Entwicklung von tumorspezifischen replikations-kompetenten ... · τουτον δη τον...

Entwicklung von tumorspezifischen

replikations-kompetenten Adenoviren

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

an der Fakultät für Chemie

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt in der Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie,

Fakultät für Medizin, Ruhr-Universität Bochum

Betreuer: Prof. Dr. med. K. Überla

vorgelegt von Diplom-Biochemiker

Dennis Hoffmann aus

Oberhausen

Bochum 2004

τουτον δη τον κοινον λογον και θειον και ου κατα µετοην γινοµεθα

λογικοι, κριτηριον αληθειαχς ϕησιν ο. Ηρακλειτος (540 − 480 v. Chr.)

Vielen Dank an...

… PD Dr. Oliver Wildner für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, die Betrauung mit dem

spannenden Thema und sein Interesse an dem Fortgang der Arbeit.

… Prof. Dr. Klaus Überla für die freundliche Übernahme der Betreuung.

… Prof. Dr. Bernd-Joachim Benecke und Prof. Dr. Sabine Müller für die Übernahme des

Koreferats bzw. die Bereitschaft als dritte Prüferin der Prüfungskommission beizutreten.

… alle Mitarbeiter in meiner Arbeitsgruppe: für unzählige fachliche, politische und private

Diskussionen, Wett-Minipräppen, Biologenwitze und der Suche nach dem idealen

Kaffee. Zu nennen wären Christian Jogler, Wibke Bayer, Anika Ekrut und Sandra

Überberg.

… meine beiden Diplomandinnen Anika und Wibke, die meinen Two-Hybrid-Wahn ausleben

durften (mussten?!) und mit mir unendliche Diskussionen über Vollmilch- oder

Nugatschokolade für die Schublade führten.

… natürlich meine „Lieblings-TA“ Bettina G. Tippler, die schon in der Zellkultur der

„Pharma“ Angst vor meinen Hefen hatte und mir die Geheimnisse der Zell- und

Gewebekultur zeigte.

… die aus der anderen Arbeitsgruppe („die mit den instabilen, langweiligen RNA-Viren“):

für den Spaß, die gemeinsame Kaffeesucht, die Einführung im Labor, die vielen

Schultern, das Erleiden meiner nicht-lentiviralen Papervorschläge. Dazu gehören Dr.

Thomas Grunwald (Erklärbär ;-)), Dr. Alex Stang (rock rules, aber ohne Keyboard!),

Susann Lucke (Autoritäszwerg), Hella Monse (G.O.), Sabine Brandt, Matthias

Tenbusch (nachtragender Axti), Claudius Grossmann, Nicola Ternette, Dr. Seraphin

Kuate, Ph.D. Charles Esimone, Andreia Fernandes, Rosi Bohr, Ulla Vogel, Heike

Seidenstücker, Regina Bütermann, Klaus Sure, Uli Schumacher (der beste

Kaffeekocher!).

… alle die mich ein Stück begleitet haben, egal in welcher Arbeitsgruppe: Vera Siegmund,

Yvonne Klingen, Alexandra Hey, Mieke Sprangers, Daniela Stefanou, Dr. Uli Heindel,

Dr. Godwin Nchinda.

… Bärbel Rölleke für das Entziffern meiner „W“, „A“ und „3.“.

… und natürlich für „critical reviewing“: Vera, Susi, Thomas, Wibke und Mona.

… vielen Dank für die rosa Kaffeetasse!

i

Abkürzungsverzeichnis 5-FU 5-Flurouracil

5-FC 5-Flurocystein

AdV Adenovirus

ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaare

cDNA complementary desoxyribonucleic acid

DNA Desoxyribonukleinsäure

FACS fluorescence activated cell sorting

GCV Ganciclovir

HSV-tk Herpes Simplex Virus-1 Thymidin Kinase

ITR inverted terminal repeat

MCS multiple cloning site

mRNA messenger RNA

orf open reading frame

PCR Polymerase-Kettenreaktion

BRAV bedingt replikations-kompetenter Adenoviraler Vektor

RLU relative light units

RNA Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

Inhaltsverzeichnis

ii

1. Einleitung ............................................................................................................................... 1 1.1 Tumortherapie mit onkolytischen Viren .......................................................................... 1 1.2 Adenovirale Vektoren als präklinische Modelle zur Tumortherapie ............................... 3 1.3 Adenoviren ....................................................................................................................... 6

1.3.1 Taxonomie, Morphologie und Genom....................................................................... 6 1.3.2 Replikationszyklus ..................................................................................................... 8

2. Zielsetzung ....................................................................................................................... 12 3. Material und Methoden ........................................................................................................ 13

3.1 Material .......................................................................................................................... 13 3.1.1 Chemikalien............................................................................................................. 13 3.1.2 Enzyme .................................................................................................................... 14 3.1.3 Verbrauchsmaterialien............................................................................................ 15 3.1.4 Kits .......................................................................................................................... 15 3.1.5 Plasmide .................................................................................................................. 16 3.1.6 Lösungen, Puffer und Medien ................................................................................. 17

3.1.6.1 Medien für Bakterienkultur .............................................................................. 17 3.1.6.2 Medien und Puffer für die Zellkultur................................................................ 18 3.1.6.3 Puffer und Lösungen für molekularbiologische Arbeiten mit DNA ................. 18

3.1.7 Geräte...................................................................................................................... 19 3.1.8 Bakterien und Zelllinien .......................................................................................... 20

3.1.8.1 Verwendete Bakterienstämme .......................................................................... 20 3.1.8.2 Eukaryotische Zelllinien................................................................................... 21

3.2 Allgemeine Molekularbiologische Methoden................................................................ 22 3.2.1 Gelelektrophorese von DNA.................................................................................... 22 3.2.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen .............................................. 22 3.2.3 Restriktion von DNA................................................................................................ 22 3.2.4 Auffüllen von 5'-überhängenden DNA-Enden durch Klenow-Behandlung............. 23 3.2.5 Dephosphorylierung von Vektor-DNA mit Calf Intestinal Phosphatase ................ 23 3.2.6 Ligation von DNA-Fragmenten............................................................................... 23 3.2.7 Transformation von Bakterien ................................................................................ 24

3.2.7.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien.................................................. 24 3.2.7.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterien............................................ 24 3.2.7.3 Herstellung elektrokompetenter Bakterien....................................................... 25 3.2.7.4 Transformation elektrokompetenter Bakterien ................................................ 25

3.2.8 DNA-Präparation in kleinem Maßstab (Minipräp) ................................................ 25 3.2.9 DNA-Präparation in großem Maßstab (Maxipräp) ................................................ 26 3.2.10 Fällung .................................................................................................................. 26

3.2.10.1 Fällung von DNA ........................................................................................... 26 3.2.10.2 Fällung von RNA ............................................................................................ 26

3.2.11 Präparation von genomischer DNA aus Zellen .................................................... 27 3.2.12 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)........................................................................ 27 3.2.13 TA-Klonierung....................................................................................................... 28

3.2.13.1 Anhängen eines überhängenden Adenosin..................................................... 28 3.2.13.2 TA-Klonierung................................................................................................ 28

3.3 Zytologische Methoden.................................................................................................. 28 3.3.1 Zellpassagen............................................................................................................ 28 3.3.2 Zellen einfrieren und auftauen ................................................................................ 28 3.3.3 DNA-Transfektion von Zellen mit Calcium-Phosphat ............................................ 29 3.3.4 DNA-Transfektion von Zellen mittels Elektroporation ........................................... 29 3.3.5 Quantifizierung GFP-positiver Zellen mittels FACS .............................................. 29 3.3.6 Selektion mit G418 .................................................................................................. 29

Inhaltsverzeichnis

iii

3.3.7 Limiting dilution ...................................................................................................... 30 3.3.8 Luciferase-Assay ..................................................................................................... 30 3.3.9 Virus-Aufreinigung mit Sucrose und CsCl .............................................................. 30 3.3.10 Infektion................................................................................................................. 30

3.3.10.1 Titerbestimmung............................................................................................. 30 3.3.10.2 Infektion.......................................................................................................... 31

4. Ergebnisse ............................................................................................................................ 32 4.1 Konstruktion und Charakterisierung von Kolon- und Pankreas-spezifischen Promotoren ........................................................................................................................... 32 4.2. Abhängigkeit der Promotoren von dem Zellzyklus ...................................................... 34

4.2.1 Zellzyklusanalyse der Zellen ................................................................................... 34 4.2.2 Analyse der Promotorspezifität ............................................................................... 35

4.3 Test von Promotoren auf Transaktivierung durch adenovirale Sequenzen und Genprodukte ......................................................................................................................... 36

4.3.1 Konstruktion der Vektoren zum Testen von Promotoren auf Transaktivierung...... 36 4.3.2 Einfluss des AdV (nt 1-353)-Segmentes auf die Aktivität der getesteten Promotoren; mit und ohne stromaufwärts liegender polyA-Sequenz .............................. 39 4.3.4 Einfluss der frühen adenoviralen Genprodukte auf die Aktivität der getesteten Promotoren....................................................................................................................... 40 4.3.5 Verifizierung im adenoviralen Vektor ..................................................................... 41

4.4 AdV E4 open reading frame Transkomplementierung .................................................. 43 4.4.1 Konstruktion der AdV E4 orfs exprimierenden Plasmide ....................................... 44 4.4.2 Transkomplementierungsbestimmung mit Luciferase-Assay .................................. 44

4.5 Konstruktion des bedingt replikationskompetenten adenoviralen Vektorsystems ........ 47 4.6 Analyse der bedingt replikationskompetenten adenoviralen Vektoren.......................... 49

5. Diskussion ............................................................................................................................ 55 5.1 Promotoranalyse............................................................................................................. 55 5.2 Analyse der bedingt replikationskompetenten adenoviralen Vektoren.......................... 58

6. Ausblick ............................................................................................................................... 61 7. Zusammenfassung................................................................................................................ 62 8. Quellenangaben.................................................................................................................... 64 9. Dissertationsbezogene bibliographische Daten.................................................................... 86 10. Lebenslauf .......................................................................................................................... 87

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

iv

Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Schematischer Aufbau des humanen Adenovirus Typ 5 7

Abb. 2: Genomorganisation und Regulation des Adenovirus 8

Abb. 3: Replikationszyklus eines Adenovirus 10

Abb. 4: Plasmidkarten der vorhandenen Plasmide 16

Abb. 5: Promotoranalyse in verschiedenen Zelllinien 34

Abb. 6: Zellzyklusanalyse der genutzten Zelllinien 35

Abb. 7: Analyse der Promotorspezifität 36

Abb. 8: Analysierte Promotoren und AdV (nt 1-353) Segment 37

Abb. 9: Vektor-Konstrukte zur Analyse der Promotor-Transaktivierung 38

Abb. 10: Einfluss des AdV (nt 1-353)-Segments auf die Promotoraktivität, mit

und ohne stromaufwärts liegender polyA-Sequenz 40

Abb. 11: Einfluss von viralen Produkten auf die Promotoraktivität 41

Abb. 12: Verwendete adenovirale Konstrukte 42

Abb. 13: Einfluss auf die Promotoraktivität im adenoviralen Vektor 43

Abb. 14: Ergebnisse des Transkomplementierungstestes 46

Abb. 15: Konstruktion des adenoviralen Vektorsystems 48

Abb. 16: Analyse der Transduktionseffizienz in verschiedenen Zelllinien. 50

Abb. 17: Exemplarische Darstellung von Kristallviolett gefärbten und mit BRAV

infizierten Zellen 51

Abb. 18 A: Replikationsverhalten der 20 getesteten BRAVs 53

Abb. 18 B: Replikationsverhalten der 20 getesteten BRAVs 54

Tabellenverzeichnis Tab 1: Promotorvarianten die im pGL3basic-System charakterisiert wurden 33

Tab. 2: Nummerierungen der orf-Kombinationen 45

Tab. 3: Bedingt replikationskompetente adenovirale Vektoren 49

1. Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 Tumortherapie mit onkolytischen Viren

Der erste Bericht über ein replikations-kompetentes Virus, das onkolytische Eigenschaften

besitzt, findet Erwähnung in einer Veröffentlichung von 1912; hier wird über eine

italienische Patientin mit Zervix-Karzinom berichtet 1. Es wurde eine Tumorregression

beobachtet, als der Frau nach einem Hundebiss ein attenuiertes Tollwut-Virus injiziert wurde.

Danach wurden verschiedene Virustypen als antineoplastische Agenzien verwendet, wie zum

Beispiel West Nil-, Ilheus- und Bunyamwera-Virus 2, Egypt 101- 3, Adeno- 4 und Newcastle

Disease-Virus 5-8, Masern- 9, Mumps 10 und bovines Enterovirus 11. Bis 1990 waren alle

Versuche eine replikations-kompetente Virusmutante zur Tumortherapie herzustellen

erfolglos. 1991 stellten Martuza et al. eine Thymidin Kinase (TK)-negative Herpes Simplex-

Virus-1 (HSV-1)-Mutante, genannt dlsptk, her, welche selektiv Tumorzellen lysiert 12. 1996

berichteten Bischoff et al., dass die Adenovirusmutante dl1520 13 in p53-dysfunktionellen

Tumorzellen repliziert und diese selektiv lysiert 14. Zurzeit ist eine schnelle Erweiterung des

Gebietes zur Entwicklung von replikations-kompetenten viralen Agenzien zur Behandlung

von Tumoren zu beobachten.

Die Eigenschaften eines idealen onkolytischen Virus sind: (i) hohe Infektiösität in einem

weiten Feld von Tumoren, (ii) ein kurzer Replikationszyklus in teilenden und post-

mitotischen Zellen, (iii) eine starke Verteilung nach der Lyse, (iv) eine hohe Distribution im

Tumorgewebe und (v) eine hohe physikalische und genetische Stabilität.

Des Weiteren sollte das ideale Agens nicht toxisch in normalen Zellen sein, eine geringe

immunogene Aktivität und eine hohe Tumorspezifität besitzen um eine systemische

Applikation zu ermöglichen. Aus Sicherheitsgründen sollte ein klinisch getestetes Agens

vorhanden sein, damit eine virale Replikation und Ausbreitung ausgeschlossen werden kann.

Verschiedene Mechanismen der viralen Onkolyse sind vorstellbar: Als erstes die direkte Lyse

von Tumorzellen durch Infektion mit lytischen Viren (zum Beispiel HSV-1 und Adenovirus),

welche in Tumorregression resultiert. Als zweiter Mechanismus produzieren verschiedene

onkolytische Viren Proteine während ihres Replikationszyklus, die für die Zellen zytotoxisch

sind. Ein dritter Mechanismus ist die Immunmodulation durch Expression von viralen

Genprodukten, welche die Tumorzellen verändert und für Zytokine zugänglich macht (z.B.

verstärkt die AdV E1A Expression die Sensitivität zum Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α 15).

Alternativ führt Xenogenisation von Tumorzellen durch Präsentation von viralen Antigenen

1. Einleitung

2

auf der Zelloberfläche durch MHC-I Proteine zur zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL)-

vermittelten Zerstörung von Tumorzellen 16. Ferner wurden Lysate von Virus infizierten

Tumorzellen (Onkolysate) als immuntherapeuisches Agens bei der Behandlung von

Melanomen oder Ovarienkarzinome als Adjuvanz verwendet 17. Als vierter Mechanismus

kann die Expression von viralen Proteinen, die die Sensitivität von Tumorzellen zu

Chemotherapeutika oder Strahlungstherapie erhöhen, in Betracht gezogen werden. Zum

Beispiel sind AdV E1A Genprodukte ein potentieller Chemosensibilisierer, vor allem in p53-

intakten Zellen 18. Verstärkte Chemosensibilität nach viraler Infektion wurde in vivo in einer

klinischen Phase II-Studie mit dem intratumoralen Adenovirus ONYX-015 bei der

Koinjektion mit cis-Platin und 5-Flurouracil (5-FU) bei Patienten mit Krebs im Kopf- und

Nackenbereich beobachtet 19. Ein weiterer Mechanismus, bei dem onkolytische Viren eine

antineoplastische Aktivität induzieren, ist die Expression von therapeutischen Transgenen

(z.B. Suizid-Gene oder Zyktokine cDNAs), welche im viralem Genom inseriert wurden 20-25.

Trotz der viel versprechenden Anfänge zeigten viele klinische Versuche im besten Fall einen

minimalen Gentransfer und eine geringe beobachtbare Veränderung des Tumors 26. Eine

effektive Tumortherapie benötigt eine komplette Auslöschung aller Tumorzellen im Körper.

Ein Hauptproblem der viralen Tumorgentherapie ist das Problem mit den vorhandenen

replikations-defekten Viren mehr als ein paar Schichten eines Tumors in vivo zu infizieren.

Dieses ist dadurch zu erklären, dass im Tumor ein großer hydrostatischer Druck herrscht, der

die Vektorpenetration verringert 27. Ein weiterer Grund ist das Fehlen von Rezeptoren auf den

Tumorzellen, mit denen das Virus zum Eintritt in die Zelle interagiert und Immunantwort

durch den Vektor. Eine Möglichkeit diese Probleme zu lösen ist die Verwendung von

replikations-kompetenten Vektoren, die die Möglichkeit besitzen durch aufeinander folgende

Zyklen der Infektion und Lyse von benachbarten Tumorzellen sich im Tumor zu vermehren

und auszubreiten.

Als Versuch die antineoplasitsche Effizienz der Virustherapie zu erhöhen wurde die virale

Onkolyse kombiniert mit der Prodrug-Suizid-Gen-Therapie. Die Prodrug-Suizid-Gen-

Therapie basiert auf der selektiven Umwandlung eines nicht toxischen Medikaments in eine

zytotoxische Form, z.B. Ganciclovir (GCV) durch HSV-tk zu GCV-Monophosphat und

anschließend durch zelluläre Kinasen in GCV-Diphosphat und abschließend zu GCV-

Triphosphat. Einbau von GCV-Triphosphat in makromolekulare DNA von sich teilenden

Zellen führt zu einer Kettenabbruchreaktion 28, chromosomalen Anomalien, Schwester-

Chromatid-austausch 29,30, und letztendlich zum Zelltod. Ein weiteres weitverbreitetes System

basiert auf der Umwandlung von dem Prodrug 5-Flurocytosin (5-FC) in 5-FU durch ein

1. Einleitung

3

vektorkodiertes Cytosin Deaminase (CD) Gen 31,32. Der virale onkolytische Effekt des E1B-

55K-deletierten Adenovirus konnte signifikant verstärkt werden. Dies wurde in soliden

Xenograft Tumor Modellen, wenn das Prodrug (GCV allein oder in Kombination mit 5-FC)

erst nach maximaler Vektorreplikation und Genexpression gegeben wurde, unter-sucht 33-36.

