Massenspektrometrie (MS)

Skript zur Spektroskopie Vorlesung

an der

Ludwig-Maximilians-Universität München

Dr. Werner Spahl

Massenspektrometrie (MS)Seite Stunde

Inhaltsverzeichnis 2 1Abkürzungsverzeichnis 3 1

1. Grundlagen 4 11.1 Probeneinlass I: RI, DIP, DEP; Quantifizierung 11 11.2 Ionenquelle I: EI, LEI; Verunreinigungen 14 21.3 Analysator I: BE(EB), SIM 20 21.4 Detektor I: FC, SEV, PAD, MCP 22 2

2. Fragmentierungen 24 32.1 Radikal induzierte Spaltungen: σ, α, Mc, RDA 24 32.2 Ladungs induzierte Spaltungen: i, El, On, NV 37 42.3 Derivatisierungsreaktionen 46 42.4 Praktische Spektreninterpretation 48 4

Übung 1 5Übung 2 6

3. Fortgeschrittenes 50 73.1 Probeneinlass II: GC 50 73.2 Probeneinlass III: LC 54 73.3 Ionenquelle II: CI, NCI, APCI 59 83.4 Ionenquelle III: ESI, FAB, MALDI 68 93.5 Analysator II: Q, T, TOF, ICR, OT 76 103.6 Analysator III: MS/MS, SRM 80 10

4. Anhang (nicht klausurrelevant) 84 11

Übung 3 11Übung 4 11

Alle Abbildungen sind frei oder mit Zustimmung der Autoren verwendet, Massenspektren sind generiert oder entstammen der NIST 05 Datenbank.© Dr. Werner Spahl, Universität München: spahl@cup.uni-muenchen.de

2

Abkürzungsverzeichnis

Probeneinlass:RI Reservoir Einlass TA TargetanalyseDIP Direktinsertions Probe DEP Direktverdampfungs ProbeFIA Flussinjektions Analyse DIA Direktinfusions AnalyseGC Gaschromatographie LC Flüssigkeitschromatographie

Ionenquelle:EI Elektronenstoß Ionisation LEI Niederenergie EI CI Chemische Ionisation NCI Negative CIAPCI Atmosphärendruck CI APPI AP Photo IonisationESI Elektrospray Ionisation DESI Desorption ESIFAB Fast Atom Bombardment FIB Fast Ion BombardmentMALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation APMALDI

Analysator und Detektor:HR Hochauflösung LR NiederauflösungAM Exakte Masse FT Fourier TransformTIC Totalionenstrom PAD KonversionsdynodeSEV Sekundärelektronenvervielfacher MCP MikrokannalplatteBE(EB) Sektorfeld TOF FlugzeitQ Quadrupol (L)T (Lineare) IonenfalleICR Ionen Cyclotron Resonanz OT OrbitrapSIM Selected Ion Monitoring SRM Selected Reaction MonitoringCID Stoßaktivierung SID Skimmer StoßaktivierungAMS Beschleuniger MS IRMS Isotopenratio MS

Fragmentierung:σ σ-Spaltung α α-SpaltungMc McLafferty Umlagerung RDA Retro Diels Alderi Induktive Spaltung El EliminierungOn Onium Reaktion NV Neutralteilchen VerlustBz Benzyl Spaltung Ph Phenyl Spaltung

3

1. Grundlagen

Literatur:

Massenspektrometrie Script (http://www.cup.uni-muenchen.de/oc/spahl/)

Hesse/Meier/Zeeh: Spektroskopische Methoden in der org. Chemie

Budzikiewicz/Schäfer: Massenspektrometrie, Eine Einführung

McLafferty/Turecek: Interpretation von Massenspektren

Gross: Massenspektrometrie, Ein Lehrbuch

Ausstattung des Department Chemie der LMU München:

Ungefähr 10 Massenspektrometer in den Organischen Chemie AKs

(zusätzlich stehen 8 Massenspektrometer in der zentralen Analytik)

Anwendung:

Strukturaufklärung (kombiniert mit NMR-Spektroskopie)

Quantifizierung (direkt gekoppelt mit Trennungsmethoden)

Motto:

Und derjenige, der etwas zerbricht, um herauszufinden,

was es ist, hat den Pfad der Weisheit verlassen.

Gandalf der Graue

4

Vorteile:

Substanzmenge ~ 1 mg (bis fg = 10–15 g) → Spurenanalytik (z. B. Doping)

Messdauer ~ 1 s/Spektrum (bis 100 Spektren/s) → Kopplung (z. B. GC)

Nachteile:

Probe wird verbraucht (nicht zerstörungsfrei!) → Substanzverlust

→ Verunreinigung des Massenspektrometer → „Memory Effekt”

Probe kann im Massenspektrometer reagieren (Thermische Reaktion,

Umsetzung mit vorhandenen Reagenzien) → „Chemische Methode“

Bibliothekssuche:

Computervergleich eines EI-Massenspektrums („Fingerabdruck“) mit

Spektrenbibliotheken, z. B. NIST (National Institute of Standards and

Technology) Mass Spectral Library / Wiley Registry of Mass Spectral

Data ( > 600.000 Substanzen) → 0-100 % („Score“) Übereinstimmung

Datenbanksuche:

Computervergleich eines Peptidverdau ESI-MS/MS-Massenspektrums

(„fingerprinting“) durch Algorithmen wie MASCOT / SEQUEST mit

Sequenzdatenbanken z. B. UniProt ( > 500.000 Proteinsequenzen) die

Peptide eines theoretisch berechneten („in silico“) Verdaues enthalten

5

Prinzip:

-------------- -------- --------------- ---------------- | Molekül |--------| Ion |-----------| Trennung |-------| Detektion | -------------- -------- --------------- ----------------

Methanol Methanol-Ion Molekülion Molekülpeak

(fragmentiert) Methyl-Ion Fragmention Fragmentpeak

---------- Reaktion ---------- ---------- Aufarbeitung ----------

Massenspektrum:

Strichspektrum: „Centroid-Daten“ (Linien) <> „Profil-Daten“ (Kurven)

Massenliste: Tabelle von Masse/Ladung (m/z) zu relativer Intensität (%)

Beispiel: EI-Massenspektrum von Methanol (CH3OH, M 32 u)

Basispeak (Quasimolekülpeak)

Fragmentpeak

rel. Int. (%) → Molekülpeak

Ionenhäufigkeit Fragmentpeak

Isotopenpeak

Masse/Ladung (m/z) → Ionenmasse

Molekülpeak (Quasimolekülpeak) → Molekülmasse → Summenformel

Fragment peaks (Zerfallsmuster) → Fragmentmassen → Strukturformel

6

Molekülpeak:

Monoisotopische Atommasse <> Mittlere Atommasse (Periodensystem!)

Einheit: 1 u = 1/12 12C (1,66.10–24 g), 1 mmu = 0.001 u, 1 kDa = 1000 u

Isotope:

„A Typ”: 19F, 31P, 127I, ... (Reinelemente), H, N, O, ... (< 0.5 % Häufigkeit)

„A+1 Typ“: 11B, 12C, ... „A+2“ Typ: 28Si, 32S, 35Cl, 79Br, ...

12C 11B 28Si 32S 35Cl 79Br

13C Intensität → C Anzahl (+/– 2 C) (13C > 12C ab C90 ~ M > 2000 u!)

Cln / Brn: typische Muster Metalle: oft charakteristische Muster

C10 C100 Cl2 Br2102Ru

7

0.8 %

25 %

1.1 %4.4 %5.1 %

3.4 %

32 %

97 %

64 %

0.5 %

49 %51 %

11 %

91 %

55 %

20 % 15 % 6 %17 %

40 %54 % 59 %

6 %1 %

Isotopenmuster für mehrere Isotope im Molekülpeak: Lehrbuch, Internet

„Stickstoffregel“: (un)gerader Molekülpeak enthält (un)gerade Anzahl N

→ Isotopenmuster liefert Hinweise auf Elemente

Massengenauigkeit (∆m): Genauigkeit mit der die Masse bestimmt wird

1H 1.0078 u 14N 14.0031 u 16O 15.9949 u 19F 18.9984 u

Nominelle Masse: 0-1 Nachkommastellen (wegen Rundungsfehlern)

erfassbar durch „Niederauflösung“ (Low Resolution LR) Messungen

→ Kalibrierung (mit interner Referenz, stabil über lange Zeiträume)

Exakte Masse: 3-4 Nachkommastellen (∆m < 1-10 ppm „Mio%“)

erfassbar durch „Hochauflösung“ (High Resolution HR) Messungen

→ Massenfeinbestimmung (meist mit interner oder externer Referenz)

Beispiel:

Methanol CH3OH Sauerstoff O2

nominelle Masse 32.0 u nominelle Masse 32.0 u

exakte Masse 32.0254 u exakte Masse 31,9898 u

→ Exakte Masse liefert Hinweise auf Summenformel

8

Problem:

Je größer eine Masse, desto mehr mögliche Summenformeln →

Isotopenmuster und Vorwissen wichtig. Massenfeinbestimmung

ergibt viele Vorschläge, aber nur wenige sinnvolle Vorschläge!

Auflösung (Resolution R):

Spezifischer instrumenteller Parameter der entscheidend

für die Massengenauigkeit eines Massenspektrometer ist

„HRAM“ Messung → „High Resolution Accurate Mass“

Höhere Auflösung

→ Genauere Bestimmung der exakten Masse (geringere Peakbreite)

→ Trennung von Peaks mit der gleichen nominellen Masse (Isobare)

→ Geringere Empfindlichkeit oder längere Messzeit (pro Spektrum)

R10 % Tal = m/∆m →

RFWHM = 1.8 x R10 % Tal

Halbwertsbreitenmethode

(FWHM: Full width at half mass)

Beispiel:

Peak bei nomineller Masse m/z 28

CO 27.9949 u N2 28.0061 u

Auflösung: R10 % Tal ~ 2500 → RFWHM ~ 4500

9

Massenspektrometer Aufbau:

Datensystem: Steuerung, Spektrenaufnahme und -auswertung

--------------------- ------------------ ----------------- --------------| Probeneinlass |-----| Ionenquelle |-------| Analysator |------| Detektor |--------------------- ------------------ ----------------- --------------

Vakuumsystem: mittlere freie Weglänge der Ionen, Isolation

Drehschieberölpumpen (Vorvakuum: 10–1-10–3 mbar)

Turbomolekularpumpen (Hochvakuum: 10–4-10–10 mbar)

10

1.1 Probeneinlass I

Auswahl: Anwender und Instrument, kritisch für Probenerfassung!

