Centro de Investigación en Química Aplicada TESIS ... · ÍNDICE GENERAL v ÍNDICE DE TABLAS...

Centro de Investigación en Química Aplicada

TESIS

Bioconjugados de Poi(ácido γ-glutámico) con Posible Aplicación en la

Fabricación de Partículas Fluorescentes y en Membranas Electrohiladas

con la Capacidad de Reconocimiento de Escherichia coli Uropatógena

PRESENTA:

I.Q. Eduardo Castro Torres

PARA OBTENER EL GRADO DE:

Maestría en Tecnología de Polímeros

Asesor: Dr. Jorge Romero García

Co-asesor: Dr. Eduardo Manuel Arias Marín

Saltillo, México Agosto 2014.

ÍNDICE GENERAL

i

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................................... v

ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................ v

RESUMEN .......................................................................................................................... vii

I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1

II. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 3

2.1 Los polímeros ............................................................................................................... 3

2.1.1. Polímeros conjugados ........................................................................................... 3

2.1.2. Luminiscencia ....................................................................................................... 5

2.2. Reacción de acoplamento Sonogashira-Heck .............................................................. 6

2.2.1 Principios básicos ................................................................................................... 6

2.2.2. Reacción de Heck .................................................................................................. 6

2.2.3. La reacción de Sonogashira................................................................................... 8

2.2.4. Reacción Sonogashira-Heck. ................................................................................ 8

2.3 Polí(ácido γ-glutámico) (PGA) ................................................................................... 11

2.3.1. Generalidades. ..................................................................................................... 11

2.3.4. Aplicaciones del poli(ácido γ-glutámico) ........................................................... 13

2.4. Bioconjugación ......................................................................................................... 13

2.4.1. Estrategias de Síntesis para el Diseño de Conjugados Polímero – Proteína ....... 15

2.4.2. Bioconjugación injerto de vía enlace covalente .................................................. 17

2.4.4 Química click ....................................................................................................... 20

2.5 Nanopartículas. ........................................................................................................... 22

2.6 Nanofibras. .................................................................................................................. 24

2.7 Sensores ...................................................................................................................... 25

2.7.1 Biosensores........................................................................................................... 25

2.8 Escherichia Coli. ......................................................................................................... 25

2.9 Estado del arte. ............................................................................................................ 26

III. HIPÓTESIS .................................................................................................................. 31

ÍNDICE GENERAL

ii

IV. OBJETIVOS ................................................................................................................. 31

4.1. Objetivo general ......................................................................................................... 31

4.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 31

V. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................... 32

VI. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA ............................................................................. 32

VII. CONTRIBUCIÓN CIENTÍFICA DEL TEMA ....................................................... 33

VIII. DESARROLLO EXPERIMENTAL ...................................................................... 33

8.1 Reactivos ................................................................................................................ 35

8.2 Disolventes .................................................................................................................. 37

8.3 Material y equipo ....................................................................................................... 37

8.4. Cepas de microorganismos ........................................................................................ 39

8.5 Síntesis del trímero de fenilenetinileno ...................................................................... 40

8.5.1. Síntesis del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-dibromobenzoato.......................... 40

8.5.2.Síntesis del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5 bis((trimetilsilil)etinil)benzoato .... 40

8.5.3 Síntesis del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5- dietinilbenzoato ............................ 41

8.5.4 Síntesis del 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato .............................................. 42

8.5.5. Síntesis de bis(2-(2-methoxyethoxy)ethyl) 3,3'-(2-((2-(2-(2-

chloroethoxy)ethoxy)ethoxy)carbonyl)-1,4-phenylene)bis(ethyne-2,1-diyl)dibenzoatel

(trímero fenilenetinileno) .............................................................................................. 42

8.5.6.Síntesis del trímero con terminación azida .......................................................... 43

8.6 Funcionalización del PGA .......................................................................................... 44

8.6.1. Funcionalización de PGA con N-hidroxisuccinimida ......................................... 44

8.6.2. Modificación de PGA funcionalizado con NHS con propargil amina ................ 44

8.7 Síntesis del bioconjugado PGA-Trímero .................................................................... 45

8.8 Síntesis de la azida de 6(-4-amidofenil α-D manopiranosido)hexanoilo .................... 45

8.8.1 Síntesis del 2,5-dioxopirrolidon-1-il 6 bromohexanoato .................................... 45

8.8.2. Síntesis de bromuro de 6(-4-amidofenil α-D manopiranosido)hexanoilo ........... 46

8.8.3. Síntesis de la azida de 6(-4-amidofenil α-D manopiranosido) hexanoilo ........... 46

8.9 Síntesis del bioconjugado PGA-Manosa .................................................................... 47

8.10 Formación partículas de bioconjugado PGA-Trímero por el método de la doble

emulsión ............................................................................................................................ 48

ÍNDICE GENERAL

iii

8.11 Fabricación de nanofibras por electrohilado ............................................................. 49

8.11.1. Obtención de nanofibras electrohiladas de PVA ............................................... 49

8.11.2 Preparación de membranas de PVA/PGA-Manosa ....................................... 50

8.12. Evaluación microbiológica de las membranas ................................................... 50

IX. RESULTADOS Y DISCUSIONES ............................................................................. 56

9.1 Síntesis del trímero fenilenetinileno ........................................................................... 56

9.1.1. Ruta de síntesis .................................................................................................... 57

9.1.2 Mecanismos de reacción involucrados en la síntesis del trímero......................... 58

9.1.3. Caracterización por RMN 1H .............................................................................. 63

9.1.4. Caracterización por RMN 13C ............................................................................. 67

9.1.5. Caracterización por FT-IR .................................................................................. 70

9.2. Funcionalización del poli(ácido glutámico) .............................................................. 70

9.2.1. Ruta de síntesis .................................................................................................... 70

9.2.2. Mecanismos de reacción ..................................................................................... 71

9.2.3 Caracterización por RMN 1H ............................................................................... 72

9.2.5. Caracterización por espectroscopia RAMAN ..................................................... 75

9.3. Síntesis del bioconjugado PGA-Trímero ................................................................... 76

9.3.1. Ruta de síntesis .................................................................................................... 76

9.3.2. Mecanismos de reacción del bioconjugado PGA-Trímero ................................. 76

9.3.3. Análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC) ...................................... 78

9.4. Síntesis del bioconjugado PGA-azida de 6(-4-amidofenil α-D

manopiranosido)hexanoilo ................................................................................................ 79

9.4.1. Ruta de síntesis .................................................................................................... 79

9.4.2. Mecanismos de reacción ..................................................................................... 80

9.4.4. Caracterización por RMN 13C ............................................................................ 84

9.4.5. Caracterización por FT-IR de la azida de 6(-4-amidofenil α-D

manopiranosido)hexanoilo ............................................................................................ 84

9.5 Caracterización por 1H RMN del bioconjugado ......................................................... 86

9.6.1. Microscopia electrónica de barrido de las partículas PGA-trímero .................... 86

9.6.2. Análisis de distribución de tamaño ..................................................................... 90

9.6.3. Análisis por microscopía de barrido laser confocal ............................................ 91

ÍNDICE GENERAL

iv

9.7. Fabricación de membranas electrohiladas de poli(vinil alcohol)/PGA-manosido para el

atrapamiento y retención de Escherichia coli uropatógena .............................................. 92

9.7.1 Microscopía electrónica de barrido ...................................................................... 93

9.8 Evaluación de las membranas electrohiladas con el bioconjugado PVA/PGA-manosido

como herramienta de reconocimiento y atrapamiento de cepas de E. coli uropatogéna .. 96

9.8.1 Ensayos microbiológicos..................................................................................... 96

9.8.2. Evaluación de las membranas de PVA y PVA/PGA manosido por medio de

microscopía electrónica de barrido ............................................................................... 98

9.8.3. Análisis por microscopía electrónica de transmisión ........................................ 100

X. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 103

XI. TRABAJO A FUTURO. ............................................................................................ 104

XII. BIBLIOGRAFÍA. ..................................................................................................... 105

ÍNDICE GENERAL

v

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 2.1. Estructura de polí(aminoácidos), distribución y posibles aplicaciones ............. 11

Tabla 8.1. Reactivos utilizados para el desarrollo del proyecto de tesis. ........................... 35

Tabla 8.2. Disolventes y sus propiedades utilizados en la tesis........................................... 37

Tabla 8.3. Cepas utilizadas en las evaluaciones microbiológicas. ...................................... 39

Tabla 8.4. Componentes y concentración para la preparación del medio luria. .................. 50

Tabla 8.5. Componentes y concentración para la preparación de agar ............................... 53

Tabla 8.6. Prueba del ensayo de aglutinación de las cepas de E. Coli. ............................... 55

Tabla 9.1. Resultados de las pruebas microbiológicas de membranas en medio 1/500 ...... 97

Tabla 9.2. Resultados de las pruebas microbiológicas de membranas en solución

fisiológica……………………………. ............................................................................ 98

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Metodología para la síntesis de poli(arilenetinileno)s. ...................................... 4

Figura 2.2. Moléculas conjugadas de mayor relevancia........................................................ 4

Figura 2.3. Transiciones electrónicas en el fenómeno de luminiscencia. ............................ 5

Figura 2.4. Variantes del acoplamiento catalizado por Pd(0). .............................................. 6

Figura 2.5 Mecanismo para la reacción de acoplamiento de Heck. ...................................... 7

Figura 2.6. Reacción de acoplamiento de Sonogashira. ........................................................ 8

Figura 2.7. Reacciones de acoplamiento para la formación de fenilenetinilenos. ................ 9

Figura 2.8. Mecanismo de reacción de acoplamiento Sonogashira. .................................... 10

Figura2.10. Esquema de la unión covalente para formar un bioconjugado ........................ 14

Figura 2.11. Esquema representativo de la metodología grafting from. ............................. 19

Figura 2.12. Metodología de la química click. ................................................................... 21

Figura 2.13. Metodología química click aplicada a bioconjugación polímero-proteína. ... 22

Figura 2.14. Aproximaciones para la fabricación de nanopartículas ................................. 23

Figura 2.15. Organización de genes en la fimbria tipo I ..................................................... 26

Figura 2.16. Estructura del polímero sintetizado por Ramos y col. (2010)......................... 26

Figura 2.17Bioconjugado propuesto por Miyamoto y col. (2003). ..................................... 27

Figura 2.18. Estructura del polímero sintetizado utilizado por Vázquez y col. (2006). ...... 27

Figura 2.19. Estructura del biosensor sintetizado por Liu y col. (2007). ............................ 28

Figura 2.20. Familia de polímeros fluorescentes empleada por Bajaj y col. (2009). .......... 28

Figura 8.1. Apariencias de las muestras durante la formación de las emulsiones............... 48

Figura 8.2. Configuración del sistema de helectrohiado. ................................................... 49

Figura 8.3. Metodología de inoculación de cepas de E. coli ............................................... 51

Figura 8.4. Procedimiento empleado para la dilución de células para el conteo viable. ..... 52

Figura 8.5. Procedimiento para dispersión en agar ............................................................. 53

Figura 8.6 Esquema del conteo de colonias para recuentos viables. ................................... 54

Figura 9.1. Ruta de síntesis del trímero fenilenetinileno portador de un grupo azida. ....... 57

Figura 9.2. Ruta de síntesis para obtener el 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato ........... 58

Figura 9.3. Mecanismo de reacción de Steglitch. ................................................................ 58

Figura 9.4. Mecanismo de reacción de Steglitch ................................................................. 59

Figura 9.5. Ciclo de Sonogashira para el acoplamiento entre acetilenos y halogenuros. . 60

Figura 9.6. Mecanismo de desprotección de acetilenos protegidos .................................... 61

ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS

vi

Figura 9.7. Mecanismo de desprotección de acetilenos protegidos .................................... 61

Figura 9.8. Mecanismo de reacción para la formación del trímero. .................................... 62

Figura 9.9. Mecanismo de reacción para la azida del trímero. ............................................ 63

Figura 9.10. Espectros de 1H RMN ............................................................................ 64

Figura 9.11. 1H RMN del -(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato en CDCl3 ........................ 65

Figura 9.12. 1H RMN del Trímero en CDCl3. ..................................................................... 66

Figura 9.13. Espectros de 13 C RMN. ............................................................................ 68

Figura 9.14. 13C RMN del 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato. .................................... 69

Figura 9.15. Espectro de 13C RMN del trímero de feniletinileno. ...................................... 69