Jedoch war die Verabreichung von GCV nicht förderlich zur viralen onkolytischen Aktivität

der HSV Vektoren hrR3, G207 sowie des adenoviralen Ad.OW34 (ein AdV, das die

komplette E1-Region und HSV-tk exprimiert, mit einer vielfachen robusteren Replikation als

das E1B-deletierte Ad.TKRC) unter Konditionen, die die Vektorreplikation und –ausbreitung

begünstigen. Dieses resultierte aus der möglichen Verstärkung des HSV-tk/GCV vermittelten

onkolytischen Effekts und des virostatischen Effekt von GCV 37-39. Chase et al. generierten

einen replikations-kompetenten HSV-1-Vektor, welcher das Ratten Cytochrom P450 2B1

(CYP2B1) besitzt, das Cyclophosphamid (CPA) in den aktiven Metaboliten Phosphoamid

konvertiert. Phosphoamid vermittelt intra-Strang Verbindungen, welche dann bei der

Zellteilung für Strangbruch verantwortlich sind. Im Gegensatz zum HSV-tk/GCV und

CD/5-FU Paradigma war die Verwendung des CYP2B1/CPA-Systems nicht für eine

signifikante Inhibition der viralen Replikation verantwortlich, dieses System verstärkte den

onkolytischen Effekt des HSV-1 Vektors 40. Das Fehlen eines antiviralen Agens zur

Behandlung einer Infektion mit in der Tumortherapie eingesetzten Viren macht es

unabdingbar, dass zum klinischen Einsatz von replikations-kompetenten Viren ein

Sicherheitsgen (fail-save gene) zum Abstoppen der viralen Replikation und Ausbreitung

inseriert sein muß.

1.2 Adenovirale Vektoren als präklinische Modelle zur Tumortherapie

Drei verschiedene Ansätze werden zurzeit in der präklinischen Tumortherapie als

adenoviralen replikations-kompetente Vektoren verwendet. Der erste Ansatz verfolgt den

Austausch von viralen Promotoren, die essentiell für die Replikationskontrolle sind, durch

gewebespezifische und/oder zellzyklusabhängige Promotoren. Die E1A-Region kodiert für

zwei wichtige E1A Proteine, die während der viralen Infektion exprimiert werden. Diese

binden an den Tumorsuppressor Retinoblastoma-Protein (pRb). E1A Expression führt zu

einer Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F, welcher die Zellen in die S-Phase bringt um

für die AdV Replikation ein ideales zelluläres Umfeld zu generieren 41. In einem Versuch, die

Virus-Replikation durch das Prostata-Spezifischen Antigen (PSA) zu limitieren, welches im

Prostatakrebs exprimiert wird, platzierten Rodriguez et al. die E1A-Region des CN706

1. Einleitung

4

Vektors unter die Kontrolle des PSA Promotors und Enhancers 42. Um die Selektivität des

Vektors zu erhöhen, wurde ein zweiter PSA Enhancer stromaufwärts der E1B-Region

inseriert 43. Andere Forscher versuchten die E1A-Expression selektiv in anderen Tumoren

unter Verwendung von gewebespezifischen Promotoren zu erhöhen (z.B. α-Fetoprotein und

MUC-1) 44,45. Der Versuch, die virale Replikation durch heterologe Promotorkontrolle der

E1A-Region zu kontrollieren, wird dadurch beeinträchtigt, dass schon eine geringe Menge an

E1A-Genprodukten ausreicht um die adenovirale Replikation zu initiieren 46. Außerdem

beinhaltet die der E1-Region stromaufwärts gelegene Verpackungssequenz zwei Enhancer-

Elemente 47, welche in vielen Geweben aktiv sind und daher zahlreiche Promotoren aktivieren

können 48,49. Diese Elemente können nicht entfernt werden ohne die Verpackungseffizienz des

Virus zu reduzieren. Des Weiteren befindet sich in dem stromaufwärts gelegenen AdV-

Segment eine kryptische Transkriptions-Startstelle 50, welche signifikant mit den heterologen

Promotoren interferiert und somit zur Aufhebung der Spezifität führt.

Da eine Menge an kritischen regulatorischen Proteinen, die während einer adenoviralen

Replikation inaktiviert werden, auch in tumorösem Gewebe inaktiviert sind 51,52, wurde ein

zweiter Ansatz entwickelt, um bedingt replikations-kompetente AdVs herzustellen. Dies

wurde durch die Deletion von den adenoviralen Proteinen erreicht, die mit den zellulären

regulatorischen Proteinen interagieren.

Um virale Replikation zu ermöglichen, bringt das adenovirale Protein E1A die Zellen in die

S-Phase. Dieser abnormale S-Phasen Eintritt aktiviert normalerweise p53, welches die Zellen

in einen Zellzyklus-Arrest oder Apoptose bringt. Die beiden adenoviralen Proteine E1B-55K

und E1B-15K inaktivieren den p53-Signalweg; E1B-55K bindet und inhibiert p53,

wohingegen E1B-15K die p53-abhängige Apoptose blockt 53-55. Daher wählten Barker und

Berk et al. ein E1B-55K-deletiertes Adenovirus, dl1520 56 oder ONYX-015 um Tumore zu

therapieren, die eine p53-Dysfunktion aufweisen. Gesunde Zellen, die keine Veränderung im

p53 Signalweg besitzen, werden nicht beeinflusst 57,58. Jedoch zeigten viele

Veröffentlichungen, dass die Interaktion zwischen E1B-55K und p53 weitaus komplexer ist

als angenommen und die Fähigkeit des dl1520 Vektors zur produktiven Replikation nicht mit

dem p53-Status der Wirtszelle korreliert 59-68. ONYX-015, welches kein therapeutisches oder

fail-save-Gen, wie HSV-tk, besitzt, wurde in klinischen Phasen mit Patienten, die rezidive,

refraktäre Adenokarzinome am Kopf und Nacken hatten, eingesetzt. Wenn es als einziges

Agens verwendet wurde, war nur eine Tumorregression bei 15% der behandelten Patienten zu

beobachten 69. Aber in Kombination mit cis-Platin- und 5-FU-basierender Chemotherapie,

konnte mit dem dl1520 Vektor eine Regression in 25 von 30 untersuchten Patienten

1. Einleitung

5

beobachtet werden. In acht Fällen (27%) wurden eine komplette und in elf Fällen (36%) eine

teilweise Regression erzielt und das ohne nennenswerte Nebeneffekte 70.

Ein weiterer Mutationsansatz basiert auf der Deletion der konservierten-E1A Region 2 (CR2),

welche für die Bindung von pRB verantwortlich ist 71. Das ∆24 E1A-CR2 mutierte Virus ist

fähig, in Zellen effizient zu replizieren, die pRB defizient sind, währenddessen in pRB-

intakten Zellen die Replikation inhibiert ist. Dies konnte in vitro und in vivo gezeigt

werden 72. Eine weitere E1A-CR2 Mutante dl922/947 verstärkt den antitumoralen Effekt

wenn man diesen Vektor mit dem dl1520 Vektor vergleicht. dl922/947 inhibierte den S-

Phasen Eintritt und die virale Replikation in postmitotischen Zellen 73. Um die

Tumorselektivität zu erhöhen setzten Johnson et al. die E4-Region in ihrem Vektor unter die

Kontrolle des E2F-Promotors 74.

Ein dritter Ansatz zur adenoviralen Gentherapie basiert auf der Modifikation des Fiber-

Proteins, welcher kritisch für den ersten Schritt der Virus-Absorption ist, um das Virus von

einem natürlichen Tropismus zu einem Rezeptor, der auf Tumoren überexprimiert ist, zu

lenken 75-78.

Obwohl Viren als onkolytische Agenzien seit ca. 100 Jahren untersucht und verwendet

werden, gibt es nur wenige klinische Versuche und Konzepte zur Tumor-spezifischen

Onkolyse und Replikation. Ergebnisse von klinischen Phase II Studien mit onkolytischen

Adenoviren zeigten ein enttäuschendes Ergebnis, wenn sie als einzelnes Agens zum Einsatz

kamen. Ein viel versprechendes Ergebnis zeigten sie, wenn sie mit Chemotherapien

kombiniert wurden.

Während genetisch veränderte Viren zur Verwendung bei der Tumortherapie entwickelt

wurden, bleiben einige native, unveränderte Viren Kandidaten als onkolytische Agenzien. In

Frage steht weiterhin die Regulation der Replikation. Des Weiteren sind noch viele

Signaltransduktionswege, welche in der Zelle stattfinden und durch virale Proteine verändert

werden, unbekannt. In der weiteren Entwicklung von onkolytischen Vektoren sollten Tumor-

spezifische Infektion und/oder Replikation, die Ausbreitung im Tumor, die Effizienz als

einziges Agens, und Interaktion mit dem Immunsystem berücksichtigt werden. Des Weiteren

muss untersucht werden, in welchen Kombinationen das Virus, Gentherapie, Chirurgie,

Strahlentherapie und/oder Chemotherapie die Überlebensrate und die Lebensqualität bei

verschiedenen malignen Tumorerkrankungen erhöhen.

Obwohl erste Studien vermuten lassen, dass die intratumorale Injektion von replikations-

kompetenten onkolytischen Viren sicher ist, müssen Vektoren entwickelt werden, die die

Effizienz von Tumorlyse, Replikation und Infektion in Tumoren erhöhen. Für den Fall, dass

1. Einleitung

6

eine nicht gewollte lokale oder systemische Infektion sich ausbreitet, sollten onkolytische

Viren die zum klinischen Einsatz gelangen ein fail-save System, wie HSV-tk/GCV besitzen.

1.3 Adenoviren

1.3.1 Taxonomie, Morphologie und Genom

Adenoviren (AdV) gehören zur Familie der Adenoviridae, die in zwei Genera,

Mastadenoviridae (Adenoviren der Säugetiere) und Aviadenoviridae (Adenoviren der Vögel),

unterteilt ist. Die Mastadenoviren beinhalten zahlreiche Subgenera, die neben den humanen

AdV auch Tierpathogene Viren, wie z. B. Rinder-, Hunde- und Vogeladenovirus umfassen.

Die humanen AdV sind auf Grund ihrer Fähigkeit zur Agglutination roter Blutkörperchen in 6

Subgruppen (A bis F) unterteilt, denen 51 Serotypen 41 zugeteilt werden 79-82.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das humane Adenovirus Typ 5 eingesetzt. Dieses ist

endemisch verbreitet und verursacht vor allem Infektionen des Respirationstraktes. Die

Übertragung erfolgt gewöhnlich über Aerosole oder kontaminierte Flüssigkeiten. Etwa 50 %

der Infektionen verlaufen symptomatisch, nach einer Inkubationszeit von sechs Tagen treten

die ersten Anzeichen auf. Die Erkrankung verläuft in der Regel mild, wobei die Pathologie

aus Entzündung und Schädigung epithelialer Zellen besteht.

AdV sind unbehüllte, ikosaedrische Partikel, die einen Durchmesser von 80 – 100 nm

aufweisen 83. Sie beinhalten eine lineare doppelsträngige DNA von ca. 36 kb, die zusammen

mit vier Strukturproteinen (Protein V, VII, µ und TP) das Core bildet 84. Sieben weitere

Strukturproteine bilden das Kapsid, welches aus 252 Untereinheiten zusammengesetzt ist,

nämlich aus 240 Hexonen und 12 Pentonen, welche die Ecken des Ikosaeders bilden. Für die

Fiberproteine, welche antennenartig in die Peripherie reichen, sind die Pentone die

Ankerproteine 85. Die distale C-terminale Domäne des Fiberproteins wird als „Knob“

bezeichnet und interagiert mit dem Coxsacki und Adenovirus-Rezeptor (CAR) der Zielzelle.

1. Einleitung

7

Abb. 1: Schematischer Aufbau des humanen Adenovirus Typ 5 Das Viruscapsid besteht aus Hexon- und Pentonbasisproteinen, deren Interaktionen durch die Strukturproteine IIIa, VI, VIII und IX unterstützt werden. Das lineare DNA-Genom ist mit dem terminalen Protein kovalent verbunden und interagiert mit dem Core-Protein VII. Die Interaktion zwischen Genom und Capsid-Proteinen wird durch das Core-Protein V vermittelt. Verändert Nach 86.

Das etwa 36 kb große Genom der AdV enthält überlappende transkriptionale Einheiten auf

beiden DNA-Strängen, die über 50 Polypeptide kodieren 41. Die Gene werden eingeteilt in die

fünf frühen Transkriptionseinheiten (E1A, E1B, E2, E3, E4), die beiden verzögerten

Transkriptionseinheiten (IX, IVa) und in die späte Transkriptionseinheit (L, major late).

Letztere generiert fünf mRNAs und ist verantwortlich für die Synthese der viralen

Strukturproteine (Kapsidbildung) 41. An beiden Enden des viralen Genoms befinden sich

wiederholende Sequenzen, die Inverted Terminal Repeats (ITR) genannt werden und eine

Rolle in der Anfangsphase der Replikation spielen 41. Bei der Transkription werden beide

DNA-Stränge abgelesen, wobei E1A, E1B, IX, E3 und die Major Late Region in sense-, E4,

E2 und IVa dagegen in antisense-Richtung abgelesen werden 87.

1. Einleitung

8

Abb. 2: Genomorganisation und Regulation des Adenovirus Die Genomgröße des humanen Adenovirus Typ 5 beträgt 35.938 bp; an den Enden des Genoms befinden sich invertierte Sequenzwiederholungen (ITR) von 103 bp Länge. Die Gene der E1-Gruppe befinden sich am 5’ Ende des Genoms und umfassen etwa 4.000 bp, die zwei aktiven Transkriptionseinheiten kodieren für die sofort transkribierten E1A- und verzögert transkribierten E1B-, IVa und IX-Proteine. E1A transaktiviert die Expression der anderen frühen Gene. Der für die E2-Proteine kodierende Bereich erstreckt sich über 20.000 bp in der zentralen Region des Genoms und ist in zwei Bereiche, E2A und E2B, unterteilt. E2 ist verantwortlich für die virale Replikation. Die E3-Genregion befindet sich im 3’ Bereich des Genoms, hat eine Größe von etwa 4.000 bp und schützt den Virus vor der Wirtsimmunantwort. Die E4-Region liegt am 3’ Ende des Genoms, umfasst 3.500 bp. Ihre Produkte regulieren die E2-Expression und bilden mit E1B einen regulatorischen Komplex der die L1 – 5 RNA-Translation beschleunigt. Die spät exprimierten Gene liegen in der L-Genregion, diese überspannt etwa 80% des Genoms und ist somit beinahe 30.000 bp lang. Nach 88.

1.3.2 Replikationszyklus

Das Virion wird nach Bindung des C-terminalen Endes des Fiberproteins (Knob) an den

Coxsacki und Adenovirus-Rezeptor (CAR) durch Endozytose in die Zielzelle aufgenommen,

welche durch die Interaktion des Pentonbasisproteins (RGD-Motiv) mit den αvβ5-/αvβ3-

Integrinen vermittelt wird 89. Die Endosomenmembran wird durch eine weitere Interaktion

der αvβ5-Integrine mit anderen Zellfaktoren und dem Pentonbasisprotein aktiviert 90, die

freien Viruspartikel gelangen durch Assoziation mit den Mikrotubuli der Wirtszelle zum

Zellkern 91. Die viruskodierte Protease zerstört während des Transports zu den nukleären

Poren 92,93 das Kapsid durch Proteolyse des Proteins VI. Dieses stellt die Verbindung

1. Einleitung

9

zwischen Kapsid und den Core-Komponenten dar. Die Replikation wird durch die Bindung

des nun freien, an die virale DNA gekoppelten Terminalproteins an die Kernmatrix initiiert 94.

Der Replikationszyklus beginnt mit der sofortigen Transkription des E1A-Gens 41. Die E1A-

Proteine binden an verschiedene zelluläre Transkriptionsfaktoren und Regulatorproteine,

wodurch sie die Transkription der weiteren frühen Gene der viralen DNA induzieren und das

zelluläre Umfeld für die Virusreplikation verbessert 95.

Das E2-Gen kodiert für das prä-terminale Protein und die DNA-Polymerase, die beide unter

Komplexbildung an die ITRs des viralen Chromosoms binden 96, sowie für das Einzelstrang-

DNA-Binde-Protein, welches zusammen mit der Polymerase und dem zellulären Protein NFII

die Elongation des Transkripts ermöglicht. Das prä-terminale Protein dient als Primer für die

DNA-Replikation 97. In der ersten Phase der Replikation dient nur einer der beiden DNA-

Stränge als Template für die Synthese, so dass das Ergebnis der Replikation ein Duplex aus

der originalen Matrix und einem Tochterstrang sowie ein separater Einzelstrang ist. Der

Einzelstrang bildet hierauf eine Kreisform, in der die komplementären ITRs sich einander

annähern („Pfannenstiel“) und somit die gleiche Struktur bilden wie die Termini der viralen

Duplexform. Diese Struktur kann nun wie in der ersten Replikationsphase durch die

Initiationsmaschinerie der DNA-Synthese erkannt werden, und das zweite Duplex, bestehend

aus originaler Matrix und einem Tochterstrang wird generiert 41.

