1

Mémoire de recherche

Charlotte SAINT-ANDRE

Arnaud GUILLIEN

Année universitaire 2007-2008

Promotion 8

Etude de HIF-1α : inhibition de l’interaction de HIF-1 / ADN par des polyamides

2

RESUME

Grâce à la voie HIF-1, les cellules tumorales ont mis en place des mécanismes d’adaptation à

l’hypoxie. En hypoxie, HIF-1α n’est pas dégradé ce qui va lui permettre d’être transloqué, de

se dimériser avec HIF-1β, ainsi le dimère formé (HIF-1) va activer la transcription de ses

gènes cibles via l’interaction avec le HRE (Hypoxia Response Element). En effet, HIF-1 peut

ainsi activer la transcription de nombreux gènes impliqués notamment dans le développement

tumoral (VEGF pour l’angiogenèse, les cyclines pour la prolifération cellulaire ou EPO pour

l’érythropoïèse). HIF-1 représente ainsi une cible thérapeutique prometteuse pour le

développement de traitement anti-cancéreux. Cependant, dans certaines tumeurs, HIF-1 active

la transcription de gènes impliqués dans l’apoptose tels que BNIP3. Il s’agit donc d’une part

de bloquer spécifiquement la voie HIF-1, afin de ne cibler que les cellules tumorales, et

d’autre part de ne cibler que les gènes impliqués dans le développement tumoral. Pour cela,

Nickols et son équipe ont choisi d’interrompre l’interaction HIF-1/ADN grâce à l’action de

petites molécules : les polyamides. Ils ont ainsi comparé la spécificité d’action des

polyamides avec celle de l’échinomycine et du siRNA de HIF-1α. Leurs résultats montrent

que le polyamide 1 a la meilleure affinité pour la séquence HRE. En revanche, il vise un panel

de gènes plus restreint que l’échinomycine et le siRNA et n’affecte pas l’expression des gènes

de l’apoptose. A la vue de ces résultats, le polyamide 1 semble être un bon candidat pour

cibler spécifiquement la voie HIF-1. On se propose pour la suite, de tester l’efficacité de ce

polyamide sur des lignées cellulaires cancéreuses et de vérifier la toxicité sur des cellules

saines, avant de passer à de l’expérimentation animale.

3

SOMMAIRE

I. Introduction……………………………………….……………1

1) Fonctions de HIF-1…………………………………………………………………....1

2) Structure de HIF-1………………………………………………………………..…..2

3) Mécanismes de régulation de HIF-1α………………………………………………..5

a. Dépendant de l’oxygène………………………………………………….…….5

i. Condition normoxique……………………………………………...5

ii. Condition hypoxique……………………………………….............7

b. Indépendant de l’oxygène……………………………………………………..7

4 ) HIF-1α comme cible thérapeutique…………………………………………………9

II. Inhibition de l’interaction HIF-1/ADN par des petites

molécules…………………………………………….………...11

1) Conception des polyamides…………………………………………………...…….11

2) Mesure de l’affinité des polyamides et de l’échinomycine…………………..……13

3) Suppression de l’expression de VEGF et FLT1 dans des conditions

hypoxiques………………………………………………………………………...…13

4) Analyse de l’expression génique……………………………………………...…….15

III. Projet de recherche…………………………………...………19 1) Effet des polyamides in vivo sur des cellules humaines tumorales en hypoxie ou en

normoxie : U251 et Hela………………..……………………………………..…….19

a. Evaluation de la prolifération cellulaire par test colorimétrique MTT……….19

b. Evaluation de la survie cellulaire par TUNEL ……………………………….20

2) Test de demi-vie des polyamides dans le sérum……………………………..…….20

3) Test de toxicité sur cellules endothéliales humaines saines (HMEC-1) en hypoxie

ou non…………………………………………………………………………….…..21

4) Test sur le petit animal……………………………………………………………...21

Conclusion……………………………………………………….…..22 Bibliographie…………………………………………………….…..23

4

I. Introduction L’oxygène est une des molécules indispensables à la survie des organismes multicellulaires.

Dans le processus de respiration cellulaire, il constitue l’accepteur final d’électrons au niveau

de la chaîne respiratoire des mitochondries et permet ainsi la synthèse d’ATP. Ce sont les

vaisseaux sanguins qui apportent aux cellules les éléments indispensables à leur croissance

tels que l’oxygène et les nutriments.

L’hypoxie est une caractéristique commune des tumeurs solides. Il s’agit d’une diminution de

la concentration en oxygène au sein de la cellule. Elle peut être chronique (lorsque l’oxygène

ne diffuse pas jusqu’aux cellules périphériques tumorales), ou aiguë (lorsqu’une

vascularisation aberrante apparaît suite au développement de la tumeur). Afin d’éviter une

nécrose des cellules périphériques induite par la privation d’oxygène et de nutriments, les

tumeurs ont mis en place des mécanismes d’adaptation à l’hypoxie.

En altitude, l’hypoxie entraîne les adaptations physiologiques suivantes : hyperventilation,

augmentation de la synthèse de l’érythropoiétine (EPO) suivie de l’activation de la synthèse

d’érythrocytes et donc de l’augmentation de la capacité de transport d’oxygène. Si l’hypoxie

persiste on observe également un phénomène d’angiogenèse. En 1992, Semenza et al. mettent

en évidence un facteur de transcription induit par l’hypoxie et capable d’interagir avec une

séquence enhancer (HRE : Hypoxia Response Element) du gène de l’EPO (Semenza et al.,

1992). Il s’agit du facteur de transcription HIF-1, protéine clé de l’adaptation à l’hypoxie. La

même équipe a ensuite purifié et caractérisé cette protéine (Wang et al,. 1995).

1) Fonctions de HIF-1

Normalement exprimé en condition d’hypoxie, il a été démontré que ce facteur est également

exprimé dans certaines conditions de normoxie comme lors de l’embryogenèse. Des souris

KO pour le gène HIF-1 ont été réalisées. Ces KO présentent un phénotype embryonnaire-létal

(Ryan et al., 1998). HIF-1 active la transcription de plus de 70 gènes, favorisant notamment

la croissance de la tumeur, tels que des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire

(cyclines), dans le métabolisme du glucose (glut-1), dans l’angiogenèse (VEGF) ou

l’érythropoïèse (EPO) (Feldser et al., 1999 ; Gleadle & Ratcliffe, 1997 ; Forsythe et al.,

1996 ; Jiang et al., 1996). HIF-1 constitue ainsi une cible thérapeutique intéressante.

Cependant, dans certains types de tumeurs, HIF-1 a un effet anti-prolifératif en activant la

transcription de gènes de l’apoptose (Bruik, 2000).

5

2) Structure de HIF-1

HIF-1 est une protéine hétérodimérique constituée de 2 sous-unités : HIF-1α (120 kDa) et

HIF-1β (Wang et al., 1995). Ces dernières appartiennent à la famille des protéines à domaine

PAS pour Per-ARNT-Sim, du nom des trois premières protéines identifiées contenant ce

motif structural (Figure 1). Le domaine PAS est constitué de 2 sous-unités homologues A et

B impliquées dans la dimérisation, quant au domaine bHLH (basic Helix-Loop-Helix), il est

impliqué dans l’interaction avec l’ADN ainsi que dans la formation de l’hétérodimère entre

les sous-unités HIF-1α et HIF-1β. Les 2 sous-unités possèdent 2 séquences de localisation

nucléaire chacune (NLS) et des domaines de transactivation (TAD) (Jiang et al., 1997).