Problem: Hochvakuum im Instrument, Substanz bei Normaldruck

Reservoir Einlass (RI):

Heizbare Kammer (100-200 °C) unter Normaldruck mit Vakuumventil

→ geeignet für Gase und leicht flüchtige Feststoffe oder Flüssigkeiten

Vorteil: Dosierbarkeit → Referenz Nachteil: „Memory Effekt“

Direktinsertions Probe (DIP):

Ionenquelle Schubstange

Tiegel

Vakuumschleuse

Tiegel (Aluminium/Glas) in temperierbarer Schubstange (20 bis 400 °C

mit bis 20 °/min) → geeignet für Flüssigkeiten und flüchtige Feststoffe

Faustregel: Verdampfungstemperatur im Hochvakuum ~ Schmelzpunkt

Vorteil: Zukneifen des Tiegels → flüchtige Proben oder Schutzgas

Nachteil: Empfindliche und schwer flüchtige Proben zersetzen sich

11

Direktverdampfungs Probe (DEP):

Ionenquelle Schubstange

Fadenträger

Vakuumschleuse

Draht (Platin/Rhenium) elektrisch geheizt (bis 1600 °C mit bis 120 °/min)

in Schubstange = „in beam” = Direkt = Desorptions EI, CI (DEI, DCI)

→ geeignet für schwer flüchtige Flüssigkeiten und Feststoffe

Vorteil: Verdampfung schneller als Zersetzung → empfindliche Proben

Nachteil: Substanz Verlust in der Vakuumschleuse → Diskriminierung

Fraktionierte Hochvakuum Verdampfung → 2D Methode (min, %, m/z)

schwer flüchtige Lösungsmittel ungeeignet für MS (z. B. DMSO, DMF)

Massenspur → Auswahl, Subtraktion → Selektivität, Bibliothekssuche

Beispiel: Thermogramm einer Urin Probe auf Koffein und Amphetamin

(Extracted Ion Current EIC)

% Spur 2 (m/z 194 → Koffein)

% Spur 1 (m/z 135 → Amphetamin)

% Summe aller Massenintensitäten

Zeit (min) (Reconstructed Ion Current RIC )

12

EI-Massenspektrum von Koffein (M 194 u, z. B. Kaffee, Cola):

%

m/z

EI-Massenspektrum von Amphetamin (M 135 u, z. B. „Speed“):

%

m/z

Quantifizierung:

Relative Quantifizierung → % zu internem Standard (isotopenmarkiert)

Absolute Quantifizierung → externe Standards → Eichkurve (Steigung

= Empfindlichkeit) → Konzentration in g/l

Nachweisgrenze (Signal/Rausch Verhältnis S/N) <> Empfindlichkeit

13

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 1400

50

100

39 42

44

51 56 5965

77

91

103 115 120

NH2

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 2100

50

100

15 2832

42

5567

70

82

94

109

136150

165

194

O

NN

N NO

1.2 Ionenquelle I

Auswahl: Anwender und Instrument, kritisch für Probenerfassung!

Elektronenstoß Ionisation (EI):

Ionisation gasförmiger Moleküle durch einen Elektronenstoß →

Physikalische Methode für flüchtige Substanzen (M bis ~ 1500 u)

Abschätzung: Struktur, Siedepunkt / Schmelzpunkt, Löslichkeit

(flüchtige Lösungsmittel wie Ether, Hexan, Chloroform, Aceton)

Filament (Rhenium/Wolfram) erzeugt Elektronen (~1 mA Filamentstrom)

Elektronenenergie (10-300 eV) beschleunigt Elektronen durch die Quelle

Temperatur: 100-300 °C (Filament: ~ 150 °C) → thermische Reaktionen!

1 mA70 eV

Emissionsstrom1-10 kV

Fokusblenden „Tunen“

Beschleunigungsspannung Quellenspalt (Größe beeinflusst

(zieht Ionen in Analysator) Empfindlichkeit und Auflösung)

14

Molekülionen:

M + e– → M+. + 2e– „Sanfter Stoß“

(M + e– → M2+ + 3e–)

Fragmentionen:

„primär“ M+. → F+ + N. „Harter Stoß“

M+. → F+. + N

„sekundär“ F+ → F1+ + N1 F+ → F3

+ + N3

F+. → F2+ + N2

. F+. → F4+. + N4

M: Molekül F: Fragment N: Neutralteilchen +/– : Ladung . : Radikal

EI liefert die Molekülmasse, wenn der Moleküpeak sichtbar ist, und

Strukturinformationen durch Fragmentierung: „Harte Ionisierung“

Negative Elektronenstoß Ionisation (NEI) : M + e– ↔ M–.

Probleme:

unempfindlich (1/1000 EI), intensive Fragmentionen (z. B. Halogene)

15

Unimolekularer Zerfall:

t > 10 µs Molekülionen M+. (stabile Ionen)

t < 1 µs Fragmentionen F+(.) (instabile Ionen)

1 µs < t < 10 µs Metastabile Ionen M* / F*

t: Lebensdauer der Ionen

Metastabile Ionen zerfallen im feldfreien Raum nach der Ionenquelle:

M* → F* + N

Analysator ergibt falsches m/z Verhältnis → m/z* = (m/zF*)2/(m/z)M*

Beispiel:

H2 (M 2 u) → m/z 2 (M+.), m/z 1 (F+), m/z 0.5 (m/z*: 12/2 = 0.5)

Messung mit Sektorfeldanalysatoren und „linked Scan” Techniken

→ Anwendung: Untersuchung von Fragmentierungsmechanismen

Beispiel:

Entsteht F1+ aus M+. oder F+ (primär oder sekundär)?

M* (M+. → F1+) deutet auf diesen Weg hin

M* (F+ → F1+) deutet auf alternativen Weg

16

0 50 100 150

Ionisierungsenergie (IE): benötigte Energie um ein Molekül zu ionisieren

für organische Moleküle: IE (M) ~ 7-14 eV

Auftrittsenergie (AE): benötigte Energie um ein Ion zu detektieren

Molekülion: AE (M+.) = IE (M)

Fragmention: AE (F+(.)) = IE (M) + Überschussenergie (UE)

Stabiles Molekül (IE hoch) → Geringe Fragmentierung (mehr UE nötig)

Selektivität: Moleküle werden unspezifisch mit unterschiedlicher UE

ionisiert → Spektrum ist Abbild aller vorliegenden Ionen

Standard- Elektronenenergie: 70 eV

→ Empfindlichkeit maximal (trotzdem Ionenausbeute nur ~ 1/1000)

→ Fragmentierung reproduzierbar (Überschussenergie bis ~ 15 eV)

Ionenstrom (mA)

Elektronenenergie (eV)

17

M (< 1 eV) + e- (70 eV) → M+. (IE) + 2 e- (70 eV – IE)

„Sanfter Stoß“→ Molekülpeak

M (< 1 eV) + e- (70 eV) → M+. (IE + UE) + 2 e- (70 eV – IE – UE)

„Harter Stoß“ → Fragmentpeak

Probleme: Flüchtigkeit nötig, Molekülpeak eventuell nicht sichtbar

Niederenergie Elektronenstoß Ionisation (LEI):

Elektronenenergie: 10-15 eV → Molekülpeak Intensität höher

Beispiel: EI-Massenspektrum von Ethylacetat (CH3CO2CH2CH3, M 88 u)

EI (70 eV) LEI (15 eV) M+.

% %

M+.

m/z m/z

Probleme: Empfindlichkeit (absolute Molekülpeak Intensität ist gleich)

Reproduzierbarkeit (Spektrum abhängig von Quellendetails)

18

43

61

8870

100

40 60 80 100

88

70

6143

100

40 60 80 100

Verunreinigungen:

Lösungsmittel, Zusatzstoffe in Chemikalien (z. B. Ether-Inhibitor BHT)

Weichmacher (z. B. Phthalat), Silikone (z. B. Schlifffett, „Säulenbluten“)

Beispiele:

EI-Massenspektrum von BHT (2,6-Di-t-butyl-4-methylphenol, M 220 u):

%

m/z

EI-Massenspektrum von „Säulenbluten“ (Si Isotopenmuster!)

