Dr. Horvth FerencSZTE, Nvnybiolgiai TanszkAnyagtranszport s mechanizmusai

A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdseAz anyagtranszportot ngyfle hajter mozgatja:

koncentrci, hidrosztatikus nyoms, (gravitci) s elektromos mezj - j anyag (elektro)kmiai potencilja

j0 j anyag standard kmiai potencilja R egyetemes gzlland (8,314 J mol-1 K-1)T abszolt hmrsklet (K)a aktivits, tlts nlkli oldatoknl: Cj molris koncentrciVj j anyag parcilis molris trfogataP hidrosztatikai nyomsz az anyag tltse F- Faraday lland (96500 coulomb / mol proton)E elektromos potencil A kmiai potencil mrtkegysge a J mol-1.

A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdsePasszv transzport:

A sejt nem fektet be metabolikus energit az anyag felvtelre.

1. A transzport hajtereje: kt pont kztt fennll kmiai potencil klnbsg DIFFZIS MOZGS

Passzv transzporttal mozog:a vzgzok: oxign, szndioxid,N oxidok, kndioxid stb.lipidoldkony, apolros anyagok (benzin, sznhidrognek, aroms szennyezdsek), ionok (bizonyos esetekben)

S anyag kmiai potencilja:A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdseElektromosan tltetlen anyagok kmiai potenciljaA kmiai potencil klnbsge:Kt vizes teret hatrol membrn esetn:Mindig a citoplazmhoz viszonytunk.Ez a koncentrci-klnbsgben raktrozott energia.

A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdseDmS eljele fontos, hapozitv a citoplazmba az S anyag energiaignyes, aktv mdon jutnegatv a citoplazmba az S anyag passzv mdon jut0 nincs koncentrci-klnbsgA transzport irnya

A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdseVegynk egy z tltssel rendelkez iont (I):

Elektrokmiai potencilmembrnpotencil

Aktv transzport

A sejt metabolikus energit fektet be az anyag felvtelhez.

Elsdleges aktv transzport: ionpumpkNvnyekben a proton-transzlokl ATP-zok (H+-ATP-z)- lokalizci: plazmamembrn, vakulum membrn (tonoplaszt)- az ATP hidrolzisvel felszabadul energit a proton sejtfalba ill. vakulumba irnyul transzportjra hasznlja;Eredmny: proton elektrokmiai potencil gradiens proton mozgat er (pmf)

Msodlagos aktv transzport:

A pmf felhasznlsa ms anyagok transzportjban- ezek a transzporterek lehetnek hordozk s csatornk

A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdse

A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdseProton mozgat er (pmf): a protonra vonatkoz transzmembrn elektrokmiai potencilklnbsg, voltokban kifejezvez = +1A pmf-et voltokban fejezzk ki s nem J/mol egysgekben, gyTeht 1 pH egysg klnbsg 59 mV elektrokmiai potencilvltozst jelent a protonmozgat erben!

A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdsepH: 5,5pH: 7,5Vm = -150 mVDpH = -2pmf = -268 mVA protonpumpk mkdse elektrogn:gy nem csak a pH klnbsg ellltsn keresztl nvelik a pmf abszolt rtkt, hanem a Vm rtkt is negatvabb teszik.A proton elektrokmiai potencil-grdiensben rejl energia a msodlagos aktv transzportban hasznosul

A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdsePeter Mitchell 1960-as vek (Nobel dj, 1978).A sejt energiatermelse s a H+ elektrokmiai potencil-gradiense kztti sszefggs.ATP ADP+Pi+pmf

Kemiozmotikus hipotzis

A membrntranszport alapjai2. A membrntranszport szervezdseAz ionpumpk tviteli szma kicsi, s pmf-et generl a hordozk szmra is, ezrt jval nagyobb a koncentrcija a membrnban, mint a csatornk.