HIF-1β, également connue sous le nom de ARNT (Aryl Hydrocarbon Nuclear Translocator),

est une protéine nucléaire exprimée de façon constitutive. En revanche, HIF-1α contient un

domaine ODD (Oxygen-Dependant-Degradation) qui permet de réguler sa stabilité en

hypoxie à travers l’hydroxylation de deux prolines (P402 et P564) et l’hydroxylation d’une

lysine (K532) (Pugh et al., 1997). Elle est adressée au protéasome et dégradée en condition

normoxique, alors qu’en hypoxie elle est transloquée vers le noyau où elle se dimérise avec

HIF-1β pour activer la transcription des gènes cibles (Figure 2).

Il existe 2 autres membres dans la famille de HIF-1α : HIF-2α et HIF-3α. HIF-2α partage 48%

d’identité de séquence en acides aminés avec HIF-1α et possède des similarités biochimiques

et structurales avec HIF-1α (hétérodimérisation avec HIF-1β et fixation sur le HRE). HIF-2α

est exprimée principalement dans les cellules endothéliales des tissus vasculaires tels que les

poumons, les reins et le cœur (Talks et al., 2000). HIF-3α, facteur dont l’activité est mal

connue, a une organisation structurale semblable aux deux autres sous-unités α (Makino et

al., 2002).

Les expressions tissulaires de HIF-2α et HIF-3α sont plus restreintes que celle de HIF-1α

exprimée de façon ubiquitaire. Le facteur de transcription HIF-1α est de ce fait le plus étudié

(Semenza, 2000).

6

Figure 1 : Structures de HIF-1α et HIF-1β. bHLH : basic Helix-Loop-Helix. TAD: Transactivation Domain. PAS : Per-ARH-ARNT-Sim, domaine constitué de 2 sous-unités homologues internes A et B. NLS : Nuclear Localization Domain. La sous-unité HIF-1α (826 acides aminés) est une protéine de 120 kDa qui fait l’objet d’une dégradation en normoxie et d’une stabilisation en hypoxie via son domaine ODD. La sous-unité HIF-1β ou ARNT (aryl hydrocarbon nuclear receptor translocator) ne possédant pas de domaine ODD est une protéine nucléaire exprimée de façon constitutive. Il existe 2 isoformes de HIF-1β (774 et 789 acides aminés c’est-à-dire respectivement 92 et 94 kDa). Figure 2 : Structure détaillée du gène de HIF-1α. ODDD : Oxygen Dependant Degradation Domain. TAD : Transactivation Domain. NLS : Nuclear Localization Signal. Le gène codant pour HIF-1α code chez l’homme pour un ARNm comprenant 15 exons et une protéine de 826 acides aminés (aa.). Les domaines bHLH (17-30 aa.) et PAS (85-298 aa.) permettent la formation de l’hétérodimère HIF-1α et HIF-1β, et la fixation sur les HRE (hypoxia response elements, 5’(A/G)CGTG 3’) des gènes cibles. Le domaine PAS est divisé en 2 sous-domaines, PAS-A (85-158 aa.) and PAS-B (228-298 aa.). HIF-1α fait l’objet de régulation O2-dépendante via des modifications post-traductionnelles sur son domaine ODDD (P402, K532 et P564). Le domaine ODD (401-603 aa.) contenant le N-TAD contrôle la dégradation de HIF-1α par la voie ubiquitine/protéasome. Le domaine de transactivation (C-TAD) permet le recrutement de coactivateurs et l’activation de la transcription des gènes cibles. Les signaux de localisation nucléaire (NLSs) sont situés en N-terminal (17-74 aa.) and C-terminal (718-721 aa.) de HIF-1α. Le C-NLS est crucial dans l’importation nucléaire de HIF-1α.

N L S

HIF-1α

HIF-1β

TAD

TAD PAS ODD

N L S

N L S

bHLH

N L S

bHLH PAS

TAD

7

Figure 3 : Régulation de la transactivation et de la stabilisation HIF-1α dépendante de l’oxygène. En normoxie (à gauche), deux résidus prolines de HIF-1α (P402 et P564) et l’asparagine (N803) sont hydroxylés respectivement par les PHDs et FIH-1. Ces modifications post traductionnelles sont dépendantes de la concentration en fer, 2-oxoglutarate et oxygène. Les protéines HIF-1α hydroxylées vont se fixer au complexe VHL-E3 ubiquitine ligase menant à leur dégradation par le protéasome. L’acétylation de la lysine (K532) par ARD1 favorise l’interaction de HIF-1α avec VHL. D’autre part, le recrutement des coactivateurs comme CBP/p300 est bloqué par l’hydroxylation de N803. En hypoxie (à droite), les activités des PHDs et de FIH-1 sont inhibées à cause du manque d’oxygène. Ainsi les prolines et l’asparagine ne seront pas hydroxylées. Donc VHL n’est plus fixée et HIF-1α est stabilisée. Les protéines HIF-1α stabilisées vont être transloquées dans le noyau et vont se fixer à HIF-1β. Comme N803 n’est plus hydroxylée, les coactivateurs CBP/p300 vont être recrutés. L’hétérodimère va se fixer sur une séquence spécifique (HRE) et induire la transcription des gènes cibles. 2-OG (2-OxoGlutarate), ARD1 (ADP-Ribosylation factor Domain 1), CBP (CREB Binding Protein), FIH-1 (Factor Inhibiting HIF-1), HIF (Hypoxia-Inducible Factor), HRE (Hypoxia Response Element), PHD (Prolyl-4-Hydroxylase Domain), Ub (Ubiquitin), VHL (Von Hippel-Lindau)

8

3) Mécanismes de régulation de HIF-1α

a. Dépendant de l’oxygène : Figure 3

i. Condition normoxique

La protéine HIF-1α va être prise en charge par les prolyl hydroxylases (Bruik et al., 2001).

Cette famille d’enzymes contient 3 membres : PHD1 (Prolyl-4-Hydroxylase Domain 1),

PHD2 et PHD3 (Epstein et al., 2001). L’expression de HIF-1α est régulée par les PHDs qui

sont elles même dépendantes de l’oxygène et du fer pour leur activité (Epstein et al., 2001).

HIF-1α va être hydroxylée sur 2 prolines (P) contenues dans le domaine ODD : P402 et P564

(Ivan et al., 2001, Jaakkola et al., 2001). D’autre part, une acétylation sur la lysine (K)

présente dans ODDD en position 532 par la protéine ARD1 (ADP-Ribosylation factor

Domain 1) a été démontrée (Jeong et al., 2002). Ces modifications post-traductionnelles vont

permettre le recrutement de la protéine suppresseur de tumeurs VHL (Von Hippel-Lindau,

Maxwell et al., 1999). VHL fait partie du complexe multiprotéique E3 ubiquitine ligase. HIF-

1α va donc être polyubiquitinylée et sera dégradée très rapidement par le protéasome 26S

(Kallio et al., 1999). La durée de demi-vie de la protéine HIF-1α est inférieure à 5 minutes en

normoxie (Chun et al., 2002).