[(–O–Si(CH3)2–)3–CH3]+

% [(–O–Si(CH3)2–)4–CH3]+

m/z

Untergrund:

Luft (N2 28 u, O2 32 u, Ar 40 u, CO2 44 u) → Messbereich ab m/z 40-80

19

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 2300

50

100

1529

41

57

67 81 91 105 115 128 141

145

149 161177

189

205

220

OH

1.3 Analysator I

Auswahl: Instrument, entscheidend für Auflösung und Massengenauigkeit

Sektorfeld (BE + EB):

Magnetischer Sektor (B = Magnet)

m/z = B2r2e/2U Impulsanalysator

B: Magnetfeld (1-2 Tesla) m2r: Radius, e: Elementarladung m1 + m2 m1U: Beschleunigungsspannung(1-10 kV, gebräuchlich 5 kV) m1 < m2

Elektrostatischer Sektor (E = ESA)

m/z = reE/v2 Energieanalysator

v: Geschwindigkeit der Ionen e2E: Elektrisches Feld, r: Radius e1 + e2(korrigiert Energieunterschiede e1 → verbessert Auflösung x 50) e1 < e2

Doppelt fokussierend (BE/EB) e1

→ BE: höhere Auflösung→ EB: metastabile Ionen e2

m2m1

20

Spektrum (Scan): kontinuierliches Verändern eines Parameters

→ Magnetfeldstärke B (oder E, U) wird erhöht (oder erniedrigt)

→ ~ 1-10 s/Spektrum (langsame Scanrate erhöht Empfindlichkeit)

Selected (Single) Ion Monitoring (SIM): diskrete Änderung von B/E/U

→ Empfindlichkeit x100-1000 gegenüber Spektrum (~ 1 ng → pg - fg)

Eigenschaften: ∆m < 2 ppm, R < 100.000 FWHM, Bereich < m/z 50.000

Beschleuniger Massenspektrometrie (AMS):

Teilchenbeschleuniger/Sektorfeld-Analysator für 14C Analyse: 10-10 % 12C

von Graphit (U ~ MeV!) → Altersbestimmung von bis zu 100.000 Jahren

Beispiel:

Turiner Grabtuch (1988 Alter durch AMS bestimmt auf ~ 1300 n. Ch.)

21

1.4 Detektor I

Auswahl: Instrument, kombiniert mit dem geeigneten Analysator-System

Dynamik: Totalionenstrom TIC 10–9-10–18 A → Verstärkungsfaktor 106-8

Faraday-Auffänger („Faraday Cup“ FC):

Ion+ oder Ion– e–

10-100 MOhm

Isotopenratio Massenspektrometrie (IRMS):

Einfach fokussierende Sektorfeldgeräte mit Detektoren bei festen Radien

→ Nachweis von Isotopenverhältnissen (2H/H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O)

→ Herkunft von Proben (z. B. Unterschied 13C/12C in CO2 Europa/USA)

Beispiel:

Tequila (Agave: C3 → 1.080 % 13C, Zuckerrohr: C4 → 1.095 % 13C)

Blaue Agave Tequila Zuckerrohr

22

Sekundärelektronenvervielfacher („Multiplier“ SEV):

Mehrstufen SEV (10-20 BeCu Dynoden), Channeltron (Pb dotiertes Glas)

–3 kV 0 kV –3

kV

Ion+ 1 e– → ~ 3 e– → ...0 kV

Konversionsdynode (Post Acceleration Detektor PAD):

Konversion negativer Ionen → bessere Detektion

Nachbeschleunigung aller Ionen → hohe Massen

Ion– oder Ion+ Ion+ oder e–

Detektorspalt 0 kV +/–8-30 kV

Mikrokanalplatte („Array Detektor“, Microchannelplate MCP):

Empfindlichkeit x 100 (Detektion gleicher Ionen)

Schnellere Messungen (ortsabhängige Detektion)

→ Sektorfeldgerät in EB Konfiguration

→ Flugzeitmassenspektrometer (TOF)

23

2. Fragmentierungen

Allgemeine Regeln:

Fragmentierungen sind Resultat gleichzeitig ablaufender Ionenreaktionen

→ Antrieb ist Bildung stabiler Ionen/Neutralteilchen (Stevenson Regel)

→ „Bei der Fragmentierung spaltet sich immer das größte Radikal ab.“

Ionisierungsvorgang (~ fs) ist schneller als Molekülschwingungen (~ ps)

→ elektronisch angeregtes Molekülion (Franck-Condon-Prinzip FCP)

→ Energiekonversion in Schwingungsenergie (keine Stöße!) → Zerfall

Schwingungsenergie Verteilung ist schneller als folgende Fragmentierung

→ Fragmentierung ist nur von Ionenenergie und Ionenstruktur (Zahl der

Schwingungsfreiheitsgrade) abhängig (Quasi-Equilibrium-Theorie QET)

Formalismus:

Konzept der l okalisierten Ladung: Wahrscheinlichkeit +. : n > π > σ

Anzeige einer delokalisierten Ladung: [Molekül]+. oder Molekül +.

+. : Radikalkation (odd electron OE) + : Kation (even electron EE)

: Elektronen Bewegung : Elektronenpaar Bewegung

24

2.1 Radikal induzierte Spaltungen

σ-Spaltung (σ):

Spaltung von nicht aktivierten σ-Bindungen (Radikalkation → Kation):

σ

Alkane zeigen charakteristisches Muster (Massendifferenz von m/z 14):

Beispiel: n-Tetradecan (M 198 u)

%

M+.

m/z

25

Verzweigungen führen zu stabileren sekundären und tertiären Ionen:

Beispiel: n-Hexadecan (M 226 u) 5-Methylpentadecan (M 226 u)

% %

M+. M+.

m/z m/z

Folgereaktion ist oft Neutralteilchen Verlust (NV) (Kation → Kation):

NV

Homolytische Bindungsspaltung ist zu energieaufwendig!

(wenn das Radikal einmal weg ist, kommt es nicht wieder)

→ „Even Electron Rule”: EE Ionen erzeugen nur EE Fragmente

26

Einzelne Doppelbindungen erzeugen um m/z 2 verschobene Peaks:

Beispiel: 1-Hexadecen (224 u)

%

M+.

m/z

Fluorierte Kohlenwasserstoffe zeigen ähnliche Muster:

Beispiel: Perfluorkerosin (PFK)

%

m/z

σ[CF3–(CF2)m–(CF2)n–CF3]+. CF3–(CF2)m

+ + .(CF2)n–CF3

Anwendung: Referenz für EI Kalibrierung und Massenfeinbestimmung

(exakte Masse < nominelle Masse, hoher Massenbereich: 69-1017 u)

27

α-Spaltung (α):

Spaltung der α-Bindung zu einer Radikalstelle, üblicherweise einem

Heteroatom oder einer Doppelbindung (Radikalkation → Kation):

X: O, NR, ... Y: OR, NRARB, ...

α α α α CRA=CRBRC, Aromat

Spaltung der α-Bindung zu einem sekundären Heteroatom:

Diethylether α Oxonium-Ion

m/z 74 m/z 59

Spaltung der α-Bindung zu einem primären Heteroatom:

Beispiel: Methanol (M 32 u) αM+.

%

m/z

αMethanol [H–CH2–O–H]+. [CH2=O–H]+ Oxonium-Ion

m/z 32 - .H m/z 31

28

Beispiel: 1-Hexylamin (M 101 u)

α

%

m/z

1-Hexylamin α Immonium-Ion

m/z 101 m/z 30

Bei unterschiedlichen α-Bindungen erfolgt bevorzugt die Abspaltung:

OR > R > NR2 > H

α α

„Alkylregel”: Homologe spalten den größeren Alkylrest bevorzugt ab

αOxonium-Ion

Ethylbutylketon

29

Folgereaktion ist oft Neutralteilchen Verlust (Kation → Kation):

α NV

(NH statt O → - CNH)

→ manchmal so schnell, dass das α-Fragment nicht sichtbar ist!

Allylspaltung (Al):

α-Spaltung zu einer Doppelbindung (Radikalkation → Kation):

EI Al

Beispiel: 1-Hexen (M 84 u)

Al 41 56%

28 69

m/z

30

Wasserstoffumlagerung (WU) → „Distonisches Radikalkation“

→ „Remote Site Fragmentation“

Al

WU im Radikalfragment → m/z 41

nach außen reine σ-Spaltung σ (WU)

m/z 55

WU + NV σ (WU)

m/z 56 m/z 69

WU + NV

m/z 42

WU + NV

m/z 28

Bei unspezifischen Wasserstoffumlagerungen → chemische Fixierung →

Fragmente geben Hinweise auf ursprüngliche Doppelbindungs Position

chemisch Ketal

massenspektrometrisch Fragment A

α

α

Fragment B

31

Benzylspaltung (Bz):

α-Spaltung zu einem aromatischen System (Radikalkation → Kation):

m/z 91

Bz Tropylium-Ion

m/z (90+R)

Beispiel: Toluol (M 92 u)

Bz

%Bz + 2NV Bz + NV

m/z

Bz NV NV

Toluol aromatisch!

m/z 92 m/z 91 m/z 65 m/z 39

Es folgen typische Neutralteilchen Verluste zu m/z 65 und m/z 39

32

Benzylspaltungen sind auch charakteristisch für Heteroaromaten:

Thiophenderivat Bz Thiopyranyl-Ion

(aromatisch!)

m/z 97

Bei der α-Spaltung in zyklischen Systemen kommt es zu einer

Wasserstoffumlagerung vor der eigentlichen Fragmentierung:

Cyclohexanon α WU α Mesomerie!

m/z 98 sechsgliedrig! m/z 55

Die Reaktion geht von dem Radikal und nicht der Ladung aus

→ die α-Spaltung ist eine sog. „Radikal induzierte Spaltung”

Die Tendenz α-Spaltungen zu initiieren folgt den ladungsstabilisierenden

Eigenschaften der „Heteroatom“ Gruppe (siehe Tabellen in der Literatur)

→ α-Wahrscheinlichkeit: N > S, I, O, π-Aromat, π-Allyl, R . > Br, Cl > H

33

McLafferty Umlagerung (Mc):

β-Spaltung mit gleichzeitiger Wasserstoffumlagerung

(Radikalkation → Radikalkation / Kation → Kation):

WU α

Die Ladung verbleibt im Normalfall am ursprünglichen Ort

Mc konzertierte Variante

Seltener bewegt sich die Ladung zu dem anderen Fragment

Achtung: Auf McLafferty Umlagerungen folgt oft Keto-Enol-Tautomerie!

Beispiel: Benzoesäurepropylester (M 164 u)

Mc

m/z 164 m/z 122

Wasserstoffübertragung von Carbon- oder Sulfonsäuren

führt zur Abspaltung von CO2 und SO2 Neutralteilchen!

