COLES NORMALES SUPRIEURES

COLE NATIONALE DES PONTS ET CHAUSSES

CONCOURS DADMISSION SESSION 2016

FILIRE BCPST

COMPOSITION DE BIOLOGIE

preuve commune aux ENS de Cachan, Lyon, Paris et lENPC

Dure : 6 heures

Lutilisation des calculatrices nest pas autorise pour cette preuve.

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Thme de lpreuve :

Les relations interspcifiques

Lpreuve comporte un sujet de synthse et un sujet avec documents. Des dures conseilles sont donnes :

Sujet Pages Dure conseille Intitul

Synthse 3 2 h 30 Importance cologique

des relations interspcifiques

Documents 4 21 3 h 30 Le systme CRISPR/Cas :

Mcanisme, aspects volutifs et applications

Il vous est fortement recommand de bien grer votre temps de composition afin de pouvoir traiter correctement les diffrentes parties de lpreuve.

Lors de lvaluation, les correcteurs et correctrices attacheront une importance

particulire :

la justification des raisonnements ;

la clart et la concision des rponses ;

la qualit et la prcision des illustrations ;

lorthographe, la grammaire et la prsentation.

Lusage des calculatrices est interdit.

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SUJET DE SYNTHESE

Importance cologique des relations interspcifiques

En utilisant prfrentiellement des exemples issus de la prairie pture, vous prsenterez

la diversit des relations interspcifiques et montrerez comment celles-ci participent

au fonctionnement et la dynamique des cosystmes.

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SUJET SUR DOCUMENTS

Le systme CRISPR/Cas Mcanisme, aspects volutifs et applications

Chez certaines espces bactriennes, le locus dit CRISPR (pour clustered interspaced short

palindromic repeats) est hautement polymorphe. Le locus CRISPR (Figure 1) est constitu

de multiples rptitions dune mme squence denviron 30 nuclotides, quon appellera

squence rpte . Deux squences rptes sont spares par une squence

espaceur . Les squences espaceurs ont chacune une longueur d'environ 35 nuclotides,

mais une squence variable, unique au sein du locus. Le locus CRISPR est adjacent un ou

plusieurs gnes dits cas (pour CRISPR-associated). On sintresse dans ce sujet

au mcanisme dit CRISPR/Cas de rsistance aux lments gntiques trangers.

Les rsultats prsents sont issus dexpriences rptes au moins 3 fois. Dans

les graphiques, on reprsente la moyenne des rsultats, les barres derreur

correspondant lintervalle de confiance 95% de la moyenne. Les images et

donnes brutes sont reprsentatives de lensemble des rsultats obtenus.

PARTIE I Identification du mcanisme volutif CRISPR/Cas de rsistance

des procaryotes aux lments gntiques trangers

Dans une premire srie dexpriences, on utilise comme systme exprimental lespce

bactrienne Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) et les phages (virus infectant

les bactries) 858 et 2972. Le gnome de ces deux phages est constitu dune molcule

dADN double brin. Les squences gnomiques des deux phages sont identiques 93%.

La souche bactrienne S. thermophilus sauvage (WT) est sensible ces deux phages, cest-

-dire que linfection par les phages aboutit la lyse bactrienne.

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On procde tout dabord une exprience dvolution in vitro. La souche bactrienne

S. thermophilus WT est cultive pendant plusieurs gnrations en prsence de lun, ou

de lautre, ou des deux phages 858 et 2972. Neuf souches bactriennes mutantes

rsistantes aux phages sont obtenues de faon indpendante et leur locus CRISPR est

analys. On quantifie leur sensibilit chacun des deux phages (Figure 1). La sensibilit

relative dune souche bactrienne est exprime comme le ratio du nombre de plages de lyse

obtenues aprs culture sur milieu glos en prsence du phage sur le nombre de plages

de lyse obtenues pour la souche bactrienne WT en prsence du mme phage.