Die E3-Transkriptionseinheit kodiert immunsuppressive Funktionen, die auf zwei

Mechanismen basieren. Das E3-19 kDa-Protein reguliert die Transkription des Major-

Histokompatibilitäts-Komplex Klasse I (MHC-1) herab, verhindert so die Antigenpräsentation

auf der Zelloberfläche und somit die Differenzierung zytotoxischer T-Lymphozyten gegen die

viralen Antigene 98. Das E3-14.7 kDa- und das RIDα/β-Protein unterbinden die Apoptose

infizierter Zellen, was durch Fas/Fas-Liganden und/oder den Tumornekrose-Faktor α (TNFα)

vermittelt wird 99,100. Ein weiteres wesentliches Produkt der E3-Region ist das Adenovirus

Death Protein (ADP; 11.6 kDa-Protein), das die späte Zytolyse der infizierten Zelle fördert

und damit die Effizienz der Freigabe der neu entstandenen Viruspartikel erhöht 101.

Die E4-Region ist in sechs offene Leserahmen aufgeteilt (open reading frames (orf) 1–4; 6;

6/7) und spielt durch Förderung der selektiven Expression viraler Gene, sowie durch

Herunterregulierung zellulärer Gene eine wichtige Rolle im viralen Zyklus 102. So verhindern

zum Beispiel die Proteine E4orf3 und E4orf6 den Transport der zellulären Transkripte vom

Zellkern ins Zytoplasma und unterstützen den Transport der späten viralen Transkripte, indem

sie die Stelle des zellulären Transportfaktors einnehmen 103. Gleichzeitig aber konnte auch

nachgewiesen werden, dass E4orf4 den E1A-regulierten Mechanismen zum Teil

1. Einleitung

10

entgegenwirkt und somit eine negative Rückkopplung darstellt. Dabei hemmt E4orf4 die

E1A-Aktivierung des E2F-Promotors 104. E4orf6 nimmt zusätzlich direkten Einfluss auf

das

Abb. 3: Replikationszyklus eines Adenovirus Nach dem Eintritt des Virusq wird dessen Hülle abgebautw und das Genom in den Nucleus transportierte. Dann folgt der Beginn der Transkription der frühen E1A Gener-yund die Stimulation zum Übergang in die S-Phase, sowie die Transaktivierung der anderen frühen viralen Gene, der viralen Polymerase und der viralen Proteaseu-o. Danach kommt es zur Duplizierung des viralen Genoms. In der späten Phase der Infektion kommt es zur Translation der Strukturproteine g-jund zum Zusammenbau des Proviron k. Nachdem das Provirion durch die Protease prozessiert wird l, wird es durch Zell-Lyse freigelassen . Nach 105

1. Einleitung

11

zelluläre p53-Protein, indem es dieses mittels einer Zinkfinger-Bindungsdomäne aus dem

Komplex mit E1B-55kDa löst und es nachfolgend destabilisiert 106. E4orf3 relokalisiert das

E1B-55kDa-Protein vom Zytoplasma in den Zellkern und unterbindet somit die Inaktivierung

des p53 durch E1B-55kDa. Hierbei wird in Anwesenheit von E4orf6 die Freisetzung des p53

durch E4orf3 außer Kraft gesetzt 107.

Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass p53 mit dem E1A-regulierten

Transkriptionsfaktor p120-E4F interferiert und dadurch die Aktivität des E4-Promotors

hemmt 108.

Die Expression der späten mRNAs, die aus komplexen Spleißvorgängen resultieren und in

fünf Familien (L1 – L5) eingeteilt werden, wird durch den Major-Late-Promotor (MLP)

kontrolliert. Es entstehen hieraus die viralen Strukturkomponenten, und es folgt die Formation

des zunächst leeren Kapsids 109. Der Eintritt eines viralen DNA-Moleküls wird durch die

Verpackungssequenz, ein AT-reiches DNA-Element, das ca. 260 Basenpaare vom 5’ ITRs

des Genoms entfernt liegt, vermittelt 110. Die reifen Viruspartikel reichern sich 20 bis 24

Stunden nach der Infektion (post infectionem; p.i.) im Zellkern an 41. Zur Aktivierung des

MLP werden mindestens zwei Komponenten benötigt. Nach dem Beginn des

Replikationszyklus kommt es zum einem zur E4orf1 vermittelten Transformation des viralen

Chromatin-Komplexes, welches die Bindung des zellulären Transkriptionsfaktors USF

(MLTF) an den MLP ermöglicht 111. Zum anderen wird die Aktivierung durch die

Transkriptionsfaktoren IVa2 und IX, die durch die verzögerte frühe Transkriptionseinheit

kodiert werden, erreicht 112,113. IV2a bindet hierbei zusätzlich zu USF an alternative

Bindungsdomänen stromabwärts der Major-Late-Startdomäne 114,115, IX steuert zur

Aktivierung des MLP über das TATA-Motiv bei. Diese Vorgänge werden von

Veränderungen der nukleären Infrastruktur und einer Permeabilitätserhöhung der

Kernmembran begleitet 116,117. Der Austritt der Viren in das Zytoplasma wird nach Zerstörung

der Intermediärfiliamente und Disintegration der Zellmembran, gefolgt von der Freilassung

der Viren in den Interzellularraum 2 bis 4 Tage p.i., ermöglicht.

2. Zielsetzung

12

2. Zielsetzung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein bedingt replikations-kompetentes Adenovirus

zur Behandlung von Kolon- und Pankreaskarzinomen zu konstruieren. Dieses Ziel wurde mit

der transkriptionellen Kontrolle der frühen Gene des Adenovirus verfolgt. Dazu sollten zwei

heterologe Promotoren die Regulation der zur Replikation wichtigen adenoviralen Gene E1

und E4 kontrollieren. Bisher wurde versucht, die transkriptionelle Kontrolle durch einen

heterologen Promotor vor der E1 Region zu erreichen, jedoch war die Replikationsspezifität

des Virus nicht sehr hoch, das heißt, dass das Virus auch in nicht tumorartigem Gewebe

repliziert. Daher sollten zunächst einige Promotoren gefunden werden, die bevorzugt in den

beiden Karzinomen aktiv sind und in gesunden Geweben keine Aktivität aufweisen. Als

nächstes war das Ziel, dass die Promotoren im adenoviralen Kontext nicht transaktiviert

werden. Für den potentiellen E1-Promotor kam noch eine Besonderheit hinzu. Im 5’ITR und

im Verpackungssignal, die sich in unmittelbarer Nähe zum nativen E1-Promotor befinden und

für das Virus essentiell sind, befindet sich eine alternative Transkriptionsstart-Stelle, die den

E1-Promotor oder den heterologen Promotor beeinflusst. Dazu muss ein Lösungsweg

gefunden werden wie diese alternative Start-Stelle von der Promotoraktivität entkoppelt

werden kann.

Ein anderes Problem stellt die Verpackung von übergroßen Genomen im Adenovirus dar. Die

Replikationseffizienz sinkt sobald die Genomlänge über 103% der Wildtyp-Genomlänge

liegt. Liegt die Genomlänge über 106%, wird das Genom nicht verpackt. Um genügend Platz

für die heterologen Promotoren und das therapeutische Gen zu schaffen, sollte mittels

Transkomplementierung untersucht werden, welche open reading frames der E4-Region für

eine effiziente Replikation entbehrlich sind. Des Weiteren wurde die E3-Region, die das

Adenovirus vor der zellulären Immunantwort schützt, deletiert.

Als Grundlage für das onkolytische Adenovirus musste ein Klonierungsvektor konstruiert

werden, der die Möglichkeit bietet, die E4-Region und die E1-Region zu manipulieren. Dazu

sollte zum einem ein adenoviraler backbone, dem pAdEasy1-Plasmid ähnlich, geschaffen

werden, in dem die E4-Region von zwei Homing-Endonukleasen flankiert wird. Die

veränderte E1-Region sollte dann mittels homologer Rekombination in das Gesamtgenom

rekombiniert werden.

Als Abschluss der vorliegenden Arbeit sollte die tumorspezifische virale Replikation in vitro

gezeigt werden. Dazu wurden verschiedene Karzinom-Zelllinien und primäre Zellen mit den

bedingt replikations-kompetenten Vektoren infiziert und die viral-vermittelte Lyse analysiert.

3. Material und Methoden

13


3.1 Material

3.1.1 Chemikalien

Agar AppliChem

Agarose SeaKem®, Cambrex

Carbencillin AppliChem

Bromphenolblau (0,1%) Fluka

Butanol J. T. Baker

Cäsiumchlorid Fluka, AppliChem

DEPC AppliChem

DMEM Gibco

dNTP-Mix Pharmacia

EDTA Merck

Eisessig J. T. Baker

Ethanol Riedel-de Haёn

Ethidiumbromid-Lösung (1%) AppliChem

FCS Gibco

Formamid, deionisiert Sigma

Formaldehyd J. T. Baker

Geneticindisulfat (G418) AppliChem

Gentamycinsulfat AppliChem

Glycerol J. T. Baker

Glucose J.T Baker

Hefeextrakt AppliChem

HEPES Biomol

Isopropanol Merck

Kaliumacetat J. T. Baker

Kaliumchlorid J. T. Baker

Kaliumdihydrogenphosphat Riedel-de Haën

Kanamycinsulfat AppliChem

Magnesiumchlorid J. T. Baker

Maleinsäure J. T. Baker


14

MOPS Biomol

NaOH J. T. Baker

Natriumacetat J. T. Baker

Natriumchlorid J. T. Baker

Natriumcitrat J. T. Baker

Natriumdihydrogenphosphat Merck

Natriumdodecylsulfat (SDS) AppliChem

Pepton AppliChem

Phenol AppliChem

Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) AppliChem

RNase A AppliChem

Streptomycinsulfat AppliChem

Tetracyclinhydrochlorid AppliChem

Tris AppliChem

Trypton AppliChem

Tween AppliChem

Wasser BBraun

Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien wurden von den Firmen Riedel-de-Haën und Sigma

bezogen.

3.1.2 Enzyme

CIAP MBI Fermentas

Klenow Gibco

T4 DNA Ligase NEB

Taq-Polymerase Amersham Pharmacia Biotech Inc.

Restriktionsendonukleasen NEB, MBI Fermentas


15

3.1.3 Verbrauchsmaterialien

Centricons Microcon

Cellulose-Säulen Invitrogen

Filter Papier 288 Sartorius

Hybridisierungsröhrchen Schott

Nitrocellulose Schleicher & Schuell

Whatman-Papier Schleicher & Schuell

QIAshredder Qiagen

Zellkulturflaschen (25 cm2, 75 cm2, 175 cm2) Nunc

96-Loch-Platte Nunc

Sterilfilter Roth, Sarstedt

Plastikwaren (Pipettenspitzen, PE-Röhrchen,

Petrischalen, Reaktionsgefäße etc.) Brand, Greiner, Nunc, Sarstedt,

STARLAB

3.1.4 Kits

Jetsorb Gel Extraction Kit Genomed

CombizymeTM (DNA-Polymerase-Mix) Invitek

NucleoSpin Macherey-Nagel

pCR2.1-TA-kloning Kit Invitrogen

pGem-T-Easy Clonig Kit Promega


16

3.1.5 Plasmide

Abb. 4: Plasmidkarten der vorhandenen Plasmide (A) pCR2.1-TOPO (Invitrogen); (B) pCR3.1 (Invitrogen); (C) pBR322 (Promega); (D) pGL3basic (Promega); (E) pRL-CMV (Promega); (F) pGL3Control (Promega); (G) pGCsamEN (Promega); (H) pShuttle (Qbiogene); (I) pShuttle-CMV (Qbiogene); (J) pAdEasy-1 (Qbiogene); (K) pAdEasy-2 (Qbiogene)


17

3.1.6 Lösungen, Puffer und Medien

Alle angegebenen Puffer, Lösungen und Medien wurden, soweit nicht anders angegeben, in

Wasser angesetzt.

Zum Ansetzen von Lösungen wurde ausschließlich demineralisiertes Wasser aus der

Reinstwasseranlage Pro 90 CN der Firma Seralpur verwendet. Bei den Medien für die

Zellkultur wurde Reinstwasser von BBraun verwendet.

3.1.6.1 Medien für Bakterienkultur

LB-Medium 1 % (w/v) Trypton

0,5 % (w/v) Hefeextrakt

1 % (w/v) NaCl

in H2O, pH 7,0

LB-Festagar LB-Medium mit 2% (w/v) Agar

TB-Medium 17 mM KH2PO4

72 mM K2HPO4

1.2 % (w/v) Trypton

2.4 % (w/v) Hefeextrakt

0.4 % (w/v) Glycerol

in H2O, pH 7,2

Dem Nährmedium wurde nach dem Autoklavieren ein Antibiotikum zur Selektion zugesetzt

(Endkonzentration des Carbencillins: 100 µg/ml, Endkonzentration des Kanamycins:

50 µg/ml, Endkonzentration des Streptomycins: 30 µg/ml).

SOC-Medium 20 g/l Pepton

5 g/l Hefe-Extrakt

8,6 mM NaCl

2,5 mM KCl

10 mM MgCl2

20 mM Glucose


18

X-Gal-Lösung 20 % (w/v) 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-

galactopyranosid in N,N-Dimethylformamid

3.1.6.2 Medien und Puffer für die Zellkultur

Kultur-Medium DMEM (Gibco)

10 % FCS (Invitrogen)

0,01 % Gentamycin (AppliChem)

PBS 10x (Gibco) 1,37 M NaCl

0,027 M KCl

0,043 M Na2HPO4 x 7H2O

0,014 M KH2PO4

in H2O, pH 7,4

Trypsin/EDTA 10x (Biochrom KG) 0,05 % (w/v) Trypsin

0,02 % (w/v) EDTA

in PBS

HBS (2x) 1,4 M NaCl

250 mM HEPES

10 mM Na2HPO4

in H2O, pH 7,12; steril filtriert

G418-Lösung 10 mg/ml

in DMEM

3.1.6.3 Puffer und Lösungen für molekularbiologische Arbeiten mit DNA

TE-Puffer 100x (AppliChem) 1 M EDTA x Na2

1 M Tris

pH 8,0


19

TAE-Puffer 50x (AppliChem) 0,05 M EDTA x Na2 x H2O

1 M Eisessig

2 M Tris

pH 8,5

DNA-Ladepuffer (6x) 0,25 % (w/v) Bromphenolblau

0,25 % (w/v) Xylencyanol FF

30 % (v/v) Glyzerin

autoklavieren

P1 50 mM Tris-Cl, pH 8,0

10 mM EDTA

100 µg/ml RNase A

in bidest. Wasser

P2 200 mM NaOH

1 % (w/v) SDS

in bidest. Wasser

P3 3,0 M Kaliumacetat

in bidest. Wasser

pH 5,5

3.1.7 Geräte

Analysewaage SCALTEC SPB64

Präzisionswaage SCALTEC SBH31

BioPhotometer Eppendorf

Brutschrank HS12 Heraeus Instruments

Dampfsterilisatoren H+P Labortechnik GmbH

Elektrophoresesystem PEQLAB Biotechnologie GmBH

Elektorporator Gene Pulser Excell BioRad

FACS Calibur Becton Dickinson

Geldokumentationskammer Biozym

Labor-pH-Meter Greisinger electronic


20

Lichtmikroskop CK40 Olympus

Luminometer Hamamatsu Photonics

pH-Meter GHPR 1400A Greisinger electronic

Pipetten Finnpipette

Pipettierhilfe, Repeater Plus Hirschmann Laborgeräte, Eppendorf

Peltier Thermal Cycler PTC 200 MJ Research

Rotoren:

Festwinkelrotor NVT100 Beckman Coulter

SW 28, SW 41 Beckman Coulter

Festwinkelrotor 12,500 Sigma

Rührer IKAMAG RCT

Schüttelapparat Certomat SII B. Braun Biotech International

Schüttelwasserbad 1086 GFL

Thermomixer compact Eppendorf

Tiefkühlschrank -86C ULT Freezer Thermo Forma

Ultraschallbad MERCK eurolab

Vortexer K-550-GE BENDER & HOBEIN AG

Wasseraufbereitungssystem Pro 90 CN Seralpur

Wasserbad E100 LAUDA

Zentrifugen:

Mikrofuge 18 Zentrifuge Beckman Coulter

6-15K Laboratory Zentrifuge Sigma

Optima L-70K Ultrazentrifuge Beckman Coulter

Zentrifuge 5810 Eppendorf

3.1.8 Bakterien und Zelllinien

3.1.8.1 Verwendete Bakterienstämme

DH5α (Invitrogen) F- Φ80lacZ∆M15 ∆( lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-,

mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-

DH10B (Invitrogen) F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZ∆M15 ∆lacX74 endA1

recA1 deoR ∆(ara, leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL


21

SCS110 (Stratagene) rpsL (StrR) thr leu endA thi-1 lacY galK galT ara tonA tsx dam dcm

supE44 ∆(lac-proAB) [F' tra∆36 proAB lacIqZDM15]

Stabl2 (Gibco BRL) F- mcrA ∆(mcrBC-hsdRMS-mrr) recA1 endA1 lon gyrA96 thi-1 supE44

relA1- λ- (lac-proAB)

BJ5183 (Stratagene) endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR)

3.1.8.2 Eukaryotische Zelllinien

A375 ATCC# CRL-1619

A549 ATCC# CCL-185

BxPc3 ATCC# CRL-1687

cFPac3 ATCC# CRL-715

DLD-1 ATCC# CCL-221

D54 Dr. Derek Bigner (Duke University, Durham, IL)

HaCaT ATCC# CCL-169

HCT-116 ATCC# CCL-247

HEK-293 Microbix

HeLa ATCC# CCL-2

HT-29 ATCC# HTB-38

JB6 Dr. Kerstin Reimers (MHH, Hannover)

K-1-17 Dr. Kerstin Reimers (MHH, Hannover)

MiaPaca ATCC# CRL-1420

PancTH1 ATCC# CRL-193

Panc1 ATCC# CRL-1469

Sk-Mel2 DSMZ# ACC-303

SNB-19 DSMZ# ACC-325

SW480 ATCC# CCL-228

U373 ATCC# HTB-17

293T ATCC# CRL-11268

888 ATCC# CRL-307

911E4 Crucell Holland B.V.

HEK-293vil∆BH von Bettina Tippler zur Verfügung gestellt


22

3.2 Allgemeine Molekularbiologische Methoden

Die molekularbiologischen Methoden wurden, soweit nicht anders gekennzeichnet, nach 118

durchgeführt.