34

Für eine McLafferty Umlagerung sind keine Heteroatome nötig:

Mc

1-Hexen (siehe Seite 29)

m/z 84 m/z 42

Sie funktioniert auch an Aromaten und Heteroaromaten

(siehe z. B. auch m/z 82 beim Histamin in Kapitel 3.2):

Beispiel: n-Butylbenzol (M 134 u)

Bz

% Mc

m/z

Bz Mc

m/z 91 m/z 134 m/z 92

35

Retro Diels Alder Reaktion (RDA):

Zweifache α-Spaltung in einem zyklischen Doppelbindungs-

system (Radikalkation → Radikalkation / Kation → Kation):

α α RDA

Die Ladung verbleibt im Normalfall im Dien-, seltener im En-Teil

Beispiel: 4-Phenylcyclohexen (M 158 u)

104 RDA

%

m/z

RDA

m/z 158 m/z 104

RDA aus Übergangszustand: RDA

36

2.2 Ladungs induzierte Spaltungen

Induktive Spaltung (i):

Spaltung der direkten Bindung zu einer Ladungsstelle, üblicherweise

einem Heteroatom oder einer Doppelbindung (Radikalkation → Kation):

i X: F, Cl, Br, I, OR, SR, ...

Die Tendenz zur i-Spaltung steigt mit F, Cl, Br, I > O, S >> N, R

Beispiel: Methanol (M 32 u)

α

i % M+.

[CH3–O–H]+. CH3+ i

- .OH

m/z

Jede α-Spaltung hat theoretisch eine i-Alternative, in der die Ladung

am anderen Rest bleibt, normalerweise ist die Ladungsstabilisierung

durch die typischen α-induzierenden Heteroatome (N und O) besser!

i

37

Die Reaktion geht von der Ladung und nicht dem Radikal aus

→ die i-Spaltung ist eine sog. „Ladungs induzierte Spaltung”

Die i-Variante zur Benzylspaltung ist die seltenere Phenylspaltung:

i NVnicht aromatisch

(X auch R) m/z 77 m/z 51 (sp2 orthogonal)

Iod kann auch positiv geladen abgespalten werden (quasi σ-Spaltung)

σ

m/z 127 (Iod+)

Chlor und Brom zeigen typische σ + U (Umlagerung) Ringschlüsse:

σ + U X: Cl X: Br

m/z 91 m/z 135

X: Cl X: Br

σ + U m/z 105 m/z 149

Beispiel: 1-Chlordecan (M 176 u)

σ + U

%

σ + U

m/z

38

Eliminierung (El):

i-Spaltung mit Wasserstoff Umlagerung zur Abgangsgruppe

(Radikalkation → Radikalkation):

WU i

X: F, Cl, Br, I, OR, ...WU i

Ist X ein Hydroxylrest kann es zur Wasser Abspaltung kommen

Achtung: Eliminierung erfolgt auch aus tautomeren Strukturen!

Beispiel: Ethylacetat CH3CO2CH2CH3 (M 88 u)

α

%

El (- H2O)

M+.

m/z

WUCH3–C(=O)–O–CH2CH3 ↔ CH2=C(–OH)–O–CH2CH3 Tautomerie

ElCH2=C(–+.OH)–O–CH2CH3 → CH2=C+–O–CH2CH2

. + H2O

39

43

61

8870

100

40 60 80 100

α-Spaltung, i-Spaltung und Eliminierung stehen in Konkurrenz:

i

El

α

Beispiel: 1-Hexanol (M 102 u)

El + NV + α El + NV

α% El + α

Elσ

m/z

m/z 73 m/z 69

σ α

WU i

m/z 84

α α NV

m/z 31 m/z 43 m/z 56

40

Onium Reaktion (On):

i-Spaltung mit Wasserstoff Umlagerung von der Abgangsgruppe

(Kation → Kation / sehr selten Radikalkation → Radikalkation):

On

X: NR, O, PR, S, ...

Alkylrest >= Ethyl!

On X: NR2, OR, ...

Beispiel: 1-N-Ethylpentylamin (M 101 u)

α2

% α + On

α1

m/z

m/z 86α1 On

m/z 30^

m/z 101 α2 On

m/z 58

41

43

61

8870

100

40 60 80 100

On erzeugt das typische Ion von Phthalat-Weichmachern bei m/z 149:

α U On

m/z 149

Beispiel: Diethylhexylphthalat (DEHP, M 390 u, 50 % der Weichmacher)

149

%167

279 (390 M+.)

m/z

Beispiel: Ethylacetat CH3CO2CH2CH3 (M 88 u)

α

% OnEl

M+.

m/z

WUCH3–C(=O+.)–O–CH2CH3 ↔ CH3–C(–OH)=O+–CH2CH2

. O-TautomerieOn

CH3–C(–OH)=O+–CH2CH2. → CH3–C(–OH)=O+–H + .CH=CH2

42

O OO

O

Neutralteilchen Verlust (NV):

i-Abspaltung von Neutralteilchen ohne Wasserstoffumlagerung

(Kation → Kation / Radikalkation → Radikalkation):

NV ist eine typische Folgereaktion von:

σ-Spaltung (- C2H4)

α-Spaltung (- CO, - CNH)

Aromaten Abbau (- C2H2)

NV aus ungesättigten zyklischen Systemen unter Ringverkleinerung:

α NV

- CO

Aus Heterozyklen wird beim NV bevorzugt das Heteroatom abgespalten:

+. NV +.

Isochinolin - HCN

m/z 129 m/z 102

43

N

Aus Aromaten erfolgt NV auch nach Wasserstoff Umlagerung zum Ring:

Beispiel: Anilin (M 93 u)

WU + NV

% WU + NV + Al

m/z

WU NV Al

m/z 93 m/z 93 m/z 66 m/z 65

Beispiel: Cyanodicarbonylcyclopentadienyleisen(II)-Komplex

56 Fe+ 147 [M-2xCO]+.

% [M-2xCO-CN.]+ 175 [M-CO]+.

65 Cp+ 121 203 M+.

m/z

44

OO

N

Fe

Isomerfragmentierung:

Racemate und Enantiomere zeigen immer gleiche Massenspektren!

Diastereomere und geometrische Isomere (cis/trans, E/Z) können

durch Nachbargruppeneffekte verschiedene Massenspektren zeigen

Nachbargruppeneffekte:

Spezifische Fragmentierung in Nachbarschaft funktioneller Moleküle

→ z. B. McLafferty, Eliminierung → „ortho Effekte” / „peri Effekte”

Beispiel: m-Nitroanilin (M 138 u)

65 92

%80 108

m/z

i WU + NV

m/z 92 m/z 65m/z 138

U i NVm/z 138 m/z 108 m/z 80

45

Beispiel: o-Nitroanilin (M 138 u)

65

% 9280 108

121

m/z

WU Bz

m/z 138 (formale Radikalbewegung) m/z 121

2.3 Derivatisierungsreaktionen

Einführung oder Änderung von funktionellen Gruppen vor der Messung

Erhöhung der Verdampfbarkeit:

Methylierung (–CH3) oder Silylierung (TMS: –Si(CH3)3) polarer Gruppen

(außer für GC/MS nicht sehr wichtig, TMS-Gruppen fragmentieren stark)

Schutzgruppen in der Peptidchemie fragmentieren meistens stark (z. B.

T-Butyloxycarbonyl BOC: t-Bu–O–CO, Benzoylcarbonyl Z: Bz–O–CO)

46

155

Änderung des Fragmentierungsmusters:

Reaktive Gruppe (Ethylenacetal, Dimethylamino) erzwingt gezielte

Fragmentierung → Fixierung von beweglichen Doppelbindungen

(nicht mehr wichtig wegen NMR, Einzelheiten siehe Lehrbücher)

Unreaktive Gruppe (2H, 13C, Methyl, Silyl) verschiebt einzelne Peaks:

„Shift Technik” → Quantifizierung (Markierungsgrad siehe Lehrbücher)

Problem: M+1 Peaks in deuterierten Lösungsmitteln (z. B. nach NMR)

Beispiel: n-Decansäure (M 172 u)

Mc WU + WU + α

% σ

m/z

Beispiel: n-Decansäuremethylester (M 186 u)

(60+14)

% (73+14)

(129+14)

m/z

47

2.4 Praktische Spektreninterpretation

1. Bibliothekssuche durchführen (Computer oder Literatur)!

2. Identifikation des Molekülpeaks: Peak bei größtem m/z?

a) Quasimolekülpeak kann falsche Molekülmasse vortäuschen, z. B.:

M+H2 (Chinone), M+H (Amine, Nitrile), M–H (Amine, Nitrile, α–H.!)

M–H2 (Hydrochinone, primäre Alkohole), M–H2–H (primäre Alkohole)

Quasimolekülpeaks durch andere Ionisationen ausschließen (LEI, CI)

b) Isotopenmuster und Summenformel (durch Hochauflösung) stimmig?

→ Sind Elemente aller Fragmente auch im Molekülpeak vorhanden?

c) Doppelbindungsäquivalente (DBÄ, R+D) der Summenformel stimmig?

DBÄ (CxHyNzOn) = x – 0.5 y + 0.5 z + 1 → Molekülpeak ganzzahlig

(Si = C, X = H, S = O, P = N, und je +1 für höhere Oxidationsstufen)

Fragmente/Wasserstoffaddukte können .5 ergeben → DBÄ abrunden

d) Mehr ungerade/gerade Fragmente → M vermutlich gerade/ungerade

(weil Radikalkation → Kation häufiger als Kation → Kation)

e) Fragment-Löcher bei M – 4 bis M – 14 und M – 21 bis M – 25

% M +/– 14: Homologe(Unterschied –CH2–)

m/z

48

3. Fragmentierungen vom Molekülion aus sind am aussagekräftigsten

→ im Spektrum Peak-Differenzen vom Molekülion her ausrechnen

4. „Fragmentierungs-Haken“ (R−∫−R) durch logische Bindungen ziehen

und Fragmentmassen in beide Richtungen (+/–2 H) darüber schreiben

→ wird für Proteomics bei Peptiden benutzt und ergibt typische

Fragment-Serien a/b/c (N-Terminus) und x/y/z (C-Terminus)

5. Fragmentierungen durchführen (Massendifferenzen siehe Lehrbücher)

→ Ladung lokalisieren (Heteroatome/π-Systeme), α-Bindungen suchen

→ Doppelbindungen/H-Atome in 6-er Ringstellung (El/Mc) suchen

→ Fragmentierungen aus tautomeren Molekülstrukturen überdenken

→ Folgereaktionen aus nicht sichtbaren Fragmentionen kontrollieren

Nicht wie bei NMR Segmenten potentielle Strukturen zuordnen!