Les protéines HIF-1α échappant à la dégradation par le protéasome vont être régulées par

l’action d’une seconde enzyme appelée FIH (Factor Inhibiting HIF-1, Mahon 2001, Lando et

al., 2002a). FIH, tout comme les PHDs, utilise l’oxygène comme substrat. HIF-1α va être

hydroxylée sur une asparagine (N) contenue dans le domaine de transactivation (TAD) C-

terminal : N803 (Lando et al., 2002b). HIF-1α va être transloquée dans le noyau via une

protéine chaperonne appelée Hsp90 (Minet et al., 1999). HIF-1α va interagir avec HIF-1β,

l’hétérodimère HIF-1 ainsi formé va se fixer sur une séquence consensus 5’-(A/G)CGTG-3’

du gène cible appelé HRE (Hypoxia Response Element, Semenza et al., 1996). Comme on a

une hydroxylation de N803, les protéines co-activatrices transcriptionnelles p300/CBP ne

vont pas pouvoir interagir avec HIF-1α (Lando et al., 2002a). En condition normoxique, les

PHDs et la FIH, détecteurs d’oxygène, permettent donc de verrouiller la transcription des

gènes cibles de HIF-1.

9

Figure 4 : Régulation indépendante de l’oxygène de la synthèse protéique de HIF-1α. Les facteurs de croissance se lient à leurs récepteurs spécifiques qui ont une activité tyrosine kinase. Ils vont permettre l’activation des voies de signalisation de la PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase) et/ou des MAPK(mitogen-activated protein kinases). PI3K va activer par phosphorylation AKT (protéine kinase B) qui elle même va activer mTOR

(mammalian target of rapamycin). Dans la voie des MAPK, ERK est activée en amont par la MAP/ERK (MEK). A son tour, ERK va phosphoryler MNK. ERK et mTOR phosphorylent la p70 S6K. Cette dernière phosphoryle la protéine ribosomale S6 entraînant ainsi l’activation d’eIF-4E (eukaryotic translation initiation factor S6 protein). D’autre part, ERK et mTOR vont inhiber la protéine 4E-BPI, l’empêchant ainsi de se lier à eIF-4E. Lorsque 4E-BPI se lie à eIF-4E, elle l’inactive et prévient la traduction cap-dépendante des ARNm. MNK phosphoryle eIF-4E et stimule directement son activité. L’effet de l’activation de ces voies de signalisation sous la dépendance de facteurs de croissance est une augmentation de la vitesse de traduction d’un ensemble d’ARNm dont fait partie l’ARNm de HIF1-α. La protéine est produite en plus grandes quantités que ne peut en dégrader le système VHL-E3 ubiquitine ligase-protéasome. Elle s’accumule, gagne le noyau, s’associe avec HIF1-β et va ainsi pouvoir transactiver ses gènes cibles.

10

ii. Condition hypoxique

Dans des conditions hypoxiques, l’action des PHDs et de la FIH qui utilisent l’oxygène

comme substrat sont diminuées voire inhibées. Ainsi les régulations post-traductionnelles

(hydroxylations) de HIF-1α ne sont plus réalisées et VHL ne se fixe plus. HIF-1α ne va donc

plus être dégradée par le protéasome. Il va être transloqué dans le noyau via Hsp90.

L’hétérodimère HIF-1α / HIF-1β va se fixer sur le HRE dans le promoteur des gènes cibles.

Les co-activateurs tels que CBP/p300 (CREB-Binding Protein) vont pouvoir être recrutés et

activer la transcription du gène cible.

Une balance est donc créée entre la stabilisation et la dégradation des protéines HIF-1α dans

les cellules humaines.

b. Indépendant de l’oxygène

Cette régulation est basée sur la stimulation de la croissance cellulaire par des facteurs de

croissance qui permettent l’augmentation de la quantité de protéines HIF-1α (Figure 4). La

régulation de l’expression de HIF-1 par les facteurs de croissance a été démontrée pour la

première fois dans des cellules cancéreuses de prostate, dans lesquelles HIF-1 est exprimé de

façon constitutive même dans des conditions de normoxie (Zhong et al., 1998). On peut citer,

parmi les facteurs de croissance ayant un tel effet, IGF-1 (Insulin-like Growth Factor), IL-1

(InterLeukin-1) et EGF (Epidermal Growth Factor) (Fukuda et al., 2002 ; Stiehl et al., 2002 ;

Jiang et al., 2001).

Lorsqu’un de ces facteurs de croissance se fixe sur son récepteur tyrosine kinase, une ou des

voies de signalisation vont être activées : la voie PI3K (Phosphatidylinositol-3-Kinase) ou/et

de la voie des MAP kinases (Mitogen-Actived Protein kinases). L’activation de l’une ou

l’autre de ces deux voies entrainera l’inhibition de la protéine 4E-BPI et l’activation de eIF-

4E (facteur d’initiation de la traduction). La traduction de l’ARNm de HIF-1α est augmentée,

engendrant une accumulation de protéines HIF-1α. La quantité de protéines HIF-1α est telle

que le système de dégradation VHL-E3 ubiquitine ligase-protéasome est surpassé. Par

conséquent, HIF-1α est transloquée dans le noyau et va activer la transcription des gènes

cibles (Forsythe et al., 1996).

11

.

Figure 5 : Cibles possibles de l’inhibition de HIF-1α par des petites molécules. 1 : traduction de HIF-1α ; 2 : voie de signalisation mTOR (mammalian target of rapamycin) ; 3 : dégradation de la protéine HIF-1α ; 4 : translocation de HIF-1α ; 5 : interaction entre p300 et HIF-1α ; 6 : interaction entre HIF-1 et l’ADN du gène cible (HRE). Abréviations : 2ME2 (2-methoxyestradiol), HDACi (histone deacetylase inhibitors), HRE (hypoxia response element), YC-1 (3-(5’-hydroxymethyl-2’-furyl)-1-benzylindazole).

ARNm HIF-1α HIF-1α HIF-1α HIF-1β

HRE

p300 p300

mTOR

Facteur de croissance

Chétomine

Temsirolimus Gefitinib Herceptin

Protéasome

Topotecan 2-ME2

HDACi YC-1

1

2

3

5

6 Echinomycine

Polyamides

4

Gualdanamycine

12

4) HIF-1α comme cible thérapeutique

Des analyses immunohistochimiques ont montré la surexpression nucléaire de HIF-1α dans

des tumeurs solides variées (Talks et al., 2000).

De nombreuses études réalisées démontrent clairement que l’accumulation de HIF-1α dans les

cellules tumorales est en général favorable à la progression maligne et est souvent corrélée à

un faible taux de survie des patients (Harris, 2002). Il semble donc très intéressant de pouvoir

cibler l’action de HIF-1α afin de contrer l’angiogenèse et la prolifération tumorale.

De nombreuses investigations ont été entreprises pour cibler la voie de signalisation de HIF-1.

Le but de ces nouvelles thérapies est d’exploiter le microenvironnement hypoxique de la

tumeur ou de manipuler la voie de signalisation de HIF-1 pour inhiber la croissance tumorale.