3.2.1 Gelelektrophorese von DNA

Die DNA-Fragmente wurden mittels Agarosegelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt.

Die verwendeten 1%igen Gele wurden durch Aufkochen der Agarose in TAE-Puffer, Zusatz

von 0,01% Ethidiumbromid-Lösung und Erstarren in der Elektrophoresekammer hergestellt.

Die DNA-Proben wurden mit etwa 1/6 Ladepuffer versetzt und in die Taschen des mit TAE-

Puffer überschichteten Gels geladen.

Als Größenstandard wurden die Marker 1 kb DNA Ladder bzw. 1 kb Plus DNA Ladder von

Invitrogen verwendet, hiervon wurden in kleine 5 µl und in größere Taschen 10 µl

aufgetragen.

3.2.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Für die Isolierung von DNA-Fragmenten (< 8 kb) aus Agarosegelen wurde das NucleoSpin

Kit nach Herstellerangaben verwendet. Bei größeren Fragmenten wurde das Jetsorb Gel

Extraction Kit (Genomed) nach Herstellerangaben verwendet.

3.2.3 Restriktion von DNA

Die verwendeten Typ II-Restriktionsendonukleasen prokaryotischer Herkunft spalten

spezifische DNA-Sequenzen hydrolytisch, wobei entweder glatte (blunt-end) oder

überhängende (sticky-end) Enden entstehen. Je nach Restriktionsenzym werden verschiedene

Pufferbedingungen und optimale Temperaturen (üblicherweise 37 °C) benötigt, die der

Hersteller im Beipackzettel angibt. Folgende Reaktionsansätze wurden standardmäßig

verwendet:

-analytischer Verdau (20 µl): 1-3 µl Plasmid-DNA (0,1-1 µg DNA)

2 µl Reaktionspuffer

1 µl Restriktionsenzym

mit bidest. Wasser auf 20 µl Gesamtvolumen auffüllen


23

-präparativer Verdau (50 µl): 5-10 µl Plasmid-DNA (1-5 µg DNA)

5 µl Reaktionspuffer

2 µl Restriktionsenzym

mit bidest. Wasser auf 50 µl Gesamtvolumen auffüllen

Der Ansatz wurde für 1 bis 3 h oder auch über Nacht bei 37 °C inkubiert. Anschließend

wurde die Vollständigkeit des Verdaues durch elektrophoretische Auftrennung in einem

Agarosegel kontrolliert.

3.2.4 Auffüllen von 5'-überhängenden DNA-Enden durch Klenow-Behandlung

Für das Auffüllen von 5'-überhängenden DNA-Enden wurde das Enzym DNA-Polymerase I

Large Fragment (Klenow) verwendet. Zum Restriktionsansatz wurde 1 µl einer 10 mM

dNTP-Lösung und 2 µl Klenow gegeben. Dann wurde er für 1½ h bei Raumtemperatur

inkubiert.

3.2.5 Dephosphorylierung von Vektor-DNA mit Calf Intestinal Phosphatase

Die Calf Intestinal Phosphatase (CIAP) katalysiert die Entfernung der 5’-Phosphatgruppe von

DNA, RNA, sowie Ribo- und Desoxyribonucleosidtriphosphaten, wodurch eine Religation

von Vektor-DNA nach erfolgreichem Restriktionsverdau verhindert wird.

Direkt im Anschluß an den Restriktionsverdau wurden 10-20 µl bidest. Wasser, 5 µl CIAP-

Puffer und 1 µl CIAP (10 U) hinzugefügt und für ½ h bei 37°C inkubiert.

Danach wurde die Reaktion durch eine Inkubation für 10 min bei 75 °C gestoppt.

3.2.6 Ligation von DNA-Fragmenten

Die ATP-abhängige T4-DNA-Ligase ist in der Lage, freie 3’-Hydroxylenden mit 5’-

Phosphatenden von doppelsträngiger DNA zu verknüpfen, indem sie die Bildung einer

Phosphodiesterbindung katalysiert. T4-DNA-Ligase kann sowohl kohäsive (sticky-end)

Enden als auch glatte (blunt-end) Enden miteinander ligieren.

Der Klonierungsvektor und das Insert wurden vor der Ligation mit den entsprechenden

Enzymen geschnitten und gereinigt. Der Vektor wurde, wenn nur mit einem

Restriktionsenzym geschnitten wurde, vor der Reinigung dephosphoryliert .


24

-20 µl Ansatz: 4 µl 5x Ligationspuffer

2 µl T4-Ligase (2 U/µl)

5 µl Insert DNA

2 µl Vektor DNA

7 µl bidest. Wasser

-20 µl Kontrollansatz: 4 µl 5xLigationspuffer

2 µl T4-Ligase (2 U/µl)

2 µl Vektor DNA

12 µl bidest. Wasser

Die Reaktion erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 16°C.

3.2.7 Transformation von Bakterien

3.2.7.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien

Bakterien einer Übernachtkultur wurden in 2 l SOB verdünnt und bei 30 °C inkubiert bis eine

OD600 von 0,5 +/- 0,2 erreicht war. Die Bakterien wurden 1 h auf Eis geschüttelt und dann bei

3.200 g und 4 °C für 12 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1/3 des ursprünglichen

Kulturvolumens FSB resuspendiert und nach 15 min Inkubation auf Eis erneut bei 3.200 g

und 4 °C für 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1/12,5 des ursprünglichen Volumens

FSB resuspendiert und mit 3,5% des aktuellen Volumens DMSO versetzt. Nach vorsichtigem

Schwenken wurde 5 min auf Eis, nach Zusatz weiterer 3,5% DMSO für weitere 10 min

inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Bakterien aliquotiert, in flüssigem

Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.

3.2.7.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterien

50 µl der Bakteriensuspension wurden in einem 13 ml-Röhrchen auf Eis vorgelegt und mit

der zu transformierenden DNA versetzt. Von den oben angegebenen Ligationsansätzen

wurden hierbei 3 µl verwendet, die DNA-Menge musste unter 1 µg liegen. Nach Inkubation

auf Eis für 30 min erfolgte ein Hitzeschock für 30 sec bei 42,2 °C, es wurden 500 µl SOC

zugegeben, bei 37 °C für 1 h inkubiert und schließlich 250 µl auf Selektionsmedium

ausplattiert.


25

3.2.7.3 Herstellung elektrokompetenter Bakterien

Eine frische Kolonie oder ein gefrorener Stock der Bakterien wurde über Nacht in einer 3-

5 ml großen Kultur angezogen, diese Übernachtkultur wurde verwendet, um eine 300 ml-

Kultur anzuimpfen. Es wurde bis zu einer OD600 von ~0,8 bei 32 °C oder 37 °C geschüttelt.

Die Zellen wurden in einem Zentrifugationsbecher gesammelt und 10 bis 60 min auf Eis

inkubiert. Die Zellen wurden bei 2.600 g und 4 °C für 10 min pelletiert, dann mit demselben

Volumen eiskaltem Wasser (+ 15% Glycerol) gewaschen und für 30 min pelletiert. Nach

Wiederholen des Waschschrittes wurden die Zellen in 20 ml Restvolumen resuspendiert, in

ein 50 ml-Gefäß überführt und nach erneutem 10-minütigen Pelletieren in 5 ml Restvolumen

resuspendiert. Nach Aliquotieren wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren und

bei -80 °C gelagert.

3.2.7.4 Transformation elektrokompetenter Bakterien

In einer 2 mm-Küvette wurden 20 µl Bakterien auf Eis vorgelegt und zwischen 0,1 und 1,0 µg

DNA hinzu pipettiert. Die Elektroporation erfolgte bei einer Spannung von 2,5 kV. Nach

Zusatz von 200 µl SOC-Medium wurden die Bakterien auf LB-Platten ausplattiert. Bei einer

Retransformation wurden 50 µl auf einer kleinen Platte (92 mm Durchmesser) ausgestrichen.

Bei einer Transformation vortransformierter Bakterien zur Rekombination der Plasmide

wurde der gesamte Ansatz auf einer großen Platte (150 mm Durchmesser) ausgestrichen.

3.2.8 DNA-Präparation in kleinem Maßstab (Minipräp)

Unter den mit den rekombinanten Plasmiden transformierten Bakterien mussten die Klone

identifiziert werden, die das gewünschte Plasmid korrekt amplifizierten. Hierfür wurden 4 -

48 willkürlich ausgewählte Bakterienkolonien, je nach Transformationseffizienz und dem

Verhältnis der Kolonien auf der Kontroll- und der Ligationsplatte, mit sterilen Pipettenspitzen

gestochen und in etwa 5 ml LB-Medium mit Selektionsantibiotikum in 15 ml verschließbare

15 ml-Plastikreagenzgefäße überführt. Die Minikulturen wurden über Nacht im 37°C-

Schüttler inkubiert.

Je 2 ml der Minikulturen wurden in Eppendorf-Reaktionsgefäßen 1 min lang in einer

Tischzentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 150 µl kaltem

P1 resuspendiert und mit 150 µl P2 6-mal invertiert. Anschließend wurde 5 min bei

Raumtemperatur inkubiert und nach Zugabe von 300 µl P3 6-mal invertiert und 10 min bei

Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf-


26

Reaktionsgefäß überführt und mit 900 µl kaltem absoluten Ethanol versetzt. Nach 15 min

Zentrifugation bei Höchstgeschwindigkeit wurde der Überstand verworfen und das Pellet

10 min im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in 50 µl bidest. Wasser gelöst.

3.2.9 DNA-Präparation in großem Maßstab (Maxipräp)

300 ml Medium wurden mit einer Kolonie oder 200 µl einer Übernachtkultur angeimpft und

über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden bei 5.000 g und 4 °C für 10 min pelletiert

und anschließend in 10 ml P1 resuspendiert. Nach Zusatz von 10 ml P2 und sechsmaligem

Invertieren wurde für 10 min bei RT inkubiert. Es wurden 10 ml P3 zugesetzt, erneut 6x

invertiert und durch einen Faltenfilter filtriert. Dem Filtrat wurden 0,7 Volumen Isopropanol

zugesetzt und dann für 30 min bei 4 °C bei 12.500 g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde

in 4 ml P1 resuspendiert, mit 4,6 g CsCl und 40 µl Ethidiumbromidlösung versetzt und in ein

Ultrazentrifugationsröhrchen überführt. Die Zentrifugation erfolgt bei 20 °C entweder bei

70.000 g für 4,5 h, bei 90.000 g für 2,5 h oder bei 50.000 g über Nacht. Die erhaltenen

Banden wurden abgesaugt, das Volumen auf etwa 4 ml erweitert und mit TE-gesättigtem 2-

Butanol zweimal ausgeschüttelt. Das Volumen wurde anschließend auf 5 ml eingestellt, mit

0,7 Volumen Isopropanol versetzt und bei 20 °C und 12.500 g für 30 min zentrifugiert. Das

erhaltene Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und in 1x

TE resuspendiert.

3.2.10 Fällung

3.2.10.1 Fällung von DNA

Die DNA-Lösung wurde mit 0,1 Volumen 3 M NaAc, 0,1 Volumen 100 mM EDTA und 3,0-

3,5 Volumen Ethanol versetzt, für 30 min bei -20 °C inkubiert und 30 min lang bei

Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen

und nach erneuter Zentrifugation getrocknet und in Wasser resuspendiert.

3.2.10.2 Fällung von RNA

Die RNA-Lösung wurde mit 0,1 Volumen 8 M Lithiumchlorid und 3 Volumen Ethanol

versetzt und 1 h bei -80 °C inkubiert. Es wurde bei 4 °C und 14.500 g für 30 min zentrifugiert


27

und das erhaltene Pellet mit 75% Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde das

Pellet getrocknet und schließlich in RNase-freiem Wasser resuspendiert.

3.2.11 Präparation von genomischer DNA aus Zellen

Die Präparation von genomischer DNA wurde mit den Genomed Tissue

3.2.12 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zur Amplifikation einzelner DNA-Abschnitte wurde die Polymerase-Ketten-Reaktion

eingesetzt. Ein Standard-PCR-Ansatz wurde wie folgt zusammengesetzt:

10x Puffer 5 µl

2,5 mM dNTPs 4 µl

10 pmol/µl sense-Primer 10 µl

10 pmol/µl antisense-Primer 10 µl

Template 1 µl

2,5 U/µl Taq-Polymerase 0,5 µl

bidest. Wasser 19,5 µl

Die Amplifikation einiger cDNAs erfolgte mit Hilfe einer Proofreading-PCR. Hierzu wurde

das Proofreading-Polymerase-Kit von Combizyme nach Herstellerangaben angewendet.

Für Standard-PCRs wurden folgende Temperatur-Zyklen eingesetzt:

1. 95 °C 4:00 min

2. 95 °C 0:30 min

3. 52 °C 0:30 min

4. 72 °C 1:00 min

30 Wiederholungen Schritt 2.-4.

5. 72 °C 1:00 min

Die Wahl der Annealing-Temperatur wurde an die Schmelztemperatur der verwendeten

Primer angelehnt, die sich nach folgender Formel ermitteln lässt:

Tm = 69,3 °C + 0,41 x (%G+C) °C bei pH 7,0, 165 mM NaCl

Je nach Größe der erwarteten Fragmente wurde die Elongationszeit (72 °C) auf bis zu 5 min

erhöht.


28

3.2.13 TA-Klonierung

3.2.13.1 Anhängen eines überhängenden Adenosin

Die durch PCR mit einer Proofreading-Polymerase erhaltenen PCR-Produkte wurden vor der

TA-Klonierung mit einem überhängenden Adenosinrest versehen, hierzu wurden die PCR-

Fragmente in Anwesenheit von Taq-Polymerase und 10 mM ATP 15 min bei 72 °C inkubiert.

3.2.13.2 TA-Klonierung

Die TA-Klonierungen wurden mit dem TA-Cloning-Kit von Invitrogen nach

Herstellerangaben durchgeführt.

3.3 Zytologische Methoden

3.3.1 Zellpassagen

Alle verwendeten Zelllinien wurden, je nach Flaschengröße, in 5 ml, 20 ml oder 30 ml des

entsprechenden Mediums bei 37 °C, 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit kultiviert.

Im Abstand von 2-3 Tagen wurden die Zellen 1:10 passagiert: Zunächst erfolgte ein Waschen

mit 1x PBS, dann ein Abtrypsinieren der Zellen und schließlich das Resuspendieren im

Medium. Danach wurde ein Teil dieser Suspension in eine neue Kulturflasche mit Medium

gegeben.

3.3.2 Zellen einfrieren und auftauen

Um Zellen einzufrieren, wurden diese zunächst abtrypsiniert und sedimentiert (1000 rpm,

10 min, 4 °C). Dann erfolgte eine Aufnahme in DMSO-haltigem Zellkulturmedium (10 %

DMSO). Die Zellen konnten in Aliqots bei -80 °C gelagert werden.

Für weitere Verwendungen wurden die Zellen bei 37 °C aufgetaut und in frischem Medium

aufgenommen. Um das DMSO, welches toxisch für gewisse Zelllinien ist, zu entfernen,

wurden die Zellen zuvor sedimentiert.


29

3.3.3 DNA-Transfektion von Zellen mit Calcium-Phosphat

Für die Transfektion von Zellen wurden diese subkonfluent in T25-Kulturflaschen ausplattiert.

Ein Mediumwechsel fand noch einmal 4 h vor der Transfektion statt. Die Transfektion wurde

nach der Calcium-Phosphat-Methode durchgeführt: Zuerst wurden 31 µl CaCl2, 5 – 10 µg

DNA und bidest. Wasser vermischt, so dass ein Ansatz mit dem Endvolumen von 250 µl

entstand. Dieser wurde schließlich gemischt und mit 250 µl HBS tröpfchenweise versetzt.

Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur konnte der Transfektionsansatz zu

den ausplattierten 293T-Zellen gegeben werden. Das Medium wurde dann entweder nach 4

oder nach 12 h gewechselt.

3.3.4 DNA-Transfektion von Zellen mittels Elektroporation

Die Transfektion von einigen Zellen ließ sich mittels Elektorporation durchführen. Hierzu

wurden die Zellen einer T75-Kulturflasche gewaschen, abtrypsiniert, pelletiert (1000 rpm, 10

min, 4°C) und in 1 ml PBS aufgenommen. Jeweils 10 µg der zu transfizierenden DNA

wurden mit Zellsuspension (107 Zellen/Puls) vermischt und in eine 1mm-Küvette überführt.

Die Elektroporation erfolgte mit dem BioRad Protokoll, welches nach der jeweiligen Zelllinie

ausgesucht wurde. Anschließend erfolgte jeweils eine Zugabe von 200 µl Kulturmedium. 3 -

5 Elektroporationsansätze wurden dann zusammen in eine neue T75-Kulturflasche mit

Medium gegeben.

3.3.5 Quantifizierung GFP-positiver Zellen mittels FACS

Eine FACS-Analyse transfizierter Zellen wurde ca. 48 h nach der Transfektion durchgeführt.

Nachdem die Zellen mit PBS gewaschen, abtrypsiniert und pelletiert (1000 rpm, 10 min,

4 °C) wurden, sind sie in einem angemessenen Volumen PBS (ca. 1 ml) aufgenommen

worden. Die FACS-Analyse erfolgt nach Angaben des Herstellers mit dem FACS Calibur.

3.3.6 Selektion mit G418

24 h nach einer Transfektion mit einem Plasmid, welches für eine Neomycin-Resistenz

kodiert, wurde dem Zellmedium G418 zugefügt (Endkonzentration: 1000 µg/ml). Die Zellen

wurden je nach Zelllinie 1-4 Wochen unter G418-Selektionsmedium passagiert.


30

3.3.7 Limiting dilution

Um aus einer Zellsuspension monoklonale Zellkulturen herzustellen, wurde das Verfahren

Limiting dilution angewendet. Hierbei wurden die Zellen so verdünnt, dass sich ca. 4 Zellen

in 1 ml Medium befanden. Diese verdünnte Suspension ließ sich dann in eine 96-Kavitäten-

Kulturplatte verteilen (200 µl/Kavität). Einzelne Klone sind nach einigen Tagen in 24-

Kavitäten-Platten und schließlich in T25-Kulturflaschen ausplattiert worden.