→ Bei Wasserstoffumlagerungen alle Wasserstoffe explizit zeichnen

→ Fragmentierungsreihen mit mehr als drei Folgeschritten sind selten

→ Pro Molekül gibt es immer nur eine Ladung und/oder ein Radikal

→ Sind gleiche Fragmente aus verschiedenen Positionen abspaltbar

entscheidet die Triebkraft der funktionellen Gruppe (α versus i)

49

3. Fortgeschrittenes

3.1 Probeneinlass II

Gaschromatographie (GC):

Aufbau: Trägergas Injektor

Detektor (MS)

Säule

Säulenofen

50

Trägergas: ~ 1 ml/min Helium → gasförmige mobile Phase

(Trennleistung: Wasserstoff > Helium >> Stickstoff)

Injektor (Aufgabesystem): Split/Splitlos (SSL), Cold-on-Column (CoC)

Headspace (HS), Pyrolyse (Py), Temperaturprogrammiert (PTV)

Spritze Septum (Silikon) Split/Splitlos (SSL)

Trägergas Septenspülung

Split („Verdünnung der Probenlösung“)

Nadel

Liner (Quarzglas) Injektionsvolumen: 0.1-30 µl (üblich 1 µl)

(Glaswolle Filter) mittels Mikroliterspritze und Autosampler

Säule Injektortemperatur: –50-400 °C (üblich 300 °C)

Säule: Quarz Kapillarsäule (10-100 m Länge, 0.1-0.5 mm Durchmesser)

mit 0.1-0.5 µm innerer Beschichtung → flüssige stationäre Phase

unpolar:

z. B. Dimethylpolysiloxan [-O-Si(CH3)2-]n

polar:

Polyethylenglykol [-O-CH2-CH2-]n „Carbowax”

GC/MS Phasen sind oft chemisch gebunden → weniger „Säulenbluten“

51

Säulenofen: Heizbar RT-500 °C (+/– 0.1 °C), Heizrate 0.1-100 °C/min

Chromatogramm ohne Temperaturprogramm

Chromatogramm mit Temperaturprogramm

Beispielprogramm: (Messzyklus ~ 20 min, inklusive GC Abkühlen)

50 °C (1 min) → 300 °C (4 min) @ 25 °/min (auf 25 m GC-Säule)

↑ Durchflußzeit „Totzeit“ → Retentionszeit des Lösungsmittels

→ gut zur Erkennung von „Memory Effekten“

Kopplung zum Massenspektrometer:

Probe gasförmig (Gase messbar!) und Trägergasstrom gering für

Vakuumsystem (~ 0.25 mm Säule) → geheiztes Kopplungsrohr

(auf ~ GC Endtemperatur) → Säule ragt bis in die Ionenquelle

→ geeignet für Gase, Flüssigkeiten und flüchtige Feststoffe

Vorteile:

Bestmögliche Trennung, sehr gute Kompatibilität zum MS

Nachteile:

Schwer flüchtige Substanzen (~ > 400 u) → Derivatisierung der Probe

Proben Zersetzung und Reaktionen im Injektor → PTV/CoC Injektor

Säuren und Basen zersetzen Säule → pH Wert (Hydrohalegonide!)

Zerstörung der Säulen durch das Hochheizen → „Säulenbluten“

52

Beispiel: Chromatogramm von Kokain in einer Haarprobe

Peak überladen („fronting“)

Peak reaktiv („tailing“)

%Säulenbluten TIC Chromatogramm

Kokain% Ionenchromatogramm

von m/z 303 (M+.)

Retentionszeit (min)

EI-Massenspektrum von Kokain:

%

m/z

→ Nachweis durch Bibliotheksspektrum und GC-Retentionszeit

→ Quantifizierung in SIM mit Kokain-d3 als internem Standard

53

10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 3100

50

100

15

42

5159 68

82

94105

122152 166

182

198 272

303

N

HO

O

H O

O

3.2 Probeneinlass III

Flüssigkeitschromatographie (LC):

Aufbau: Injektor

Säule Detektor

PumpeProbenschleife

Laufmittel MehrwegeventilFluss zur Säule

Laufmittel:

„Normale Phase” z. B. Hexan/Propanol

„Reverse Phase” z. B. Wasser/Acetonitril

(0.1-1 % Ameisensäure) → üblich in LC/MS

Pumpe:

0.1-10 ml/min Laufmittel (isokratisch)

oder Laufmittel Gradient (z. B. 50/50

Wasser/Acetonitril → 100 % Acetonitril)

< 200 bar High Performance ( HP LC)

< 1000 bar Ultra Performance (UPLC)

Injektor: Mehrwegeventil mit Probenschleife festen Volumens (1-100 µl)

54

Säule: Stahlsäule 2-80 cm Länge, 2-50 mm Innendurchmesser

gepackt mit fester stationärer Phase: Kieselgel oder Polymer

(sphärische oder irreguläre Partikel, „solid core“, Monolithe)

Partikelgröße 1-50 µm

Porengröße 1-500 nm

Adsorption Größenausschluss

(Kieselgel, (Size Exclusion SEC,

unbehandelt) Gel Permeation GPC)

Ionenaustausch (Ion(exchange) IEC, IC)

Kationenaustausch Alanin

Laufmittel: z. B. CH3SO3H

Anionenaustausch Gegenionen

Laufmittel: z. B. NaOH

Detektion: Leitfähigkeit Phenol

vorher Ionensuppressor

55

Verteilung: z. B. Zyanide, Alkane Affinität: z. B. Rezeptoren

unpolares polares

Laufmittel Laufmittel

-(CH2)3CN -(CH2)17CH3 „RP18“

(~ 90% RP-HPLC)

normale Phase reverse Phase

Tipps und Tricks:

Verstopfung → Filter/Vorsäule Luftblasen → Laufmittel entgasen

Probe in Acetonitril rutscht bei Wasser durch → Lösungsmittel beachten!

Detektor:

z. B. UV/VIS-Detektor (Photodiodenarray PDA) → vorgeschaltet zu MS

Problem: Lichtempfindliche Verbindungen werden vor dem MS zersetzt!

Kopplung zum Massenspektrometer:

Laufmittel erzeugt zu viel Gasbalast für Vakuumsystem (~ 2 mm Säule)

→ Trennung von Laufmittel und Probe (nur flüchtige Puffer benutzen!)

1) Trennung vor der Ionisierung: Particle Beam Interface (EI/CI)

2) Trennung nach der Ionisierung: Atmosphärendruck Ionisation

56

Particle Beam:

Desolvatationskammer (70 °C)

Momentumseperator Nebulizer (30 °C)

Überschallflugzur Ionenquelle

Blitzverdampfungan der Quellenwand

1 mbar 10 mbar Laufmittelzufuhrzu Vorvakuumpumpen Nebulizergaszufuhr (He, N2)

Partikelbildung in der Desolvatationskammer:

Partikel Tropfen

(1 μm) (100 μm)

Cluster Mikrotropfen

Probleme:

Substanzverluste im Momentumseperator → schlechte Empfindlichkeit

Matrixeffekte durch Partikelzusammenlagerung → schlechte Dynamik!

Probenzufuhr ohne Trennung:

Flussinjektions Analyse (FIA): Proben Injektion in HPLC Laufmittelfluss

Direktinfusions Analyse (DIA): Proben Zufuhr durch eine Spritzenpumpe

57

Beispiel: Chromatogramm des Methanol Extraktes eines Zahnkomposites

BIS-GDMA (Basismonomer)

BIS-GMMA

% TEGDMA BIS-IGDMA

Koffein BIS-GTMA

Zeit (min) Koffein = Standard

EI-Massenspektrum von Triethylenglykoldimethacrylat

(TEGDMA, M 286 u, Komonomer)

%

m/z

Anwendung:

Schlecht gelegte Kompositfüllungen verlieren Restmonomere, die den

Zahnnerv angreifen können → Analyse extrahierbarer Restmonomere

(Additive wie Photoinitiatoren, Koinitiatoren, Photostabilisatoren und

Inhibitoren sind kleiner und deshalb besser durch GC/MS zu erfassen)

58

10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 2900

50

100

29

41

4558

69

86100

113

143 172 200

O

O

OO

O

O

3.3 Ionenquelle II

Chemische Ionisation (CI):

Ionisation gasförmiger Moleküle durch Ion-Molekül-Reaktionen

→ Chemische Methode für flüchtige Substanzen (M bis 1500 u)

EI mit Reaktandgas (G) im Überschuss (1000/1) → Plasma (10-1 mbar)

(Quelle dichter, Quellentemperatur niedriger, Elektronenenergie höher)

Protonentransfer:

M + [G+H]+ → [M+H]+ + G M + [G-H]+ → [M+H]+ + [G-2H]

Bedingung:

Protonenaffinität: PA (M) > PA (G) → Quasimolekülion [M+H]+

PA (M) ~ 6-10 eV, PA (G): CH4 5.7 eV (Methan)

C4H8 8.5 eV (Isobutan), NH3 8.8 eV (Ammoniak)

Ion-Molekül-Reaktionen + Stoßstabilisierung mit Gas:

Überschussenergie < 5 eV → wenig Fragmentierung!