Plusieurs approches (Figure 5) ont été utilisées pour inhiber l’expression et/ou l’activité de

HIF-1α : siRNA, inhibiteurs de l’accumulation des protéines HIF-1α (topotecan, inhibiteurs

de Hsp90, 2ME-2, YC-1, HDACi), inhibiteurs des voies de signalisation impliquées dans

l’activation de HIF-1α (inhibiteurs de la voie mTOR, inhibiteurs du récepteur du facteur de

croissance épidermique EGFR) (Melillo, 2007). La plupart de ces agents décrits sont

impliqués dans d’autres fonctions biologiques. Ces agents représentent donc des inhibiteurs

non sélectifs de HIF-1. Au contraire, des inhibiteurs sélectifs seront des outils idéaux pour

cibler la voie HIF-1 et pour établir des thérapies potentielles d’inhibition de HIF-1. Plusieurs

domaines de HIF-1 ont été des cibles appropriées pour le développement d’inhibiteurs

sélectifs de HIF-1 : domaines impliqués dans la dimérisation avec HIF1-β, dans le

recrutement de coactivateurs qui sont exigés pour une activité transcriptionnelle, ou dans la

fixation à l’ADN. Par exemple, la chétomine a permis d’empêcher l’interaction entre le C-

TAD de HIF-1α et le domaine CH1 de p300. Cette molécule permet une atténuation de la

transcription inductible par l’hypoxie et une diminution de la croissance des tumeurs (Kung et

al., 2004).

Une autre approche a été d’inhiber l’interaction entre HIF-1 et la séquence spécifique d’ADN

(HRE) des gènes cibles. Le blocage de cette interaction entre ADN et HIF-1 peut se réaliser

par des polyamides synthétiques mais aussi par un peptide cyclique appelé échinomycine.

Dans ce rapport, nous verrons si les polyamides peuvent être des molécules efficaces pour

lutter contre le cancer.

13

Figure 6 : Structure de l’échinomycine (NSC-13502, Van Dyke & Dervan, 1984). Peptide cyclique constitué de 2 chromophores et d’un octapeptide. C’est une molécule intercalante qui interagit avec le petit sillon de l’ADN via ses chromophores.

Figure 7 : Structures des petites molécules utilisées et stratégies d’inhibition de l’expression du gène VEGF (vascular epidermal growth factor) cible de HIF-1 (Nickols et al., 2007a). L’interaction entre HIF-1/ADN va être ciblée par des petites molécules : les polyamides 1 et 2 (P1 et P2), l’échinomycine (E) et par l’utilisation d’un siRNA pour la dégradation des ARNm de HIF-1α. P1 et E sont censés interagir avec la séquence HRE (hypoxia response element) de VEGF 5’-TACGTG-3’; P2 avec la séquence 5’-AGTGCA-3’ (en amont du HRE du gène VEGF) et P3 avec la séquence 5’-WGGWCW-3’ où W = A ou T. P3 ne devrait pas interagir de manière spécifique sur le HRE de VEGF et donc ne devrait pas ou peu perturber l’interaction entre HIF-1 et l’ADN. Rond rouge : Imidazole ; rond vide : Pyrrole et carré : Chlorothiophène.

14

II. Inhibition de l’interaction HIF-1/ADN par des petites

molécules Les petites molécules constituent une stratégie idéale pour bloquer une interaction

protéine/ADN de façon spécifique. Par exemple, il a été démontré que l’échinomycine inhibe

l’interaction HIF-1/ADN au niveau du HRE (séquence consensus reconnue par HIF-1) du

gène du VEGF grâce à une expérience d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) (Kong et

al., 2005). L’échinomycine est un petit peptide cyclique, constitué de 2 chromophores et d’un

octapeptide, appartenant à la famille d’antibiotiques des quinoxalines. Il reconnaît

spécifiquement les séquences 5’-ACGT-3’ et 5’-TCGT-3’ (Figure 6). La séquence du HRE

étant 5’-A/TACGTG-3’, on peut supposer que l’échinomycine peut bloquer d’autres

interactions de type facteur de transcription/ADN en plus de l’interaction HIF-1/ADN. Cette

petite molécule intercalante interagit avec le petit sillon de l’ADN via la formation de pont

hydrogène entre ses 2 chromophores et une paire de bases de l’ADN (GC) causant ainsi le

désenroulement local de la double hélice (Van Dyke & Dervan, 1984). Les polyamides sont

des oligomères synthétiques dont la spécificité d’interaction avec l’ADN peut être

programmée en fonction de la séquence ciblée. De la même manière que l’échinomycine, ils

interagissent avec le petit sillon de l’ADN et déstabilisent localement l’enroulement de la

double hélice en formant des ponts hydrogène avec les bases de l’ADN (Dervan & Edelson,

2003).

1) Conception des polyamides

- Reconnaissance d’une séquence GC : le motif Im-Py (Imidazole-Pyrrole) reconnaît

spécifiquement la séquence GC (Dervan & Edelson, 2003)

- Reconnaissance d’une séquence AT : le motif Ct-Py (Chlorothiophène-Pyrrole)

reconnaît spécifiquement la séquence AT

Les auteurs ont utilisé des polyamides existant déjà : les polyamides 1 et 3 (P1 et P3, Nickols

et al., 2007b), ainsi qu’un nouveau polyamide : le polyamide 2 (P2) (Nickols et al., 2007a).

P1 est censé interagir avec le HRE directement, P2 est censé interagir avec une séquence en

amont du HRE du gène VEGF et P3 est un contrôle négatif portant un mismatch avec la

séquence HRE (Figure 7). La synthèse de polyamides, qui reconnaissent spécifiquement une

séquence donnée d’ADN en se fixant dans le petit sillon, vont permettre dans notre cas

d’empêcher l’interaction entre une protéine (HIF-1) et sa séquence cible (HRE du gène cible).

Le but de ces polyamides est de pouvoir réguler l’expression des gènes cibles de HIF-1.

15

Tableau 1 : Détermination des affinités de fixation des polyamides 1, 2, 3 et de l’échinomycine sur les HREs (hypoxia response element) de VEGF (vascular epidermal growth factor) et FLT1 (récepteur de VEGF type 1) mesurées grâce à l’empreinte à la DNase I (Nickols et al., 2007a). Le polyamide 1 est la molécule qui se fixe avec la plus grande constante d’affinité sur les HREs de VEGF et FLT1.

Figure 8 : Empreinte à la DNase I (Nickols et al., 2007a). a et c: Séquence partielle du plasmide utilisé contenant les sites d’interaction hypothétiques des inhibiteurs. P1 et E sont censés interagir avec la séquence 5’-TACGTG-3’ (HRE) ; P2 avec la séquence 5’-AGTGCA-3’ (en amont du HRE du gène VEGF) et P3 avec la séquence 5’-WGGWCW-3’ où W = A ou T. b et d: empreintes obtenues pour le gène de VEGF et de FLT1 respectivement. Concentrations en P1, P2 et P3, pistes 1 à 11 : 100 nM, 30 nM, 3 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 10 pM, 3 pM et 1 pM. Concentrations en E, pistes 1 à 11 : 10 μM, 3 μM, 1 μM, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM et 100 pM.