3.3.8 Luciferase-Assay

Das Enzym Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin unter Abgabe eines Photons.

Der Nachweis der Luciferase-Expression erfolgte mit dem Luciferase Detection Kit

(Promega). Nach Abnehmen des Mediums und Waschen der Zellen mit 1x PBS wurden die

Zellen direkt mit 100 µl Lysispuffer (für eine 96er Kavität) überschichtet. Nach einer

Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur und 10 min bei -80 °C wurden die abgelösten

Zellen in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und anschließend 15 Sekunden bei 14000 x g

zentrifugiert. 20 µl des Überstandes wurden mit 100 µl Luciferase-Substrat gemischt und die

Luciferase-Aktivität innerhalb von 10 s im Luminometer bestimmt.

3.3.9 Virus-Aufreinigung mit Sucrose und CsCl

Die Virus-Überstände wurden nach dem Auftauen geschüttelt und bei 1000 rpm für 10 min

zentrifugiert. Dann wurden 2 ml CsCl-Lösung (26,5 g CsCl + 43,5 ml 10 mM Tris, pH 7,9)

mit 4 ml Saccharose-Lösung/VTE (30 % oder 50 %) und dem Überstand der Viruspräparation

überschichtet. Es folgte eine Zentrifugation bei 25000 rpm (SW 28-Rotor) und 4°C für 2 h.

Die sedimentierten Viruspartikel wurden geerntet und in PBS-Glycerin aufgenommen.

Anschließend wurde eine Ultrazentrifugation mit CsCl bei 55000 rpm (NVT 100-Rotor) und

4 °C für ca. 16 h durchgeführt.

3.3.10 Infektion

3.3.10.1 Titerbestimmung

Die Titerbestimmung wurde nach der TCID50-Methode durch Infektionen von 911E4-Zellen

in 96-Kavitäten-Platten mit Verdünnungen des Virus durchgeführt. In den Vertiefungen einer

neuen Platte wurden zunächst 120 µl Medium vorgelegt, in die erste Vertiefung jeder Reihe


31

wurden je 40 µl des Virus-Stocks zugesetzt. 40 µl dieser ersten Verdünnung wurden in die

nächste Vertiefung der Reihe überführt und mit dem vorgelegten Medium vermischt. Durch

sukzessives Überführen der Verdünnungen in die folgenden Vertiefungen erhielt man so eine

Verdünnungsreihe. Das Medium der Zellen wurde entfernt und durch jeweils 100 µl des

virushaltigen Mediums der Verdünnungsreihe ersetzt. Nach 24-36 h wurde der cytopathische

Effekt beurteilt. Es wurde der Quotient der Vertiefungen bestimmt, in denen die Zellen bei

einer bestimmten Verdünnung einen cytopathischen Effekt zeigten, und die TCID50 nach

folgender Formel berechnet:

T = 101+d(S-0,5) mit d = log10 der Verdünnung

S = Summe der Quotienten

Das Ergebnis gibt den Titer des Virus-Stocks in TCID50 für das eingesetzte Volumen an.

3.3.10.2 Infektion

Nach der Titerbestimmug des Virus-Stocks wurden die Zellen infiziert. Zunächst wurde die

Zellzahl bestimmt und dann das Zellmedium mit dem entsprechenden Volumen des Virus-

Stocks versetzt. Der Wechsel des Mediums erfolgte nach 12 h.

4. Ergebnisse

32

4. Ergebnisse

4.1 Konstruktion und Charakterisierung von Kolon- und Pankreas-

spezifischen Promotoren

Zur Auswahl eines Kolon- bzw. Pankreas-spezifischen Promotors zur Kontrolle der E1- und

E4-Region des AdV wurden 17 verschiedene Promotoren in insgesamt 23 verschiedenen

Varianten getestet. Dazu wurden alle Promotorvarianten mittels nested PCR aus genomischer

DNA mit einer Pwo-Polymerase amplifiziert und zur weiteren Bearbeitung in pCR2.1 TA

kloniert. Mittels Overlap-Extension-PCR wurden Modifikationen an den einzelnen

Promotoren zur Verkleinerung der Gesamtlänge vorgenommen. Außerdem wurden SacI und

XhoI Restriktionsschnittstellen 5’ und 3’ der Promotorsequenzen durch die Wahl der Primer

bei der Overlap-Extension-PCR angehängt Anschließend wurden alle erhaltenen PCR-

Produkte mittels SacI und XhoI in das Luciferase-Expressions-Plasmid pGL3basic

subkloniert. Die beiden Promotorvarianten von COX-2 wurden von Dr. Inoue und Dr. Tanabe

(National Cardiovascular Center Research Institute, Osaka, Japan) zur Verfügung gestellt und

ohne weitere Modifikationen auch mittels SacI und XhoI in pGL3basic subkloniert. Dabei

entstanden die in Tabelle 1 aufgeführten Promotorkonstrukte.

Die Integrität der Konstrukte wurde durch Sequenzierungen überprüft.

Anschließend wurden die Konstrukte mit pRL-CMV als interne Kontrolle der

Transfektionseffizienz in verschiedenen Zelllinien mittels Luciferase-Assay analysiert. Je

10µg der Konstrukte und ein Zehntel der äquimolaren Menge von pRL-CMV wurden mit der

Calciumchlorid Transfektionsmethode oder mit dem kationischen Lipid DOTAP in 2 x 105

Zellen pro Kavität einer 24-Kavitäten Platte transfiziert. Der Versuch wurde in zwei Ansätze

pro Konstrukt und Transfektionsmethode durchgeführt. Als humane Zelllinien wurden dabei

verschiedene Kolonkarzinome (DLD-1, HCT116, HT-29 und SW480), Glioblastome (D54,

SNB19 und U373), Pankreaskarzinome (BxPc3, cFPac3, MiaPaca, Panc1 und PancTH1),

Melanome (888, A375 undSk-Mel2) sowie embryonale Nierenzellen (HEK-293),

Lungenepithelzellen (A549), Cervixkarzinomzellen (HeLa) und eine Keratinozytenzelllinie

(HaCaT) verwendet. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und je ein Fünftel

des Lysates wurde verwendet, um die Luciferase-Aktivität zu bestimmen. Die

Promotoraktivität wurde über die Quantenausbeute von Firefly-Luciferin bestimmt. Bei der

Messung der internen Transfektionskontrolle wurde Renilla reniformis Luciferin verwendet.

4. Ergebnisse

33

Gemessen wurde die Quantenausbeute in RLU/s. Die Promotoraktivität wurde in

Relation zu der zehnfachen

Konstruktname Länge Promotor Typ Literatur-

Verweis CEA 425 bp Carcionoembryonic antigen G 119 Cyclin A 503 bp Cyclin A P 120 Cyclin E#1-1 354 bp Cyclin E#1-2 354 bp Cyclin E#2 378 bp

Cyclin E P 121

E2F1#1 273 bp E2F1#2 380 bp E2F1 P 122

FGF-1B 1052 bp Fibroblast Growth Factor 1 B G 123 GFAP 1034 bp glial fibrillary acidic protein G 124 HSP-70 436 bp Hitze Schock Protein 70 G 125 hTERT 294 bp Homo Sapiens Telomerase Reverse

Transcriptase P 126

IGFBP 739 bp Insulin Like Growth Factor Protein G 127 Ki-67 1034 bp Antigen Number Ki-67 P 128 MK 1037 bp Midkine G 129 MUC 1808 218 bp MUC 1959 209 bp MUC D 393 bp

Humanes Mucin G 130

PAI 780 bp Plasminogen Activator Inhibitor Type-I G 131 PCNA 502 bp Proliferating Cell Nuclear Antigen P 132 phES2(-329/59) 368 bp phES2(-52/59) 112 bp Cyclooxygenase-2 P 133

SART3 1034 bp squamous cell carcinoma antigen recognised by T cells 3 G 134

VEGF 674 bp Vascular endothelial growth factor related factor P 135

Tab 1: Promotorvarianten die im pGL3basic-System charakterisiert wurden 17 verschiedene Promotoren wurden in 23 Varianten im Größenbereich von ca. 0,2 bis 1,1 kb in pGL3basic kloniert. Es wurden zwei verschiedene Promotortypen, zum einen proliferationsabhängige (P), zum anderen gewebespezifische (G), analysiert. Aktivität von Renilla reniformis gesetzt, womit die Promotoraktivität relativ zur CMV-IE-

Promotoraktivität dargestellt wird. Die Ergebnisse der Messung sind in Abbildung 5 gezeigt.

Zusammenfassend lässt sich aussagen, dass die Promotorvariante E2F1#2 in allen Zelltypen

eine Aktivität von über 100%, verglichen mit einem CMV-IE Promotor in der gleichen

Zelllinie, zeigt. Des Weiteren konnte man sehen, dass der Ki-67 Promotor hauptsächlich in

Pankreas- und Kolonkarzinomen aktiv ist. Eine ähnliche Aktivitätsverteilung in den getesteten

Zelllinien, jedoch mit geringerer Luciferase-Expressionsstärke, zeigt die Promotorvariante

phES2(-327/59). Der getestete Midkine-Promotor zeigte eine recht spezifische Aktivität in

Pankreaskarzinomen.

4. Ergebnisse

34

Abb. 5: Promotoranalyse in verschiedenen Zelllinien Dargestellt ist die Promotoraktivität relativ zu dem CMV-IE Promotor in % Relative Licht Einheiten (RLU) relativ zu pRL-CMV. Die Werte unter 5% CMV-IE-Promotoraktivität sind grau dargestellt. Die Darstellung von grün über gelb nach rot symbolisiert Werte von 5% über 100% nach 781%. 23 verschiedene Promotorvarianten (x-Achse) wurden in 19 Zelllinien (y-Achse) analysiert.

4.2. Abhängigkeit der Promotoren von dem Zellzyklus

4.2.1 Zellzyklusanalyse der Zellen

Die verwendeten Zellen Panc1 und DLD-1 wurden zum einen subkonfluent und zum anderen

postmitotisch arretiert untersucht, um den Einfluss des Zellzyklus auf die Promotoraktivität zu

bestimmen. Dazu musste die Zellzyklusverteilung mit einem FACS-Gerät untersucht werden.

Die Zellen wurden entweder in T25-Zellkulturflaschen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen

ausplattiert und zur Arretierung mit 10µM Mitomycin C behandelt oder hoch konfluent

analysiert. 24 h später wurden die Zellen dann geerntet und mit Propidiumiodid gefärbt. Der

DNA-Gehalt der Zellen wurde im FL2-A Kanal des FACS-Gerätes bestimmt (s. Abb. 6). Die

4. Ergebnisse

35

Ergebnisse repräsentieren vier unabhängige Versuche. Die unbehandelten Zellen waren zu 28

– 29 %, die behandelten bzw. hochkonfluenten Zellen zu 4 – 6 % in der S-Phase.

Abb. 6: Zellzyklusanalyse der genutzten Zelllinien Die Zellen wurden im FACS analysiert, und der Prozentsatz der Zellen in jeder Phase des Zellzyklus wurde mit der MODFIT Software ermittelt.

4.2.2 Analyse der Promotorspezifität

Die Spezifität der getesteten Promotoren wurde mit einem dualen Luciferase-Reportergen-

Assay untersucht, bestehend aus Firefly-Luciferase für die Promotorenanalyse und Renilla

reniformis-Luciferase kontrolliert vom CMV-IE-Promotor als interne Kontrolle, um die

Transfektionseffizienz zu normalisieren. Firefly-Luciferase-Aktivität der Vektoren

p●<Promotor>-Luc wurde in subkonfluenten und in arretierten bzw. hochkonfluenten Panc1-

und DLD1-Zellen gemessen und mit der CMV-IE kontrollierten Renilla reniformis-Luciferase

verglichen. Wie in Abb. 7 A gezeigt, waren alle Promotoren in subkonfluenten Panc1-Zellen

aktiv. Der MK-, COX-2-, Ki-67- und E2F1-Promotor zeigte in diesen Zellen eine 136%ig,

4. Ergebnisse

36

162%ig, 87%ig bzw. 100%ig höhere Aktivität als der CMV-IE-Promotor. Die

Expressionslevel der frühen viralen Promotoren SV40, AdV E1 und AdV E4 waren um ca.

65% niedriger als die des CMV-IE Promotor.

In arretierten Panc1-Zellen (siehe 4.2.1. für die Prozentzahl der Zellen in der S-Phase) war die

Aktivität des proliferationsassoziierten Ki.-67- und des proliferationsabhängigen E2F1-

Promotors um 1,6-fach bzw. 58,8-fach reduziert (P<0,03). Die Aktivität aller anderen

getesteten Promotoren wurde nicht signifikant vom Zellzyklus beeinflusst.

Wie in Abb. 7 B gezeigt, sind die Expressionslevel aller getesteten Promotoren in

subkonfluenten und arretierten DLD1-Zellen mit denen in Panc1 vergleichbar. Eine

Ausnahme sind die MK- und COX-2-Promotoren, sie waren im Gegensatz zu den anderen

getesteten Promotoren nur in Panc1 und nicht in DLD1 aktiv.

Abb. 7: Analyse der Promotorspezifität Die Spezifität der untersuchten Promotoren wurde mit einem dualen Luciferase-Reportergen-Assay analysiert. Die Firefly-Luciferase-Expression des p●<Promotor>-Luc-Vektors wurde in subkonfluenten sowie in arretierten Panc1- und DLD1-Zellen gemessen und im Anschluss mit der CMV-IE kontrollierten Renilla reniformis-Luciferase-Expression verglichen.

4.3 Test von Promotoren auf Transaktivierung durch adenovirale Sequenzen

oder Genprodukte

4.3.1 Konstruktion der Vektoren zum Testen von Promotoren auf Transaktivierung

Es wurden zum einen die vorher beschriebenen Promotorvarianten E2F1#2 („E2F1“), Ki-67,

phES2(-327/59) („COX-2“) und Midkine („MK“), zum anderen die frühen viralen

4. Ergebnisse

37

Promotoren Simian Virus 40 minimal-Promotor („SV40“) und die frühen adenoviralen

Promotoren E1 und E4 verwendet. Für den Simian Virus 40 (SV40) frühen Promotor ohne

Enhancer diente das XhoI – HindIII Fragment aus dem pGL3-Control-Vector. Zur Kontrolle

wurden die getesteten Promotoren in die Multiple-Klonierungsstelle (MCS) stromabwärts

einer synthetischen Polyadenylierungssequenz (polyA), bezeichnet mit „●“, und

stromaufwärts der Firefly Luciferase-cDNA des pGL3basic-Vektors mit XhoI und SacI

kloniert. Die resultierenden Vektoren wurden p●MK-Luc, p●COX2-Luc, p●Ki67-Luc,

p●E2F1-Luc, p●SV40-Luc, p●E1-Luc, and p●E4-Luc (Abb. 7 A) genannt. Das polyA diente

zur Untersuchung, ob es sich bei den beobachteten Ergebnissen um die Auswirkung eines

Enhancers oder einer alternativen Startstelle handelt, da das polyA keinen Einfluss auf die

Aktivitätsänderung eines Enhancers hat, jedoch auf die einer alternativen Startstelle.

Abb. 8: Analysierte Promotoren und AdV (nt 1-353) Segment Der Cyclooxygenase-2 (cox2)-Promotor wurde von -327 bis +59 inklusive zweier NF-κB Bindestellen kloniert. Der E2F1-Promotor beinhaltet die Basenpaare von -229 bis +66 mit drei Sp-1 Erkennungstellen, zwei E2F-Bindestellen und einer GGGCGG-Box in der translatierten Region. Der Midkine Promotor wurde mit vier GC-Boxen von -1009 bis +25 und der Ki-67-Promotor von -1121 bis +7 mit den zwei MRE- Erkennungstellen und einer E2A-Bindungstelle zur Analyse kloniert. Der adenovirale E1-Promotor beinhaltet die Basenpaare -99/+2 und der E4-Promotor die Basenpaaren -328/+4 und enthält eine E4F1-Bindestelle. Als Enhancer Element wurden die ersten 322 Basenpaare der wtAdV genomischen DNA verwendet, die auch den 5’ inverted terminal repeat und alle Verpackungssignale (PI und PII) beinhaltet und die mit den Enhancer-Elementen EEI und EEII überlappen.

4. Ergebnisse

38

Das mittels PCR amplifizierte AdV Segment (nt 1-353) wurde mit AflII und SpeI

stromaufwärts des synthetischen polyA und des Promotors eingesetzt, die resultierenden

Vektoren wurden pAd353●<Promotor>-Luc genannt (Abb. 7 B); <Promotor> wird als

Platzhalter für den verwendeten Promotor verwendet. Um den positionellen Effekt des AdV

(nt 1-353) Segmentes zu untersuchen, wurde dieses in die BamHI-SalI-Stelle des

p●<Promotor>-Luc kloniert und p●<Promotor>-Luc-Ad353 genannt (Abb. 7 C). Des Weiteren

wurde das synthetische polyA in die Vektoren pAd353●<Promotor> und p●<Promotor>-Luc-

Ad353 mit SacI/AflII-Restriktion, Nukleaseverdau und abschließender Religation entfernt,

wodurch die Vektoren pAd353<Promotor> und p<Promotor>-Luc-Ad353 entstanden (Abb. 7

D & E).

Abb. 9: Vektor-Konstrukte zur Analyse der Promotor-Transaktivierung Die folgenden Vektoren wurden konstruiert: Zur Kontrolle wurde der zu testende Promotor in die MCS des pGL3basic-Vektors 5’ der Luciferase-cDNA kloniert (A). Insertion des AdV (nt 1-353)-Segments stromaufwärts des Promotors und der polyA-Sequenz (B) und stromabwärts der Luciferase Expressionskassette (C). Die Vektoren D und E wurden durch die Deletion der polyA-Sequenz 5’ der Promotoren der Konstrukte B und C erhalten.

Je 10 µg der Vektoren und ein Zehntel der äquimolaren Menge von pRL-CMV wurden mit

der Calciumchlorid-Transfektionsmethode in 1 x 104 Zellen pro Kavität einer 24-Kavitäten

4. Ergebnisse

39

Platte transfiziert. Der Versuch wurde in zwei unabhängige Ansätze pro Konstrukt und

Transfektionsmethode durchgeführt. 48 h nach der Transfektion wurde das Zelllysat

analysiert. Alle Versuche wurden in vier unabhängigen Experimenten durchgeführt.