Figure 1. Evolution du locus CRISPR au cours de linfection de S. thermophilus par 858 et 2972. En haut, structure du locus CRISPR de S. thermophilus WT. La squence rpte est symbolise par

des losanges noirs. Les squences espaceurs sont numrotes de 1 32 et symbolises par des rectangles gris. Le locus est bord par une squence L en amont comportant le site dinitiation de la transcription et une squence T en aval comportant le site de terminaison de la transcription. Les gnes cas adjacents au locus CRISPR sont galement symboliss. En bas, structure du locus CRISPR des souches bactriennes rsistantes (numrotes I IX) obtenues aprs

culture en prsence de 858 (souches I et II notes Mut858), en prsence de 2972 (souches III VII notes Mut2972) ou en prsence des deux phages (souches VIII et IX notes Mut8582972). Les squences espaceurs prsentes dans la souche bactrienne WT sont symbolises par des rectangles gris. Les squences espaceurs absentes dans la souche bactrienne WT sont numrotes de S1 S14 et symbolises par des rectangles blancs. Pour chaque souche bactrienne, la sensibilit relative chacun des phages est quantifie sur les histogrammes.

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On analyse alors les squences espaceurs S1 S14. En particulier, on compare ces squences aux squences gnomiques des phages 858 et 2972 (Figure 2).

Figure 2. Carte du gnome des phages 858 et 2972. La position des squences de phages prsentant

un fort taux didentit avec les squences S1 S14 est indique. Labsence dastrisque indique 100% didentit entre la squence S et la squence du phage. Un astrisque (*) indique lexistence de polymorphismes nuclotidiques entre la squence S et la squence du phage. Les squences indiques au-dessus du gnome du phage prsentent un fort taux didentit avec le brin codant du gnome du phage. Les squences indiques en dessous du gnome du phage prsentent un fort taux didentit avec le brin non codant du gnome du phage.

Question 1. Analysez la structure du locus CRISPR des souches rsistantes

prsentes en figure 1. A laide de la figure 2, formulez une hypothse expliquant

lorigine des squences S1 S14.

Question 2. Regroupez les souches I IX en diffrentes catgories en fonction de

leur sensibilit chacun des deux phages. A laide de la figure 2, proposez

une hypothse pouvant expliquer les profils de rsistance des diffrentes souches.

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Afin de valider ces observations, la squence du locus CRISPR de la souche I est modifie :

on procde la dltion des squences rptes et espaceurs (souche X). Par ailleurs,

on procde linsertion, au sein du locus CRISPR de la souche III, des squences

espaceurs S1 et S2 spares par une squence rpte (souche XI). On mesure alors

la sensibilit relative des souches bactriennes ainsi obtenues linfection par 858

(Figure 3).

Figure 3. Modification artificielle des locus CRISPR et impact sur la sensibilit 858. A partir du locus

CRISPR de la souche bactrienne I, on dlte les squences rptes et espaceurs. La souche bactrienne rsultante est nomme X. On insre par ailleurs les squences espaceurs S1 et S2 au sein du locus CRISPR de la souche bactrienne III. La souche bactrienne rsultante est nomm XI. La sensibilit relative des souches bactriennes I, X et XI au phage 858 est quantifie dans lhistogramme.

Question 3. Analysez et interprtez la figure 3.

Dans une deuxime srie dexpriences, on utilise comme systme exprimental lespce

bactrienne Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis). Cette bactrie peut acqurir

des plasmides trangers par transfert horizontal et en particulier par conjugaison. Le gnome

de la souche S. epidermidis sauvage (WT) comporte un locus CRISPR qui inclut

une squence espaceur identique une squence du gne nes port par le plasmide

pNes(wt), un plasmide qui peut tre transmis par conjugaison.

On gnre une souche bactrienne mutante (S. epidermidis mut) dans laquelle le locus

CRISPR est dlt. On gnre galement un plasmide pNes(mut) dans lequel des mutations

silencieuses ont t introduites dans le gne nes. On analyse alors lefficacit de lacquisition

de chacun des deux plasmides pNes(wt) et pNes(mut) par conjugaison chez les deux

souches de bactries S. epidermidis WT et S. epidermidis mut (Table 1).