IonpumpkHordozkIoncsatornktviteli szm (db molkekula/msodperc)102103106 108Membrnon vett srsg (db/mm2)100-100010-1001-10

Pumpk

F-tpus H+-ATPzokbels mitokondrilis s tilakoid membrn

P-tpus H+-ATPzokgomba PM H+-ATPznvny PM H+-ATPz Na+ / K+ ATPz (llati sejtek)Ca2+-ATPzok (nvny s llat PM s endomembrnok)H+ / K+ cserl ATPz (emls gyomor mucosa rteg)

V-tpus H+-ATPzok

Vakuolris proton pirofoszfatz (H+-PPz)

ABC-tpus pumpkA membrntranszport alapjai3. Pumpk

A membrntranszport alapjai3. PumpkF-tpus H+-ATPzok a bels mitokondrlis membrnon s a tilakoid membrnon tallhatk a redoxpotencil ill. a fny energijbl pmf keletkezik a pmf hajtja a H+ ramlst az F-tpus ATPzon keresztl ATP szintetizldikF0 (mitokondrium) CF0 (kloroplasztisz) alegysg

ab2c9-12A c alegysgek forognak a proton transzlokci sorn, ami a g alegysget prgeti, gy a b nukleotidkt helyek konformcivltozst szenvednek..F1 (mitokondrium) CF1 (kloroplasztisz) alegysg

a3b3gde3 db b alegysg: 3 nukleotidkt domn

A membrntranszport alapjai3. PumpkJohn Walker s Paul Boyer (Nobel dj, 1997)Ktsvltoztat mechanizmusGyenge ktds: az aktv centrum gyengn kti az ADP-t s Pi-tErs ktds: az ATP molekula kialakulNyitott konformci: ATP levls

3 db H+ tjutsa alatt szintetizldik 1 ATP molekula.

ADP + Pi

ATP

ATP

ATP

ADP

+ Pi

ATP

ADP

+ Pi

ATP

open

tight binding

loose binding

repeat

Binding Change Mechanism

a

subunit

ring of

c subunits

H+

H+

A membrntranszport alapjai3. PumpkP-tpus ATPzok csaldja1 db 100 kDa-os protein, ATP-t kt s H+ transzportot katalizlFunkcii: - pmf (Vm) generlsa (hordozk s ioncsatornk) - sejtfal savanyts (auxin hozzadsa utn 2 perccel!) expanzin enzimek aktivldnak, amelyek a H-ktseket laztjk sejtfal nvekeds - H+ eltvoltsa a sejtbl (anyagcsere folytonosan termeli) - a citoszol pH-jnak szablyozsa (7,3-7,5): a H+-ATPz pH-optimuma 6,6, teht ha savas a kzeg, akkor jobban mkdik

Hatkonysga: 1 proton / 1 MgATP hidrolzise

Reakciciklus: E1 konformci H+ ktdik hozzAz ATP hidrolzise, s a foszft-csoport enzimhez val kapcsoldsa az E2 konformci kialakulst eredmnyezi.E2 alacsony affinits a H+-ra nzve, gy az a tloldalon levlik.Az enzim-foszft kts hidrolzise sorn Pi disszocildik, s az enzim E1 konformciba tr vissza.

A membrntranszport alapjai3. PumpkA foszftcsoport kovalens ktdse (E-P) megklnbzteti az F-tpus ATPzoktl.

Az enzimcsald tagjai:gomba PM H+-ATPznvny PM H+-ATPz Na+ / K+ ATPz (llati sejtek) (Skou, Nobel dj, 1997)Ca2+-ATPzok (nvny s llat PM s endomembrnok)H+ / K+ cserl ATPz (emls gyomor mucosa rteg)

Kzs tulajdonsgok:ortovanadttal (H2VO4-) val gtolhatsgdomn struktra azonossga (fleg az ATP-kt domn konzervlt a klnbz pumpk kztt)D aszparaginsav (foszforilldik)ATP-kt domnA defoszforilciban rsztvev hurokAutoinhibcis domn

A membrntranszport alapjai3. PumpkA P-tpus ATPzokat egy multign-csald kdolja, mely szvetspecifikus expresszit mutatArabidopsis (ldf) esetn AHA gncsald (10 tag, 10 izoformt kdol)pl. AHA3 flom AHA10 fejld magvakMagyarzat: ms s ms az ATP-re vonatkoz KM rtk, ms az ortovanadtra val rzkenysg Szvetspecifikus P-tpus ATPz gnexpresszi Arabidopsisban.

szrkeresztmetszet, az AHA3-c-Myc fzis protein immunofluoreszcens kimutatsa P flom, C kortiklis sejtek, X xilmAHA10 gn promternek expresszija fejld magvakban, b-glkuronidz (GUS) festssel. A nyilak kt magot mutatnak a bectermsben. A kk szn az AHA10-GUS fzis protein termeldst mutatja.