Figura 9.16. Espectros de FT-IR ............................................................................ 70

Figura 9.17. Mecanismo de reacción para la esterificación del PGA ................................. 71

Figura 9.18.Mecanismo de reacción para la formación del (PGA)-propargil amida. ......... 71

Figura 9.19. Espectros de 1H RMN con respecto al bioconjugado PGA-Trímero. ............ 73

Figura 9.20. Comparación de espectros del PGA ............................................................... 74

Figura 9.21. Espectro Raman 532 nm del PGA funcionalizado con propargil amina. ...... 75

Figura 9.22. Ruta de síntesis para la obtención del bioconjugado PGA-Trímero. .............. 76

Figura 9.23. Ciclo catalítico de Huisgen Sharpless ............................................................. 77

Figura 9.24. Termogramas de DSC ............................................................................ 79

Figura 9.25.. Ruta de síntesis para la bioconjugación PGA con la manosida. ................... 80

Figura 9.26.. Mecanismo de reacción para sustitución por aminas. .................................... 81

Figura 9.27. Mecanismo de reacción para formar un enlace amida. ................................... 81

Figura 9.28. Mecanismo de reacción para formar azidas ................................................... 82

Figura 9.29. Mecanismo de reacción del bioconjugado PGA-Manosa vía química click .. 82

Figura 9.30. Espectros de 1H RMN ............................................................................ 83

Figura 9.31 Espectro 13C del 2,5-dioxopirrolidon-1-il 6 bromohexanoato ........................ 84

Figura 9.32. Comparación de espectros de infrarrojo ......................................................... 86

Figura 9.33. 1H RMN del bioconjugado PGA-manosa. ...................................................... 87

Figura 9.34. Micrografía SEM de partículas bioconjugado PGA-trimero (1:1) ................. 88

Figura 9.35. MicrografíasSEM de partículas bioconjugado PGA:trímero(1:5) .................. 90

Figura 9.36. Histogramas de distribución de tamaño de partículas. .................................... 91

Figura 9.37. Imágenes de microscopia confocal ................................................................. 92

Figura 9.38. Imágenes de microscopia confocal ................................................................. 93

Figura 9.39. Micrografías SEM de nanofibras en membranas ........................................... 94

Figura 9.40. Micrografías SEM de nanofibras de PVA ...................................................... 95

Figura 9.41. Micrografías SEM de nanofibras de PVA ...................................................... 96

Figura 9.42. IMicrografías SEM, analizadas con detector de electrones secundarios ........ 97

Figura 9.43. Micrografías SEM de membrana PVA/Bioconjugado sumergida en solución de

bacterias ORN 208. ............................................................................ 99

Figura 9.45. Micrografías SEM de la membrana PVA/Bioconjugado sumergida en solución

de bacterias de la cepa salvaje SS3…….. ....................................................................... 100

Figura 9.46. comparación gráfica entre un cristal de bioconjugado PGA/manosa embebido en

una fibra de PVA (a) y un defecto de electrohilado (b). ................................................. 101

Figura 9.47. Micrografías TEM de las fibras de PVA en las regiones que no presentan

cristales de bioconjugado .......................................................................... 102

Figura 9.48. Cristales de bioconjugado PGA/manosa embebidos en nanofibras de PVA.102

RESUMEN

vii

RESUMEN

En esta tesis se describe y discute el diseño y la síntesis de dos bioconjugados basados en

polí(ácido-glutámico) (PGA), polímero natural de origen bacteriano. El primero de ellos

contiene en su estructura unolígomero de feniletinileno (PGA-OP) y el segundo una molécula

con manosa (PGA-M), acoplada en los extremos de las cadenas poliméricas de PGA. Las

síntesis de PGA se llevó a cabo por medio de acoplamiento catalítico de Pd(II) Sonogashira-

Heck y bioconjugación vía química click. En tanto que la síntesis de PGA-M se realizó a

través de esterificación y la posterior bioconjugación vía química click. En la caracterización

de los monómeros, productos intermediarios, oligómeros y bioconjugados se utilizaron

técnicas espectrofotométricas (Raman y Uv-visible), resonancia magnética nuclear (RMN 1H

y 13C), análisis térmico (DSC), microscopíaelectrónica (SEM y TEM) y diferentes técnicas de

análisis microbiológico; mediante la evaluación microbiológica se logró obtener evidencia

sobre el reconocimiento de los sitios específicos de a E. coli uropatógena, entre el

bioconjugado PGA-M y la adhesina FimH . Con la realización de esta tesis se logró demostrar

la posible aplicación como filtro de bacterias de un dispositivo fabricado a partir de nanofibras

de PVA cargadas con un biconjugado PGA-M así como la formación de nanoestructuras con

posible aplicación como acarreador de fármacos a partir de un bioconjugado PGA-OP.

ANTECEDENTES

1

I. INTRODUCCIÓN

Desde su aparición en la tierra, el hombre ha luchado por su sobrevivencia, preservación y

aumento de su longevidad, a lo largo de su historia ha desarrollado técnicas y conocimientos

para lograr dicho cometido. Y entonces bajo estas premisas, la medicina ha logrado satisfacer

tales necesidades.

El diagnóstico compone la estructura medular de la medicina, provee de forma indirecta

información sobre los procesos que están siendo llevados a cabo en los seres vivos, de forma

que, de un diagnóstico rápido y correcto depende la aplicación de tratamiento oportuno para

curar las enfermedades. Es en este aspecto que los biosensores han llegado para mejorar en

gran medida las técnicas de diagnóstico, desde la detección de bacterias patógenas para el ser

humano, hasta la localización de células enfermas, mal funcionamiento de órganos y tejidos a

través de la presencia o ausencia de ciertas actividades enzimáticas o incremento, disminución

e inclusive ausencia de metabolitos es posible detectarlos con el biosensor específico.

Las macromoléculas bioconjugadas o quimeras son una alternativade biosensado debido a

que poseen una parte sintética capaz de interactuar con los sistemas biológicos y sus procesos

metabólicos (microorganismos, células, enzimas, hormonas, receptores moleculares yotros

analitos). En los sistemas bioconjugados la molécula sintética confiere las características para

transmitir y eventualmente detectar e inclusive cuantificar una señal (amperométrica,

electroquímica, mecánica, lumínica, etc.) resultado de la interacción de un metabolito o un

receptor molecular, enzima, bacteria, virus, etc., con la parte biológica del bioconjugado.

Las infecciones causadas por bacterias constituyen una de las enfermedades más

frecuentes que ocurren en la población y en particular en países poco desarrollados o

emergentes. Toda investigación científica que eventualmente conduzca a la detección de una

bacteria patógena de forma rápida y al mismo tiempo eficaz puede contribuír de forma

importante en la prevención y cura de este tipo de enfermedades, tal es el caso de las

infecciones del aparato urinario ocasionado por el ataque de ciertas bacterias conocidas como

uropatógenas(Escherichia coli, Proteus mirabelis, Pseudomonas auruginosa, etc.)

Mundialmente se estima que anualmente ocurren aproximadamente 150 millones de casos de

infecciones del tracto urinario (Foxman B., 2010).

Un grupo particularmente vulnerable son personas jóvenes y mujeres aparentemente

sanas. La mayoría de los casos se curan con un tratamiento adecuado de antibióticos, pero esta

enfermedad es recurrente en aproximadamente 25% de las personas afectadas. La infección

frecuentemente está asociada con fuertes dolores e inflamación, y si la infección alcanza los

riñones puede ocasionar pielonefrites con daño renal y todas las otras consecuencia nefastas.

La mayoría de las infecciones del sistema urinario son ocasionadas por Escherichia coli

uropatógena [(Song & Abraham, 2008), (Weichhart et al., 2008)]. Para que se establezca una

infección crónica aguda, la bacteria debe expresar factores específicos de virulencia (Wiles et

al 2008). Así por ejemplo en este microrganismo, la estructura denominada pili tipo I (fimbria)

que es un factor de reconocimiento de los receptores de la superficie del urotelio, donde la

bacteria se ancla con gran fuerza para evitar su desprendimiento debido a los esfuerzos de

ANTECEDENTES

2

corte de flujo urinario. Las interacciones entre el huésped y el patógeno que ocurren durante

las infecciones del tracto urinario son complejas y moduladas por las diferencias entre los

pacientes humanos, así como las de la propia bacteria uropatógena. Aunque existe mucho

conocimiento acerca de los aspectos de la interacción entre E. coli y las células del tracto

urinario, aún estamos muy alejados de entender y comprender el mecanismo involucrado en

esta patogenicidad (Schulz AW., 2011). Por consiguiente el descubrimiento de nuevas

herramientas que aporten avance en el conocimiento de este mecanismo es de enorme

importancia para desarrollar nuevas estrategias de combate de esta y otras infeccciones. En

este trabajo se presentan los resultados del diseño, construcción y prueba del concepto de dos

tipos de diseños moleculares que pueden ser usado por un lado para el transporte y

seguimiento de fármacos y por otro el atrapamiento mediante el reconocimiento de sitios

específicos de E. coli uropatógena.

El propósito de la síntesis y caracterización de estos bioconjugados es probar su posible

aplicación como filtros de bacterias generando por un lado el conocimiento científico para el

desarrollo de sistemas de identificación bacterianay por otro el de acarreadores de fármacos

en estudios posteriores.

ANTECEDENTES

3

II. ANTECEDENTES

2.1 Los polímeros

Los polímeros son macromoléculas formadas por la unión covalentede un

númeroconsiderable de moléculas de bajo peso molecular con una estructura química definida,

conocidas como monómeros, pudiendo ser del mismo tipo de molécula (homopolímero) o de

dos o más (copolímeros)(Odian, 2004).

Aunque existen diferentes formas de clasificara los polímeros, una muy utilizada se basa

en el origen de los mismos, es decir pueden ser naturales o sintéticos. Se hace referencia a esta

clasificación, debido a que responde al tipo de polímeros que se utilizaron en el desarrollo

experimental, caracterización y evaluación de los sistemas moleculares reportados. En

particular nos referimos a un polímero obtenido víasíntesis, que a su vez se incluye dentro de

los oligómeros o polímeros fluorescentes altamente conjugados y un polímero natural de

origen bacteriano, el poli(ácido γ-glutámico) (PGA).

2.1.1. Polímeros conjugados

Los oligómeros ypolímeros 𝜋 -conjugados están formados por un sistema regular

alternado de enlaces carbono-carbono sencillos (C-C), dobles (C=C) y triples (C≡C). Las

propiedades ópticas y electrónicas de los polímeros conjugados derivan de la presencia de

electrones 𝜋 deslocalizados a lo largo de la cadena polimérica (Salaneck, 1996).

Un tipo de polímeros 𝜋-conjugados que poseen triples y dobles enlaces alternados son

nombrados poli(arilenetinilenos).

Existen varios tipos de poli(arilenetinilenos) dependiendo de la estructura y de la unidad

arílica, en la actualidad existen tres aproximaciones de síntesis para la elaboración de

poli(arilenetinilenos) como se muestra en la figura 2.1. La reacción de acoplamiento de

Sonogashira (reacción c) es la más común y utilizada para la síntesis de éstos (Aoki, et

al.2006).

ANTECEDENTES

4

Figura 2.1. Metodología para la síntesis de poli(arilenetinileno)s.

Hoy en día entre las moléculas conjugadas de mayor importancia, por su potencial en la

fabricación de diversos dispositivos (diodos electroluminiscentes, celdas solares, biosensores,

etc.) además de su recurrencia en la investigación y por ende en la literatura científica se

encuentran las estructuras químicas de los poli(fenilenvinilidenos) (PPV),

Poli(arilenetinilenos) (PAE), Poli(p-fenilenos) (PP), Poli(tiofenos) (PT), Polipirroles (PPyr),

Políanilinas (PAN) entre otras. (Bredas, 2004).

Figura 2.2. Moléculas conjugadas de mayor relevancia: A) PPV, B) PAE, C) PAN, D) PPP,

E) PT, F) PPyr.

A) B) C) D) E) F)

ANTECEDENTES

5

2.1.2. Luminiscencia

La luminiscencia es la emisión de fotones ultravioletas, visibles, infrarrojos o rayos X

provenientes de una especie electrónicamente excitada. El primero en emplear este término

fue el físico Eihardt Wiedemann en 1888, para todos aquellos fenómenos no originados por el

aumento de la temperatura de la especie química emisora, termino opuesto a la

incandescencia.