2,9.10-78,4.10-6E

8.10-83

2,2.10-83,2.10-92

2,7.10-92,6.10-10 M1

FLT1 VEGF HRE Inhibiteurs

16

2) Mesure de l’affinité des polyamides et de l’échinomycine

Afin de vérifier l’interaction des petites molécules avec leur séquence cible et de déterminer

les affinités correspondantes, les auteurs ont réalisé une expérience d’empreinte à la DNaseI

(Figure 8). Des plasmides portant des séquences comprenant les HRE du gène de VEGF et

FLT1 (gènes cibles de HIF-1) sont utilisés, les séquences d’intérêt sont amplifiées par PCR,

marquées en 5’ avec du 32P, mises en présence de différentes concentrations en inhibiteurs et

digérées à la DNaseI. Comme prévu, P1 interagit spécifiquement avec le HRE des gènes

VEGF et FLT1, avec une affinité de l’ordre de 10-10 et 10-9 M respectivement (Tableau 1). P2

interagit spécifiquement avec la séquence en amont du HRE du gène VEGF avec une affinité

de 10-9 M. Il a également une affinité de 10-8 M avec une séquence du gène FLT1, cependant,

ce fragment amplifié ne contient pas la séquence reconnue par P2, donc on peut supposer

qu’il s’agit là d’une interaction non spécifique. Quant à P3, il montre une affinité de 10-8 M

pour le HRE du gène VEGF, l’affinité pour le HRE du gène FLT1 n’est pas mesurable. Enfin,

l’échinomycine interagit aussi avec le HRE avec une affinité de l’ordre de 10-6 et 10-7 M pour

les gènes VEGF et FLT1 respectivement. P1 possède donc la plus forte affinité pour sa

séquence cible. Après avoir vérifié l’interaction des inhibiteurs avec leur séquence cible, les

auteurs ont mesuré leur effet sur l’expression des gènes cibles de HIF-1. On vient de montrer

que le polyamide 1 avait une meilleure affinité que l’échinomycine avec les HREs de VEGF

et FLT1. Donc l’utilisation d’un tel polyamide serait intéressante pour réguler l’expression

des gènes cibles de HIF-1 en condition d’hypoxie.

3) Suppression de l’expression de VEGF et FLT1 dans des conditions hypoxiques

Des expériences de RT-PCR quantitatives temps réel (Figure 9) sont réalisées pour évaluer

les niveaux d’ARNm de VEGF et FLT1 en hypoxie (induction par DFO) dans des cellules

U251 traitées par différents inhibiteurs (siRNA HIF-1α, échinomycine, polyamides 1, 2 et 3).

En parallèle, des cellules non traitées sont utilisées comme contrôle. Le taux d’ARNm de

VEGF est réduit de plus de 50% par rapport au contrôle induit, en présence du siRNA de HIF-

1α, du polyamide 1 et du polyamide 2, à des niveaux proches de celui du contrôle non induit

(Figure 9A). Comme décrit auparavant, une concentration de 100 nM d’échinomycine inhibe

l’expression de VEGF à un niveau en dessous de celui du contrôle non induit (Kong et al.,

2005). Le polyamide 3 qui se fixe sur le HRE avec une constante d’affinité moindre que 1 et 2

a peu d’effet sur les niveaux d’ARNm de VEGF. L’induction de FLT1 (récepteur de VEGF

17

Figure 9 : Expériences de PCR temps réel quantitatives. A) Quantité d’ARNm de VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) dans des conditions hypoxiques (DFO) mesurée par PCR temps réel. Le traitement avec R, 1 ou 2 diminue la quantité d’ARNm de VEGF à un niveau proche du contrôle non induit. E diminue très fortement la quantité d’ARNm de VEGF à un niveau en dessous du contrôle non induit. Le polyamide 3 a un effet plus modeste. B) Quantité d’ARNm de FLT1(récepteur de VEGF type 1) dans des conditions hypoxiques (DFO) mesurée par PCR temps réel. R, E et polyamide 1 diminuent la quantité d’ARNm de FLT1. Les polyamides 2 et 3 ont peu ou pas d’effet. R = siRNA HIF-1α ; E = 100 nM d’échinomycine ; 1, 2 et 3 = 1 µM de polyamide 1, 2 et 3 ; DFO = deferoxamine

Tableau 2 : Analyse de l’expression génique (microarray) dans les cellules U251 traitées par R, E ou polyamide 1 et induits par DFO (p ≤ 0,01). Le niveau d’expression génique est normalisé par rapport aux contrôles induits par DFO. Dans tout les cas, une majorité de gènes affectés est sous-exprimée. L’échinomycine affecte plus de 10000 gènes (au moins 2 fois), tandis que le polyamide 1 affecte un nombre de gènes comparable avec le siRNA HIF-1α et le contrôle non-induit par DFO. R = siRNA HIF-1α ; E = 100 nM d’échinomycine ; 1= 1 µM de polyamide1; DFO = deferoxamine

18

type 1) est activée par la fixation de HIF-1 sur le HRE 5’-A/TACGTG-3’ dans le promoteur

de FLT1 (Gerber et al., 1997). Le traitement par le polyamide 1 et le siRNA HIF-1α inhibe

l’expression de FLT1 de plus de 50% en conditions hypoxiques (Figure 9B). Comme pour

VEGF, 100 nM d’échinomycine réduisent fortement l’expression de FLT1 à un niveau en

dessous du contrôle non induit. Les polyamides 2 et 3 ont peu ou pas d’effet sur les taux

d’ARNm de FLT1.

Nous avons vu précédemment que l’échinomycine avait une constante d’affinité plus faible

que les 3 polyamides pour la fixation sur le HRE des gènes VEGF et FLT1. Or les résultats

d’expression de VEGF et FLT1 nous montrent que 1 µM de polyamide 1 est nécessaire pour

inhiber l’expression de ces 2 gènes en comparaison avec le siRNA de HIF-1α, tandis que 100

nM d’échinomycine réduisent l’expression de ces gènes à des niveaux en dessous des

contrôles non induits.

Cette expérience nous montre que le polyamide 1 affecte l’expression des ARNm de VEGF et

FLT1. La quantité d’ARNm de ces deux gènes est réduite d’environ 2 fois dans les cellules

cancéreuses et en condition d’hypoxie. Donc le polyamide 1 se positionne comme un candidat

potentiel pour réguler l’expression des gènes cibles de HIF-1.

4) Analyse de l’expression génique

Afin d’examiner les effets globaux du traitement avec les polyamides sur la régulation des

gènes en condition hypoxique (induction par DFO), les auteurs ont réalisé des microarrays

avec des séquences d’oligonucléotides représentant plus de 50000 transcrits. Les cellules

U251 sont traitées en 3 exemplaires avec le siRNA de HIF-1α, 100 nM d’échinomycine et 1

µM de polyamide 1. Les niveaux d’expression génique sont normalisés par rapport aux

contrôles traités par DFO. Ensuite 300 µM de DFO sont ajoutés pendant 16 heures et les

ARNs totaux sont collectés. Les cellules non traitées avec DFO sont normalisées par rapport

aux contrôles traités avec DFO.

Le traitement sans DFO affecte l’expression de 2142 gènes dont la majorité est sous-exprimée

(Tableau 2). Le polyamide 1 affecte l’expression de 2284 gènes (<5% des transcrits testés), le

siRNA de HIF-1α 3190 gènes et l’échinomycine 10906 gènes (gènes sur-exprimés ou sous-

exprimés au moins 2 fois). Dans tous les cas, la majorité des gènes sont sous-exprimés.

Cette expérience montre que le polyamide 1 cible, dans les cellules U251 en condition

hypoxique, une quantité de gènes limitée comparée à l’échinomycine. Donc malgré la taille

du site de fixation (5’-TACGTG-3’) du polyamide 1, un nombre limité de gènes est affecté en

condition hypoxique.