A membrntranszport alapjai3. PumpkA P-tpus ATPzok szablyozsa

- pH-tl val fggs- a C-terminlis autoinhibcis domn (ennek eltvoltsa vagy pontmutci benne mdostja az enzim mkdst)- az auxinnak hatsa a pumpa expresszijnak nvelsben van

A fuzikokcin (Fusicoccum amygdali gomba toxinja) nveli a zrsejtek turgort sztmanyitds, levlszrads1994 a fuzikokcin receptora a szignl-transzdukcis proteinek csaldjbl val 14-3-3 protein14-3-3 proteinek dimerek, melyek a clproteinre (foszforillt szerin rezidulist tartalmaz) vonatkoz konszenzus szekvencival rendelkeznek

A membrntranszport alapjai3. PumpkA C terminus autoinhibcis domnknt viselkedik.

A szerin foszforilcija s a ktd 2 db 14-3-3 protein megsznteti a gtlst s aktivlja az enzimet (balra)

Az enzimet foszforilci hjn a fuzikokcin + 14-3-3 proteinek is aktivlhatjk

A membrntranszport alapjai3. PumpkNa+ / K+ ATPz (llati sejtek)

A membrntranszport alapjai3. PumpkA Ca2+-ATPzMegtallhat: PM, ER, kloroplasztisz membrn, vakuolris membrnokCa2+-ot pumplnak ki a citoszolbl, [Ca2+]cyt = 0,2 mM

llati sejtekben rszletesen tanulmnyozott pumpk: Vakuolris PM-tpus Ca2+-ATPzA Ca2+ tjuttatshoz sok energia kell, mert: - kint tbb Ca2+ van mint a citoszolban - a citoszol elektromosan negatvabb, mint a kls oldal

A Ca2+ eletrokmiai potencilklnbsgbl szrmaz szabadenergia: -60 kJ/molAz ATP hidrolzisbl szrmaz szabadenergia: -50 kJ/mol, ami nem elg a pumpa mkdtetshez.

Gyakran Ca2+ / H+ cserlknt mkdik!

PM-tpusER-tpusAktivcia kalmodulin a C-terminlishoz ktdiknincs kalmodulin kthelyHelye nvnyekbenPM, tonoplaszt (itt kivtelesen a kalmodulin kthely az N-terminlison van), kloroplasztisz bels membrnER

A membrntranszport alapjai3. PumpkA vakuolris (V-tpus) H+-ATPzok csoportjaFunkcija: a vakuolris tr savanytsa kb. pH 5,5-s rtkre (citrusflk gymlcsnek esetn ez akr pH 3 alatt is lehet)nemcsak a hordozk szmra energizlja a membrnt, desok vakuolris enzim (protezok, glkozidzok, foszfatzok, nukleotidzok) pH optimuma savasAz F-tpus ATPzok rokonai, de fordtott irnyban mkdnek. Sokkal sszetettebb alegysg szerkezet, mint az F-tpusnl.

Sztchiometria: 2 db H+ transzlokci / 1 ATP hidrolzis

Gtolhatsg: bafilomicin A1, a V0 szektorral lp klcsnhatsba

Elfordulsa: tonoplaszt, ER, Golgi, burkolt vezikulumok membrnja (a mitokondriumon s a kloroplasztiszon kvl minden organellum kpes fenntartani a savas bels tert.V0V1

A membrntranszport alapjai3. PumpkVakuolris proton pirofoszfatz (H+-PPz) A szervetlen pirofoszft (PPi) hidrolzisbl felszabadul energit hasznostja

Szerkezete: egyszer, kicsi (80 kDa)-os fehrje, 16 transzmembrn szegmenssel

Szubsztrtja a dimagnzium-pirifoszft (citoplazmban mM-os nagysgrendben)

Gtolhatsga: Ca2+, aminometiln-difoszfont, a mkdshez a citoplazmatikus felsznnl K+ ionoknak kell jelen lenni

Mirt van szksg ktfle protonpumpra a tonoplaszton?