Souche bactrienne

S. epidermidis WT S. epidermidis mut

Plasmide pNes(wt) pNes(mut) pNes(wt) pNes(mut)

Efficacit de conjugaison 0 2,3x10-4 2,8x10-5 8,2x10-5

Table 1. Efficacit dacquisition des deux plasmides pNes(wt) et pNes(mut) par conjugaison chez les deux souches bactriennes S. epidermidis WT et S. epidermidis mut. Lefficacit de conjugaison est calcule

comme le rapport du nombre de bactries transconjugantes (cest--dire ayant acquis le plasmide) sur le nombre total de bactries dans chaque condition.

Question 4. Analysez et interprtez la table 1.

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Pour prciser le mcanisme CRISPR/Cas, on utilise le plasmide pNes(wt) dans lequel on a

insr un intron auto-pissable au sein de la squence de nes identique la squence

espaceur du locus CRISPR. Ce plasmide modifi est appel pNes(intron).

On mesure alors lefficacit de lacquisition de pNes ou de pNes(intron) par conjugaison chez

les souches bactriennes S. epidermidis WT et S. epidermidis mut (Table 2).

Souche bactrienne

S. epidermidis WT S. epidermidis mut

Plasmide pNes(wt) pNes(intron) pNes(wt) pNes(intron)

Efficacit de conjugaison 0 5,6x10-6 2,0x10-5 7,9x10-6

Table 2. Efficacit dacquisition des deux plasmides pNes et pNes(intron) par conjugaison chez les deux souches S. epidermidis WT et S. epidermidis mut. Lefficacit de conjugaison est calcule comme le rapport

du nombre de bactries transconjugantes sur le nombre total de bactries.

Question 5. En quoi le protocole utilis en table 2 permet-il de dterminer la cible

du mcanisme CRISPR/Cas ? Analysez et interprtez la table 2.

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On infecte ensuite par le phage 2972 la souche bactrienne S. thermophilus WT (sensible

linfection) et la souche bactrienne mutante VI (rsistante linfection ; voir Figure 1).

diffrents temps post-infection, lADN est extrait des bactries infectes, digr laide de

lenzyme de restriction HpaII et les diffrents fragments obtenus sont analyss par Southern

blot laide de deux sondes oligonuclotidiques radiomarques de squence

complmentaire au gnome du phage (Figure 4).

Figure 4. Analyse de lADN extrait des souches bactriennes S. thermophilus WT et mutante VI aprs infection par le phage 2972. A. Carte partielle du gnome du phage 2972 indiquant la position des sites de restriction par lenzyme HpaII,

de la squence identique la squence espaceur S7 et des squences complmentaires aux sondes 1 et 2 utilises en B. B. Les souches bactriennes WT et mutantes VI sont infectes par le phage 2972, ou non infectes (NI). Aprs 2, 15, 30 et 45 minutes dinfection, lADN est extrait, digr laide de lenzyme de restriction HpaII et

les diffrents fragments obtenus sont analyss par Southern blot laide des sondes oligonuclotidiques 1 et 2 de squence complmentaire au gnome du phage. C+, contrle positif : lADN purifi partir du phage est digr par HpaII. La mme quantit dADN a t dpose dans chaque puits. kb : kilobases.

Question 6.

a) Analysez et interprtez la figure 4.

b) Rsumez alors les informations obtenues dans cette premire partie sur

le mcanisme CRISPR/Cas.

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PARTIE II Modalits molculaires du mcanisme CRISPR/Cas

Afin de caractriser le mcanisme molculaire lorigine du phnotype de rsistance

observ prcdemment, on tudie le systme CRISPR/Cas de lespce bactrienne

Escherichia coli (E. coli). Le locus CRISPR de cette bactrie comporte des squences

espaceurs dont plusieurs sont identiques des squences du phage . La souche

bactrienne sauvage (note WT) comporte huit gnes cas adjacents au locus CRISPR,

dont on cherche dfinir la fonction : les cinq gnes casA, B, C, D et E dont les produits

protiques forment un complexe appel Cascade, ainsi que les gnes cas1, cas2 et cas3.

On utilise une souche bactrienne mutante dE. coli (E. coli mut) dans laquelle les gnes cas

sont dlts. On introduit dans cette souche E. coli mut les 5 gnes casA, B, C, D et E et/ou

les gnes cas1, cas2 ou cas3 dE. coli WT. Pour chacune des souches bactriennes

obtenues, on quantifie la sensibilit relative au phage , exprime comme le ratio du nombre

de plages de lyse obtenues aprs culture sur milieu glos en prsence du phage sur

le nombre de plages de lyse obtenues pour la souche bactrienne E. coli mut (Figure 5).