CI liefert Quasimolekülionen und die Molekülmasse, auch wenn kein

Molekülpeak im EI-Massenspektrum sichtbar ist: „Sanfte Ionisierung“

59

100

%

20 40m/z

18 NH4+

35 NH3NH

4+

Ammoniak(10–1 mbar)

Beispiel: Histamin (M 111 u)

Entsteht in Lebensmitteln durch Reifungsprozesse

z. B. in altem Fisch → Grund von Fischvergiftung

EI-Massenspektrum (70 eV) CI-Massenspektrum (Isobutan)

Reaktandgas-Ionen:

Ammoniak:

NH3+. + NH3 → NH4

+ + NH2.

m/z 18 schwache Säure

NH3 + NH4+ → NH3NH4

+

m/z 35 Nebenprodukt

Spezielle Anwendung von Ammoniak CI:

Bestimmung austauschbarer Wasserstoffe (x) mit ND3 → [M+xD+D]+

60

50 100

100 82

111M+.

%

m/z50 100

100 112 [M+H]+

%

m/z

Methan:

CH4+. + CH4 → CH5

+ + CH3.

m/z 17 starke Säure

CH4+. → CH3

+ + H. CH4 + CH3+ → C2H5

+ + H2

m/z 29 Nebenprodukt

Isobutan:

(CH3)3CH+. → (CH3)2CH+ + CH3.

m/z 43 Nebenprodukt

(CH3)3CH + (CH3)2CH+ → (CH3)3C+ + (CH3)2CH2

m/z 57 mittelstarke Säure

61

100

%

20 40m/z

16 CH4+.

Methan(10–5 mbar)

100

%

20 40m/z

17 CH5+

29 C2H5+

Methan(10–1 mbar)

100

%

m/z20 40

(CH3)2CH+ 43

Isobutan (10–5 mbar)

58M+.

100

%

m/z20 40

43

(CH3)3C+ 57

(CH3)2CH+

Isobutan (10–1 mbar)

Selektivität:

Reaktandgas erzeugt spezifische Ionisierung und gezielte Fragmentierung

Beispiel: Lavandulolacetat (M 196 u, Duftstoff)

CI (Methan) 137

%

197 [M+H]+

m/z

CI (Isobutan) 137

197 [M+H]+

%

m/z

CI (Ammoniak) 197 [M+H]+

214 [M+NH4]+

%137

m/z

62

Elektrophile Addition: M + [G+H]+ → [M+G+H]+ M + F+ → [M+F]+

Besonders bei CI Nebenprodukten: [M+NH4]+, [M+C3H7]+, [M+C2H5]+

Anion Abstraktion: M + G+ → [M–A]+ + [G+A] A: Anion

Typisch für Alkane bei Methan CI: M + C2H5+ → [M–H]+ + C2H6

Ladungsaustausch: M + G+. → M+. + G IE (M) ~ 7-14 eV

Bedingung: Rekombinationsenergie RE (G+.) > IE (M) → M+.

RE: He+. 24.6 eV (GC), N2+. 15.3 eV (Luft), CO2

+. 13.8 eV (Luft)

Überschussenergie > 5 eV → CI Spektrum entspricht EI Spektrum!

Probleme:

Neutralteilchenabspaltung wird forciert (z. B. H2O, NH3) → kein [M+H]+

ACE (Alternierend CI + EI) → EI+CI-Kombi-Ionenquelle

→ hohe Probenkonzentration bei EI → „Selbst-CI“

→ falsches Isotopenmuster, falsche Molekülmasse!

Erkennung am Messverlauf:

M+. < [M+H]+

% M+. > [M+H]+ M+. > [M+H]+

Zeit (min)

63

Negative Chemische Ionisation (NCI):

Ion-Molekül-Reaktionen: Reaktandgase: CH2Cl2 (Cl–), NO/CH4 (OH–)

Protonentransfer: M + G– → [M–H]– + [G+H]

Nukleophile Addition: M + G– → [M+G]–

Kation Abstraktion: M + G– → [M–Y]– + [G+Y] Y: Kation

Ladungsaustausch: M + G– → M– + G

Elektroneneinfang NCI: Reaktandgase: Methan, Isobutan, Ammoniak

e– + G → e– (thermisch: 0-2 eV) + G

e– (thermisch) + M → M– (angeregt)

M– (angeregt) + G → M– (thermisch)

Vorteile:

Hohe Empfindlichkeit: Ionenausbeute NCI ~ EI ~ 10 x (P)CI

Hohe Selektivität: Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK),

Halogen-, Nitro- und Phosphat-Verbindungen (Langlebige Organische

Schadstoffe, POP): Dioxine, Pflanzenschutzmittel, Flammschutzmittel

→ Umwelt- und Nahrungsmittelanalytik (üblich ist GC/NCI-HRAM)

Nachteile: temperaturabhängig, druckabhängig (Stoßstabilisierung)

64

Atmosphärendruck Chemische Ionisation (APCI):

Probenlösung wird versprüht, verdampft und durch eine 1-2 kV

Koronaentladung ionisiert → Quasimolekülionen [M+/–H]+/–

(selten: Ladungsaustausch M+./M–, Clusterionen [2M+/–H]+/–)

Koronaentladung (2-10 μA) → e- (ähnlich zu EI)

Nebulizerheizer (200-600 °C)

HPLC-Fluß: Skimmer

0.2-2 ml/minVakuum

Nebulizergas (N2)Koronanadel (1-2 kV) „Stickstoffvorhang“

Alternative zum Stickstoffvorhang: geheizte Kapillare (200-300 °C)im Skimmer und Sprühkopf dazu „orthogonal“ (10-90°)

Mechanismus:

1. Chemische Ionisation mit Luft und Laufmitteldampf als „Reaktandgas“

pos.: M + H3O+ → [M+H]+ + H2O neg.: M + OH- → [M–H]– + H2O

2. Ladungsrückstand Ionisation (analog Particle Beam, aber mit Ladung):

Tropfen Ion

Mikrotropfen Cluster

65

Beispiel: APCI von Reserpin (M 608 u, Alkaloid, Blutdrucksenker)

609.6 [M+H]+

%

1218.3 [2M+H]+

m/z

APPI (Atmosphärendruck Photo Ionisation):

APCI mit photochemisch ionisiertem Dotiermittel (Dopant) z. B. Toluol

als Reaktandgas im HPLC Laufmittel → besser für unpolare Substanzen

APCI, APPI: „sanfte Ionisierung“ geeignet für LC/MS Kopplung

Probleme:

Substanz Flüchtigkeit notwendig (M bis 1500 u, nur flüchtige Puffer!)

Keine Strukturinformationen wegen fehlender Fragmentierung → SID

Skimmer Induced Dissociation ( SID):

Fragmentierung im Skimmer durch Stöße mit Laufmittelmolekülen

66

3.4 Ionenquelle III

Elektrospray Ionisation (ESI):

Probenlösung wird aus einer Quarz/Metall Kapillare unter Hochspannung

von 1-5 kV versprüht → Quasimolekülionen [M+/–nH]n+/– mit n: 1-100 !

→ M bis 100.000 u (Adduktionen [M+/–Y)]+/–, Clusterionen [2M+/–H]+/–)

Nebulizergas N2 Skimmer

HPLC-Fluß: 1-100 μl/min

Kapillare ~ 0.1 mm Ø Vakuum

„Stickstoffvorhang“

Nanospray 10-1000 nl/min, ESI 0.1-100 μl/min, Ionspray 0.1-1 ml/min

Beispiel: ESI von Pferde-Myoglobin (M 16951 u, roter Muskelfarbstoff)

[M+16H]16+ [M+11H]11+

[M+15H]15+

z = 1%

m/z m/z

% z = 2

m (!) „Dekonvolution“ m/z

67

Bestimmung der Ladungsanzahl:

z = (mz+1 – 1)/(mz+1 – mz) oder 13C Peaks bei Hochauflösung

~ pro 1000 u eine Ladung (abhängig von pH, 3D-Struktur)

Mechanismus:

„Taylor Konus“ → Ladungsverteilung bis zum „Raleigh Limit“ →

Tropfen (1-2 μm) → Laufmittel Verlust → „Coulomb Explosion“

(„Raleigh Limit“) → Mikrotropfen → Laufmittel Verlust → ... ↑

1. Ladungsrückstand: Ionen bleiben über (große Moleküle)

2. Ionenverdampfung: Ionen desorbieren (kleine Moleküle)

Ladungsdichte E ~ 106 V/m → Ionenstrom I ~ 10–7-10–8 A!

→ Ionisations-Ausbeute ~ 1/100 (EI/NCI-Ausbeute 1/1000)

(aber Verluste beim Eintritt ins Hochvakuum am Skimmer)

Pos. ESI: Amine, Aminosäuren Neg. ESI: Säuren, Halogenderivate

68

Desorption ESI (DESI):

ESI Nebel wird direkt auf Material gerichtet (z. B. Sprengstoffe, Drogen)

ESI Sprühkopf Skimmer des MS

„Ambient „Imaging“ von

Ionisation“ Gewebe möglich

Paper Spray: Hochspannung direkt an Papier mit Probe in Lösungsmittel

ESI, DESI: „sanfte Ionisierung“ mit mehrfach geladenen Ionen!

Vorteile:

Beste Methode für polare Moleküle, sehr große Molekülmassen messbar

Nachteile:

Keine Strukturinformationen wegen fehlender Fragmentierung → SID

Stark konzentrationsabhängig → Probe aufkonzentrieren → Nanospray

Probe zu konzentriert → Clusterionen ([2M+/–H]+/– und [2M+/–Y]+/–)

Ladungskonkurrenz → Ionen stören (z. B. Tetrabutylammonium+, TFA–)

Addukte [M+/–Y(+X)]+/–: + ESI Y: NH4, Na, K, Li X: Triethylamin

– ESI Y: Cl, Br, Formiat, Acetat → Entsalzen!

Trifluoressigsäure (TFA): + ESI: Ionenpaarbildung mit Ionen der Probe

– ESI Ladungskonkurrenz → Ameisensäure!