Fiatal sejtekben sok PPi termeldik a hidrolzise sorn felszabadul h helyett az energia inkbb a pmf ltrehozsban hasznosul

A membrntranszport alapjai3. PumpkABC-tpus pumpkAz amfipatikus molekulk vakuolris membrnon val tjutst katalizljkpl. flavonoidok, antocianinok, a klorofill lebontsi mellktermkei, xenobiotikumok (herbicidek).Az tjutshoz ATP szksges, a transzport viszont nem cskkenti a pmf-t.

ABC = ATP binding casette elterjedt az enzimek kztt, melyek ATP-t ktnek.Walker A s B motvumNBF = nucleotide-binding fold (2 db van belle)Sok transzmembrn szegmens

A flavonoidok s xenobiotikumok glutation-konjugtumknt (GS-konjugtumok) transzlokldnak. GS=tripeptid (glutaminsav+cisztein+glicin)Glutation S-transzferz (GST) enzim vgzi a konjugtum-kpzst.

Az ABC-transzporterhez val ktds utn1, pumpaszer mkds, vagy2, flippzszer mkds.Nem tisztzott.glutation (GS)DNP dinitrofenol (xenobiotikum)NCC lineris tetrapirrolBn Brassica napusAtMRP2 Arabidopsis ABC-transzporterA membrntranszport alapjai3. PumpkABC-tpus pumpk

Hordozkuniport elektrokmiai gradiensen lefel (facilitlt diffzi)kotranszport elektrokmiai gradiensen flfelszimportantiport

Msodlagos aktv transzport: az elsdleges aktv transzportban generlt pmf hasznldik fel az anyag energiaignyes transzportjraEnergit szolgltatja: pmf (H+), Na+ s tbb tlts nlkli anyag isH+pmfszimport v. antiportanyaguniportA membrntranszport alapjai4. Hordozk

A membrntranszport alapjai4. Hordozk- a transzport alatt nem trtnik kmiai mdosuls,- a transzport kinetikja szubsztrttal val teltdst mutat- a Michaelis-Menten kinetikval kezelhetLineris szakasz:Alacsony S koncentrcin az S hordozhoz val ktdse alaktja a kinetiktMagasabb S koncentrcin a konformcis vltozs, a kthelyhez val hozzfrhetsg a limitl tnyezA maximlis sebessg felnl mrhet szubsztrt koncentrci a Michaelis-Menten lland (KM)A hordozk mkdse Michaelis-Menten kinetikt mutat, mely konformcis vltozsra utalszubsztrt

A membrntranszport alapjai4. HordozkA msodlagos aktv transzport molekulris mechanizmusa (itt szimport esetn)

A membrntranszport alapjai4. HordozkMsodlagos aktv transzport: szimport s antiportA kotranszportlt anyag lehet semleges s tltssel rendelkez is

nagy affinits rendszer: K+-H+ szimport (1:1)HKT1 (534 aminosav protein)M [K+]ext tartomnybangykr kortex sejtekben

alacsony affinits rendszer: befel egyenirnyt ioncsatornk1 mM [K+]ext flttVm-hajtotta K+ influx (H+-ATPz!)Al3+ ionok gtoljkA membrntranszport alapjai4. Hordozk - A klium felvtele

A membrntranszport alapjai4. Hordozkpl. vakuolris glkz s aminosav hordozkKloroplasztisz: 2-oxoglutrsav-almasav, ATP-ADP, hexz-foszft-ortofoszft,DHAP-ortofoszft

Ekkor a transzportlt anyag koncentrci-gradiense szolgltatja az energit.Ms, nem ionhoz kapcsolt kotranszport