Figure 5. Caractrisation fonctionnelle des gnes cas chez E. coli. On introduit dans la souche bactrienne E. coli mut les 5 gnes casA, B, C, D et E (casABCDE) et/ou les gnes cas1, cas2 ou cas3 dE. coli WT, comme indiqu. Pour chaque souche bactrienne ainsi obtenue, la sensibilit relative au phage est quantifie sur lhistogramme.

Question 7. Analysez et interprtez la figure 5.

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Lensemble des molcules dARN de E.coli WT est extrait et analys par northern blot

laide dune sonde oligonuclotidique radiomarque de squence complmentaire

lune des squences espaceurs du locus CRISPR (Figure 6A). Lexprience est alors

rpte avec 8 sondes correspondant chacune une squence espaceur diffrente du locus

CRISPR. Le plus petit ARN dtect par chaque sonde (dit ARNcr) est entirement

squenc. La Figure 6B prsente la squence et la structure secondaire prdites de lARN

transcrit partir du locus CRISPR (en haut) ainsi que les squences compltes des ARNcr

obtenus (en bas).

Figure 6. Caractrisation des ARNcr chez la souche bactrienne E. coli. A. Les molcules dARN de E.coli WT sont extraites, spares par lectrophorse puis transfres sur

membrane. La membrane est rvle par hybridation laide dune sonde oligonuclotidique radiomarque de squence complmentaire lune des squences espaceurs du locus CRISPR. La piste (-) correspond une piste sans dpt dARN. A gauche est indique la taille en nuclotides. B. En haut, squence et structure secondaire prdites de lARN transcrit partir du locus CRISPR. Les N

reprsentent ici nimporte lequel des quatre nuclotides. En bas, squences compltes alignes des 8 ARNcr identifis par lapproche dcrite en A rpte avec 8 sondes oligonuclotidiques diffrentes.

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Question 8.

a) Analysez la figure 6A. Proposez une ou plusieurs hypothses rendant compte

de la dtection de plusieurs espces dARN de taille diffrente.

b) Justifiez les variations de la squence non grise des ARNcr, situe entre

les squences 5 et 3 conserves (figure 6B, en bas).

c) Daprs la figure 6B et la taille des molcules dARN dtectes en figure 6A,

prcisez alors lhypothse formule en a).

Question 9. Daprs vos connaissances, quel type dARN dcrit chez les eucaryotes

pourraient sapparenter les ARNcr ? Justifiez.

On introduit alors dans la souche E. coli mut les 5 gnes casA, B, C, D et E ou seulement

4 dentre eux selon les diffrentes combinaisons possibles. Lensemble des molcules

dARN est extrait et analys par northern blot laide dune sonde oligonuclotidique

radiomarque de squence complmentaire lune des squences espaceurs du locus

CRISPR (Figure 7).

Figure 7. Caractrisation du complexe Cascade chez E. coli. Les molcules dARN sont extraites de la souche E.coli mut exprimant ou non 4 ou 5 des gnes casA, B, C, D et E dE. coli WT, comme indiqu. Les molcules dARN sont alors spares par lectrophorse puis transfres sur membrane. La membrane est rvle laide dune sonde oligonuclotidique radiomarque de squence complmentaire lune des squences espaceurs du locus CRISPR. A gauche est indique la taille en nuclotides. La mme quantit dARN a t dpose dans chaque puits.

Question 10. Analysez et interprtez la figure 7.

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On purifie alors le complexe Cascade et les molcules qui lui sont associes partir de

bactries E. coli WT infectes par le phage . Aprs purification, la fraction protique est

limine et la fraction non protique subit un traitement la RNase A, une enzyme

hydrolysant spcifiquement lARN, ou la DNase I, une enzyme hydrolysant spcifiquement

lADN. La fraction ainsi obtenue est analyse par lectrophorse (Figure 8A).