Para que el fenómeno de la luminiscencia se lleve a cabo se requiere la existencia de

transiciones electrónicas entre los distintos niveles energéticos. Una transición electrónica

consiste en el desplazamiento de un electrón del orbital de una molécula en el estado basal

(LUMO) hacia uno desocupado de mayor energía (HOMO), mediante la absorción de fotones.

Estos desplazamientos también pueden darse entre orbitales de diferente naturaleza, y es

entonces cuando los electrones regresan a su estado basal, momento en que la energía se libera

en forma de luz, En la figura 2..3se ilustra un ejemplo de dicho fenómeno (Bernard, 2001).

Figura 2.3Transiciones electrónicas en el fenómeno de luminiscencia.

El fenómeno anterior se presenta a lo largo de la cadena debido a la gran cantidad de

electrones deslocalizados a través de los dobles o triples enlaces alternados (Alvarez, et al.

2011).

El fenómeno luminiscente es clasificado en función a la duración de la emisión a partir de

que se presenta la excitación; El fenómeno es denominado como fluorescencia cuando el

tiempo de la emisión es de 1/e donde “e” es la carga del electrón (del orden de 10-3 segundos o

menor). Caso contrario se denomina como fosforescencia cuando el fenómeno alcanza una

duración de segundos a incluso horas (Cabriales, 2004).

ANTECEDENTES

6

2.2. Reacción de acoplamento Sonogashira-Heck

2.2.1 Principios básicos

Las reacciones de acoplamiento consisten en la formación de enlaces carbono-carbono

mediante catálisis con paladio.

El principio del acoplamiento catalizado por paladio consiste en el ensamblado de dos

moléculas en el metal mediante la formación de enlaces metal-carbono. De esta forma los

átomos de carbono enlazados al paladio son colocados muy cerca uno de otro y esto trae

consigo la formación de un nuevo enlace sencillo carbono-carbono.

Existen dos variantes de este tipo de reacción de acoplamiento como se muestra en la

figura 2.4.ambas reacciones son catalizadas por Pd(0) y de igual modo ambas emplean

órgano-haluros (RX) como la parte electrófilica (Coupling partner), la diferencia entre estas

dos variantes radica en la parte nucleofílica, en la reacción tipo 1 se utiliza una olefina

mientras que para la reacción tipo 2 un compuesto órgano-metálico (R´´M) (Nicolaouet al.

2005). .

Figura2.4 Variantes del acoplamiento catalizado por Pd(0).

2.2.2. Reacción de Heck

En 1968 Heck reportó en una serie de artículos que los haluros de metil y fenilpaladio

generados-in situ (RPdX; R= me, Ph; X=Haluro) pueden ser añadidos a olefinas a temperatura

ambiente.

Un año más tarde Heck proporciono los mecanismos correctos para la arilación de

olefinas, y en estudios más detallados también proporciónó la explicación para la ruta

esteroquímica de la reacción (Nicolaou , et al. 2005).

ANTECEDENTES

7

En 1972 hizo una modificación importante a su reacción, con lo cual incrementó la

utilidad de ésta. En esta nueva versión, el complejo orgánico de paladio RPdX es generado por

un órgano-haluro, RX, y el Pd(0) en una adición oxidativa.

El proceso (Figura 2.5.) comienza con adición oxidativa del halogenuro de Arilo al

catalizador de Paladio (1-2), posteriormente se adiciona el alqueno para la formación del

complejo de paladio (1-3) y mediante la inserción migratoria del complejo y la ruptura del

doble enlace el grupo arilo se separa del catalizador y ambos se enlazan de forma covalente al

ahora alcano, por último es liberado el alqueno con doble enlace intermedio y la eliminación

del haluro de hidrógeno para con esto lograr la regeneración del catalizador (5-6) (Nicolaou ,

et al. 2005).

Figura2.5 Mecanismo para la reacción de acoplamiento de Heck.

Las reacciones de Heck pueden ser definidas de forma general como un acoplamiento

catalizado por paladio de haluros de arilo o alquenilo (sp2), la primera reacción de este tipo fue

reportada por primera vez por Mizoroki (1972), la cual fue mejorada por Heck en 1972.

El descubrimiento de reacciones catalíticas asimétricas de Heck a principios de la década

de los 80s trajo consigo un resurgimiento del interés en este campo de la catálisis. En la

actualidad la reacción de Heck es una alternativa eficiente para la formación de enlaces

ANTECEDENTES

8

carbono-carbono, particularmente en la generación de estereocentros ternarios y cuaternarios

así como la formación de anillos intramoleculares (Nicolaou , et al. 2005).

2.2.3. La reacción de Sonogashira

La reacción de Sonogashira provee un método valioso para la síntesis de sistemas

acetilénicos conjugados, los cuales juegan un papel importante en el ramo farmacéutico para el

diseño de moléculas con intereses biotecnológicos y nanotecnológicos.

La reacción de Sonogashira ha demostrado ser en los últimos años el método emergente

más seguro y efectivo para la síntesis de alquinos sustituídos.La metodología de Sonogashira

(utilizando sales de Cu1 como co-catalizador) es la más empleada entre los métodos de

alquilación catalizada por paladio (Nicolaou et al. 2005).

Figura 2.6. Reacción de acoplamiento de Sonogashira.

2.2.4. Reacción Sonogashira-Heck

El premio nobel de química fue entregado a Richard Heck, Ei-ichiNegishi y Akira

Suzuki en el año 2010 por su destacado trabajo de investigación en reacciones de

acoplamiento catalizadas por paladio. Su trabajo revolucionó la forma de conceptualizar y

elaborar moléculas conjugadas al mismo tiempo que proveyeron métodos antes imposibles

para la formación de enlaces C-C.

Hasta mediados de los años 70´s las reacciones de acoplamiento de acetileno estaban

basadas en catálisis de sales de cobre. Sin embargo, en el año de 1975 el acoplamiento de

acetilenos catalizado por paladio con haluros de arilo o vinilo fue elucidado simultáneamente

por tres grupos independientes de investigación, Sonogashira, Cassar y Heck.

Las condiciones de acoplamiento reportadas por Sonogashira emplean co-catálisis basada

en cobre, haciendo con esto condiciones de reacción excesivamente suaves comparadas con

las no co-catalizadas de Cassar y Heck, la figura 2.7. muestra una comparativa entre las

reacciones de acoplamiento de los tres grupos de investigación; El acoplamiento co-catalizado

por cobre de Sonogashira muestra un rendimiento ligeramente superior en comparación a las

otras dos, las reacciones de acoplamiento básicamente consisten en unir un grupo fenilo a un

arilo para formar fenilenetinilenos. (Johansson et al. 2012).

ANTECEDENTES

9

Figura 2.7Reacciones de acoplamiento para la formación de fenilenetinilenos.

Aún no se ha logrado entender completamente los factores que afectan la velocidad de

reacción en las reacciones de Sonogashira, sin embargo si se sabe que la estereoquímica y las

propiedades electrónicas de los ligandos y catalizadores son parámetros determinantes en

éstas.

En la figura 2.8 se muestra el mecanismo propuesto por Sonogashira, comienza por la

formación del complejo bis(trifenilfosfina) dialquinil paladio (II) obtenido mediando la acción

catalítica del CuI sobre el catalizado 1 y el alquino, en un paso siguiente se produce la especie

catalítica 3 mediante la reducción de Pd(II) a Pd(0) al igual que la eliminación reductiva de

una molécula de diacetileno, posteriormente se presenta la adición oxidativa del haluro de

arilo dando lugar al complejo 4 y como último paso por medio de eliminación reductiva se

obtiene el aril-etinileno 6 y la regeneración del catalizador(Doucet & Hierso, 2007).

ANTECEDENTES

10

Figura 2.8. Mecanismo de reacción de acoplamiento Sonogashira.

2

1

4

3

6

5

ANTECEDENTES

11

2.3 Polí(ácido γ-glutámico) (PGA)

2.3.1. Generalidades

Dentro del grupo de los biopolímeros se incluyen todas aquellas macromoléculas de

origen natural (celulosa, almidón, ácidos nucleicos o polinucléotidos, proteínas, polisacáridos,

etc.). Pero en las últimas décadas otros tipo de moléculas que se sintetizan a través de rutas

químicas a partir de un monómero o derivado de éstese incluyen también en el grupo de los

biopolímeros[(poli(lisina), poli(aspártico), poli(triptófano y muchos otros poliaminoácidos)

(Katchalski et al.1958)

El poli(ácido γ-glutámico) junto con la poli(lisina), y la cianoficina forman parte de

algunos de los poli(aminoácidos) de origen natural producido por diferentes cepas de

microorganismos (Tabla 2.1).

Tabla 2.1 Estructura química de polí(aminoácidos), distribución en organismos y posibles

aplicaciones técnicas (Sanio & Steinbüchel, 2002).

Poli(aminoácido) Distribución en

microorganismos.

Aplicaciones.

HN

OH

O

On

Poli(ácido γ-glutámico)

Bacillus amyloliquefaciens

B. licheriformis

B. megaterium

B. subtilis

sporosarcina halophila

Planococcus halophila

Natrialba aegyptiaca

Nematocyst Cnidaria

Dispersante (sustituto de

poliacrilatos).

Suavizador de agua (quelante

para Ca2+)

Tratamiento de aguas residuales

(floculador)

Superabosrbente (hidrogeles)

Dispositivos de acarreo de

fármacos.

Humectante en cosméticos

Tratamiento de pieles.

HN

O

NH3+ n

Poli(lisina)

Streptomyces abulus

lysinopolymerus

Superabosrbente (hidrogeles)

Dispositivos de acarreo de

fármacos

Aditivo para alimento de

animales.

ANTECEDENTES

12

HN

O

NH

OH

HN

+H2N NH2

O

O

n

Cianopicina

La mayoría de las

cianobacterias

Dispersante

Suavizador de agua

Estos polímeros de origen bacteriano están englobados en una inmensa diversidad de

productos poliméricos agrupados como poliamidas, los cuales tienen en común que sus

unidades monoméricas que los constituyen están unidas por medio enlaces covalentes de tipo

amida. Las poliamidas se dividen en homopoliamidas, en donde solo participa un mismo tipo

de monómero (aminoácidos), y copoliamidas, en las cuales los monómeros constituyentes son

de diferentes tipos en n combinaciones de los 21 aminoácidos naturales. La abrumante

mayoría de las poliamidas de origen natural son proteínas copoliméricas. Otro pequeño grupo

de poliamidas son referenciados como poli(aminoácidos), cuyo único propósito es

diferenciarlos o distinguirlos de las proteínas, esto debido a las marcadas diferencias en el

proceso de su biosíntesis. En el primer caso el mecanismo de síntesis implica procesos de

transcripción de ADN a ARN mensajero (ARNm), que actúa como plantilla), traducción del

ARNm que se realiza a nivel de los ribosomas y por último en algunas proteínas ocurre otro

proceso de modificación pos-transcripcional. Es importante resaltar que en todos estos

procesos, el producto final es una homopoliamida (proteína) con peso molecular

monodisperso, estructura primaría, secundaría, terciaría y cuaternaria bien definida y además

realizan una función específica en la estructura, en la síntesis y en la regulación del

metabolismo celular. En cambio los poli(aminoácidos) se producen en la bacteria a través de

una ruta metabólica donde están implicadas una serie de enzimas (proteínas) que catalizan la

formación de los intermediariosconcluyendo con la condensación de los respectivos

aminoácidos que forman la homopoliamida. A diferencia de las proteínas los

poli(aminoácidos) no son monodispersos presentándose una marcada distribución en el

tamaño de las cadenas o polidispersidad. En las proteínas la formación del enlace amida es

única y exclusivamente entre los grupos α-amino y los grupos β-carboxilos de los aminoácidos

participantes, en los poli(aminoácidos) además participan en el enlace amida también pueden

participar otros grupos funcionales de la cadena lateral las funciones ( por ejemplo, β y γ-

carboxilos y ε-amino. Los poli(aminoácidos) pueden estar constituidos de los isómeros L o D

del aminoácido respectivo. En la actualidad, únicamente se conocen tres poli(aminoácidos)

que son la poli(lisina), la cianoficina y el poli(ácido γ-glutámico), pero seguramente existen

muchos más que aún no se han descubierto.