A membrntranszport alapjai4. HordozkA hordozk szerkezete

mretk 40-50 kDa, tbbnyire hidrofb fehrjk ltalban 12 transzmembrn domn, a 6-7 kztt ersen hidrofb loop tbb bels repeat szekvencia a C s N-terminlisflben (az idk sorn gnduplikci trtnt) MFS (main facilitator superfamily)-ba tartoznak, mely nagy s ersen diverz csoport

A membrntranszport alapjai4. HordozkH+pmfszimporterSzecn: sztchiometriai arnyz: tvitt anyag tltseReakci:A reakci akkor jtszdik le balrl jobbra (akkor juttat a szimporter befel protont s S anyagot), ha a kt elektrokmiai potencilgradiens vektori sszege befel mutat, azaz (a citoplazmhoz viszonytunk)Kifejtve a kt kmiai potencilt:

A membrntranszport alapjai4. HordozkHa pl.pHcyt = 7,5pHextracell = 5,5 akkor az anyag maximlis felhalmozdsi arnya:Ha pl. S tlts nlkli anyag, s 1 protonnal transzportldik, akkor n = 1 esetn Vm= -150 mV mellett a max. felhalmozdsi arny 36500. n = 2 esetn ez 1,34 x 109 !

Teht a protonhoz kapcsolt hordozk nagy koncentrciklnbsget kpesek ltrehozni, szablyozsuk nagyon fontos.

A membrntranszport alapjai4. HordozkNhny esetben a hordozk mkdse nem H+-hoz hanem Na+-hoz kttt.Tengerben l algafajok esetn az NO3- s nhny aminosav felvtele Na+-hoz kttt szimportot mutat.Tengervz 480 mM Na!

desvzi algknl a Na/K szimport is lehetsges, a Na-ra vonatkoz nagy Vm komponens miatt.

IoncsatornaMinden sejt minden membrnjn megtallhat.A membrntranszport alapjai5. Az ioncsatornk ltalnos tulajdonsgaiTeljes sejt mrseknl az teljes ionramot fel lehet rni:

I = N i Po , aholN a csatornk szmai 1 db nyitott csatornn tfoly ramPo annak a valsznsge, hogy a csatorna nyitott llapotban van.Kt konformcis llapot: nyitott s zrt.

Az llapotok kzti tmenetet a membrnpotencil s a ligandum ktdse szablyozza (kapuzsi faktorok).

A membrntranszport alapjai5. Az ioncsatornk ltalnos tulajdonsgaiAz ioncsatornn val tjuts passzv: csak -tl fgg.

Az egycsatorna-ram membrnpotenciltl val fggse lineris: rvnyes r Ohm-trvnye: I = V / RMeredeksge = 1 / R = g (konduktancia) [pS]

g rtke fgg a permel ion koncentrcijtl, teht a csatorna konduktancijt adott ionkoncentrci-viszony mellett adjk meg.Az ram irnya:negatv ram kation influx vagy anion effluxpozitv ram kation efflux vagy anion influx

A membrntranszport alapjai5. Az ioncsatornk ltalnos tulajdonsgaiEquilibrium esetn nincs nett ionramls:Eeq,ion az ion egyenslyi potencilja, csak az ion koncentrci-klnbsgtl fgg. Ha csak egyfle ion van a rendszerben, ezt Nernst-potencilnak nevezzk.Ha tbbfle permel ion (legfontosabb a Na+, K+, Cl-) van a membrn kt oldaln, akkor a Goldman-Hodgkin-Katz egyenlet lerja a nyugalmi membrnpotencilt:Az egyensly itt azt jelenti, hogy az iont adott irnyba mozgat koncentrci-gradiens nagysga megegyezik az ellenkez irnyban hat elektromos potencil-gradiens nagysgval.P permeabilits

A Nernst-egyenletbl szmtott rtkmegfigyelt rtk A K+ ionok a citoszolba s a vakulumba passzv mdon jutnak, kivve, ha az extracellulris K + koncentrci alacsony (aktv mdon hordozval)

A Na+ aktv mdon pumpldik a citoszolbl kifel az extracellulris trbe s a vakulumba

A kztes anyagcsere protonjai aktv mdon pumpldnak ki a citoszolbl (megrzdik a citoszol semleges pH-ja, mg az extracellulris tr s a vakulum 1-2 pH egysggel savanyodik)