4.3.2 Einfluss des AdV (nt 1-353)-Segmentes auf die Aktivität der getesteten

Promotoren; mit und ohne stromaufwärts liegender polyA-Sequenz

Im nächsten Schritt wurde der Effekt des AdV (nt 1-353)-Segmentes analysiert. Um

festzustellen, ob der Einfluss des AdV (nt 1-353)-Segmentes positionsabhängig ist, wurde das

Fragment stromaufwärts und stromabwärts der Luciferase-Expressionskassette in den

Reportergen-Vektor gesetzt. Des Weiteren wurde eine synthetische polyA-Sequenz

stromaufwärts des Promotors eingesetzt um die Aktivität der kryptischen Initiations-

Startstelle zu blockieren, die im AdV (nt 1-353)-Segment lokalisiert ist. Die Firefly-

Luciferase-Aktivität der Vektoren, die das AdV (nt 1-353)-Segment enthalten, wurde mit der

Expression der korrespondierenden Vektoren p●<Promotor>-Luc ohne AdV (nt 1-353)-

Segment verglichen. Wie in Abb. 10 A gezeigt, war die Aktivität der COX-2-, E2F1-, SV40-,

AdV E1- und AdV E4-Promotoren um 146%, 149%, 99%, 116% bzw. 96% erhöht, wenn das

AdV (nt 1-353)-Segment vor der Luciferase-Expressionskassette eingesetzt wurde und keine

polyA-Sequenz vorhanden war. Wenn das AdV-Segment stromabwärts der Luciferase-

Expressionskassette lokalisiert war, wurde die Aktivität der getesteten Promotoren, mit

Ausnahme von COX-2, nicht beeinflusst. Die Aktivität des MK- und Ki-67-Promotors wurde

durch das AdV-Segment, unabhängig von der Position, nicht signifikant beeinflusst, wenn

man es mit den korrespondierenden Kontroll-Vektoren vergleicht.

4. Ergebnisse

40

Abb. 10: Einfluss des AdV (nt 1-353)-Segments auf die Promotoraktivität, mit und ohne stromaufwärts liegender polyA-Sequenz Der Effekt des AdV (nt 1-353)-Segments stromaufwärts oder stromabwärts der Luciferase-Expressionskassette wurde in Panc1-Zellen analysiert und mit den Kontroll-Vektoren p●<Promotor>-Luc verglichen. Im Abbildungsteil B wurde analysiert, ob der Effekt des AdV-Segments durch eine polyA-Sequenz stromaufwärts des Testpromotors geblockt werden kann. Im nächsten Schritt wurde der Effekt einer polyA-Sequenz stromaufwärts des Promotors

analysiert. Wie in Abb. 10 B gezeigt, wurde die mittlere Aktivität des E2F1-, SV40-, AdV

E1- und AdV E4-Promotors mit dem stromaufwärts liegenden AdV-Segmentes um 145%,

100%, 115% bzw. 98% verstärkt. Die Position des AdV-Segmentes hatte keinen signifikanten

Einfluss auf die Transkriptionsrate dieser Promotoren. Die Aktivität des COX-2-, MK- und

Ki-67-Promotors mit einer stromaufwärts liegenden polyA-Sequenz wurde nicht signifikant

durch das AdV nt (1-353)-Segment beeinflusst, wenn man es mit dem korrespondierenden

Kontroll-Vektor vergleicht. Gleiche Daten konnten mit MiaPaca- und A549-Zellen ermittelt

werden (Daten nicht gezeigt).

4.3.4 Einfluss der frühen adenoviralen Genprodukte auf die Aktivität der getesteten

Promotoren

Um festzustellen, ob frühe adenovirale Genprodukte einen Einfluss auf die getesteten

Promotoren haben, wurden Panc1-Zellen mit den Firefly-Luciferase-Konstrukten und dem

Renilla reniformis-Expressionsplasmids pRL-CMV transfiziert. Zwölf Stunden vor der

Analyse wurden die Zellen mit wtAdV infiziert oder mit Voll-Länge-AdV-DNA transfiziert.

Wie in Abb. 11 A gezeigt, war die mittlere Aktivität der E2F1-, SV40-, AdV E1- und AdV

4. Ergebnisse

41

E4-Promotoren mit dem AdV (nt 1-353)-Segment in der stromaufwärts oder stromabwärts

liegenden Position, aber ohne polyA-Sequenz 5’ vor dem Promotor 194%, 19%, 67% bzw.

16% gegenüber nicht infizierten Zellen erhöht. Die erhöhte Aktivität der E2F1-, SV40-, AdV

E1- und AdV E4-Promotoren durch frühe adenovirale Genprodukte wurde nicht signifikant

durch das Einsetzen einer stromaufwärts liegenden polyA-Sequenz verändert (siehe Abb. 11

B). Die Stärke der Promotoren MK, COX-2 und Ki-67 wurde nicht signifikant durch frühe

adenovirale Genprodukte beeinflusst. Die Ergebnisse konnten auch in MiaPaca und A549

Zellen bestätigt werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 11: Einfluss von viralen Produkten auf die Promotoraktivität Die Panc1-Zellen wurden mit den Reportervektoren, die das AdV (nt 1-353)-Segment stromauf- oder stromabwärts der Luciferase-Expressionskassette tragen, transfiziert. Um den Einfluss der frühen adenoviralen Genprodukte zu zeigen, wurden infizierte mit nicht infizierten Zellen verglichen. Die Daten zeigen die Prozentzahl der Veränderung der Luciferase-Aktivität. In Abbildungsteil B wurde analysiert, ob diese Effekte durch eine polyA-Sequenz stromaufwärts vom Testpromotor geblockt werden können. Da kein signifikanter Unterschied zwischen der wtAdV-Infektion und der Voll-Länge-AdV-DNA-Transfektion zu beobachten war, repräsentieren die Graphen den Mittelwert der beiden Methoden.

4.3.5 Verifizierung im adenoviralen Vektor

Zur Überprüfung der bisher erhaltenen Ergebnisse im adenoviralen Vektor wurden die

Promotoren mit stromaufwärts liegender polyA-Sequenz und stromabwärts liegender

Luciferase-Expressionskassette in pShuttle-AflII kloniert. Dabei wurden vier verschiedene

Varianten je Promotor konstruiert: zwei, bei denen die Luciferase Expressionskassette auf der

5’-ITR-Seite innerhalb der E1-Region lag, eine in sense-Orientierung, die andere in antisense-

4. Ergebnisse

42

Orientierung. Zum anderen wurden zwei Vektoren konstruiert, bei denen die

Expressionskassette nahe des 3’-ITRs innerhalb der E4-Region in sense und antisense-

Orientierung eingesetzt wurde. Als Kontrolle wurde ein pShuttle-Plasmid konstruiert, welches

eine CMV-IE-Promotor-regulierte Luciferase-cDNA in der E1-Region in sense-Orientierung

enthielt. Anschließend wurden alle Konstrukte mit pAdEasy1 rekombiniert, so dass volllange

adenovirale DNA entstand. Mit dieser DNA wurden dann replikationsdefekte Adenoviren in

Zellkultur hergestellt.

Abb. 12: Verwendete adenovirale Konstrukte Die folgenden Vektoren wurden konstruiert: Zur Kontrolle wurde in die E1A-Region des AdV eine mit CMV-IE Promotor kontrollierte Luciferase-cDNA kloniert (A). Insertion des Promotors mit der Luciferase cDNA in die E1A-Region des AdV zum einen in sense-Orientierung (B) und in antisense-Orientierung (C). Insertion der Expressionskassette zwischen der E4-Region und den 3’ITR ergab in sense-Orientierung den Vektor 3’ <Promotor S>-Luc (D) und in antisense-Orientierung den Vektor 3’ <Promotor AS>-Luc (E).

Zur Analyse der Promotoraktivität und -spezifität wurden zuerst die pShuttle-Konstrukte im

dualen Luciferase-Assay untersucht. Dazu wurden, wie vorher schon beschrieben, 10µg je

pShuttle-Konstrukt mit einem Zehntel der äquimolaren Menge an pRL-CMV kotransfiziert.

Zum einen wurde ein Test mit einer Zelllinie, in der der Promotor aktiv ist, und zum anderen

mit einer Zelllinie, in der er inaktiv ist, durchgeführt. 48h nach der Transfektion wurde der

duale Luciferase-Assay durchgeführt und die Werte relativ zur CMV-IE-Aktivität gesetzt (s.

Abb. 13 A). Im zweiten Schritt wurden dieselben Zelllinien mit den replikationsdefekten

Adenoviren mit einer MOI von 5 infiziert und nach 24 h wurde die Promotoraktivität wieder

4. Ergebnisse

43

mit einem Luciferase-Assay gemessen. Diesmal wurde die ermittelte Aktivität mit der des

CMV-IE Kontrollvirus (Abb. 13 B) verglichen. Alle Tests wurden in unabhängigen

Triplikaten durchgeführt.

Abb. 13: Einfluss auf die Promotoraktivität im adenoviralen Vektor Verschiedene Zellen, in denen der heterologe Promotor aktiv oder inaktiv ist, wurden mit den adenoviralen Genomen, die die Luciferase Expressionskassette unter heterologer Promotorkontrolle beinhalten, transfiziert. (A) Als positive Zelllinie diente Panc1 und als negative DLD-1. Bei den beiden zellzyklusabhängigen Promotoren E2F und Ki-67 wurden die Zellen DLD-1 mitotisch arretiert. Das gleiche Experiment wurde mit Adenoviren wiederholt. Dazu wurden die gleichen Zelllinien mit den adenoviralen Vektoren mit einer MOI von 5 infiziert. Als Kontrolle diente ein CMV-IE kontrollierter Luciferase-Adenovirus (s. Abb. 12 A). Die Ergebnisse der oben beschriebenen Plasmid-Transfektionsmethode ließen sich im

adenoviralen Kontext bestätigen. Es konnte gezeigt werden, dass der E2F1-Promotor im

adenoviralen Kontext eine Basalaktivität besitzt, wie auch im Plasmid-basierenden System.

Mit Mk und Cox war kein Einfluss durch virale Proteine im adenoviralen Kontext zu

beobachten. Ki-67 zeigte als Promotor, im Gegensatz zum Plasmid-basierenden System, eine

leichte Transaktivierung im Adenovirus.

4.4 AdV E4 open reading frame Transkomplementierung

Da das Adenovirus nur maximal 106% seiner Wildtyp-Genomlänge verpacken kann, sind die

Promotoren in ihrer Länge limitiert. Des Weiteren muss noch genügend Platz für das

therapeutische Transgen und eine IRES-Sequenz im adenoviralen Vektor sein. Als erstes

bietet sich die E3-Region des AdVs zur Deletion an, die den Adenovirus vor der zellulären

Immunantwort schützt. Ein weiterer Ort zur Platzgewinnung im adenoviralen Vektor bietet

4. Ergebnisse

44

die E4-Region mit den verschiedenen offenen Leserahmen (orf). Diese orfs besitzen in der

frühen und späten Phase des viralen Infektionszyklus verschiedene Aufgaben. Daher soll

untersucht werden, wie sich die Deletion verschiedener E4 orfs auf die virale Replikation

auswirkt.

4.4.1 Konstruktion der AdV E4 orfs exprimierenden Plasmide

Um zu untersuchen, welche E4 orfs transkomplementierend wirken, wurden alle sechs

verschiedenen orfs der E4 Region in eukaryotische Expressionsplasmide kloniert. Dazu

wurden die orfs jeweils mittels Proofreading-Polymerase amplifiziert und durch die Primer

am 5’- und am 3’-Ende mit den Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen von NotI und XhoI

erweitert. Abschließend wurden diese Produkte mittels NotI und XhoI in pCR3.1 subkloniert.

Die Integrität der Konstrukte wurde durch Sequenzierungen überprüft.

4.4.2 Transkomplementierungsbestimmung mit Luciferase-Assay

Es wurde mit Hilfe von Transfektionen und nachfolgenden Infektionen untersucht, welche E4

orfs transkomplementierend wirken; wodurch gezeigt werden kann, welche E4 orfs die

Replikation eines E4-deletierten replikationsdefekten Adenovirus unterstützen. Hierzu

wurden HEK-293-MLV-Luc3-Zellen zunächst mit einem oder mehreren orfs transfiziert.

Insgesamt gibt es 63 Möglichkeiten, die sechs orfs zu kombinieren, dies zeigt sich anhand der

Formel:

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

kn

Ckn

Die Kombinationen wurden nummeriert (Tab. 2).

Als Transkomplementierungskontrolle wurden Zellen mit einem Voll-Länge-Konstrukt

transfiziert, das alle adenoviralen Genregionen umfasst.

4. Ergebnisse

45

Nr. orfs Nr. orfs Nr. Orfs 1 1 22 1 + 2 + 3 43 2 + 3 + 4 + 6 2 2 23 1 + 3 + 4 44 3 + 4 + 6 + 6 / 7 3 3 24 1 + 4 + 6 45 1 + 2 + 3 + 6 4 4 25 1 + 6 + 6 / 7 46 2 + 3 + 4 + 6 / 7 5 6 26 1 + 2 + 4 47 1 + 4 + 6 + 6 / 7 6 6 / 7 27 1 + 3 + 6 48 1 + 2 + 3 + 6 / 7 7 1 + 2 28 1 + 4 + 6 / 7 49 2 + 3 + 6 + 6 / 7 8 1 + 3 29 1 + 2 + 6 50 1 + 3 + 4 + 6 / 7 9 1 + 4 30 1 + 3 + 6 / 7 51 1 + 2 + 6 + 6 / 7

10 1 + 6 31 1 + 2 + 6 / 7 52 2 + 4 + 6 + 6 / 7 11 1 + 6 / 7 32 2 + 3 + 4 53 1 + 3 + 4 + 6 12 2 + 3 33 2 + 4 + 6 54 1 + 3 + 6 + 6 / 7 13 2 + 4 34 2 + 6 + 6 / 7 55 1 + 2 + 4 + 6 14 2 + 6 35 2 + 3 + 6 56 1 + 2 + 4 + 6 / 7 15 2 + 6 / 7 36 2 + 4 + 6 / 7 57 1 + 2 + 3 + 4 + 6 16 3 + 4 37 2 + 3 + 6 / 7 58 1 + 2 + 3 + 4 + 6 / 7 17 3 + 6 38 3 + 4 + 6 59 1 + 2 + 3 + 6 + 6 / 7 18 3 + 6 / 7 39 3 + 6 + 6 / 7 60 1 + 2 + 4 + 6 + 6 / 7 19 4 + 6 40 3 + 4 + 6 / 7 61 1 + 3 + 4 + 6 + 6 / 7 20 4 + 6 / 7 41 4 + 6 + 6 / 7 62 2 + 3 + 4 + 6 + 6 / 7 21 6 + 6 / 7 42 1 + 2 + 3 + 4 63 1 + 2 + 3 + 4 + 6 + 6 / 7

Tab. 2: Nummerierungen der orf-Kombinationen Es gibt 63 verschiedene Möglichkeiten, die einzelnen E4 orfs miteinander zu kombinieren. Den Kombinationen wurden Nummern von 1-63 zugewiesen.

Die transfizierten Zellen wurden 48 h inkubiert und dann mit dem E4-deletierten Adenovirus

AdV dl1011 infiziert (MOI = 5). Nach 48 h wurde der Luciferase-Assay durchgeführt. Als

Testkontrolle wurde der Luciferase-Assay auch an nicht-transfizierten Zellen durchgeführt.

Wobei der zytopatische Effekt der adenoviralen Replikation durch die Abnahme der

Luciferase-Aktivität gemessen wurde.

Die Ergebnisse sind in Abb. 14 dargestellt. Anhand dieser Abbildung kann man feststellen,

dass nur die Anwesenheit von lediglich ein bis zwei orfs keine akzeptable adenovirale

Replikation ermöglicht. Erst ab einer Kombination von 4 orfs, in denen die orfs 4 und 6

enthalten sind, ist eine ausreichende virale Replikation vorhanden. Wenn man aus der E4-

Region nur die orfs 1 oder 2 deletiert, erhält man ein Virus, der nahezu gleichstark repliziert

wie das Wildtyp-Virus. Zusammenfassend kann man sagen, dass eine E4-orf-

Deletionsvariante auf jeden Fall die orfs 4, 6 und 6/7 beinhalten sollte.

4. Ergebnisse

46

Abb

. 14:

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4. Ergebnisse

47

4.5 Konstruktion des bedingt replikationskompetenten adenoviralen

Vektorsystems

Um ein Vektorsystem zu erhalten, in dem man zum einem die E1A-Region, zum anderen die

E4-Region unter heterologer Promotorkontrolle stellen kann, musste ein neuer adenoviraler

backbone-Vektor konstruiert werden, in dem es möglich ist, die E4-Region zu manipulieren.

Daher wurde der pAdEasy-Vektor als Grundlage verwendet, damit die manipulierte E1

Region mittels pShuttle hineinrekombiniert werden kann. Durch die homologe

Rekombination entsteht eine zirkuläre rekombinante Adenovirus-DNA, die durch PacI-

Restriktion linearisiert und dann in HEK-293- oder 911E4-Zellen zur Vektorproduktion

transfiziert werden kann (s. Abb. 15).

Zuerst wurde in die EcoRI- und NdeI-Restriktionsschnittstelle des pBR322-Vektors ein

synthetisches Oligonukleotid eingesetzt. Dieses Oligonukleotid war so konstruiert, dass es

verschiedene Restriktionsschnittstellen zur weiteren Klonierung beinhaltet (s. Abb 15).