19

Tableau 3 : Profils d’expression de 11 gènes cibles de HIF-1 possédant un HRE (hypoxia response element) fonctionnel induits et traités dans les cellules U251 par le siRNA de HIF-1α (R), 100 nM d’échinomycine (E), 1 µM de polyamide 1 et 3. La normalisation de ces gènes est réalisée par rapport au contrôle induit par DFO. TRFC : Transferrin Receptor ; PKFB3 : 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphate-3 ; LDHA : Lactate Deshydrogenase ; BNIP3 : 19 kDa Interacting Protein 3 ; EGLN1 et 3 : HIF prolyl hydroxylase 2 et 3 ; PGK1 : Phosphoglycérate Kinase 1 ; CA9 : Carbonic Anhydrase 9 ; VEGF :Vascular Endothelial Growth Factor ; FLT1 : récepteur de VEGF type 1 ; EDN1 : Endothelin 1. DFO = deferoxamine (induit l’hypoxie). Figure 10 : Tests d’immunoprécipitation de chromatine sur les HRE des gènes VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), CA9 (Carbonic Anhydrase 9) et PGK1 (Phosphoglycérate Kinase 1). a) ChIP de HIF-1α sur la séquence contenant le HRE de VEGF après traitement avec les inhibiteurs (R, E,1 et 3) et DFO. b) ChIP de HIF-1α sur le HRE du gène CA9. c) ChIP de HIF-1α sur le HRE du gène PGK1. R = siRNA HIF-1α ; E = 100 nM d’échinomycine ; 1 et 3 = 1 µM de polyamide 1 et 3 ; DFO = deferoxamine (induit l’hypoxie).

20

Afin de déterminer plus précisément les effets provoqués par le polyamide 1, le siRNA de

HIF-1α et l’échinomycine sur la transcription induite directement par HIF-1, un nombre

limité de transcrits (31) est examiné. Ces transcrits ont été précédemment identifiés comme

des cibles directes de HIF-1 et induits par DFO au moins 1,5 fois. La quasi-totalité des 31

transcrits sont sous-exprimés par le siRNA de HIF-1α. Dans la plupart des cas, l’expression

des gènes est diminuée à des niveaux observés dans les cellules non traitées avec DFO.

Le traitement par l’échinomycine entraîne une sous-expression des 31 gènes, tandis que le

polyamide 1 diminue significativement (au moins 2 fois) l’expression de seulement 10 gènes

et affiche peu d’effets sur les autres. Les gènes pour lesquels le HRE fonctionnel a été

identifié sont listés dans le tableau 3.

Des RT-PCR temps réel quantitatifs ont été réalisées pour confirmer les effets des différents

inhibiteurs sur ces 11 gènes. Ces expériences confirment que le siRNA de HIF-1α et

l’échinomycine diminuent l’expression des 11 gènes étudiés. Le polyamide 1 quant à lui

inhibe significativement l’expression de 4 gènes à savoir CA9, VEGF, FLT1 et EDN1

(VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor, CA9 : Carbonic Anhydrase 9, FLT1 : récepteur

de VEGF type 1 ; EDN1 : Endothelin 1), ce polyamide 1 est donc moins efficace que

l’échinomycine mais n’affecte pas BNIP3, gène impliqué dans l’apoptose. Comme prévu le

traitement avec le polyamide 3 n’a pas d’effet significatif sur l’expression de ces gènes.

Ces études nous révèlent que le polyamide 1 diminue spécifiquement l’expression des gènes

tels que VEGF, CA9, EDN1 et FLT1 impliqués dans la croissance tumorale en condition

hypoxique. D’autre part, le polyamide 1 a peu ou pas d’effet, en condition hypoxique, sur

l’expression de gènes impliqués dans l’apoptose (BNIP3) et le métabolisme du fer (TRFC),

mais aussi des gènes codant pour les PHDs. Donc le polyamide 1 semble être un bon candidat

pour réguler l’expression des gènes cibles de HIF-1 impliqués dans la prolifération et/ou la

vascularisation de tumeurs.

Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) ont été entreprises dans les

cellules U251 pour évaluer les variations d’occupation des promoteurs de 3 gènes (VEGF,

CA9 et PGK1) par HIF-1 en présence du siRNA de HIF-1α, de l’échinomycine, du polyamide

1 et 3 (Figure 10). Dans des conditions hypoxiques, l’occupation de HIF-1α sur le HRE des

gènes VEGF et CA9 est diminuée de moitié environ par le siRNA de HIF-1α, l’échinomycine

et le polyamide 1 ; en revanche le traitement avec le polyamide 3 a un effet plus modeste sur

VEGF et pas d’effet sur CA9. D’autre part, le polyamide 1 et l’échinomycine ont un effet

21

minimal sur l’occupation de HIF-1α du HRE de PGK1, tandis que le siRNA de HIF-1α

diminue fortement l’occupation.

Ces expériences démontrent, en condition d’hypoxie, que le polyamide 1 diminue

significativement le taux de fixation de HIF-1 sur les HRE des gènes VEGF et CA9. Donc la

diminution du nombre de protéines HIF-1 se fixant sur le HRE de VEGF et CA9, en condition

hypoxique, entraînera une baisse d’activité transcriptionnelle de ces 2 gènes. Le polyamide 1

se présente alors comme une petite molécule capable de réguler spécifiquement l’expression

des gènes cibles de HIF-1 impliqués dans la croissance tumorale.

Conclusion Les résultats montrent que le polyamide 1 synthétisé pour cibler le HRE, peut se fixer sur son

site de reconnaissance, avec une haute affinité et spécificité et est capable d’interrompre la

fixation de HIF-1 sur l’ADN.

Contrairement à l’échinomycine qui peut inhiber l’expression de nombreux gènes, le

polyamide 1 n’affecte que certains des gènes cibles de HIF-1. De plus, ce dernier n’affecte

pas l’expression des gènes codant pour BNIP3, EGLN1 et EGLN3 ; gènes favorisant

respectivement l’apoptose et la dégradation de HIF-1α par les prolyl hydroxylases. On en

déduit que le polyamide 1 est donc plus adapté que l’échinomycine pour cibler

spécifiquement l’interaction HIF-1/ADN. D’autre part, les essais cliniques en phase I et II de

l’échinomycine ont montré l’inefficacité de celle-ci in vivo ainsi que de lourds effets

secondaires (Melillo, 2007).

D’après les résultats obtenus, on ne peut pas conclure sur la relation entre interaction du

polyamide 1 avec le HRE et inhibition de l’expression des gènes cibles de HIF-1. Il serait

intéressant d’effectuer des expériences complémentaires : vérifier l’efficacité du polyamide 1

sur des cellules tumorales, mener des tests de toxicité sur des cellules saines. Après une

éventuelle optimisation du polyamide 1, il serait nécessaire d’effectuer de l’expérimentation

animale pour juger des effets anti-cancéreux apportés par cette petite molécule.

22

III. Projet de recherche

1) Effet des polyamides in vivo sur des cellules humaines tumorales en hypoxie ou en

normoxie : U251 et Hela (Shui Ping Tu et al., 2003)

a. Evaluation de la prolifération cellulaire par test colorimétrique MTT

Ce test MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ou tétrazole)

permet de voir la prolifération cellulaire grâce à la réduction d’un composé chimique : le

tétrazole. Le tétrazole est réduit en formazan, composé coloré absorbant à 540 nm, par les

réductases mitochondriales. Cette conversion ne peut avoir lieu que dans les cellules viables,

on mettra donc en évidence les cellules viables grâce à la coloration due au formazan.

Les lignées cellulaires U251 et Hela ont été isolées à partir de cellules tumorales de cerveau et

d’utérus respectivement. Elles constituent de bons modèles d’études notamment pour leur

facilité d’utilisation. Ce test est effectué sur des cellules en normoxie (cellules contrôles) et

des cellules en hypoxie (induite par le DFO). Les cellules en phase exponentielle sont traitées

ou non au DFO puis cultivées pendant 24h à 37°C, on veut travailler à une concentration

d’environ 1000 cellules par puits. Elles sont ensuite traitées ou non avec différentes

concentrations de polyamide 1 (0.1 nM à 100 µM) pendant 96h. Enfin, la solution MTT est

ajoutée dans chaque puit, avant incubation pendant quelques heures à 37°C. Le formazan

produit, contenu dans le surnageant, est solubilisé et l’absorbance lue à une longueur d’onde

de 595 nm.