Par ailleurs, un fragment radiomarqu dADN issu du phage (ADN cible), ou dADN

de squence alatoire (ADN non-cible), est incub seul ou en prsence du complexe

Cascade purifi partir de bactries E. coli WT non infectes. A lissue de lincubation,

lADN radiomarqu est analys par lectrophorse (Figure 8B). Notez que

les lectrophorses des acides nucliques sont ralises dans des conditions

non dnaturantes.

Figure 8. Identification des molcules associes au complexe Cascade. A. Le complexe Cascade et les molcules associes sont purifis partir de bactries E. coli WT infectes

par le phage . Aprs limination de la fraction protique, les chantillons sont traits la RNase A ou la DNase I ou non traits (Cascade), puis analyss par lectrophorse en prsence dun intercalant des acides nucliques fluorescent, et visualiss sous lumire UV. A gauche est indique la taille en nuclotides. B. LADN cible ou non-cible radiomarqu est incub seul ou en prsence du complexe Cascade purifi partir de bactries E. coli WT non infectes, puis lADN radiomarqu est analys par lectrophorse suivie dune autoradiographie. Le sens de migration de llectrophorse est indiqu.

Question 11.

a) Analysez et interprtez la figure 8A.

b) Que cherche-t-on tester dans lexprience dcrite en figure 8B ?

Justifiez brivement.

c) Analysez et interprtez la figure 8B.

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On sintresse alors au produit du gne cas3. Afin de visualiser limplication de Cas3 dans

le mcanisme CRISPR/Cas, on ralise une exprience de complmentation bimolculaire de

fluorescence. Cette technique repose sur la capacit que possdent deux fragments

dun fluorochrome, non fluorescents lorsquils sont isols, de prsenter de nouveau

leur proprit de fluorescence lorsquils sont en contact troit. Lun des fragments

de fluorochrome est fusionn la protine Cas3, et lautre la protine CasA, et

ces protines sont exprimes chez E. coli WT. Les bactries sont alors cultives en absence

ou en prsence de phage et analyses par microscopie pifluorescence (Figure 9).

Figure 9. Caractrisation de limplication de Cas3 par complmentation bimolculaire de fluorescence.

Les protines Cas3 et CasA sont fusionnes deux fragments dun fluorochrome puis exprimes chez des bactries E. coli WT. Les bactries sont alors infectes ou non par le phage puis analyses par microscopie pifluorescence (A et C). Le mme champ visualis par microscopie en lumire blanche est prsent (B et D).

Question 12. Analysez et interprtez la figure 9.

Question 13. Daprs lensemble des donnes des parties I et II,

proposez des hypothses quant au rle de Cas3 dans le mcanisme CRISPR/Cas.

Vous prciserez les tapes du mcanisme CRISPR/Cas mises en vidence

jusqu prsent.

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PARTIE III Aspects volutifs du mcanisme CRISPR/Cas

Question 14. Par une argumentation rigoureuse, vous expliciterez les avantages et/ou

dsavantages volutifs quun mcanisme tel que CRISPR/Cas peut prsenter

pour lorganisme procaryote.

Dans le but de dtecter des vnements rares, on rpte lexprience de conjugaison

chez S. epidermidis WT avec le plasmide pNes(wt), mais en augmentant le nombre de

bactries utilises. A lissue de lexprience, les rares colonies transconjugantes sont isoles

et on analyse leur locus CRISPR par PCR (Figure 10).

Figure 10. PCR du locus CRISPR de trois colonies bactriennes transconjugantes 1, 2 et 3, ainsi que de la souche bactrienne dorigine S. epidermidis WT. LADN de chaque souche bactrienne est purifi et

amplifi par PCR en utilisant des amorces situes de part et dautre du locus CRISPR. Les produits damplification sont spars par lectrophorse en prsence dun intercalant de lADN fluorescent et visualiss sous lumire UV. M : marqueur de taille. kb : kilobases.

Question 15. Proposez trois vnements volutifs pouvant chacun rendre compte

du fait que des bactries transconjugantes sont dtectables malgr le systme

CRISPR/Cas prsent chez la souche bactrienne dorigine.

Question 16. Analysez et interprtez la figure 10.