ANTECEDENTES

13

2.3.4. Aplicaciones del poli(ácido γ-glutámico)

Hoy en día la mayoría de los materiales plásticos incluyendo productos de empaque,

industria automotriz, electrónica, dispositivos médicos, provienen de la industria

petroquímica, esto es debido a la abundancia de las materias primas y los bajos costos de

producción. Sin embargo el abuso de estos materiales se ha convertido en un serio problema

medio ambiental y de salud, en ocasiones con consecuencias irreversibles. Por lo que la

sociedad demanda urgentemente el desarrollo de macromoléculas, cuya producción y

aplicaciones contribuyan a resolver o paliar los efectos del uso y abuso de los polímeros

sintéticos (calentamiento global, ahorro de energía, contaminación de suelos, aguas y

atmosfera, etc).

El PGA es precisamente una de las macromoléculas de este tipo tal como se ha

señalado previamente es un biopolímero de origen natural, producido por bacterias es

biodegradable y no tóxico a los humanos. Además por su estructura química tiene potencial

para su uso en la fabricación o preparación de materiales para diferentes aplicaciones tales

como medicina, agricultura, electrónica, polímeros biodegradables, adhesivos entre los que se

incluyen hidrogeles, bioplásticos, nanopartículas, agentes de contraste, vacunas, terapia

genética, análisis electroquímico, ingeniería de tejidos, fármacos bioconjugados, adhesivos

médicos, y es de esperarse que en el futuro se encuentran novedosas aplicaciones,

especialmente en el área biomédica (Joerg et al.2007).

A través del trabajo de investigación desarrollado en el CIQA, se han aprovechado las

características y bondades de este biopolímero y se ha reportado investigación para la

preparación de hidrogeles de redes semi e – interpenetradas como uno de los componentes de

la red, hidrogeles para la liberación controlada de fármacos, fabricación de biocementos, con

potenciales aplicaciones en reparaciones óseas y odontológicas, y como uno de los

componentes en la construcción de nanocapacitores[(Ledezma-Pérez et al.2005)(Barrientos et

al. 2003)(Rodriguez-Felix et al. 2007)]

2.4. Bioconjugación

En las últimas décadas emergió un campo de investigación centrado en la combinación

de moléculas biológicamente activas y polímeros de origen sintético o natural para fabricar

materiales avanzados dirigidos a ciertas aplicaciones específicas. En estos materiales híbridos,

las características individuales de ambos componentes se combinan para obtener moléculas

nuevas con propiedades y aplicaciones únicas, principalmente en áreas como la farmacéutica,

recuperación de enzimas, modulación de propiedades en el enlace de péptidos y materiales

nanoestructurados para diagnóstico y usos terapéuticos, biosensores y marcadores biológicos.

En años recientes la investigación de la conjugación de biomoléculas con polímeros

sintéticos se ha incrementado de forma sorprendente debido a la importancia y expectativas de

la combinación de ambos componentes para diferentes aplicaciones biomédicas y

biotecnológicas. La síntesis de bioconjugados se inició a mediados de los setentas por

Ringsdorf y col ( Bushet al. 1971)quienes trabajaron con modelos de reacción para la

obtención de conjugados centrados en la idea de desarrollar un copolímero soluble en agua

unido ala doxorubicina (fármaco utilizado en el tratamiento de ciertos tipos de cáncer) para

http://pubs.acs.org/action/doSearch?action=search&author=Bush%2C+C.+Allen&qsSearchArea=author

ANTECEDENTES

14

prolongar y retener su actividad biológica. En la actualidad las técnicas de polimerización,

incluida la químicaclic han permitido la bioconjugación de una amplia variedad de

biomoléculas con polímeros sintéticos.

El uso de polímeros sintéticos en el diseño de compuestos bioconjugados se amplió

con el uso de otros monómeros. Actualmente, polímeros como el poli (isopropilacrilamida)

(PNIPAM), glicopolímeros, poli(etilen-glicol)-metacrilato (PEGMA), poli (ácido acrílico)

(polAA), poli(L-lisina) (PLL), poli(vinil-alcohol) (PVA), poli(estireno) (PS), han emergido

como respuesta a demandas estructurales y de funcionalidad, así en los últimos años se están

aprovechando los polímeros naturales que presentan grupos funcionales.

Entre la diversidad de factores que debe presentar un polímero para su aplicación en

bioconjugación destacan: la biocompatibilidad, alta hidrofilicidad, estabilidad en solución,

grupos funcionales compatibles y reactividad con la biomolécula objetivo, además de poseer

un peso molecular controlado e índice de polidispersidad estrecho. Estas características

proporcionan a las biomoléculas (proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos etc.)

propiedades como alta estabilidad y aumento en la disolución en diversos solventes orgánicos

además permite el diseño de macromoléculas híbridas con propiedades sinérgicas (Hermanso

2008).

Las macromoléculas hibridas o bioconjugados se obtienen básicamente a partir de la

unión química o covalente entre un polímero de origen sintético y una biomolécula (Fig.

2.10.)La selección del tipo de conjugación se determina en función de su aplicación y se

consideran factores como la estructura, tamaño, forma, superficie y sitio de conjugación así

como los grupos funcionales disponibles y la estructura tridimensional de la

biomolécula(Niemeyer, 2004).

Figura2.10Esquema de la unión covalente de un polímero con una biomolécula para formar

unbioconjugado

En la actualidad la bioconjugación no se limita únicamente al uso de biomoléculas.

Sistemas biomiméticos también pueden ser unidos químicamente y participar de manera

similar a su contraparte biológica. Por ejemplo oligonucleótidos sintéticos u oligopéptidos

preparados mediante ingeniería genética y que de alguna forma imitan a los sistemas

biológicos, inclusive en su aspecto catalítico.

Las enzimas, glicoproteínas, nucleótidos, péptidos y oligosacáridos son las principales

biomoléculas que se han utilizado en la preparación de bioconjugados.

ANTECEDENTES

15

Los métodos modernos de bioconjugación utilizan estrategias para colocar, de forma

predeterminada, el sitio o multi-sitios de la funcionalidad para la unión a las biomoléculas.

Estos sitios suelen estar en los extremos de la cadena polimérica o en una determinada

superficie de conjugación. Esto permite la unión directa o indirecta con biomoléculas,

minimizando así perturbaciones que puedan alterar la forma activa de la biomolécula(Gauthier

& Harm-Anton ,2010).

En la actualidad para la preparación de bioconjugados se prefiere obtener polímeros

con la funcionalidad en un sitio específico (preferentemente en el extremo de la cadena) a el

uso de polímeros con el grupo funcional al azar. Los sitios preferidos en las biomoléculas para

la conjugación de manera específica han sido los residuos de cisteína y lisina, debido a la

abundancia de estos aminoácidos en la estructura de las proteínas. La selección del sitio o

multi-sitios es determinada por la ruta o técnica a utilizar para llevar a cabo la bioconjugación

(Reina et al. 2007).

Otro aspecto importante a considerar en la bioconjugación es la estrategia de síntesis

para el diseño de los conjugados, es decir la dirección de la inserción de la biomolécula. Esta

es por el sitio de enlace y que se puede direccionar en tres vías: “injerto a” (a través de una

parte de la molécula biológica se enlazan covalentemente con uno o más sitios reactivos del

polímero sintético. “injerto de” (la biomolécula participa como macroiniciador para permitir el

crecimiento in situ de un segmento de polímero a partir de esta unión) e “injerto hacia” (la

biomolécula se enlazada a un polímero en crecimiento).

Una característica que posee injerto a e injerto de es la eficiencia de conjugación, que a

su vez depende de la reactividad de la funcionalidad del polímero y del grupo reactivo de la

biomolécula. Esta eficiencia decrece de forma importante para el caso de la estrategia injerto

a, cuando se utilizan polímeros de alto peso molecular. En el caso de la estrategia injerto de se

requiere de una distribución homogénea del grupo funcional en la biomolécula de forma tal

que se favorezca la iniciación del polímero que se desea injertar.

2.4.1. Estrategias de Síntesis para el Diseño de Conjugados Polímero – Proteína

2.4.1.1. Bioconjugación vía injerto a

La vía injerto a es una de las técnicas mayormente empleadas para la obtención de

conjugados polímero-proteína. Esta estrategia se inició a principios de los ochentas con los

trabajos pioneros de Abuchowski y col. con la PEGilación de ciertas biomoléculas En esta

etapa de investigación los polímeros de tipo PEG utilizados en la conjugación mostraban

como única opción de grupo funcional, el grupo hidroxilo en la cadena terminal del polímero,

y una estructura rígida y químicamente inerte que no permitía la conjugación lateral. Pero más

tarde con el empleo de las técnicas RDRP, particularmente RAFT o ATRP habré nuevas

oportunidades para realizar un ajuste más fino en la tasa de funcionalidad presente en cada uno

de los extremos del polímero, esto fue posible gracias al uso de iniciadores funcionales,

agentes de transferencia funcionalizados y/o modificación posterior al polímero sintetizado.

.

ANTECEDENTES

16

2.4.1.2. Bioconjugación “injerto a” vía α-terminal mediante enlace covalente

La síntesis de moléculas conjugadas con funcionalidad α-terminal es sin duda la ruta

más explorada en bioconjugación. La obtención de polímeros con grupos funcionales reactivos

permite el acoplamiento a otros grupos reactivos presentes en las biomoléculas para formar

enlaces covalentes.. La conjugación de biomoléculas mediante injerto a con polímeros

sintéticos está limitada al tipo de grupo funcional presente en estos últimos. A la fecha se han

sintetizado polímeros con grupos hidroxilos, ácidos carboxílicos, aminas, fosfatos, y grupos

aldehídos todos ellos capaces de reaccionar covalentemente con moléculas biológicas para

formar esteres, carbonates, carbamatos y amidas entre otros. En la actualidad los enlaces de

tipo éster formados a partir de un grupo ácido carboxílico son los más utilizados en la

bioconjugación, debido a la simplicidad de su síntesis y a la alta labilidad del enlace 66 lo que

permite la sustitución por grupos amidas en presencia de grupos amina,

La formación de enlace tipo amida en la síntesis de un bioconjugado, frecuentemente

se sintetizan polímeros con grupo amino o ácido carboxilo, en el extremo de la cadena. En la

amidación de un determinado polímero con una biomolécula se utiliza un agente esterificante

que participa como acoplante, comúnmente del tipo carbodiimida (ejem.: N, N'-

diciclohexilcarbodiimida (DCC)) y además la reacción esta mediada por activadores como la

N-hidroxisuccinimida (NHS) (Figura 2-14), ambos compuestos son altamente selectivos para

el acoplamiento a grupos aminos libres, localizados fundamente en los residuos de las

proteínas.

2.4.1.2.1. Bioconjugación de la terminación-α

Este método es de los más utilizados en la bioconjugación, existe un número considerable

de ejemplos de complejos obtenidos mediante esta técnica a partir de polímeros α-funcionales

sintetizados.

Existen varias técnicas para llevar a cabo el acoplamiento entre polímeros α-funcionales y

biomacromoléculas, entre estas podemos nombrar la conjugación vía grupo amino reactivo,

conjugación vía grupo tiol reactivo, focalización de enlaces por disulfuros y química click

(Droumaguet & Nicolas, 2010).

El uso de ésta ruta de síntesis a permitido no solo realizar conjugaciones de amidación

directa sino también el diseño de polímeros a partir de iniciadores o agentes de transferencia

funcionalizados que contienen el grupo N-hidroxisuccinimida α-terminal y son utilizados en la

bioconjugación con una amplia variedad de biomoléculas.

El acoplamiento a moléculas mediante NHS y carbodiimidas, no solo es eficiente en solución,

películas de polímeros con un grupo funcional reactivo, pueden ser acopladas a sistemas

biológicos mediante estos procesos de bioconjugación. Yan y col, prepararon una película con

el grupo funcional expuesto hacia la superficie de la misma. El grupo funcional del polímero

sintetizado se utilizó para formar un enlace covalente con la enzima peroxidasa de rábano,

dicho bioconjugado fue evaluado en la formación de un complejo con el sistema biotina –

streptavidina (Yanet al.1994).

http://pubs.acs.org/action/doSearch?action=search&author=Yan%2C+Mingdi&qsSearchArea=author

ANTECEDENTES

17

2.4.1.2.2. Bioconjugación injerto a vía ω-terminal mediante enlace covalente

La conversión del grupo ω-terminal generada por la funcionalización de polímeros

sintetizados mediante RDRP ha demostrado ser una ruta eficiente para la introducción de

grupos funcionales, útiles en la bioconjugación. La fracción “viviente” del polímero puede ser

utilizada en una reacción post-conjugación(Droumaguet & Nicolas, 2010).