En condition normoxique, les cellules tumorales doivent proliférer avec ou sans traitement au

polyamide. Par contre, en condition hypoxique, à partir d’une certaine dose en polyamide, on

s’attend à ce que le taux de cellules viables diminue significativement. Un contrôle positif

sera réalisé, en hypoxie, afin de vérifier que les cellules continuent à proliférer en absence de

23

traitement par le polyamide 1. Ce test permettra aussi de calculer l’EC50, concentration de

polyamide 1 nécessaire pour activer l’apoptose de 50 % des cellules cancéreuses.

b. Evaluation de la survie cellulaire par TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick

End Labeling)

La mort cellulaire programmée ou apoptose est accompagnée par une fragmentation d’ADN

effectuée par des endonucléases. La méthode TUNEL permet la visualisation in situ de

l’apoptose à partir d’une section tissulaire ou d’une culture cellulaire. La terminale

déoxynucleotidyl transférase catalyse l’addition de polydUTP marqués, ici à la Fluorescéine

IsoThioCyanate (FITC), aux extrémités 3’OH des ADN endommagés. Donc, contrairement au

test précédent qui permet de voir les cellules viables, celui-ci permet de voir les cellules en

apoptose. Pour ces expériences, un kit est utilisé : ApoAlert DNA Fragmentation Kit (environ

150€ pour 25 essais). Ces fragments d’ADN marqués pourront alors être visualisés et

quantifiés par microscopie de fluorescence ou par cytométrie en flux (FACS, Fluorescence-

Activated Cell Sorter). Les cellules en apoptose émettent une fluorescence verte importante.

Comme précédemment cette expérience est effectuée sur des cellules Hela et U251, et la

même gamme de concentrations en polyamide 1 est utilisée. L’Indice Apoptotique (IA) est

déterminé par le ratio de cellules en apoptose sur cellules totales. Ensuite l’IA des cellules en

hypoxie traitées avec le polyamide est comparé à celui des cellules en normoxie (cellules

contrôles) traitées au polyamide.

2) Test de demi-vie des polyamides dans le sérum

Un paramètre largement utilisé pour exprimer l'élimination d'un médicament de

l'organisme est la demi-vie. La t1/2 correspond au temps nécessaire pour passer d'une

concentration plasmatique à sa moitié, le médicament est métabolisé ou éliminé.

Généralement la demi-vie est calculée à partir des concentrations plasmatiques mesurées à

différents temps. La t1/2 est donc fonction de deux paramètres physiologiques caractéristiques

de chaque molécule : la clairance (capacité de l’organisme à éliminer une molécule) et le

volume de distribution (Vd). Elle est donc fonction de l’élimination et de la distribution du

composé étudié. Ce paramètre va donc permettre de décider du rythme d’injection de

polyamides pour l’expérimentation animale (étape suivante).

24

Afin de déterminer ces paramètres pharmacocinétiques, des souris saines subissent une

injection de polyamides en intraveineuse par la veine jugulaire. Des échantillons sanguins

sont ensuite prélevés immédiatement après injection puis toutes les heures et centrifugés à

1000 g pour séparer le plasma. Les échantillons sont alors analysés par HPLC, le polyamide

est détecté à 214 nm (UV). La concentration plasmatique en polyamide est calculée à partir de

l’aire sous la courbe des chromatogrammes.

3) Test de toxicité sur cellules endothéliales humaines saines (HMEC-1) en hypoxie

ou non

Afin d’évaluer la toxicité des polyamides à l’échelle cellulaire, des tests MTT et TUNEL sont

également réalisés afin de vérifier la prolifération et la survie cellulaires. Pour cette étude, des

cellules humaines saines sont utilisées : les cellules HMEC-1 (Human Microvascular

Endothelial Cells). Comme pour les cellules Hela et U251, une gamme de concentration en

polyamide 1 de 0.1 nM à 100 µM est utilisée et les conditions de normoxie et d’hypoxie (avec

le DFO)sont testées.

La concentration effective en polyamides est censée affecter la croissance des cellules saines

en hypoxie et entraîner l’apoptose. Afin de mettre au point un traitement qui cible

spécifiquement les cellules en hypoxie, on veut s’assurer qu’il n’y a pas d’altération de la

croissance cellulaire et/ou d’activation de l’apoptose sur les cellules saines en normoxie à

cette concentration.

4) Test sur le petit animal

Afin d’observer l’impact des polyamides sur la tumorigenèse d’un organisme entier, des tests

peuvent être initiés sur le petit animal. Des études d’hétérotransplantation de tumeurs

humaines (ou xénogreffes) seront réalisées sur des souris.

Les souris de type « Nude » constituent un bon modèle d’études des tumeurs humaines in vivo

car elles présentent un déficit en lymphocytes T, de plus, les caractéristiques des tumeurs

transplantées ne subissent pas de modifications majeures.

L’évolution du volume de la croissance tumorale humaine est déterminée. Les cellules

tumorales U251 ou Hela sont utilisées pour les tests d’efficacité des polyamides sur la

prolifération et la mort cellulaires. La réalisation de tests sur animaux permet des évaluations

pré-cliniques des polyamides 1 comme médicament anticancéreux.

25

Les tumeurs humaines sont implantées dans une région de la souris « Nude » pour permettre à

la tumeur de se développer. Quand la tumeur a atteint la taille voulue, les souris sont traitées

avec différentes doses de polyamides 1 par injection en intraveineuse une fois par jour

pendant un temps déterminé (quelques semaines). Durant cette période, le volume de la

tumeur est mesuré. Ainsi, on visualise les effets dose dépendants des polyamides sur la

croissance tumorale. En parallèle, un lot de souris témoins portant les tumeurs humaines ne

sera pas traité par les polyamides 1 ; pour valider l’essai, ces souris doivent développer un

cancer.

Conclusion et perspectives

D’après les résultats des expériences de binding de Nickols et al., les polyamides 1 ont une

forte affinité pour le HRE. De plus, ces petites molécules semblent plus spécifiques que les

inhibiteurs de l’interaction HIF-1/ADN existants (siRNA et échinomycine). En effet, il altère

significativement l’expression d’un panel de gènes plus réduit que ses 2 homologues.

D’ailleurs, il est important de noter que contrairement au siRNA et à l’échinomycine, les

polyamides1 n’affectent pas l’expression des gènes cibles induisant l’apoptose (BNIP3) ou la

dégradation de HIF-1α (gènes codant pour les PHD). Il faudra donc vérifier le rôle anti-

tumoral sur des cultures de cellules tumorales et déterminer ainsi l’EC50. Puis il faudra

s’assurer qu’il n’y a d’effet toxique sur des cellules saines à cette même concentration. Enfin,

après détermination de la demi-vie, l’effet anti-tumoral sur la souris devra être évalué. Si le

traitement s’avère peu ou pas efficace, le polyamide 1 subira une nouvelle phase

d’optimisation et de tests : binding in vitro et in vivo (gel retard, ChIP) et expression des

gènes cibles (RT-Q-PCR, microarrays).