Anschließend wurde mit einer Proofreading-Polymerase ein linker homologer Arm (LHA)

mit eine Länge von 3052 bp 5’ der E4-Region bis zur SpeI-Seite aus dem Adenovirus

amplifiziert. Durch die Primer wurden die Restriktionsschnittstellen NheI und KpnI eingefügt,

und mit diesen wurde das LHA-Fragment dann in den modifizierten pBR322-Vektor

eingesetzt. Der nächste Schritt war die Klonierung des rechten homologen Arms (RHA) in

das Plasmid. Dazu wurde wiederum mit einer Proofreading-Polymerase ein Fragment aus

dem pAdEasy-1-Plasmid amplifiziert. Dieses besitzt eine Länge von 1179 bp und liegt

zwischen dem 3’ Ende des E4-Promotors und dem Vektor-backbone von pAdEasy-1. Durch

die Primer wurden die Restriktionsschnittstellen XbaI und MluI eingefügt. Zum Abschluss der

Grundkonstruktion wurde das Kanamycin-Resistenzgen aus dem pCR3.1-Plasmid mit NotI /

SacII in das Grundkonstrukt subkloniert.

Jetzt können alle Promotoren, die die E4-Region kontrollieren sollen, mit den

Restriktionsenzymen XhoI und SacI in das Vektorsystem kloniert werden. Die E4-Region

oder andere (therapeutische) Gene können über ClaI und SalI in dieses Vektorsystem kloniert

werden. Anschließend kann diese modifizierte E4-Region mit SpeI und PacI oder durch

homologe Rekombination in pAdEasy-1 kloniert oder rekombinert werden. Als

Selektionsmarker dient Kanamycin. Nach erfolgreicher Klonierung kann das Kanamycin-Gen

mit PI-PspI oder SwaI deletiert werden.

Der Promotor zur Kontrolle der E1-Region wurde mit MluI und XhoI in pShuttle-AflII-HSV-

tk-IRES subkloniert. Die E1-Region aus dem Plasmid pOW127 wurde in das pShuttle-

Plasmid mit AflII und NotI kloniert.

4. Ergebnisse

48

Abb

. 15:

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4. Ergebnisse

49

Abschließend wurden die beiden Plasmide, die auf den Plasmiden pAdEasy-1 und pShuttle

basierten, in BJ5183 Bakterien homolog rekombiniert und auf Kanamycin selektioniert. Das

so gewonnene Plasmid wurde mit PacI linearisiert und in 911E4-Zellen zur Virusproduktion

transfiziert.

4.6 Analyse der bedingt replikationskompetenten adenoviralen Vektoren

Als Promotoren für die Kontrolle der frühen adenoviralen Gene E1 und E4 wurden die vorher

getesteten Promotoren COX-2, E2F1, Ki-67 und Midkine ausgewählt. Dabei wurden die in

Tabelle 4 aufgeführten Vektorvarianten konstruiert.

Tab. 3: Bedingt replikationskompetente adenovirale Vektoren Gezeigt sind die Promotorvarianten der bedingt replikationskompetenten adenoviralen Vektoren. Es wurden zwei frühe Gene des Adenovirus (E1 und E4) unter die Kontrolle eines heterologen Promotors gesetzt. „Nativ“ zeigt an, dass die E4-Region unter der Wildtyp E4-Promotorkontrolle steht.

Nach Abschluss der Konstruktion und der Vektorproduktion wurden die gewonnenen

Überstände verdünnt, so dass Zellen mit einer MOI von 5 infiziert werden konnten.

Anschließend wurden in 6-Kavitäten-Platten Zellen in unterschiedlicher Dichte ausplattiert.

Dafür wurden pro Kavität 106 Zellen ausplattiert. Verwendet wurden die

Pankreaskarzinomzelllinien Panc1, MiaPaca, PancTH3, SW480 und cFPac3, die

Kolonkarzinomzelllinien BxPc3, HT-29 und CaCo2, sowie als Kontrolle A549 und die

Keratinozytenzelllinien HaCaT und JB6, sowie die primäre Zellline K-1-17.

Um zu überprüfen ob die Transduktioneffizienz der Zellen ähnlich ist, wurden alle Zellen mit

einem GFP-exprimierenden AdV in zwei unterschiedlichen Konzentrationen infiziert. Zum

Vektorname E1-

Promotor

E4-

Promotor

pAd-COX-0 COX-2 Nativ

pAd-COX-COX COX-2 COX-2

pAd-COX-E2F COX-2 E2F1

pAd-COX-Ki COX-2 Ki-67

pAd-COX-Mk COX-2 Midkine

pAd-E2F-0 E2F1 Nativ

pAd-E2F-COX E2F1 COX-2

pAd-E2F-E2F E2F1 E2F1

pAd-E2F-Ki E2F1 Ki-67

pAd-E2F-Mk E2F1 Midkine

Vektorname E1-

Promotor

E4-

Promotor

pAd-Ki-0 Ki-67 Nativ

pAd-Ki-COX Ki-67 COX-2

pAd-Ki-E2F Ki-67 E2F1

pAd-Ki-Ki Ki-67 Ki-67

pAd-Ki-Mk Ki-67 Midkine

pAd-Mk-0 Midkine Nativ

pAd-Mk-COX Midkine COX-2

pAd-Mk-E2F Midkine E2F1

pAd-Mk-Ki Midkine Ki-67

pAd-Mk-Mk Midkine Midkine

4. Ergebnisse

50

einem wurde eine MOI von 5 und zum anderem eine von 0,5 gewählt. 24h nach der Infektion

wurden die Zellen im FACS analysiert. Dabei zeigte sich, dass alle Zellen eine ähnliche

Transduzierbarkeit für den AdV besitzen. Dieses zeigt, dass keine Schwankungen durch

verschiedene virale Transduktionseffizienzen zu erwarten sind.

Abb. 16: Analyse der Transduktionseffizienz in verschiedenen Zelllinien. 13 verschiedene Zelllinien in 6-Kavitäten Platten wurden mit einem GFP exprimierenden Adenovirus in zwei verschiedenen Verdünnungen infiziert. 4 h nach der Infektion wurde das Medium gewechselt. 24h nach der Infektion wurden die Zellen im FACS analysiert und die Zahl der GFP positiven Zellen mir denen von nicht infizierten Zellen verglichen. Die Prozentangaben repräsentieren den Median von 2 unabhängigen Experimenten. Alle Zellen wurden mit einer MOI von 5 (s. Abb. 16) mit den verschiedenen

Virusvarianten infiziert. Sechs Stunden nach der Infektion wurde das Medium gewechselt.

Vier Tage nach der Infektion wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und mit

Kristallviolett gefärbt. Abschließend wurden die Platten fotografiert und die Zelldichte mit

der Software ImageJ V1.32 (NIH, USA) ermittelt. Die Ergebnisse sind in den Abbildung 18 A

und 18 B dargestellt.

4. Ergebnisse

51

Vektor / Platte A B

Kontrolle

wtAdV

pAd-COX

pAd-COX-E2F

pAd-COX-COX

pAd-COX-Ki

pAd-COX-Mk

Legende

Abb. 17: Exemplarische Darstellung von Kristallviolett gefärbten und mit BRAV infizierten Zellen Gezeigt sind zwei 6-Kavitäten Platten in denen in jeder Kavität eine andere Zelllinie ausplattiert wurde. Diese Zellen wurden mit pAd-COX-E2F mit einer MOI von 5 infiziert. Nach 4 Tagen wurden die Zellen fixiert und gefärbt. Auf Grund der Menge wurde darauf verzichtet alle Konstrukte als Lichtbild zu zeigen. Im unteren Teil des Bildes wurde in den skizzierten 6-Kavitäten Platten die Anordnung der Zelllinien dargestellt.

4. Ergebnisse

52

Dabei konnte gezeigt werden, dass das AdV, das E2F1 als Promotor in der E1-Region enthält,

in allen Tumoren repliziert, jedoch nicht in primären Zellen und Keratinozyten. Dies gilt aber

nur für die Konstrukte in denen der E4-Promotor durch COX-2, Ki-67 oder Midkine ersetzt

wurde.

Bei den Konstrukten mit Mk und Ki-67 wurde eine höhere Spezifität des Virus erreicht, wenn

auch die E4-Region unter heterologe Promotorkontrolle gestellt wurde. Jedoch brachte die

Kombination des gleichen heterologen Promotors zur Kontrolle der E1- und der E4-Region

nur eine leichte Veränderung in der Spezifität des Virus. In ein paar Fällen replizierte das

Virus stärker als in einer Kombination mit zwei verschiedenen heterologen Promotoren. Alle

Viren, deren E1-Region durch COX-2-, Ki-67- oder Midkine-Promotoren kontrolliert wurden,

zeigten eine Spezifität für Pankreas- und Kolonkarzinome, jedoch replizierten sie auch in den

Lungenepithelzellen A549, jedoch nicht in den Keratinozyten, die als Kontrolle dienten. Die

Kombination von COX-2 zur Regulation der E1-Region und Ki-67 zur Regulation der E4-

Region zeigt eine erhöhte Spezifität zu Kolon- statt zu Pankreaskarzinomen.

4. Ergebnisse

53

Abb. 18A: Replikationsverhalten der 20 getesteten BRAVs Bildunterschrift siehe Abbildung 18B auf der nächsten Seite.

4. Ergebnisse

54

Abb. 18 B: Replikationsverhalten der 20 getesteten BRAVs Untersucht wurde die Spezifität der Replikation der adenoviralen Konstrukte, die heterologe Promotoren zur Kontrolle der E1- und der E4-Region besitzen. Dazu wurden 12 verschiedene Zelllinien, wovon drei als Kontrolle dienten (HaCaT, JB6 und K-1-17), mit den bedingt replikationkompetenten Adenoviren mit einer MOI von 5 infiziert. Nach vier Tagen wurden die Zellen fixiert und mit Kristallviolett angefärbt. Die Stärke der Violettfärbung wurde mit der NIH Software ImageJ quantifiziert.

5. Diskussion

55

5. Diskussion

5.1 Promotoranalyse

Um bedingt replikationskompetente adenovirale Vektoren (BRAV) zur Onkolyse

herzustellen, die auf der transkriptionellen Ebene kontrolliert werden, ist es unverzichtbar

Promotoren zu finden, die in dem Zielgewebe, in diesem Fall in Pankreas- und

Kolonkarzinomen, aktiv sind und in anderem, gesunden Gewebe nicht. Dazu wurden

verschiedene gewebespezifische und proliferationsabhängige Promotorfragmente getestet.

Auf Grund der limitierten Verpackungskapazität eines Adenovirus musste die Wahl der

Fragmente ein Kompromiss aus Erhalt der Spezifität des Promotors und Fragmentlänge sein.

Das Ziel war es, Promotoren mit einer maximalen Größe von 1 kb einzusetzen. Da die

Promotoren im Genom häufig eine Länge von mehreren kb und nicht selten eine Länge von

10 kb besitzen ist von vorneherein nicht die beschriebene Promotorspezifität zu erreichen. Für

Pankreas- und Kolonkarzinome konnten drei Promotorfragmente gefunden werden, die in

ihrer Schnittmenge hauptsächlich in den beiden Gewebetypen aktiv sind und in anderen keine

Aktivität aufweisen. Zu diesen Promotoren gehörten der COX-2-, Midkine- und Ki-67-

Promotor. Zu weiteren Untersuchungszwecken wurde auch noch der E2F1-Promotor

analysiert, denn die Tumore befinden sich meist, im Gegensatz zum umliegenden gesunden

Gewebe, in S-Phase, in welcher dieser Promotor aktiv wäre.

In einer größeren Zahl von Veröffentlichungen wurde festgestellt , dass gewebe- oder

tumorspezifische Promotoren in ihrer Stärke oder Spezifität beeinflusst werden, wenn sie in

einen adenoviralen Vektor gesetzt werden 136-139, währenddessen andere diesen Effekt nicht

beobachteten 140-146. In den meisten dieser Veröffentlichungen wurden verschiedene

Reportergen-Assays verwendet. Die Wahl des Reportergen-Assays kann aber die Ergebnisse

beeinflussen. Zwei hauptsächlich verwendete Assayformen in Genexpressionsstudien sind

CAT und Luciferase. CAT besitzt einen engen dynamischen Messbereich und eine

Halbwertszeit von 50 h in Säugetierzellen, was nützlich zur Messung von kumulativen

Änderungen in der Genexpression ist 147,148. Im Gegensatz dazu hat Luciferase eine

Halbwertszeit von nur 3 h, welches eine Messung einer Promotoraktivität an einem

diskreteren Zeitpunkt ermöglicht 149. Die CAT-Assay-Prozedur produziert im Allgemeinen

eine größere Differenz in der Promotoraktivität als der Luciferase-Assay. In der vorliegenden

Arbeit wurde ein transienter Luciferase-Reporter-Assay verwendet, wobei ein Plasmid,

welches Elemente zur Analyse von möglichen regulatorischen Sequenzen enthält, eingesetzt

wurde. Dieses kann zur Analyse des Einflusses von adenoviralen Sequenzen und

5. Diskussion

56

Genprodukten auf heterologe Promotoren mit wtAdV überinfiziert werden. Da die

Herstellung von adenoviralen Vektoren, die einen zu testenden heterologen Promotor tragen,

ein sehr zeitaufwändiger Prozess und die exakte Bestimmung von infektiösem adenoviralen

Titer problematisch ist, wurde das vorliegende Testverfahren ausgewählt, da dieses die

Probleme umgeht 150.

Plasmid-basierende Transfektions-Assays für Promotorstudien, welche einen internen

Standard nutzen, sind schnell und hoch reproduzierbar. Durch Kalziumphosphat-basierende

Transfektions-methoden gelangen ca. 50 Kopien der DNA in eine Zelle 151, währenddessen

durch adenovirale Infektionen ca. 104 Kopien DNA in eine Zelle gelangen 41. Der Effekt des

AdV (nt 1-353)-Segmentes und/oder der frühen adenoviralen Genprodukte, welche in dieser

Arbeit untersucht worden sind, könnten im adenoviralen System stärker ausgeprägt sein.

Im Einklang mit früheren Veröffentlichungen 152 wurde die Anwesenheit von cis-

aktivierenden Elementen in dem AdV (nt1- 353)-Segment, welche die Transkription von allen

getesteten viralen Promotoren und die des zellzyklusabhängigen E2F1-Promotors

beeinflussten, gezeigt. Dieser Effekt wurde von der Position des AdV-Segmentes zur RNA-

Startseite oder durch die Anwesenheit einer Polyadenylisierungs-Sequenz stromaufwärts vom

Promotor nicht beeinflusst. Dies deutet darauf hin, dass ein Enhancer im diesem AdV-

Segment vorhanden ist.

Des Weiteren ist die Aktivität der COX-2-Promotoren erhöht, wenn das AdV (nt 1-353)-

Segment stromaufwärts des Promotors lokalisiert ist. Der Effekt verschwindet, wenn dieses

Fragment stromabwärts vom Promotor oder eine polyA-Sequenz vor dem Promotor eingesetzt

ist. Dieses deutet auf eine kryptische Transkriptionsstartseite in dem AdV-Segment hin. Die

Aktivitäten des MK- und des Ki-67-Promotors wurden nicht durch das AdV (nt 1-353)-

Segment verändert. Diese Daten deuten darauf hin, dass die adenovirale E1A stromaufwärts

liegende regulatorische Region (URR) bevorzugt virale und zellzyklusabhängige Promotoren

transaktiviert. Schon in vorangegangenen Veröffentlichungen wurde gezeigt, dass die E1A

URR auf einige, aber nicht auf alle, Promotoren einen Einfluss hat. Die Beobachtung ist im

Einklang mit dem aktuellen Verständnis von Enhancern. Enhancer können über eine große

Distanz wirken und interagieren mit nahezu jedem Typ von Promotor, es ist aber wichtig für

die Genregulation, dass ein Enhancer nur die ihm zugehörigen Promotoren beeinflusst, nicht

jedoch andere Promotoren. Ein Modell, genannt „enhancer Promotor-selectivity“, sagt aus,

dass inhärente Eigenschaften vom Promotor und Enhancer eine Interaktion ermöglichen,

während andere keinen Einfluss haben. Diese Promotor-Enhancer-Interaktionen werden durch

Proteine, die an der DNA an Enhancer und core-Promotor binden, gesteuert 153,154. Um diesen

5. Diskussion

57

Effekt zu überwinden, wurden Insulatoren im adenoviralen Kontext analysiert, jedoch mit

wechselhaftem Erfolg 155,156.

Die Aktivität des E2F1 und der viralen Promotoren wurde auch durch die frühen adenoviralen

Genprodukte, wie schon vorher beschrieben, beeinflusst 157. Verantwortlich für diesen Effekt

ist die frühe Expression der adenoviralen Proteine der E1A-Region, welche die Zellen durch

Bindung von pRB und andauernde Freisetzung von E2F-Transkriptionsfaktoren in die S-

Phase bringt. Dies hat eine Zellprogression und die verstärkte Aktivität von Promotoren, die

E2F-Bindungsmotive enthalten, zur Folge 158,159. Des Weiteren aktiviert E1A durch direkte

Bindung an verschiedene zelluläre Faktoren, z.B. an Proteine der ATF-Familie 160 und an

YY1 161, die Transkription. Innerhalb der adenoviralen E1A URR wurden verschiedene

Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, die im Zellzyklus involviert sind, wie z.B. zwei

E2F-Bindestellen, identifiziert 162,163. Die E1A URR ist verantwortlich für die Autoregulation

der E1A-Gene auf der Ebene der Transkription 164.

Diese Daten sind nicht nur relevant für das transkriptionelle Targeting von

replikationsdefekten adenoviralen Vektoren, sondern auch für replikationskompetente

adenovirale Vektoren in der Tumor-Gentherapie. Das transkriptionelle Targeting von bedingt

replikationkompetenten adenoviralen Vektoren scheint nur bedingt eine gute Wahl zu sein,

denn drei Gründe sprechen gegen diese Vektorvariante: Als erstes können die cis-agierenden

adenoviralen regulatorischen Elemente, die weiter oben beschrieben wurden, die Spezifität

der heterologen Promotoren beeinflussen. Als zweites kann genannt werden, dass schon

geringe Mengen an E1A-Genprodukten ausreichend sind um die adenovirale Replikation zu

initiieren 165. Als dritter Grund sollte auch die positive Rückkopplungsschleife („feedback

loop“) genannt werden, denn bei dieser wird der heterologe Promotor, der die E1A-Region

kontrolliert, durch die Genprodukte der E1A-Region transaktiviert, was dann zu einem

Verlust an Spezifität führt 166-169.