2.4.1.2.3. Bioconjugación injerto a vía α, ω-terminal mediante enlace covalente

La mayoría de los bioconjugados consisten en la unión de una biomolécula con una o

más cadenas de polímero. Sin embargo, en algunos casos la naturaleza de la molécula

biológica requiere del uso de otros factores que permitan conservar la capacidad catalítica del

bioconjugado. Este tipo de bioconjugación ha sido posible gracias a la síntesis de polímeros de

tipo telequélicos. En donde durante la síntesis del polímero mediante una post-

funcionalización, una vez ya sintetizado este, se obtiene un polímero con la misma

funcionalidad en ambos extremos de la cadena. En trabajos más recientes inclusive no solo se

han reportado el uso de polímeros telequélicos, sino también heterotelequélicos (diferente

funcionalidad terminal) en la síntesis de bioconjugados.

La bioconjugación ha permitido la síntesis de una amplia gama de conjugados para

diferentes aplicaciones. En la actualidad las de mayor la mayoría de las moléculas híbridas se

lleva a cabo utilizando la técnica injerto a. Una variante de esta misma estrategia de síntesis es

medio la conjugación en medio de cadena o cadena lateral del polímero. En donde los grupos

funcionales están localizados en medio de la cadena o de grupos colgantes o laterales,

distribuidos a lo largo de la cadena polimérica. La relevancia de éste tipo de estrategia en el

diseño de bioconjugados aplicados en liberación controlada de fármacos por citar un ejemplo,

se ve reflejada en el efecto conocido como “umbrella-like” (efecto sombrilla), el cual permite

una mayor protección contra la degradación proteolítica de las enzimas en comparación con el

uso de polímeros de tipo lineal.

2.4.2. Bioconjugación injerto de vía enlace covalente

Una ruta opuesta a injerto a, es la conocida como injerto de, que mediante

polimerización RDRP, se crece una cadena de polímero a partir de una proteína o péptido,

Ésta estrategia ofrece ventajas que han incremento su utilidad en bioconjugación, entre las

principales: i) la eficiencia en la bioconjugación se garantiza ya que los impedimentos

estéricos se ven minimizados, ii) la purificación final del material es relativamente “fácil”, ya

que moléculas de monómero sin reaccionar son las únicas que son eliminadas del medio de

reacción al igual que residuos de catalizador(Chen et al., 2008) (ARTP) o agente de

transferencia (RAFT), en comparación con otras estrategias de conjugación.

ANTECEDENTES

18

2.4.2.1. Bioconjugación injerto a través de vía enlace covalente

Éste método de conjugación ese ha utilizado en la síntesis de monómeros

funcionalizados con un segmento de péptido. La conjugación con éste tipo de polímeros es

una ruta que permite el diseño de bioconjugados de tipo peine, donde el péptido queda como

un segmento colgante o grupo lateral, enlazado químicamente a la cadena principal de

polímero. Los aminoácidos como L-Valina, L-péptido o residuos de cisteína se han utilizado

como macroiniciadores en la polimerización de tert-butil-acrilato (tBA), (2-hidroxietil

metacrilato) (pHEMA) y estireno (PS) por medio de ATRP.

Recientes avances en química de polímeros y el número creciente de aplicaciones de

los conjugados péptidos/polímero en medicina y ciencia de los materiales incrementa la

utilidad de ésta técnica, de igual forma la síntesis de agentes de tipo RAFT (Mallinamadugu et

al. 2006) y ATRP(Bhalchandra et al. 2005) conteniendo la funcionalidad de un amino-acido o

un segmento de péptido genera una estrategia versátil en la innovación del diseño de

bioconjugados.

La técnica de bioconjugación en la actualidad avanza a pasos agigantados no sólo en

medicina, sino también en biotecnología, nanotecnología, injerto en fase sólida (Loschonsky et

al. 2008) entre otros. Enzimas como la glucosa oxidasa ha sido posible conjugarlas para

formar un enlace covalente, que además muestra un alto grado de libertad conformacional en

un medio hidrofílico. El resultado de ello es una mayor estabilidad durante el almacenaje y

mayor conservación de su actividad catalítica en comparación con la enzima nativa (Boyer et

al. 2007).

La funcionalización en fase sólida abrió las puertas a una alternativa que en años

recientes sólo estaba limitada al estudio químico. Además otra área que está alcanzando altos

niveles de aplicación y que fungen también en plataforma sólida a nivel de

nanopartículas(Boyer et al. 2007). e inclusive a sub niveles como los puntos cuánticos

(quantum dot)(Ayreset al. 2005) es conocida como nanobioconjugación[(Ayres et al.

2005),(Loschonsky et al. 2007); (ko & yang, 2007), (Sapsford et al. 2011), (Gauvreau et al.

2004)].

2.4.3.1 Bioconjugación con un polímero presintetizado grafting to

Este método consiste en la conjugación directa de polímeros pre-sintetizados (cadenas)

con proteínas o péptidos, básicamente es la aproximación más exacta y eficiente para la

elaboración de sistemas conjugados.

2.4.3.2 Bioconjugación de la terminación-ω

La simplificación de grupos ω-terminales de polímeros que fueron sintetizados por

métodos radicálicos controlados muestra ser una variante eficiente para introducir residuos

ANTECEDENTES

19

con grupos funcionales para futuras bioconjugaciones, se emplean las mismas técnicas que en

la biconjugación de terminación-α (Droumaguet &Nicolas, 2010).

Figura 2.11. Esquema representativo de la metodología grafting from.

Una de las características deseadas y en las cuales se pone especial énfasis en la

síntesis de bioconjugados es la biodegradabilidad, especialmente en aquellos destinados a

aplicaciones biomédicas. La biodegradabilidad tiene diversas acepciones, la más sencilla es

que el polímero puede ser biodegradable en función de la reducción progresiva de su peso

molecular generando moléculas pequeñas y con ello lograr una posterior reincorporación de

sus componentes al ambiente (Gauthier & Klok, 2010).

Como se vio anteriormente los métodos clásicos de bioconjugación pueden clasificarse

en dos grandes ramas, grafting-from, la cual consiste en polimerizar un monómero presente en

una proteína, y grafting to, la cual involucra la adición de un polímero pre-sintetizado en una

proteína mediante acoplamiento reactivo. Aunque recientemente ha sido empleada la

cicloadición alquino-azida catalizada por cobre (CuAAC), una variante de la química click (Li

et al. 2008).

ANTECEDENTES

20

2.4.4 Química click

La necesidad de sintetizar y fabricar nuevos materiales esta siempre acompañada por la

necesidad de proponer nuevas rutas para elaborarlos. Así como la naturaleza evoluciona

mediante procesos más sencillos y eficientes, así mismo debe hacerlo la ciencia de los

polímeros para asegurar su avance y desarrollo.

La química click representa esa búsqueda de herramientas sencillas y eficaces,

metodología propuesta por Sharpless y colaboradores. La química Click no es una disciplina,

sino más bien una filosofía inspirada en la simplicidad de los procesos presentes en la

naturaleza cuyo objetivo es el de fijar una reacción sencilla y altamente selectiva.

2.3.6.1 Modificación Post-polimerización vía química click

La ingeniería macromolecular involucra la síntesis de macromoléculas de composición,

microestructura y arquitectura definidas mediante técnicas de unión covalente, además de las

técnicas convencionales de polimerización, es de igual modo necesario la utilización de

técnicas de modificación post-polimerización, técnicas incompatibles con el proceso o las

condiciones de polimerización (Lahann, 2009).

El concepto “click” fue introducido en el año 2001 por Sharples y colaboradores, dicha

filosofía está basada en la búsqueda de las técnicas más sencillas y eficientes para la

generación de complejos enlazando “clicking” dos componentes.

Los últimos avances en lo que concierne a química click en el área de bioconjugación

están orientados a la unión molecular del tipo azida-alquino. Las macromoléculas formadas

(también llamadas quimeras) presentan las propiedades de los componentes individuales.

Una de las aplicaciones de la química click es la de crear enlaces C-X-C permitiendo la

quimioselectividad, la formación de 1,2,3-triazoles mediante catálisis con cobre (I) a partir de

azidas y alquinos terminales mediante la cicloadición 1,3-dipolar (Figura 2.12), es una

reacción de acoplamiento eficiente y práctica debido a su alto grado de especificidad y la

biocompatibilidad de los reactivos. Ni las azidas ni los alquinos reaccionan con otros grupos

funcionales presentes en los biopolimeros (péptidos o proteínas) por tanto no debe realizarse

una protección química de ellos. Por otro lado los triazoles son estables bajo condiciones

fisiológicas. Y así asociárseles con blancos biológicos, como consecuencia de eso la química

click ofrece un aproximación atractiva para el diseño y síntesis de moléculas con fines de

sensado (Mamamt et al. 2009).

ANTECEDENTES

21

Figura 2.12. Metodología de la química click.

La formación de 1,2,3-triazoles catalizados por cobre (I) a partir de azidas y alquinos

terminales mediante la cicloadición 1,3-dipolar es una reacción de acoplamiento poderosa con

la capacidad de formar arquitecturas complejas, también la química click es utilizada para

formar bloques de copolímeros, adhesivos entrecruzados, dendrimeros y la introducción de

grupos colgantes y grupos funcionales terminales en la cadena polimérica. (Jiang et al. 2003).

Algunos subproductos de las reacciones click son benignos y las reacciones suelen ser

rápidas, tolerantes a grupos funcionales es por ello la dualidad de la química click con la

ingeniería macromolecular.

La especificidad es especialmente importante en las reacciones que involucran por lo

menos una componente biológica, un gran número de grupos funcionales está presente en las

proteínas, y las estrategias de modificación de las biomoléculas con polímeros puede suceder

con alta fidelidad y limitando las reacciones laterales (Sumerlin et al. 2010).

El grupo azida ha sido explotado en gran parte por las reacciones click debido a su alta

reactividad intrínseca y su selectividad así mismo como su estabilidad en presencia de agua así

como de reactivos sin reaccionar y en muestras biológicas.

ANTECEDENTES

22

2.3.6.2Cicloadición Azida-alquino libre de cobre

Aunque para estudios biológicos in vitro es muy efectiva la cicloadición azida-alquino, la

toxicidad del metal hace que se lleve a cabo una cicloadición sin cobre reportada por Bertozzi

y col. (Best et al.2009).

Dado que las proteínas son biopolímeros sintetizados por procesos controlados, estos

ofrecen una serie de grupos activos en las terminaciones facilitando así la bioconjugación

polímero-proteína, aprovechando esta situación es mediante la química click específicamente

con la cicloadición azida-alquino como se muestra en la figura 2.13. que se lleva a cabo la

síntesis de conjugados cuyas propiedades finales serán la unión de las propiedades

individuales de ambas moléculas (Le Droumaguet & Nicolas, 2010).

Figura 2.13. Metodología química click aplicada a bioconjugación polímero-proteína.

2.5 Nanopartículas

Aquellas partículas solidas cuyo tamaño oscila entre los 10 y los 1000 nm son

consideradas nanopartículas (Garg et al. 2011).

En años recientes se ha comenzado a utilizar nanopartículas funcionalizadas (NPs) con

fines de sensado óptico. Se ha visto que aquéllos nanomateriales con tamaño de partícula

menor a los 100 nm muestran propiedades ópticas y electrónicas bastante interesantes. Con

esto, en trabajos recientes se ha optado porsustrituírlos fluoroforos orgánicos por

nanopartículas. (Alvarez et al. 2011).

La producción de nanopartículas requiere del entendimiento de los principios a escala nano

de la química y física y del potencial de comercialización de dichos materiales.

Existen dos aproximaciones para la fabricación de nanopartículas, descendente (top-down)

y ascendente (bottom-up), la primera de ellas hace que los materiales decrezcan en tamaño

hasta la escala nano y la segunda da origen a ellas a partir de la escala atómica (Figura 2.14).

Así mismo existen tres rutas principales para la fabricación de nanopartículas: Fase vapor, fase

líquiday fase solida (Tawatchai et al. 2008).

ANTECEDENTES

23

Figura 2.14.Aproximaciones para la fabricación de nanopartículas: Ascendente (bottom-up)

y descendente (top-down).

Zeng et al. (2011) define a aquéllosmateriales con un diámetro promedio menor a 100 nm

como nanopartículas, sin embargo Garg et al. (2011) consideran como nanopartículas a

aquéllosmateriales con un diámetro dentro del rango de los 10 a 1000 nm.