26

BIBLIOGRAPHIE Bruick RK. (2000) Expression of the gene encoding the proapoptotic Nip3 protein is induced by hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA.; 97: 9082–7. Bruick RK & McKnight SL 2001 A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF. Science 294 1337–1340. Chun YS, Kim MS, Park JW. (2002) Oxygen-dependentand -independent regulation ofHIF-1alpha. J Korean Med Sci.; 17: 581–8. Dervan PB, Edelson BS, Recognition of the DNA minor groove by pyrrole-imidazole polyamides. Curr Opin Struct Biol. 2003 Jun;13(3):284-99. Review. Epstein AC, et al. C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell 2001 ; 107 : 43-54. Feldser D, Agani F, Iyer NV, Pak B, Ferreira G, Semenza GL. (1999) Reciprocal positive regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha and insulin-like growth factor 2. Cancer Res.; 59: 3915–8. Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, Agani F, Leung SW, Koos RD, Semenza GL. (1996) Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol Cell Biol.; 16: 4604–13. R. Fukuda, K. Hirota, F. Fan, Y.D. Jung, L.M. Ellis, G.L. Semenza, J. Biol. Chem. 277 (2002) 38205– 38211. Gerber HP, Condorelli F, Park J, Ferrara N. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem. 1997 Sep 19;272(38):23659-67. Gleadle JM, Ratcliffe PJ. (1997) Induction of hypoxia-inducible factor-1, erythropoietin, vascular endothelial growth factor, and glucose transporter-1 by hypoxia: evidence against a regulatory role for Src kinase. Blood.; 89: 503–9. Harris AL 2002 Hypoxia – a key regulatory factor in tumour growth. Nature Reviews. Cancer 2 38–47. Ivan M, Kondo K, Yang H, Kim W, Valiando J, Ohh M, Salic A, Asara JM, Lane WS & Kaelin WG, Jr 2001 HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Science 292 464–468. Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, Wilson MI, Gielbert J, Gaskell SJ, Kriegsheim A, Hebestreit HF, Mukherji M, Schofield CJ et al. 2001 Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science 292 468–472. Jeong JW, Bae MK, Ahn MY, Kim SH, Sohn TK, Bae MH, Yoo MA, Song EJ, Lee KJ & Kim KW 2002 Regulation and destabilization of HIF-1alpha by ARD1-mediated acetylation. Cell 111 709–720. Jiang BH, Rue E, Wang GL, Roe R, Semenza GL. (1996) Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem.; 271: 17771–8. Jiang BH, Zheng JZ, Leung SW, Roe R & Semenza GL 1997 Transactivation and inhibitory domains of hypoxiainducible factor 1alpha. Modulation of transcriptional activity by oxygen tension. Journal of Biological Chemistry 272 19253–19260. B.H. Jiang, G. Jiang, J.Z. Zheng, Z. Lu, T. Hunter, P.K. Vogt, Cell Growth Differ. 12 (2001) 363– 369

27

Kallio PJ, Wilson WJ, O’Brien S, Makino Y, Poellinger L. (1999) Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor 1alpha by the ubiquitin-proteasome pathway. J Biol Chem.; 274: 6519–25. D. Kong, E. J. Park, A. G. Stephen, M. Calvani, J. H. Cardellina, A. Monks, R. J. Fisher, R. H. Shoemaker, and G. Melillo Echinomycin, a small-molecule inhibitor of hypoxia-inducible factor-1 DNA-binding activity. Cancer Res. 2005 Oct 1;65(19):9047-55. Kung AL, Zabludoff SD, France DS, Freedman SJ, Tanner EA, Vieira A, Cornell-Kennon S, Lee J, Wang B, Wang J et al. 2004 Small molecule blockade of transcriptional coactivation of the hypoxia-inducible factor pathway. Cancer Cell 6 33–43. Lando D, Peet DJ, Whelan DA, Gorman JJ, Whitelaw ML. (2002a) Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch. Science.; 295:858–61. Lando D, Peet DJ, Gorman JJ, Whelan DA, Whitelaw ML, Bruick RK. (2002b) FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor. Genes Dev.; 16: 1466–71. Mahon PC, Hirota K & Semenza GL 2001 FIH-1: a novel protein that interacts with HIF-1alpha and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity. Genes & Development 15 2675–2686. Makino Y, Kanopka A, Wilson WJ, Tanaka H & Poellinger L 2002 Inhibitory PAS domain protein (IPAS) is a hypoxia inducible splicing variant of the hypoxia-inducible factor-3alpha locus. Journal of Biological Chemistry 277 32405–32408. Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, Clifford SC, Vaux EC, Cockman ME, Wykoff CC, Pugh CW, Maher ER & Ratcliffe PJ 1999 The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 399 271–275. Melillo G. Targeting hypoxia cell signaling for cancer therapy. Cancer Metastasis Rev. 2007 Jun;26(2):341-52. Review. E. Minet, D. Mottet, G. Michel, I. Roland, M. Raes, J. Remacle, C. Michiels Hypoxia-induced activation of HIF-1: role of HIF-1alpha-Hsp90 interaction. FEBS Lett. 1999 Oct 29;460(2):251-6. Nickols NG, Jacobs CS, Farkas ME, Dervan PB. Modulating hypoxia-inducible transcription by disrupting the HIF-1-DNA interface. ACS Chem Biol. 2007a Aug 17;2(8):561-71. Nickols NG, Jacobs CS, Farkas ME, Dervan PB. Improved nuclear localization of DNA-binding polyamides. Nucleic Acids Res. 2007b ; 35(2):363-70. Epub 2006 Dec 14. Pugh CW, O’Rourke JF, Nagao M, Gleadle JM & Ratcliffe PJ 1997 Activation of hypoxia-inducible factor-1; definition of regulatory domains within the alpha subunit. Journal of Biological Chemistry 272 11205–11214 Ryan, H. E., Lo, J. & Johnson, R. S. HIF-1αis required for solid tumor formation and embryonic vascularization. EMBO J.17, 3005–3015 (1998). Semenza GL, Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol Cell Biol 1992 ; 12 : 5447-54. Semenza GL, Jiang BH, Leung SW, Passantino R, Concordet JP, Maire P, Giallongo A. (1996) Hypoxia response elements in the aldolase A, enolase 1, and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem.; 271: 32529–37. Semenza GL. (2000) HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol.; 88: 1474–80.

28

D.P. Stiehl, W. Jelkmann, R.H. Wenger, T. Hellwig-Burgel, FEBS Lett. 512 (2002) 157– 162. Talks KL, Turley H, Gatter KC, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ & Harris AL. 2000, The expression and distribution of the hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in normal human tissues, cancers, and tumor-associated macrophages. American Journal of Pathology 157 411–421. Van Dyke MM, Dervan PB.Echinomycin binding sites on DNA. Science. 1984 Sep 14; 225(4667):1122-7. Wang GL, Jiang BH, Rue EA & Semenza GL 1995 Hypoxia inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. PNAS 92 5510–5514. Wang GL, Semenza GL. Purification and characterization of hypoxia inducible factor 1. J Biol Chem 1995 ; 270 : 1230-7. H. Zhong, Faton Agani, Angelo A. Baccala, Erik Laughner, Natalia Rioseco-Camacho, William B. Isaacs, Jonathan W. Simons,2 and Gregg L. Semenza Increased Expression of Hypoxia Iriducible Factor-1 a in Rat and Human Prostate Cancer [CANCER RESEARCH 58. 5280-5284, December I. 1998]