69

Fast Atom Bombardment (FAB):

Probe wird auf einem „Target“ in „Matrix“ gelöst und durch Beschuss

mit hochenergetischen Teilchen direkt aus kondensierter Phase ionisiert

Atom- oder „Selvedge Region“Ionenstrahl (heiße Stoßkaskade)

„Impact cavities“ Probe gelöst(150 Å tiefe Krater) in der Matrix

Kupfer/Stahl Target kalte EI-Quelle

Primärteilchen: 5-10 kV schnelle (↑) Xenon Atome (M 132 u)

Erzeugung durch Xe Ladungsaustausch in der „FAB Kanone“

(1010 Xe↑/s mm², 1 Xe↑ → ~ 1000 Matrixteilchen in < 10 ns)

Xe + e– → Xe+. + 2 e– Xe+. → Xe+.↑ Xe+.↑ + Xe → Xe↑ + Xe+.

Fast Ion Bombardment (FIB) = Liquid SIMS (Sekundär Ionen MS):

Primärteilchen: 20-40 kV schnelle Cäsium Ionen (M 133 u)

Erzeugung durch Heizen von CsI in der „Cs-Ionenkanone“

Vorteile: Strahl fokussierbar, kein Gasdruck, hohe Energie

70

Beispiel: FAB von Leu-Enkephalin (M 555 u, Opioid)

[M+H]+

%

m/z

Mechanismus:

1) Vorgebildete Ionen werden desorbiert (Matrix pH abhängig!) → M+/–

2) Moleküle reagieren mit Matrix Ionen (erzeugt durch Stoßaktivierung)

→ Quasimolekülionen [M+/–Y]+/– ([M+/–2Y]2+/2–, Molekülionen [M]+./–)

→ Clusterionen [2M+/–Y]+/– ([M+X+/–Y]+/–, Matrixcluster [nX+/–Y]+/–)

→ Fragmentionen F+/– (Na, K und NH4 Addukte zeigen hohe Stabilität)

Y: H (Na, K, NH4) X: Matrix, n: 1-3 Säuren auch als Salz!

Matrix:

Zähflüssige schwer verdampfbare Flüssigkeit → z. B. Glyzerin (G)

3-Nitrobenzylalkohol (NBA), 2-Nitrophenyloctylether (aprotisch!)

→ Matrixverdampfung aus Clustern kühlt Substanz-Ionen

→ Matrixbeweglichkeit erneuert zerschossene Oberfläche

71

Matrixspektren:

+ FAB von NBA - FAB von NBA

+ FAB von Glyzerin:

[X+H]+ 93 (100 %) [2X+H]+ 185 (50 %) [3X+H]+ 277 (25 %)

- FAB von Glyzerin:

[X–H]– 91 (100 %) [2X–H]– 183 (50 %) [3X–H]– 275 (25 %)

FAB, FIB: „sanfte Ionisierung“ mit Matrix Hintergrund bis ~ m/z 500

→ Ausschnittvergrößerung wichtig (oder die Matrix-Peaks abschneiden)

Probleme:

Schlechte Empfindlichkeit, Matrix Reaktionen, oberflächenaktive Stoffe

stören (z. B. Silikone), keine LC Kopplung („Continuous Flow“ CF/FAB)

72

m/z

100

%

200 400

136

154 [X+H]+

289

307

460

[2X+H]+

[3X+H]+

[X+H–H2O]+

–

m/z

100

%

200 400

135

153 [X]–

288

306

460

[2X]–

[3X]

[X–H2O]–

Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI):

Probe wird in fester Matrix auskristallisiert und durch Beschuss mit

UV-Laser (selten IR-Laser) direkt aus kondensierter Phase ionisiert

Schussposition „Spot“ Plasmawichtig → Mikroskop „Plume“

Probe in Matrix

Aluminium/Stahl Target

Laserpuls:

1-10 ns (~ 106 W/cm2) → 1-100 Schüsse → gepulster Analysator: TOF

Aufheizung ist schneller als Zersetzung (siehe auch DEP und FAB/FIB)

Mechanismus:

analog FAB, aber keine Oberflächenerneuerung und keine Unterdrückung

→ Quasimolekülionen [M+/–Y]+/– ([M+/–2Y]2+/2–, Molekülionen [M]+./–)

→ Clusterionen [2M+/–Y]+/– ([M+X+/–Y]+/–, Matrixcluster [nX+/–Y]+/–)

→ Fragmentionen F+/– („In Source Decay“, Na Addukte sehr stabil!)

Y: H (Na) X: Matrix, n: 1-2 Säuren fliegen auch als Salz!

73

Beispiel: MALDI von Rinder Insulin (M 5733 u, Blutzuckersenker)

5734 [M+H]+

%

2867 [M+2H]2+

m/z

Matrix:

Matrix muss bei Laser Wellenlänge (z. B. N2 Laser: 337 nm) absorbieren

→ z. B. Sinapinsäure, 6-Azo-2-thiothymin (neutral), Anthracen (unpolar)

Laser Laser Laser

Absorption Maximum Minimum Matrix

Probe

Wellenlänge Wellenlänge Wellenlänge

Matrix Probe Matrix mit Probe

Desorption Reflektion Desorption

74

Atmosphärendruck MALDI (APMALDI, Laserspray Ionisation LSI):

MALDI unter Atmosphärendruck → Aufbau analog API und MALDI

MALDI, APMALDI: „sanfte Ionisierung“ für M bis 500.000 u!

Probleme:

Substanz muss mit Matrix auskristallisieren, keine LC Kopplung

Target Analyse (TA):

TA/FAB:

Probe wird auf einem einteiligen Metalltarget

(aus Kupfer/Stahl) in die Matrix gemischt und

mittels einer Schubstange ins Gerät eingebracht

TA/MALDI:

Probenlösung wird auf einem mehrteiligen

Metalltarget (aus Aluminium/Stahl) mit der

Matrixlösung gemischt, durch Eintrocknen

auskristallisiert und ins Gerät eingeschleust

→ „Imaging“ von Gewebeproben möglich

75

3.5 Analysator II

Quadrupol (Q):

m/z = 5.7U/ω2r2

r: ½ Stababstand ω: Wechselspannungsfrequenz

U: Beschleunigungsspannung (10-20 V)

Hexapol, Octapol oder Flatpol (viereckig) :

besser für Fokussierung und Transport (q)

Eigenschaften: ∆m < 5 ppm, R < 5.000 FWHM, Bereich < m/z 5.000

Ionenfalle (Trap T):

„elektrische (Paul-)Ionenfalle“

Lineare Ionenfalle (LT = Q als T)

Öffnungen in beiden Endkappen für Zufuhr aus Ionenquelle und Ausgang

zum Detektor, Falle gefüllt mit 10–4 mbar Helium zur Ionen Fokussierung

Eigenschaften: siehe Quadrupol, aber Raumladungseffekte

76

Flugzeit (Time of Flight TOF):

Lineares TOF Detektor 1 (MCP) → höhere Massen

m/z = 2eUt2/l2

l: Strecke (1-2 m) Reflektron = Reflektor TOFt: Flugzeit (~ μs) korrigiert EnergieunterschiedeU: 10-30 kV → höhere Genauigkeit

→ höhere Auflösungaber m/z < 50.000

Metastabile Ionen: Driftrohr„Post Source Decay“

PSD

Delayed Detektor 2 Extraction (MCP)(50-500 ns)

Eigenschaften: ∆m < 5 ppm, R < 50.000 FWHM, Bereich < m/z 500.000

Vorteile: Hoher Massenbereich, Ionisation gepulst → ideal für MALDI

77

Ionen Cyclotron Resonanz (ICR) = Fourier Transform (FT):

„magnetische (Penning)-Ionenfalle“

Magnetfeldstärke 5/7/9/12 Tesla

(~ 200/300/400/500 MHz NMR)

m/z = B/2πυ

υ: IonenfrequenzB: Magnetfeld

Messung:

Einfangen der Ionen (Trapping) durch eine Gleichspannung (pos./neg.)

→ Gleichgewicht zwischen magnetischer Kraft und Zentrifugalkraft →

Ionen rotieren auf stabilen Umlaufbahnen mit spezifischen Frequenzen

→ Breitband Anregung (Excitation) der Ionen durch Einstrahlung einer

zunehmenden Frequenz → frequenzgleiche Ionen nehmen Energie auf

und vergrößern Umlaufbahn → Spiegelstrom-Induktion (Detection) →

Fourier Transformation → υ (sehr genau) → m/z (sehr exakte Masse!)

Abklingen (Decay) durch Kollisionen → Vakuum: ~ 10–10 mbar

Eigenschaften: ∆m < 1 ppm, R < 1.000.000 FWHM, Bereich < m/z 5.000

Nachteil: Supraleitender Magnet braucht flüssiges Helium und Stickstoff

78

Orbitrap (OT):

„elektrostatische (Makarov)-Ionenfalle“

m/z = k/υz2

+/- 3-5 kVυ: Ionenfrequenzk: Konstante

0 V

Messung:

Injektion der Ionen → Oszillation in z-Richtung um die innere Elektrode

→ Breitband Anregung (Excitation) der Ionen durch Einstrahlung einer

zunehmenden Frequenz → frequenzgleiche Ionen nehmen Energie auf

und vergrößern Umlaufbahn → Spiegelstrom-Induktion (Detection) →

Fourier Transformation → υ (sehr genau) → m/z (sehr exakte Masse!)