Entre las ventajas de las nanopartículas para aplicaciones biomédicas se encuentran: la

cantidad de vías de administración, su gran capacidad de transporte y la incorporación factible

tanto de fármacos hidrofóbicos como hidrofilicos. Sin embargo también encontramos

desventajas como el alto costo de fabricación así como la toxicidad ambiental de los solventes

empleados en la fabricación de éstas.

Así mismo existen cuatro métodos de fabricación de nanopartículas no metálicas (Garg et

al 2011).

Dispersión de polímeros preformados

Métodos de polimerización

Coacertivación o método de gelatina iónica

Tecnología de fluidos supercríticos

Las nanopartículas poliméricas son preparadas a partir de polímeros biocompatibles o

biodegradables en los cuales los fármacos pueden ser disueltos, encapsulados o injertados a un

matriz, entre las ventajas del uso de nanopartículas poliméricas encontramos un Incremento de

la estabilidad de los fármacos volátiles, fabricación sencilla y de bajo costo así como el

transporte de altas concentraciones de fármacos a una locación deseada (Nagavarma et al.

2012).

ANTECEDENTES

24

Las nanopartículas pueden clasificarse orgánicas e inorgánicas. Las nanopartículas

orgánicas polímericas pueden ser fabricadas tanto a partir de polímeros naturales (albumina o

heparina) como sintéticos (PEG), dichas partículas permiten el transporte de sustancias (Chuto

et al. 2010).

Las nanopartículas de polímeros biodegradables han sido ampliamente usadas en

aplicaciones biomédicas, los polímeros biodegradables más comúnmente usados son los

poliésteres alifáticos como el poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glutámico) (PGA)

poli(caprolactona) (PCL) (Akagi et al. 2006).

2.6 Nanofibras

Las nanofibras son estructuras de forma alargada y circular caracterizadas por sus

diámetros pequeños menores a los 100 nm, existen diversos tipos de nanofibras, sin embargo

paraestetrabajo nos enfocaremos en aquéllasfabricadas mediante electrohilado dada su

relevancia científica y económica basada en su amplia gama de aplicaciones (Frenot et al.

2003).

A diferencia de las técnicas convencionales de fabricación de fibras (Húmedo, seco, por

fusión y gel) cuyos diámetros de fibra menores a la escala micrométrica, el hilado

electroestático o electrohilado logra fabricar fibras poliméricas con diámetros en la escala

nanométrica.

Este método electrostático emplea un campo eléctrico de alto voltaje para formar fibras a

partir de una corriente de fluído polimérico (solución o fundido) alimentado a través de un

orificio, para cada material hilado existe una amplia cantidad de variables que pueden ser

modificadas (He et al. 2008).

El proceso de fabricar fibras mediante fuerzas electroestáticas es capaz de producir fibras

en el rango nanometrico, el electrohilado ha tomado mucha atención en los últimos años

debido a la versatilidad en el hilado de una amplia variedad de fibras polímericas además de su

consistencia en la distribución de tamaño. El origen del electrohilado puede ubicarse a

principio de los años 30´s, Formhals patentó su primer invento, con el cual podía fabricar

filamentos artificiales usando cargas eléctricas, a través del paso del tiempo ocurrió un

incremento en la investigación del electrohilado debido al aumento del conocimiento del

potencial de aplicaciones para dicha técnica en diversas areas.

El electrohilado es un proceso mediante el cual una solución polímerica o polímero en

estado fundido puede ser convertido en fibras de diámetros pequeños usando un gran campo

de potencial eléctrico. En base a los últimos estudios en el ramo se sabe que el diámetro

promedio de las fibras electrohiladas oscila entre los 100 a los 500 nm (Subbiah et al. 2005).

ANTECEDENTES

25

2.7 Sensores

Se puede definir a un sensor como aquel dispositivo cuya función es la detección o

cuantificación de una propiedad física, respondiendo en forma de estímulo externo y

transformándolo en una señal medible y reproducible (Fegley et al. 2012).

2.7.1 Biosensores

El origen histórico de los biosensores se atribuye al trabajo precursor de Clark y Lyons en

los años 60s (Rahman et al. 2010). La necesidad de métodos de monitoreo simples, rápidos,

efectivos y portables de análisis han disparado el desarrollo de biosensores prácticos con

aplicaciones clínicas y de diagnóstico de enfermedades. Comparados con los métodos de

análisis tradicionales, los sistemas bioanalíticos poseen ventajas considerables como su alta

sensibilidad y especificidad así como la posibilidad de miniaturización y producción en masa

(Ispas et al. 2012).

2.8 Escherichia Coli

Theodore Escherich pediatra alemán, descubrió en 1885 un microorganismo presente

en las heces de niños para posteriormente darse cuenta que dicha forma de vida se encontraba

presente en la flora intestinal de todos los individuos sanos (mamíferos de sangre caliente),

coexistiendo a lo largo de la vida en un proceso simbiótico beneficiando al huésped mediante

la generación de cofactores y contribuyendo como una resistencia ante la colonización de

organismos patógenos. (Donnenberg, 2002).

El subbtipo de E. coli responsable de las enfermedades del tracto urinario difieren de la

cepa comensal que forma parte de la flora intestinal, dicho subtipo es denominado E. Coli

uropatógena (UPEC por sus siglas en ingles) dicha cepa difiere de la comensal debido a que

poseen material genético adicional que codifica productos genéticos que contribuyen a la

patogénesis bacteriológica, la UPEC expresa una serie de factores de virulencia que juegan un

rol en los procesos infecciosos entre ellos la fimbria tipo I, dicha fimbria es una estructura

tubular con afinidad a los compuestos con manosa, expresada en la superficie de la E. coli y

en algunos otros miembros de las enterobactieaceae (Donnenberg, 2002).

La E. coli es un comensal de la flora cuya colonización ocurre próxima al nacimiento

varios genes que residen en un aglomerado en los cromosomas están involucrados en, la

biosíntesis, expresión y funcionamiento de la fimbria tipo I heteropolímerica presente en la E.

coli.

ANTECEDENTES

26

Figura 2.15Organización de los genes a través del fimbria tipo I, nótese la sección final que

conforma la adhesina fimH.

La proteína FimH está formada por 279 residuos de aminoácidos distribuídosen dos

dominios, uno de ellos es un barril que agrupa a los primeros 157 residuos en 11 plegamientos

tipo y además posee una cavidad receptora en donde se lleva a cabo la interacción con la

manosa mediante puentes de hidrógeno (dominio receptor). El resto de los aminoácidos (160 a

279) tienen la función de unir la adhesina a la fimbria. (Sussman, 1997).

2.9 Estado del arte

Potter y col. (1960) observaron que la proteasa cristalina purificada de la papaína produce

cambios histológicos en el cartílago in vivo cuando ésta es inyectada directamente por vía

intravenosa. Sin embargo dicho efecto se presenta solo cuando la enzima es inactivada

mediante oxidación previa a la inyección, ya que de lo contrario, si se inyecta completamente

activa, la papaína cristalizada muestre un efecto menor o inclusive nulo en el cartílago in vivo.

Se ha encontrado en trabajos de Ramos y col. (2010) que los nanocompositos de

nanopartículas de plata mezclados con poli(fenilenetinileno) fungen un papel como

biosensores, detectando y atacando hongos, específicamente aquellos del tipo Paecilomyces

variotii.

Figura 2.16. Estructura del polímero sintetizado por Ramos y col. (2010).

Miyamoto y col. (2003) han desarrollado un nuevo bioconjugado (P-PMPC), formado por

un polímero fosfolípido biocompatible y soluble en agua (PMPC) y la papaína (figura 2.17);

El polímero fue enlazado a los grupos amino de la papaína por medio de enlacies tipo amida

entre éstos y los grupos terminales carboxílicos del polímero.

ANTECEDENTES

27

Figura 2.17Bioconjugado propuesto por Miyamoto y col. (2003).

La depositación de la enzima β-Lactamasa mediante autoensamblaje sobre un sistema

multicapa de poli(fenilenetinileno) Vázquez y col. (2006) presentaron un nuevo material

(Figura 2.18) que mostró respuesta como biosensor, observando la disminución de la

fluorescencia del polímero en función de la concentración de penicilina.

Figura 2.18. Estructura del polímero sintetizado utilizado por Vázquez y col. (2006).

Mediante la utilización de un sensor hibrido bio-síntetico basado en polielectrolitos

conjugados Lee y col. (2007) lograron la detección selectiva de oligonucleótidos con señales

fluorescentes amplificadas. Dicho sensor fue elaborado empleando poli (p-fenilenetinileno)

bioconjugado con oligonucleótidos del DNA (PPE-DNA) y mostró tener características que lo

hacen ser un buen biosensor.

Pu & Liu (2011) en su trabajo de recopilación muestran que los Polielectrolitos

conjugados (CPEs) están contenidos dentro de una categoría de materiales con propiedades

ópticas fluorescentes y de biocompatibilidad para aplicaciones del tipo in vivo así como para

las del tipo in vitro; encontraron evidencia suficiente para considerarlos como marcadores

celulares y capaces de formar nano-arquitecturas tridimensionales así como la posesión de

grupos funcionales reactivos deseables para su bioconjugación con elementos de

bioreconocimiento. Estas características pueden ser utilizadas en el sensado intracelular de

proteínas in vitro, detección celular, marcaje celular in vivo y detección de drogas.

Los trabajos realizados por Liu y col. (2007) permiten la detección de iones mercurio

en agua utilizando un polímero conjugado (PMNT) y MSO (Oligonucleótidos mercury-

specific). Ellos pudieron observar que a simple vista es posible detectar iones Hg2+ gracias a

las propiedades fluorescentes que poseen los polímeros conjugados, en este caso el PMNT,

con todo lo anterior lograron concluir que este sistema puede ser empleado como sensor de

mercurio altamente selectivo.

ANTECEDENTES

28

Figura 2.19. Estructura del biosensor sintetizado por Liu y col. (2007).

Por otro lado Bajaj y col. (2009) emplearon la familia de polímeros fluorescentes de los

PPE para crear una matriz con fines de marcaje celular. Los polímeros con cargas residuales

laterales permitieron la existencia de interacciones multivalentes con las membranas celulares,

permitiendo con esto la detección y la identificación de diferentes tipos de células, normales,

cancerígenas isogénicas metastásicas con alta precisión. .

Figura 2.20 Familia de polímeros fluorescentes empleada por Bajaj y col. (2009).

Datos publicados en el 2010 estiman que alrededor de 150 millones de casos de

infecciones del tracto urinario ocurren anualmente a nivel mundial (Foxman B. 2010). Una

buena parte de este grupo son pacientes jóvenes y mujeres aparentemente sanas. Aunque un

número notable de estos casos se combate con un tratamiento adecuado de antibióticos pero se

sabe que aproximadamente 25 % de las personas afectadas la infección es recurrente. Este tipo

de infecciones por lo común están asociadas con inflamación y dolor, y conforme la infección

se propaga hacia al riñón hay muchas probabilidades de que ocurra daño renal con las graves

consecuencias que ello implica (Bien et al, 2012.

.

La mayoría de las infecciones del tracto urinario son ocasionadas por la bacteria

uropatógena Escherichia coli (Song, 2008) Cuando esta bacteria provoca una infección aguda

o crónica expresa ciertos factores específicos de virulencia uno de los cuales, el más conocido,

aunque no el único son las fimbrias tipo I (Rodrigues & Elimelech, 2009). Este factor que no

es más que un complejo de proteínas (dominios) autoensambladas, en el ápice de la fimbria, el

dominio Fim H1 es capaz de reconocer y anclarse fuertemente a los receptores presentes en la

ANTECEDENTES

29

superficie del urotelio de los pacientes infectados, en forma tal que resiste los esfuerzos de

corte del flujo urinario. Una vez anclada la bacteria puede crecer y reproducirse e inclusive si

durante el tratamiento no es eliminada por completo puede ser fuente y origen de las

infecciones recurrentes (Dhakal et al. 2008).La investigación y el desarrollo de sistemas que

proporcionen una alternativa para la detección rápida o herramientas que funcionen como

filtros para la remoción de estas bacterias de alimentos y otros fluidos fisiológicos, representa

un reto muy interesante.

