr, J. Handelsman, K.D. Klepzig, P.D. Schloss y K.F. Raffa. 2006 Characterization of gut-associated bacteria in larvae and adults of the southern pine beetle, Dendroctonus frontalis Zimmermann. Eviron. Entomol. 35: 1710-1717.

171. Venter J.C., K. Remington, J.F. Heidelberg, A.L. Halpern, D. Rusch y J.A. Eisen. 2004. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science 304:66-74.

172. Vimala, A., A. Sree y M. Bapuji. 2004. Isolation and characterisation of Acinetobacter sp. from a marine sponge Axinella agariciformis. Asian J Microbiol. Biotechnol. Environ. Sci. 6:297-300.

173. Vorwerk, S., D. Martinez-Torres y A. Forneck. 2007. Pantoea agglomerans-associated bacteria in grape phylloxera (Daktulosphaira vitifoliae, Fitch). Agric. For. Entomol. 9: 57-64.

174. Wagner, T.L., J.A. Gagne, P.J.H. Sharpe, y R.N. Coulson. 1984. A biophysical model of southern pine beetle, Dendroctonus frontalis Zimmermann (Coleoptera: Scolytidae), development. Ecol. Model. 21: 125-147.

175. Wallin, K.F. y K.F. Raffa. 2004. Feedback between individual host selection behavior and population dynamics in an eruptive insect herbivore. Ecol. Monogr. 74:101-116.

176. Wells, M.L., R.D. Gitaitis y F.H.Sanders. 2002 Association of tobacco thrips, Frankliniella fusca (Thysanoptera: Thripidae) with two species of bacteria of the genus Pantoea Ann. Entomol. Soc. Am. 95: 719-723.

177. Wenzel, M., I. Scho nig, M. Berchtold, P. Ka mpfer y H. Ko nig. 2002. Aerobic and facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of the termite Zootermopsis angusticollis. J. Appl. Microbiol. 92: 32-40.

178. Werner, E., 1926. Die ernährung der larvae von Potosia cuprea Fbr. (Cetonia floricola Hbst.). En Beitrag zum problem der cellulosverdauung bei insectenlarven. Zeitschrift für Morphologie und Ökologie der Tiere 6: 150–206.

179. White, T.C.R. 1993. The inadequate environment: nitrogen and the abundance of animals. Springer-Verlag, New York, New York, USA.

180. Widmer, F., B.T. Shaffer, L.A. Porteuous y R.J. Seidler. 1999. Analysis of nifH gene pool complexity in soil and litter at a Douglas Fir forest site in the Oregon cascade mountain range. Appl. Environ. Microbiol. 65:374-380.

181. Wiedenmann, J.F., 1930. Die Zelluloseverdauung bei Lamellicornierlarven. Zeitschrift für Morphologie und Ökologie der Tiere 19: 228-258.

182. Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalsky y S.V. Tingey. 1990. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res.18:6531-6535.

Page 56: PROYECTO: RIQUEZA DE ESPECIES BACTERIANAS Y …sappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070651_5409.pdf · agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de

183. Wood, S.L. 1982. The bark and ambrosia beetle of North and Central America (Coleoptera: Scolytidae). A taxonomic monograph. Great Basin Nat. Mem.

184. Woolfolk, S.W. y G.D. Inglis. 2004. Microorganisms associated with field-collected Chrysoperla rufilabris (Neuroptera: Chrysopidae) adults with emphasis on yeast symbionts. Biol. Control. 29:155-168.

185. Wright S.F. y R.W. Weaver 1981. Enumeration and identification of nitrogen-fixing bacteria from forage grass roots Appl Environ Microbiol. 42:97–101.

186. Wu, L., D.K. Thompson, G. Li, R.A. Hurt, J.M. Tiedje y J. Zhou. 2001. Development and evaluation of functional gene arrays for detection of selected genes in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 67:5780-5790.

187. Xia X. y Z. Xie 2001 DAMBE: Data analysis in molecular biology and evolution. J. Heredity 92:371-373.

188. Xiang, H., G.F. Wei, S. Jia, J. Huang, X.X. Miao, Z. Zhou, L.P. Zhao y Y.P. Huang. 2006. Microbial communities in the larval midgut of laboratory and field populations of cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Can. J. Microbiol. 52:1085-1092.

189. Yang, Y. y A. Joern. 1994. Compensatory feeding in response to food quality by Melanopus differentiallis. Physiol. Entomol. 19:75-82.

190. Zehr, J.P., M. Mellon, S. Braun, W. Litaker, T. Steppe y H.W. Paerl. 1995. Diversity of heterotrophic nitrogen fixation genes in a marine cyanobacterial mat. Appl. Environ. Microbiol. 61:2527-2532.