Die wichtigste Rolle im BRAV kommt dem heterologen E1A-Promotor zu, dieser Promotor

muss auch im adenoviralen Umfeld noch immer seine Spezifität bewahren und nicht durch

adenovirale Produkte transaktiviert werden. Dieser heterologe Promotor darf auch keine

Basalaktivität besitzen, da, wie schon oben erwähnt, eine geringe Menge an E1A-

Genprodukten zur viralen Replikation ausreicht.

In einem Versuch, Bindungsstellen in den Promotorsequenzen zu finden, welches

Vorhersagen auf Elemente, welche die Aktivität des heterologen Promotors verändern,

zulässt, wurden diese mit der „Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen“-Suchmaschine

„TFSEARCH“ Version 1.3 (URL: http://cbrc.jp/research/db /TFSEARCH.html) analysiert 170.

5. Diskussion

58

Der „Threshold score“ wurde bei der Analyse auf 90% gesetzt. Es konnten aber keine

Übereinstimmungen von vorhergesagten Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in den

heterologen Promotoren und dem cis- oder trans-aktivierendem AdV-Element gefunden

werden.

Das System aus transienten Plasmid-basierenden Luciferase-Assays und adenoviralen

Überinfektionen, ist ein Werkzeug um eine schnelle Identifikation von Promotoren, die ihre

Spezifität im adenoviralen Umfeld behalten, zu erreichen.

Diese Beobachtungen, die im Plasmid-basierenden Luciferase-Assay gemacht wurden,

konnten auch im adenoviralen Umfeld bestätigt werden. Dazu wurden die Promotoren mit

polyA und Luciferase-Expresionskassette in den pShuttle-Vektor kloniert und dann mittels

homologer Rekombination mit dem pAdEasy1-Vektor zu Volllänge adenoviralen Genomen

rekombiniert. Mit den davon hergestellten AdVs konnte ein Luciferase-Assay durchgeführt

werden, der dem oben beschriebenen sehr ähnlich ist. Dieser Assay zeigte die

Vergleichbarkeit der beiden Systeme, da die Ergebnisse qualitativ miteinander vergleichbar

sind. Jedoch ist das AdV-basierende System zeitlich um ein vielfaches langsamer als das

Plasmid-basierende System.

5.2 Analyse der bedingt replikationskompetenten adenoviralen Vektoren

Um einen bedingt replikationskompetenten adenoviralen Vektor für die Onkolyse von

Pankreas- oder Kolonkarzinomen zu erhalten, wurde die transkriptionelle Kontrolle gewählt.

Da in mehreren Veröffentlichungen gezeigt wurde, dass die heterologe Promotorspezifität im

adenoviralen System beeinflusst wird 138,171-173, musste eine weitere Möglichkeit zur

Genregulation und zum Erhalt der heterologen Promotorspezifität im adenoviralen Kontext

gezeigt werden. Als erstes wurde die Wirkung des Enhancereffektes und der alternativen

Startstelle im AdV auf die heterologen Promotoren untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass

die Wahl des heterologen Promotors, der die E1-Region des AdVs kontrollieren soll, ein

wichtiger Schritt ist. Als erstes darf dieser Promotor durch den adenoviralen Enhancer nicht

induzierbar sein. Als grober Richtwert für die Wahl des heterologen Promotor gilt: Es sollte

kein Promotor sein, der durch S-Phasen-Eintritt aktiviert wird, da das Virus selbst die Zelle in

die S-Phase bringt und es sollten im Promotor keine DNA-Bindungstellen für regulatorische

Proteine vorhanden sein, die im Zellzyklus involviert sind. Als nächstes konnte festgestellt

werden, dass die Basalaktivität des heterologen Promotors im adenoviralen Umfeld durch ein,

dem Promotor vorangestelltes, synthetisches Polyadenylierungs-Signal stark reduziert werden

5. Diskussion

59

kann. Bisherige Ansätze verfolgten die transkriptionelle Kontrolle der adenoviralen

Replikation nur durch einen heterologen Promotor zur Regulation der E1A-Region. Häufig

wurde die E1A-Region mittels einer IRES-Sequenz mit einem therapeutischen Gen gekoppelt,

so dass es bei einer Transkription von E1A direkt zur Translation des therapeutischen Gens

kommt. Jedoch besitzen viele dieser Vektoren den Nachteil, dass die Gewebespezifität nicht

gegeben ist, da die Promotoren eine geringe Basalaktivität besitzen oder durch virale

Sequenzen oder Genprodukte transaktiviert werden. Daher kam es zum Aufschaukeln der

E1A-Genprodukte, welche durch die positive Rückkopplung entstand 174. Ein in letzter Zeit

verfolgter Ansatz war die heterologe Regulation eines zweiten frühen Gens, der E4-Region.

Dabei wurden, in zwei verschiedenen Ansätzen, zwei Promotoren in das adenovirale Genom

zur Regulation integriert 175,176. Beide Ansätze verfolgten aber nur die Möglichkeit jeweils

den gleichen heterologen Promotor zur Kontrolle der E1A- und der E4-Region zu verwenden.

Wenn aber der Promotor der E1A-Region durch die adenoviralen Genprodukte oder durch

den Enhancereffekt des AdV (nt 1-353)-Segmentes beeinflusst wird, so wird auch derselbe

Effekt für den gleichen heterologen Promotor der E4-Region zu beobachten sein. Daher wird

nur eine Spezifitätserhöhung des BRAV wegen der fehlenden Beeinflussung des heterologen

E4-Promotors durch die alternative Startseite, die nur im 5’ITR vorhanden ist und nicht im

3’ITR, erwartet.

In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Ansatz der doppelten heterologen

Promotorkontrolle der E1A- und E4-Region gewählt. Vor beide Promotoren wurde jeweils

ein synthetisches polyA-Signal gesetzt um die Basalaktivität der heterologen Promotoren zu

minimieren. Es wurden zwei unterschiedliche Promotoren zur Kontrolle der E1A- und der E4-

Region verwendet. Als therapeutisches Gen wurde das in unserer Arbeitgruppe analysierte

Gen HSV-tk verwendet. Aus den vorangegangenen Experimenten wurden die Promotoren

COX-2, Midkine, Ki-67 und E2F1 verwendet. Dadurch entstanden vier Vektoren mit nur

einem heterologen Promotor zur Regulation der E1A-Region und 16 Vektoren, in denen

jeweils zwei heterologe Promotoren zur Kontrolle der E1A- und E4-Region verwendet

wurden.

Als erstes sollen nur die BRAVs mit einem E2F1-Promotor zur Kontrolle der E1A-Region

betrachtet werden. Deregulation des Retinoblastoma-Proteins (pRB) und des E2F-

regulatorischen Weges sind eine Grundeigenschaft von humanen Tumoren. Daher wurde

unter anderem der E2F1-Promotor, der die frühen adenoviralen Gene kontrolliert, zur

Replikationskontrolle ausgesucht. Wie schon vorher erwähnt, konnte E2F1-Promotoraktivität

in der G0-Phase oder in mitotisch arretierten Zellen nachgewiesen werden. Des Weiteren

5. Diskussion

60

konnte gezeigt werden, dass adenovirale Sequenzen und frühe adenovirale Genprodukte die

Aktivität des E2F1-Promotors erhöhen. Die Beobachtungen mit Vektoren, in denen die E1A-

Region mit E2F1 kontrolliert wurde, stimmen mit diesen Befunden überein. Die Vektoren

zeigten keine Gewebespezifität, sondern replizierten in nahezu jedem Gewebe, unabhängig

davon, ob es sich um Keratinozyten oder um tumoröses Gewebe handelte. Resultierend kann

zu den E2F1-Varianten gesagt werden, dass diese Vektoren zur spezifischen Onkolyse nicht

geeignet sind, sondern nur unspezifisch in Tumore replizieren. Dieselben Beobachtungen

machten auch die Arbeitsgruppe um Johnson et al. an Ihren Vektor in dem die E1A- und E4

Region durch identische E2F1-Promotoren kontrolliert werden 177.

Bei den anderen Vektoren, bei denen E1A unter der Kontrolle von COX-2, Midkine und Ki-

67 steht, konnte eine Tumorspezifität gezeigt werden. Dabei stellte sich heraus, das die

Funktion des heterologen E1A-Promotors eine größere Rolle spielt als die des heterologen

E4-Promotors. Dieses korrespondiert mit den vorangegangenen Veröffentlichungen und

Beobachtungen, denn die Rolle des E4-Promotors ist nur eine untergeordnete. Wenn der E1A-

Promotor eine Basalaktivität besitzt, kommt es zum Aufschaukeln von frühen viralen

Genprodukten, vor allem E1A, und somit zur viralen Replikation. Der heterologe Promotor

der E4-Region kann nur die Spezifität des Vektors effektiv erhöhen, wenn der E1A-Promotor

nicht von adenoviralen Sequenzen oder frühen Genprodukten beeinflusst wird. Bei dem

Einsatz von gleichen heterologen Promotoren zur Regulation der E1- und E4-Regionen

kommt es zu einem ähnlichen Replikationsmuster in den verschiedenen Geweben wie mit nur

einem heterologen Promotor vor der E1A-Region. Daher führt der Ansatz mit zwei

verschiedenen heterologen Promotoren zur Kontrolle der E1- und E4-Region zu einer

Verbesserung der Tumorspezifität von BRAV. Ähnliche folgerungen konnten Hernandez-

Alcoceba et al. in ihrem adenoviralem Vektor mit dualem Promotor zeigen, dieser Vektor

besitzt ein PSA spezifisches Promotor-System 178.

Aus den in vitro-Experimenten kann gefolgert werden, dass Viren, deren heterologe

Promotoren aus COX-2, Midkine oder Ki-67 bestehen, präferentiell in Pankreas- und

Kolonkarzinome replizieren und das BRAV pAd-COX-Ki Pankreaskarzinom- spezifisch ist.

Des Weiteren ist das Adenovirus mit dem E1 heterologen Promotor E2F1 und Cox-2, Ki-67

oder Midkine als E4 heterologen Promotor, als nicht tumorspezifischer onkolytischer Vektor

geeignet. Weitere Aussagen lassen sich erst durch ein in vivo-Experiment im permissiven

Tiermodell treffen.

6. Ausblick

61

6. Ausblick

Die Ergebnisse, die im in vitro-Experiment gezeigt werden konnten, müssen noch im

Xenograft-Tiermodell bestätigt werden. Dazu müssen die bedingt replikationkompetenten

adenoviralen Vektoren (BRAV) amplifiziert und gereinigt werden. Anschließend können

diese im Tiermodell durch subkutane, intraperitoneale oder in den Pankreas gesetzte Tumore

getestet werden. Dazu wurden verschiedene Tumorzelllinien, die stabil Luciferase

exprimieren, entwickelt. Diese kann man dann mittels einer hochsensitiven Kamera im Tier

direkt durch i.p. Gabe von D-Luciferin quantitativ erfassen, wodurch eine nicht invasive

Beobachtung der Tumorregression möglich ist. Des Weiteren soll versucht werden, die

Tumorspezifität durch einen dritten heterologen Promotor weiter zu erhöhen. Gleichzeitig soll

die transkripionelle Kontrolle mit der transduktionellen Kontrolle kombiniert werden. Mit

dieser BRAV-Variante wird eine noch höhere Tumorspezifität erwartet.

Im Anschluss soll versucht werden, die in vivo-Experimente mit primären humanen Zellen,

sowohl Tumoren, als auch gesundem Gewebe, zu wiederholen. Dazu müssen aber geeignete

und charakterisierte Gewebeproben vorliegen.

In unserer Arbeitsgruppe wird zurzeit ein permissives Tiermodel für das Adenovirus

untersucht. Sollte ein geeignetes gefunden werden, dann sollten die BRAV auch in diesem

eingesetzt und eine Biodistributionsstudie durchgeführt werden.

7. Zusammenfassung

62

7. Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit sollten bedingt replikationskompetente adenovirale Vektoren

(BRAV) zur Onkolyse von Pankreas- und Kolonkarzinomen entwickelt werden. Der Ansatz

dazu war, die adenovirale E1- und die E4-Region unter heterologe Promotorkontrolle zu

setzen. Diese Promotoren sollen das Adenovirus nur in Pankreas- und in Kolonkarzinomen

replizieren lassen.

Als erstes wurden dazu verschiedene Promotoren ausgesucht und auf deren Gewebespezifität

mit einem transienten Luciferase-Assay untersucht. Anschließend wurde ein System

entwickelt, in dem diese Promotoren leicht und schnell auf ihre Transaktivierbarkeit im

adenoviralen Umfeld und der Einfluss des AdV (nt 1-353)-Segmentes, welches eine

alternative Transkriptionsstartstelle und nicht-spezifische Enhancer-Aktivität besitzt, getestet

werden können. Dieses System zeigte auf, dass die Basalaktivität eines heterologen

Promotors, der den adenoviralen E1-Promotor ersetzen soll, stark reduziert werden muss.

Ansonsten käme es durch die transaktivierende Eigenschaft von E1A-Genprodukten zu einem

Aufschaukeln der Expression und damit zur Replikation des Virus. Als Promotoren kamen

drei Promotoren für einen BRAV infrage, COX-2, Ki-67 und Midkine. Des Weiteren wurde

der unspezifische, aber proliferationsabhängige Promotor E2F1 für weitere Untersuchungen

in Betracht gezogen, da sich Tumore in ihrer Proliferation von dem gesunden, benachbarten

Gewebe unterscheiden.

Als nächster Schritt musste ein Vektorsystem entwickelt werden, welches die Manipulation

der E1- und der E4-Region erlaubt. Dazu wurde ein auf dem AdEasy-System basierendes

Plasmidsystem kloniert. Da zum Erhalt der Spezifität der heterologen Promotoren die

Fragmentlänge größer ist, als die der viralen Promotoren und im BRAV ein therapeutisches

Gen mit IRES-Sequenz untergebracht werden soll, musste versucht werden durch weitere

Deletionen, außer in der E3-Region, mehr Platz im viralen Genom zu erhalten. Dazu wurde

ein Transkomplementierungstest mit einem E4-deletierten Adenovirus (dl1011) und

transfizierten E4-orf-Expressionsplasmiden in Luciferase-exprimierenden HEK-293-Zellen

etabliert. Dabei wurde festgestellt, dass eine E4-Region, die die orfs 3, 4, 6 und 6/7 enthält,

eine ausreichende Replikation ermöglicht. Da aber die untersuchten und weiter verwendeten

heterologen Promotoren relativ klein waren, war es nicht nötig die E4-Region zu verkleinern.

Im abschließenden Experiment wurden die BRAVs in vitro getestet und die Replikation

mittels Kristallviolett-Färbung analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass Viren, deren

heterologe Promotoren aus COX-2, Midkine oder Ki-67 bestehen, Pankreas- und

7. Zusammenfassung

63

Kolonkarzinomspezifisch replizieren und das BRAV pAd-COX-Ki Pankreaskarzinom-

spezifisch ist. Des Weiteren konnte ein Tumortyp unspezifischer BRAV mit dem E1A

heterologen Promotor E2F1 entwickelt werden, der im in vitro-Experiment viel versprechende

Ergebnisse lieferte.

8. Quellenangaben

64

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specificity promoter for selective induction of apoptosis in breast cancer cells. Cancer

Gene Ther. 2001; 8: 298-307.

9. Dissertationsbezogene bibliographische Daten

86

9. Dissertationsbezogene bibliographische Daten

Publikationen:

Hoffmann D, Jogler C, Wildner O (2004). Effects of the Ad5 upstream E1 region and Early

Gene Products on Heterologous Promoters. J. Gene Med. Im Review.

Jogler C, Hoffmann D, Uberla K, Wildner O (2004). Evaluation of Swine as an Animal

Model for Replication-Competent Human Adenoviral Vectors. Hum. Gene Ther. Im Review.

Kuate S, Stefanou D, Hoffmann D, Wildner O, Uberla K (2004). Production of lentiviral

vectors by transient expression of minimal packaging genes from recombinant adenoviruses. J

Gene Med. 6, 1197-1205.

Wildner O, Hoffmann D, Jogler C, Uberla K (2003). Comparison of HSV-1 thymidine kinase-

dependent and -independent inhibition of replication-competent adenoviral vectors by a panel

of drugs. Cancer Gene Ther. 10, 791-802.

Präsentationen:

Development of tumor-specific, oncolytic adenoviral vectors for treatment of pancreatic

carcinoma.

Jahrestagung 2004 der Gesellschaft für Virologie in Tübingen, 17.-20. März 2003

Comparison of HSV-1 thymidine kinase dependent and independent inhibition of replication-

competent adenoviral vectors by a panel of drugs.

Jahrestagung 2004 der Gesellschaft für Virologie in Tübingen, 17.-20. März 2003

Comperative in vitro and in vivo antiviral activity of nucleoside analogs against replication-

competent adenovirus vector expressiong HSV-tk.

Jahrestagung 2003 der Gesellschaft für Virologie in Berlin, 26.-29. März 2003

10. Lebenslauf

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10. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Dennis Hoffmann

Geburtsdatum: 24. März 1973

Geburtsort: Oberhausen

Schulausbildung:

1980 – 1984 Hegelschule in Oberhausen

1984 – 1994 Abtei-Gymnasium in Duisburg-Hamborn

Wehrdienst

1994 – 1995 1. RakArtBat 150 in Wesel

Studium:

WS 1995/96 - SS 2001 Studium der Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum

7. Januar - Diplomarbeit in der Pharmakologie und Toxikologie der Ruhr-

7. September 2001 Universität Bochum über „Identifizierung von mit der lös-

lichen Guanylyl-Cyclase interagierenden Proteine“

Promotion:

seit 1. Oktober 2001 Wissenschaftlicher Mitarbeiter der Abteilung für Molekulare

und Medizinische Virologie an der Ruhr-Universität Bochum

18. Juni 2002 Sophia & Fritz Heinemann Preis zur Förderung der

Entwicklung von Gentherapien mittels Adenoviren gegen

Glioblastome

Entwicklung von tumorspezifischen replikations-kompetenten ... · τουτον δη τον...

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