En los últimos veinte años los olígomeros y polímeros fluorescentes altamente

conjugados han sido objeto de intensos estudios debido a sus propiedades ópticas y

electrónicas. Estas últimas son consecuencia de la estructura alternada de enlaces sencillos y

dobles a lo largo de la cadena en donde todos los átomos de la estructura del esqueleto

carbonado son formas hibridizadas sp o sp2. Esto significa la libre movilidad de los electrones

a lo largo de la cadena originando la deslocalización de los mismos, produciéndose una

molécula semiconductora fluorescente con la capacidad desplazar los electrones a orbitales de

mayor energía (HOMO) con la posterior emisión lumínica cuando dichos electrones regresan a

su orbital de menor energía (LUMO).

Este tipo de polímeros se han empleado con éxito en la fabricación de múltiples y

variados dispositivos (por ejemplo: diodos electroluminiscentes, transistores, capacitores,

celdas fotovoltaicas y electrodos modificados, entre otros muchos) que han encontrado

aplicaciones en pantallas táctiles y en muchos equipos ópticos y electrónicos (Hodkiss, 2009).

Esta tendencia también se ha manifestado en el campo de la biomedicina, en donde se

ha descrito la síntesis y aplicación de un número considerable de polímeros conjugados

fluorescentes, principalmente como marcadores y biosensores para la detección de analitos y

como biomarcadores de imagen en cultivos celulares, ingeniería de tejidos y estudios con

modelos en organismos vivos. (Samuel et al., 2007). El uso de nanopartículas altamente

fluorescente se ha demostrado en un buen número de aplicaciones, entre las que se incluyen el

cribado o selección de alto desempeño, ensayos ultrasensitivos, imágenes de células vivas y

dinámica intracelular [(Alivisatos et al. 2005), (Medint et al., 2005)] Diferentes estructuras

fluorescentes en heterofase se han utilizado para estos propósitos, tales como puntos cuánticos

semiconductores inorgánicos coloidales (Gao et al. 2004) esferas de látex cargadas de

cromoforos(Yang et al. 2004) y coloides de sílice dopadas con colorantes (Ow et al. 2005)

Aunque todas estas estructuras poseen brillantez elevada (emisión elevada) y mayor

fotoestabilidad que los fluoroforos convencionales, una de las principales limitaciones para su

aplicación es el problema de la citotoxicidad, sobre todo cuando se requieren usar con

cualquier tipo de células vivas o en experimentos con animales debido a la presencia del

cadmio [(Derfus et al. 2004),(Kirchner et al. 2005)] Además de este problema existen otros

inconvenientes que limitan el uso generalizado en biomedicina de estas nanoestructuras

cargadas con fluoroforos, tal es el caso de sus tamaños relativamente grandes (>30 nm) y la

concentración limitada del fluoroforo que puede ser cargada en las nanopartículas debido al

“self-quenching”. Otra alternativa poco explorada es el uso de polímeros conjugados para la

obtención de partículas como marcadores fluorescentes. Es bien conocido que muchos de los

polímeros conjugados poseen coeficientes de extinción relativamente altos (en el orden de 106-

ANTECEDENTES

30

107 M-1cm-1) y altos rendimientos cuánticos de fluorescencia (~ 80 %)(Pei & Yang, 1996).

Estas características han despertado el interés de varios grupos de investigación en la

preparación y aplicaciones optoelectrónicas de nanopartículas de polímeros conjugados (NPC)

(Landfester et al. 2002). Una de estas aplicaciones en donde las NCP han surgido como

candidatos prometedores es en el campo biológico, en donde a diferencia de sus contrapartes

moléculas pequeñas o inorgánicas, poseen destacadas propiedades como son la excelente

fotoestabilidad, alta brillantez, baja citotoxicidad, buena biocompatibilidad, tamaño de

pequeño a moderado y excelente capacidad de sensibilidad a la producción de especies

reactivas de oxígeno. Estas propiedades pueden ser moduladas a través del uso de diferentes

esqueletos carbonados, combinando diferentes polímeros y modificando la superficie (Feng et

al. 2013). Aunado a esto, las NPC pueden ser modificadas en su superficie con grupos

funcionales para unir biomoléculas útiles en el sensado de importantes metabólitos o el

marcaje celular para conseguir imágenes in vitro o ex/vivo. Recientemente se ha destacado el

uso de NPC multifuncionales que pueden ser utilizadas en la liberación de fármacos y genes

dirigidos contra microorganismos o células tumorales (Feng et al. 2010)

En este trabajo de tesis se planteó aprovechar el potencial del PGA, la investigación

realizada nos permitió la fabricación de un par de herramientas utilizando este biopolímero,

por un ladola bioconjugación del PGA con la manosa para fabricar nanofibras electrohiladas

con potencial aplicación como filtro en el atrapamiento y retención de la bacteria uropatogéna

E. coli y por el otro la bioconjugación del PGA con él oligomero enfocado al desarrollo de

nanopartículas luminiscentes con capacidad de acarreo de fármacos. La información de los

resultados se presenta y discute en capítulos posteriores.

ANTECEDENTES

31

III. HIPÓTESIS

El poli(ácido γ-glutámico) (PGA) puede emplearse para la síntesis de bioconjugados con

aplicaciones biomédicas (acarreadores de fármacos y sistemas de reconocimiento celular).

Mediante la emulación de la adhesión entre los sitios de reconocimiento del uroepitelio

(específicamente los que contienen manosa) y los receptores específicos de la E. Coli

uropatógena (FimH), se pueden fijar cepas de dicha bacteria en una membrana electrohilada

de PVA cargada con un bioconjugado PGA-Manosido.

Por último, dadas las características anfifilicas del bioconjugado PGA-oligomero, pueden

fabricarse partículas polímericas mediante la doble emulsión, dichas estructuras pueden

emplearse como acarreadores de fármacos.

IV.OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Elaborar herramientas mediante la unión covalente del poli(ácido γ-glutámico) por un

lado con un oligomero conjugado fotoluminiscente para la formación de partículas

luminiscentes con posible aplicación de acarreo de fármacos y por otro con una molécula con

terminación manosapara ser utilizado como un sistema de captura y filtrado de Escherichia

coli.

4.2. Objetivos específicos

Sintetizar el oligómerode fenilenetinileno.

Sintetizar la molécula con terminación manosa.

Funcionalizar el poli(ácido-glutámico)con propargilamina

Llevar a cabo la bioconjugación del olígomero y la molécula con terminacón

manosa con el PGA mediante la reacción de química click.

Caracterización química y espectroscópica tanto de los bioconjugados como de

sus especies intermedias.

Evaluación de la formación de partículas del bioconjugado PGA/oligómero.

Evaluación de la aplicación como filtro de bacterias del bioconjugado

PGA/manosa cargado en una membrana de nanofibras de PVA.

ANTECEDENTES

32

V. JUSTIFICACIÓN

El desarrollo de nuevas tecnologías así como los diversos avances en la ciencia, han

originado una necesidad de investigar nuevas metodologías que permitan la fabricación de

nanomateriales aplicables en las diferentes áreas de la ciencia para dar un enfoque diferente a

la resolución de problemas cotidianos en la vida diaria.

A pesar de las tecnologías y conocimientos que posee el ser humano aún sigue siendo

vulnerable a formas de vida microscópicas causantes de enfermedades, las cuales en muchos

casos culminan en la muerte, por ello surge la necesidad de desarrollar herramientas de

diagnostico capaces de identificar y/o fijar dichos patógenos causantes de pandemias que cada

año cuestan la vida a un número considerable de personas alrededor del mundo.

Así mismo para evitar el debilitamiento del cuerpo humano con la intromisión de agentes

externos que no puedan ser eliminados vía renal, es necesario estudiar la fabricación de

acarreadores de fármacos biodegradables y a la vez biocompatibles capaces de realizar su

función de transportar medicamentos sin generar un daño secundario por su degradación en el

organismo.

La fijación de patógenos resulta realmente importante ya que de este paso depende la

prevención de infecciones en el cuerpo humano pero también de la contaminación en

alimentos a escala industrial, situación que ha llevado incluso en algunos casos a la quiebra a

empresas del ramo alimenticio, debido a la eliminación de lotes completos de producción por

la presencia de patógenos en sus productos.

VI. DEFINICIÓN DELPROBLEMA

Un mundo tan dinámico como el nuestro exige servicios de salud, suficientes y eficaces

para combatir las necesidades sanitarias que azotan a las sociedades modernas. A pesar de que

en la actualidad se cuenta con herramientas para la detección y tipificación de

microorganismos o células patógenas, se requiere el desarrollo de sistemas de fijación o

atrapamiento celularcapaces de retener de forma selectiva células responsables de patogenias,

previniendo la contaminación de centros de salud y procesos alimenticios en industrias.

ANTECEDENTES

33

VII.CONTRIBUCIÓN CIENTÍFICA DEL TEMA

Se desarrollaron dos nuevas herramientas moleculares útiles como filtro molecular y de

diagnóstico, empleando una membrana formada por nanofibras de poli(vinil alcohol) como

soporte de un bioconjugado compuesto por poli(ácido γ-glutámico) y una molécula con

terminación manosa. Este sistema es innovador porque de acuerdo a la bibliografía no ha sido

aún desarrollado por algún otro grupo de investigación. Se estudió su aplicación como filtro en

el atrapamiento por reconocimiento molecular de la manosa con la fimbria tipo I de E. Coli.

En el segundo caso la unión del oligómero fluorescente permite la formación de partículas

fluorescentes con potencial aplicación en marcaje celular o acarreo de fármacos.

VIII. DESARROLLO EXPERIMENTAL

El trabajo experimental realizado para este proyecto de tesis puede ser dividido en

cuatro etapas, la primera de ellas lo compone la síntesis de 3 moléculas: el oligómero o

trímero de fenilenetinileno, la molécula con funcionalidad manosa y el PGA modificado con

propargil amina (acetileno terminal), como segundo paso se presenta la bioconjugación de dos

sistemas uno de ellos el PGA-trímero y el otro PGA-Manósido.

Posteriormente en un tercer paso con el bioconjugado PGA-trímero se fabricaron

nanopartículas polímericas y con el PGA- Manósido membranas electrohiladas, y así en un

último paso se evaluó la aplicación como filtro de bacterias las membranas electrohiladas del

bioconjugado PGA- Manósido, dejando pendiente para trabajos posteriores la evaluación

comoacarreador de fármacos las nanopartículas de bioconjugado PGA-trímero.

ANTECEDENTES

34

Síntesis

Bioconjugación

Fabricación de dispositivos

Evaluar aplicaciones

Evaluar su aplicación como

acarreador de fármacos en

trabajos futuros.

Se evaluó su aplicación como

filtro y su capacidad de

fijación de la cepa E. Coli

uropatógena, mediante el

reconocimiento de sitios

específicos (Adhesina FimH).

DESARROLLO EXPERIMENTAL

35

8.1 Reactivos

En la tabla 8.1 se muestran los reactivos utilizados en el desarrollo del trabajo de tesis,

tanto en la parte de síntesis, en la parte de electrohilado y en las pruebas de evaluación

microbiológica de las membranas.

Tabla 8.1Reactivos utilizados para el desarrollo del proyecto de tesis.

Nombre Estructura Peso

molecular

.

Densidad

Ácido 2,5-dibromobenzóico

279.91

----

2-(2-(2-

cloroetoxi)etoxi)etanol 186.62 1.16

Di(etilen glicol) metil éter

120.15 1.023

N,N-diciclohexilcarbodiimida

224.34

----

4-Dimetilamino piridina

122.17 ----

Cloruro de

Bis(trifenilfosfina)

Paladio(II)

666.44

----

Ioduro de cobre CuI 190.45 ----

etiniltrimetilsilil

98.22

0695

fluoruro de tretrabutil

amonio

261.46

----


36

ácido 3-yodobenzoico

248.02

----

Azida de sodio NaN3 65 ----

N-hidroxisuccinimida

115.09

----

Propargil amina

55.08 0.86

N,N-Diisopropiletilamina

129.24

0.742

acetato de cobre

181.63

-----

L-Ácido ascórbico

176.12

----

cloruro de 6-bromohexanoilo

213.15

1.395

4-aminofenil a-D

manopiranósido

271.25

----

Polivinil alcohol

13,000 -

23,000

----

Polivinil alcohol

126,000

----

Polí(ácido-y-glutámico)

34,000

----

Peptona de caseína ---- --- ----

Extracto de levadura. ---- --- ----

Cloruro de Sodio NaCl 58.44 ---

Cloruro de magnesio MgCl2 95.21 ---

Glucosa C6H12O6 180.16 ---

Agar bacteriológico. ---- --- ----


37

Concanavalin A. ---- --- ----

Sílice para cromatografía ---- --- ----

Empaque de GPC ---- --- ----

8.2 Disolventes

Los disolventes utilizados en el desarrollo de este trabajo se listan en la tabla 8.2.