16

Afin de dterminer si le gnotype des colonies transconjugantes pr-existe lexprience de

conjugaison (hypothse 1) ou sil apparat de faon inductible lors du transfert de plasmide

(hypothse 2), on ralise une exprience dite de fluctuation (Table 3). On compare

la variance du nombre de transconjugants obtenus dans 10 expriences de conjugaison

ralises :

- soit partir de 10 cultures indpendantes de S. epidermidis WT (chacune obtenue

partir dune colonie isole indpendante) (protocole A) ;

- soit partir de 10 aliquots de la mme culture de S. epidermidis WT (protocole B).

10 cultures indpendantes

(protocole A)

10 aliquots de la mme culture

(protocole B)

Variance 55488 581

Table 3. Variances obtenues suite lexprience de fluctuation.

Question 17. Pour chacune des hypothses 1 et 2, quelle prdiction pouvez-vous faire

quant la comparaison des variances obtenues par chacun des deux protocoles A

et B ? Justifiez brivement. Que permet de conclure la table 3 ?

17

On cherche alors comparer la valeur slective ( fitness ) associe au gnotype

des souches transconjugantes 1, 2 et 3 caractrises dans la Figure 10 celle associe

au gnotype de la souche dorigine S. epidermidis WT. Des expriences de comptition sont

ralises selon le protocole dtaill ci-dessous.

On co-cultive pendant 5 jours, un ratio initial de 1:1, la souche bactrienne S. epidermidis

WT avec chacune des souches transconjugantes 1, 2 et 3. On ralise galement

une exprience tmoin dans laquelle on co-cultive la souche S. epidermidis WT et

une souche S. epidermidis WT ayant acquis le plasmide pNes(mut) par conjugaison

(voir Table 1). Chaque jour, la frquence du gnotype transconjugant est mesure dans

la co-culture (Figure 11).

Question 18. Soit A le gnotype WT et B le gnotype transconjugant. On fait

lhypothse que la valeur slective du gnotype A est plus leve que celle

du gnotype B. On considre que les populations bactriennes se multiplient de faon

discrte et asexue.

Soient les paramtres suivants (voir Table 4) :

la frquence du gnotype A ;

la frquence du gnotype B ;

la valeur slective relative du gnotype B ;

la valeur slective moyenne de la population la gnration , soit

.

Gnotype

A B

Gnration

Frquence avant slection

Valeur slective relative

Gnration

Frquence avant slection

Table 4. Modle de slection chez une population haplode.

a) Exprimez et en fonction de , et .

b) En exprimant en fonction de , et , montrez alors que le gnotype A

doit envahir la population dans ces conditions.

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Figure 11. Frquence du gnotype transconjugant au cours du temps lors du test de comptition entre la souche bactrienne S. epidermidis WT et chacune des trois souches transconjugantes 1, 2 et 3.

La frquence du gnotype transconjugant est indique en ordonne. Le rsultat de lexprience tmoin de comptition entre la souche S. epidermidis WT et la souche S. epidermidis WT ayant acquis le plasmide pNes(mut) par conjugaison est prsent droite. Chaque srie de symboles de couleurs diffrentes correspond un rplicat indpendant de lexprience. La ligne noire reprsente la moyenne.

Question 19.

a) Quel est lintrt de lexprience tmoin ?

b) Analysez la figure 11. Daprs la question 18 c), quen dduisez-vous quant

la valeur slective du gnotype transconjugant par rapport celle du gnotype WT

dans cette srie dexpriences ?

c) Discutez alors la valeur slective du systme CRISPR/Cas en fonction

des conditions environnementales.

19

PARTIE IV Application du mcanisme CRISPR/Cas

pour ldition de gne in vivo chez les eucaryotes

Depuis 2012, le systme CRISPR/Cas est de plus en plus exploit pour diter les gnes

eucaryotes (cest--dire modifier leur squence) in vivo. On utilise un systme driv

du systme CRISPR/Cas de lespce bactrienne Streptococcus pyogenes et comportant

deux lments :

la protine Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9), qui est suffisante

pour reconstituer un systme CRISPR/Cas fonctionnel ;

un ARNcr artificiel dont la squence dpend du gne cible diter.

Dans la srie dexpriences prsente ci-dessous, on souhaite diter le gne Mecp2 chez

la souris. Mecp2 est exprim spcifiquement dans certains neurones et code une protine

nuclaire qui joue un rle important dans la pathogense dun syndrome neurologique

appel syndrome de Rett.