Abklingen (Decay) durch Kollisionen → Vakuum: ~ 10–10 mbar

Eigenschaften: ∆m < 2 ppm, R < 1.000.000 FWHM, Bereich < m/z 5.000

Vorteil: fast FT Eigenschaften, aber ohne flüssiges Helium und Stickstoff

Größenvergleich

79

3.6 Analysator III

Massenspektrometrie/Massenspektrometrie (MS/MS):

Massenspektrum MS/MS Spektrum

Selektion

Ionisierung CID < 2 m/z →

keine Isotope

MS1: Selektion „Vorläufer-Ionen“ MS2: Spektrum „Produkt-Ionen“

Stoßaktivierung (Collision Induced Dissociation CID ) :

Die Fragmentierung des selektierten Ions beeinflussen:

Stoßgas → Stoßquerschnitt (He < N2 < Ar < Xe)

→ Stoßhäufigkeit (Druck 10–6-10–3 mbar)

Stoßenergie → Niederenergiestöße (5-500 eV: Q, T, OT, FT)

Stoßquadrupol: viele Stöße, Stoßkomplexe (Fokussierung)

→ direkte Schwingungsenergieübertragung, Umlagerung

→ Hochenergiestöße (1-10 keV: EB/BE, TOF)

Stoßkammer: einzelner Stoß, hohe Streuung (Streifschuss)

→ geringe Ausbeute, Energiekonversion (FCP+QET): EI

80

Beispiel: 4-Hydroxytamoxifen (M 387 u, Östrogen-Rezeptor-Inhibitor)

[M+H]+

% Massenspektrum

% MS/MS Spektrum

(388@35 eV CID)

m/z

Anwendung: Analyse im Blutplasma bei Brustkrebs Therapie

Stoßexperimente (MS/MS Experimente):

Produkt-Ionen MS1: Selektion MS2: Spektrum

Vorläufer-Ionen MS1: Spektrum MS2: Selektion (Doping, Drogen)

Neutralverlust MS1: Spektrum MS2: Spektrum mit neg. Differenz

Neutralanlagerung MS1: Spektrum MS2: Spektrum mit pos. Differenz

Spektrum (MS/MS) → Strukturaufklärung (Sequenzierung), Screening

Selected Reaction Monitoring (SRM) → Quantifizierung (Übergänge)

81

Tandemmassenspektrometer („Hybridgeräte”):

MS/MS im Raum (Niederenergie oder Hochenergie Stöße)

„Triple-Quadrupol“

*: Stoßaktivierung q: Stoßquadrupol (nur Fokussierung)

„Q-TOF“

QqOT QqFT T-OT T-FT

82

Ionenfallen (T):

MS/MS in der Zeit (nur Niederenergie Stöße)

Isolierung („Einfangen“) → 1. Selektion („Rauswerfen“) ← ← ←

2. Stoßaktivierung (CID mit Helium) ↑

3. Spektrum-Aufnahme, oder → → →

Vorteile: „MSn “ (MS2, MS3 … MS12), Neutralanlagerung-Experimente

Nachteile: keine Vorläufer-Experimente, keine Folge-Fragmentierungen

Top Down Proteomics: 1. LC/MS/MS des Proteins, 2. Datenbanksuche

Vorteil: Modifikationen/Brücken bleiben ganz

Bottom Up Proteomics: 1. Protein Verdau z. B. mit Trypsin (Lys/Arg),

2. LC/MS/MS der Peptide, 3. Datenbanksuche

Beispiel: ESI MS/MS eines Peptids aus einem Protein Verdau

Vorläufer-Ion [M+2H]2+

a/b/c-Serie (N-Terminus) x/y/z-Serie (C-Terminus)

3x vergrößert 5x vergrößert

Fragmente Fragmente

[F+2H]2+ [F+H]+

83

4.0 Anhang (nicht klausurrelevant!)

Feld Ionisation (FI):

Emitter bei 8-12 kV → inhomogenes elektrisches Feld → Gas Ionisierung

Feld Desorption (FD):

Probe auf Emitter bei 8-12 kV → direkte Desorption von Ionen

Wolfram Emitterfaden(10 μm Durchmesser)

kalte EI-Quelle

Abbildung von der Firma Carbotec Graphit (oder Silizium)Mikronadeln „Whisker“ → „aktivierter Emitter“ ~ 2 mm

Mechanismus:

1) Elektronen Tunneln → M+.

Feldstärke: 108 V/cm

2) Kation Addition/Verlust → [M+/–Y]+/–

Feldstärke: 106 V/cm, Y: H (Na)

Überschussenergie < 1 eV

„Sehr sanfte Ionisierung“ aus unpolaren Lösungen und Suspensionen

Emitter wird hochgeheizt → Thermische Prozesse → Fragmentierung

84

Beispiel: Glutaminsäure (M 147 u, Aminosäure)

FI

EI

FD

Probleme:

keine negative Ionen, keine LC Kopplung („Liquid Injection“ LI/FD)

Emitter teuer und empfindlich, Emitter halten nur wenige Messungen

Emitter Analyse (EA):

Substanz wird gelöst oder suspendiert auf

den Emitter aufgetragen und eingeschleust

(FI geht mittels DIP, DEP, RI, GC und PB)

Dünnschichtchromatographie (TLC):

Probensubstanz wird direkt von der Dünnschichtplatte mittels DESI oder

MALDI (nach Aufpressen einer MALDI-Matrix) desorbiert und ionisiert

85

]

60 120

100

%

m/z

129[M–H 2 O] +

85[M–CO 2 H–NH 3

+

60 120

100

%

m/z

148[M+H]+

130[M–H 2 O+H] +

85

60 120

100 148

%

m/z

[M+H] +

Superkritische Flüssigkeitschromatographie (SFC):

Prinzip: Superkritische mobile Phase und flüssige/feste stationäre Phase

Aufbau:

Analog GC (Kapillarsäulen), mobile Phase CO2 (kritischer Druck 74 bar,

kritische Temperatur 31 °C) → Trennleistung ~ GC, aber Beladung ~ LC

Kopplung zum Massenspektrometer:

Superkritische Flüssigkeit muss vor dem Hochvakuum expandieren

→ geheizter (200-300 °C) Restriktor (1 µm Bohrung/Spitze/Fritte)

Problem:

CO2 verursacht Ladungsaustausch CI → echte CI problematisch

Ionen Mobilitäts Spektrometrie (IMS):

Prinzip: Ionen bewegen sich in einem elektrischen Feld durch ein Gas

→ Trennung nach Wanderungsgeschwindigkeit (Mobilität, Ladungszahl)

Aufbau und Kopplung zum Massenspektrometer:

NSI/ESI Ionisation der Moleküle unter Atmosphärendruck → IMS erfolgt

in einem gasgefüllten Rohr vor dem Eintritt der Ionen ins Hochvakuum

86

Kapillarelektrophorese (CE):

Prinzip: Ionen bewegen sich im elektrischen Feld durch eine Flüssigkeit

→ Trennung nach Wanderungsgeschwindigkeit → Elektropherogramm

Aufbau:

Quarz Kapillare (Durchmesser 25-250 µm, Länge 0.1-1 m) auf 20-30 kV

Spannungsdifferenz → dissoziierte Silanol Gruppen fixieren Kationen an

der Kapillarwand („Sternschicht“) → solvatisierte Kationen wandern mit

Laufmittel zur Kathode → 1-500 nl/min elektroosmotischer Fluss (EOF)

„Sternschicht“

Kathode ← → Anode

← EOF

Strömungsprofil HPLC Strömungsprofil CE

→ Peakverbreiterung → gute Auflösung

Kopplung zum Massenspektrometer:

NSI (oder ESI mit „Scheath” Flüssigkeit, weil CE Flussrate zu gering ist)

87

Elektronen Transfer Zerfall/Elektronen Einfang Zerfall (ETD/ECD):

Reduktion von [M+nH]n+ durch Elektronen (< 1 eV) zu Radikalkationen

[M+nH](n–1)+. → Zerfall mit anderen Fragmentierungen als bei CID!

Anwendung: Posttranslationale Peptid Modifizierungen bleiben erhalten

ETD: NCI mit Anthracen--Ionen durch NCI-Prozess (T)

ECD: Direkte Einstrahlung thermischer Elektronen (FT)

Protonen Transfer Reaktion (PTR):

Protonenabgabe an Anthracen--Ionen (T) → Ladungszahl Erniedrigung

Infrarot Multiphotonen Zerfall (IRMPD):

MS/MS durch direkten IR-Laser Beschuss von Ionen (FT) → Zerfall

Ultraviolet Photonen Zerfall (UVPD)

MS/MS durch direkten UV-Laser Beschuss von Ionen (T) → Zerfall

Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation (SELDI):

Targets mit Rezeptoren binden aus Probenlösungen spezifische Moleküle

→ Waschen, Aufbringen von Matrix, Laser Desorption → Direktanalytik

Direct Analysis in Real Time (DART):

Probensubstanz wird unter Atmosphärendruck direkt von Objekten herab

durch metastabile Plasma Ionen ionisiert (siehe DESI) → Direktanalytik

88

Sekundär Ionen Massenspektrometrie (SIMS):

Oberflächen Ionenbeschuss → Sekundärionen → Oberflächenanalytik

Laser Desorption (LD) = Laser Ablation (LA):

Oberflächen Photonenbeschuss → Sekundärionen → Oberflächenanalytik

Thermo Ionisation (TI) = Thermo Desorption (TD):

Faden mit Probe wird geheizt (1000-2000 °C) bis Ionen desorbieren

(kein Filament für EI Bedingungen) → Pyrolyse → Elementanalytik

Inductively Coupled Plasma (ICP):

Probenlösung wird unter Atmosphärendruck durch ein induktives Argon

Plasma (~ 8000 °C) geleitet, atomisiert und ionisiert → Elementanalytik

Glimmentladung (Glow Discharge GD):

Aus der Probenmaterial werden durch ein Argon Glimmentladungs-

Plasma Atome ausgeschlagen und im Plasma ionisiert → Elementanalytik

Funkenquelle (Spark Source SS):

Aus dem Probenmaterial werden durch Funkenüberschlag zwischen zwei

Elektroden Atome herausgeschlagen und ionisiert → Elementanalytik

Achtung: Die Anmeldung zur Klausur nicht vergessen!

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