Minden anion aktv mdon jut a citoszolba

A Ca2+ aktv mdon transzportldik ki a citoszolbl

A membrntranszport alapjai5. Az ioncsatornk ltalnos tulajdonsgai+ foszforilci, s diszulfid hidak kialaktsa

Kapuzsi faktorCsatornaMembrnKapuzsi klcsnhatsCsatorna funkciFizikai:FeszltsgCa2+, K+, Cl-, M+, X-, NPM, T, C, Mde-/aktivciidfgg inaktivciFeszltsg stabilits, ingerelhetsg, ozmotikus anyagmozgsMechanikai stresszCa2+, K+, Cl-, M+, X-PM, TAktivciTurgor/ozmoregulciKmiai (ligandum):Ca2+K+, Cl-PMIn-/aktivciingerelhetsg, ozmotikus anyagmozgsCa2+Ca2+, K+, Cl-, M+, X-, NTIn-/aktivciozmotikus anyagmozgs,szignl-transzdukciK+K+PMFeszltsgfgg aktivciElektrokmiai potencil integrci, ozmotikus anyagmozgsCl-K+TAktivciozmotikus anyagmozgsH+K+, Cl-PMFeszltsgfgg aktivciElektrokmiai potencil integrciH+H+PMInaktivci?IP3Ca2+TAktivciCa2+ felszabadts, szignl-transzdukciNukleotidokK+, X-PM, T, MIn-/aktivciElektrokmiai potencil integrciAuxinX-PMFeszltsgfgg aktivciingerelhetsg, ozmotikus anyagmozgsKalmodulinCa2+, M+, X-, NPM, TInaktivciingerelhetsg, turgor- s ozmoregulci, szignl-transzdukci

Patch clamp mrsi elrendezsekA membrntranszport alapjai5. Ioncsatornk

A membrntranszport alapjai5. IoncsatornkPatch clamp labor

A membrntranszport alapjai5. IoncsatornkPatch clamp labor

Sztmamkds, a zrsejtMkdsnek clja: a nvny CO2 ignyt a vzvesztesg minimalizlsa mellett elgtse ki Vz s gzcsere, levlhmrsklet, ionfelvtel s transzport Hidroaktv nyitds s zrds (fny, hmrsklet, CO2, pratartalom, nvnyi hormonok) A membrntranszport alapjaiSztmamozgs

A sztmanyls mretnek, a zrsejt K+ s szacharz-tartalmnak alakulsa a nap folyamnA membrntranszport alapjaiSztmamozgs

0ramFeszltsg+ 60 mV-140 mVt(KAT1)Befel s kifel mutat klium ramok zrsejtekbenA membrntranszport alapjaiSztmamozgs

1. H+-pumpa aktivci2. membrn hiperpolarizci 3. K+, Cl- s Ca2+ influx1. H+-pumpa inaktivci2. S s R-tpus anion-csatorna aktivci3. hosszan tart PM depolarizci4. K+ effluxK+Cl-K+SztmanyitdsSztmazrdsKk fnyCl-Ca2+Cl-RS[K+] 100 mM 800 mMH+depolarizciK+

Anyagtranszport a gykrbenA membrntranszport alapjaiAnyagtranszport a gykrben

Apoplaszt s szimplasztA membrntranszport alapjaiAnyagtranszport a gykrben

A membrntranszport alapjaiAnyagtranszport a gykrbenA plazmodezmk olyan 40 nm-es tmrj citoplazma-hidak, melyek a vz s kisebb oldott anyagok diffzijt teszik lehetv a sejtek kztt. Srsgk a membrnban 15 db/m2.

A membrntranszport alapjaiAnyagtranszport a gykrbenPasszv diffzis modell

A membrntranszport alapjaiAnyagtranszport a gykrbenA xilm feltlts passzv folyamat, vagy irnytott transzport-mechanizmus?

Vlasz: xilm parenchima PM

szablyozott transzport: K-specifikus s nem-szelektv kation efflux csatornk, melyek Vm s Ca2+-fggek a szablyozs fggetlen az epidermisz s kortiklis sejtek aktv anyagfelvteltlIzotppal jellt transzport