On injecte dans le cerveau deux vecteurs de transgnse. Le transgne contenu dans

le premier vecteur (vecteur SpCas9) comporte un promoteur permettant lexpression de

SpCas9 suivi dun site de poly-adnylation (pA, Figure 12A). La squence de SpCas9 est

fusionne une squence de localisation nuclaire (SLN). Le transgne contenu dans

lautre vecteur (vecteur ARNcr) comporte un promoteur ubiquiste permettant la transcription

de lARNcr ciblant Mecp2, et un promoteur permettant lexpression de la protine

fluorescente GFP suivi dun site de poly-adnylation (Figure 12B).

Figure 12. Schma des transgnes vhiculs par les vecteurs SpCas9 (A) et ARNcr (B). SLN, signal de

localisation nuclaire. pA, site de poly-adnylation. Prom., promoteur ubiquiste.

Question 20.

a) Quel est lintrt de fusionner une squence de localisation nuclaire la squence

codant SpCas9 ?

b) Quel est lintrt dinclure la squence codant la GFP dans lun des transgnes ?

c) Quel promoteur utiliseriez-vous pour diriger lexpression de SpCas9 et de la GFP

dans les cellules dintrt spcifiquement ?

20

Dans une premire exprience, le cerveau des souris est prlev deux semaines aprs

linjection des vecteurs et les cellules exprimant la GFP sont isoles. Le gne Mecp2 est

alors squenc dans chaque cellule exprimant la GFP et les squences obtenues sont

compares la squence sauvage du gne : 68% des cellules exprimant la GFP comportent

une squence diffrant de la squence sauvage. Les diffrences sont toutes situes dans

la mme portion de lexon 3 du gne (Figure 13).

Figure 13. Squence sauvage de Mecp2 et squences reprsentatives obtenues dans les cellules exprimant la GFP (GFP

+). Seule la portion de lexon 3 dans laquelle sont situes les diffrences de squence est

reprsente.

Dans une deuxime srie dexpriences, on injecte le vecteur SpCas9 dans deux lots de

souris. Dans le premier lot de souris, on injecte galement le vecteur ARNcr ciblant Mecp2,

tandis que dans le deuxime lot de souris, on injecte un vecteur ARNcr tmoin, codant

un ARNcr de squence alatoire. Le cerveau des souris est prlev deux semaines aprs

linjection des vecteurs et analys par immunofluorescence et par western blot laide

dun anticorps dirig contre MeCP2 (Figure 14).

21

Figure 14. Efficacit de ldition de Mecp2 in vivo. A et B. Des coupes histologiques de cerveau de souris chez lesquelles on a inject le vecteur SpCas9 et le vecteur ARNcr tmoin (A) ou ciblant Mecp2 (ARNcr Mecp2, B) sont marques laide dun anticorps

fluorescent dirig contre MeCP2, et laide dun intercalant fluorescent de lADN, le DAPI. La fluorescence correspondant au marquage de MeCP2 et au DAPI est alors visualise laide dun microscope pifluorescence. Les clichs de droite correspondent des agrandissements des rgions encadres. Barre dchelle : 150 m. C. Les protines extraites du cerveau de souris chez lesquelles on a inject le vecteur SpCas9 et le vecteur ARNcr tmoin ou ciblant Mecp2 (ARNcr Mecp2) sont analyses par western blot laide de deux anticorps

dirigs contre MeCP2 et la GAPDH, respectivement. La GAPDH est une protine ubiquiste dont lexpression ne varie pas.

Question 21. Analysez les figures 13 et 14. Proposez des hypothses reliant

les observations de la figure 13 au mcanisme daction du systme CRISPR/Cas dcrit

dans les parties I et II.

Question 22. En comparaison de la technique classique de gnration de souris

knock-out, citez un avantage de lexploitation du mcanisme procaryote CRISPR/Cas

dans l'tude de la fonction des gnes eucaryotes.

Question 23. Daprs les parties I IV de lexercice, proposez un schma bilan

rsumant les proprits fonctionnelles, volutives et appliques du mcanisme

CRISPR/Cas.

Fin de lpreuve.