Tabla 8.2. Disolventes y sus propiedades utilizados en el desarrollo del trabajo de tesis*.

Nombre Estructura Peso

molecular

Punto de

ebullición*

Punto de

fusión

Densidad

Cloroformo CHCl3 119.4 61 -64 1.4429

Cloruro de

metileno

CH2Cl2 84.9 40 -95 1.317

Tetrahidrofurano C4H8O 72.1 66 -109 0.889

N,N-

Dimetilformamida

C3H7NO 73.1 153 -60 0.949

Dimetilsulfóxido C2H6OS 78.1 189 18.5 1.096

Metanol CH3OH 32 65 -98 0.791

Agua H2O 80.2 100 0 1

Tolueno C7H8 92.1 111 -95 0.867

Clorobenceno C6H5Cl 112.56

Acetona C3H6O 58.08 56 -95 0.790

Trietilamina C6H15N 101.2 90 -115 0.728

*Puntos de ebullición a 760 torr, valores obtenidos a 20°C (Michigan State University).

8.3 Material y equipo

A continuación se enlista el material utilizado durante la síntesis, la elaboración de

membranas por electrohilado y en las pruebas microbiológicas.

Botellas de vidrio de 500 y 1000 mL con taparrosca.

Cajas de cultivo celular.

Cabeza de destilación de 250 mL con uniones esmeriladas 24/40 en vidrio

pyrex.

Columnas de vidrio para cromatografía de columna de vidrio pyrex en varios

tamaños.

Embudo de separación.

Embudo de dosificación.

Matraz aforado de 10 mL.




38

Matraz erlenmeyer de 250 mL en vidrio pyrex.

Matraz erlenmeyer bafleados de 250 mL en vidrio pyrex.

Matraz fondo redondo de 250 mL con 2 bocas esmeriladas 24/40 en vidrio

pyrex.

Matraz de fondo redondo de 1000 mL de 2 bocas esmeriladas 24/40 en vidrio

pyrex.

Pipeta de 10 mL 1/10 de vidrio.

Refrigerante tipo rosarios con uniones esmeriladas 24/40 en vidrio pyrex.

Tubos de ensaye con rosca de 8 mL en vidrio pyrex.

Vaso de precipitado 50 mL en vidrio pyrex.

Válvula de vidrio con esmeril 24/40 de vidrio pyrex.



Equipo

Autoclave Yamato SE510

Balanza analítica ohaus analytical plus.

Bomba de infusión de jeringa cole-parmer

Calorímetro diferencial de barrido Discovery series TA instruments.

Centrifuga Allegra 25R Beckman coulter

Centrifuga ependorf 5415

Centrifuga Peseco único

Equipo de resonancia magnética nuclear JEOL eclipse 300 MHz.

Espectrofotómetro FT-IR Nicolet550

Espectrofotómetro UV shimadzu

Espectrofotómetro de fluorescencia

Espectrofotómetro visible

Estufa de secado Imperial V

Fuente de voltaje spellman CZE1000R

Incubadora imperial II lab line

Incubadora precition mechanical convection con control de humedad.

Incubadora rotatoria new Brunswick scientific.

Liofilizador Labconco Freeze dry system/Freezone 4.5

Microscopio Leica ATC-200

Microscopio invertido Nikon eclipse Ts100

Microscopio estereoscópico

Microscopio electrónico de barrido topcom

Microscopio electrónico de barrido JEOL

Reómetro Antor Paar Physica MCR 501.

Sonicador Branson 200 ultrasonic clearer


39

8.4. Cepas de microorganismos

En la tabla 8.3. se descren las cepas de los microorganismos utilizados en este trabajo.

Tabla 8.3. Cepas utilizadas en las evaluaciones microbiológicas.

Microorg

anismo

Cepas Descripción Referencias

Escherich

ia coli

ORN

208*

Mutante por inserción en el

gene fimH. (ORN115 except

tetR inserted ca. 200 bp 39

of the end of fimH, Pil+). No

se aglutina en presencia de

células de levadrura

Harris, S. L.; Spears, P. A.;

Havell, E. A.; Hamrick, T. S.;

Horton,

J. R.; Orndorff, P. E. J.

Bacteriol. 2001, 183 (13),

4099–4102.

ORN

178*

Produce fimbrias tipo I.

(ORN115 except

fimH304::kan with adjacent

tetR, Nalr. Se aglutina en

presencia de células de

levadrura)

Harris, S. L.; Spears, P. A.;

Havell, E. A.; Hamrick, T. S.;

Horton,

J. R.; Orndorff, P. E. J.

Bacteriol. 2001, 183 (13),

4099–4102.

SS4 Cepa aislada de un Hospital

de Saltillo. Se aglutina en

presencia de células de

levadrura

-

Saccharo-

myces

cerevisiae

- Obtenida comercialmente y

es conocida comúnmente

como levadura de pan

-

*Cepas donadas amablemente por el Professor Orndorff


40

8.5 Síntesis del trímero de fenilenetinileno

8.5.1. Síntesis del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-dibromobenzoato

En un matraz de dos bocas provisto de un agitador magnético fueron colocados 1 g (4.0319

mmol) de ácido 2,5-dibromobenzoico (1), 0.532 g (3.57 mmol, 0.485 mL) de 2-(2-(2-

cloroetoxi)etoxi)etanol y 0.0871 g (0.714 mmol) de Dimetil amino piridina (DMAP). Posteriormente

se adicionaron 30 mL de cloruro de metileno lavado y anhidro, el cual fue lavado de la siguiente

manera: en un matraz erlenmeyer provisto de un agitador magnético se colocaron 100 mL de cloruro

de metileno y 100 mL de agua desionizada, se agitó la mezcla por un lapso de 20 minutos, posterior a

esto la mezcla fue separada por medio de un embudo, recuperando la fase orgánica para repetir los

lavados 2 veces más y asegurar así la remoción del metanol presente en el cloruro de metileno. Una

vez que el disolvente fue añadido, el sistema se colocó en un baño de hielo a 0°C y se adicionaron

1.84 g (8.9 mmol) de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC). La reacción se llevó a cabo a 80°C

durante 17 horas con agitación. Pasadas las 17 horas se retiró el solvente y el sólido blanco de

consistencia pastosa fue purificado por cromatografía en columna de sílice utilizando cloroformo

como fase móvil, se obtuvo un líquido transparente de tonalidad verde como producto puro con un

rendimiento del 89%.

1H RMN 300 MHz =3.6 ppm (t, 2H, CH2), 3.7 ppm (m, 4H, CH2), 3.75 ppm (m, 2H, CH2),

3.85 ppm (m, 2H, CH2) 4.45 ppm (m, 2H, CH2) 7.43 ppm (d, 1H, CH) 7.5 ppm (d, 1H, CH) 7.95 ppm

(s, 1H, CH).13C RMN 300 MHz =43 ppm (1C, CH2), 65.5 ppm (1C, CH2), 69 ppm (1C, CH2), 71

ppm (1C, CH2), 71.5 ppm (1C, CH2), 72 ppm (1C, CH2), 121 ppm (1C, CH), 121.5 ppm (1C, CH),

133.5 ppm (1C, CH), 134ppm (1C, CH), 136 ppm (1C, CH2), 165 ppm (1C, CO).

8.5.2 Síntesis del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5 bis((trimetilsilil)etinil)benzoato

En un matraz de dos bocas provisto de un agitador magnético y una válvula de vidrio en

una de las bocas, se colocaron 0.750 g (1.749 mmol) de 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-

dibromobenzoato (2) junto con 0.0613 g(0.087 mmol) de Cloruro de Bis(trifenilfosfina)

Paladio(II)y 0.0049 g (0.026 mmol) de Ioduro de cobre. La boca restante del matraz fue

cubierta con un septum de caucho y mediante la válvula, el material dentro fue liofilizado para


41

eliminar humedad y aire; teniendo una atmósfera de vacío se llenó el sistema con nitrógeno.

Posteriormente al sistema se le adicionaron 80 mL de trietil amina desgasificada y anhidra. El

sistema fue calentado a 50°C por un lapso de 15 minutos con agitación y por medio de una

jeringa se burbujeóal sistema 0.5124 g (5.226 mmol, 0.7372mL) de etiniltrimetilsilil. El

sistema se mantuvo en agitación y 90°C durante 17 horas. Se retiró el disolvente y el producto

viscoso de color negro fue purificado en columna de sílice utilizando cloroformo como

eluyente. Se obtuvo un rendimiento de 83.8%

1H RMN 300 MHz =0.25 ppm (m, 18H, CH3), 3.6 ppm (t, 2H, CH2), 3.7 ppm (m, 4H,

CH2), 3.75 ppm (m, 2H, CH2), 3.85 ppm (m, 2H, CH2) 4.5 ppm (m, 2H, CH2) 7.5 ppm (d, 2H,

CH), 7.95 ppm (s, 1H, CH).13C RMN 300 MHz = 0 ppm (6C, CH3), 43 ppm (1C, CH2), 65.5

ppm (1C, CH2), 69 ppm (1C, CH2), 71 ppm (1C, CH2), 71.5 ppm (1C, CH2), 72 ppm (2C, CH2),

121 ppm, 98 ppm (1C, CC), 103 ppm (1C, CC), 104 ppm (1C, CC), 104.5 ppm (1C, CC), 124

ppm (1C, CH), 134ppm (1C, CH), 135ppm (1C, CH), 135.5 ppm (1C, CH2), 165 ppm (1C, CO).

8.5.3 Síntesis del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5- dietinilbenzoato

En un matraz de fondo redondo de 100 mL provisto de un agitador magnético se

colocaron 0.9034 g (2.023 mmol) de 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-

bis((trimetilsilil)etinil)benzoato (3) junto con 15 mL de Tetrahidrofurano y 0.1 mL (5.55

mmol)aproximadamente de agua. Posteriormente se agregó 1 mL (3.45 mmol, 0.903 gramos)

de fluoruro de tretrabutil amonio 1 M en THF y se dejó la reacción en agitación durante 15

minutos; el producto de la reacción se colocó en una columna de sílice sin disolvente y se

utilizó cloruro de metileno como eluyente, se obtuvo un producto viscoso de coloración negra

con un rendimiento de 87%.

1H RMN 300 MHz =3.2 ppm (s, 1H, CH), 3.5 ppm (s, 1H, CH), 3.6 ppm (t, 2H, CH2), 3.7

ppm (m, 4H, CH2), 3.75 ppm (m, 2H, CH2), 3.85 ppm (m, 2H, CH2) 4.5 ppm (m, 2H, CH2)

7.55 ppm (d, 2H, CH), 8.1 ppm (s, 1H, CH).13C RMN 300 MHz = 43 ppm (1C, CH2), 65.5

ppm (1C, CH2), 69 ppm (1C, CH2), 71 ppm (1C, CH2), 72 ppm (2C, CH2), 80 ppm (1C, C≡C),

81 ppm (1C, C≡C), 82 ppm (1C, C≡C), 85 ppm (1C, C≡C), 122.5 ppm (1C, CH), 124 ppm

(1C, CH), 134ppm (1C, CH), 135ppm (1C, CH), 135.5 ppm (1C, CH2), 165 ppm (1C, CO).


42

8.5.4 Síntesis del 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato

A un matraz de dos bocas provisto de un agitador magnético fueron vertidos 1g (3.57

mmol) de ácido 3-yodobenzoico (5), 0.6023g (3.57 mmol) de Di(etilen glicol) metil éter y

0.0871g (0.714 mmol) de Dimetil amino piridina (DMAP). Posteriormente se adicionaron 30

mL de cloruro de metileno lavado y anhidro, lavado de la misma forma como se mencionó en

la primera reacción. Una vez que el disolvente fue añadido, el sistema se colocó en un baño

de hielo a 0°C y se adicionaron 2 g (9.67 mmol) de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC). La

reacción se llevó a cabo a 80°C durante 17 horas con agitación. Pasadas las 17 horas se retiró

el disolvente y el líquido amarillento fue purificado por cromatografía en columna de sílice

utilizando cloruro de metileno como fase móvil, se obtuvo un rendimiento de 82%.

1H RMN 300 MHz =3.25 ppm (m, 3H, CH3), 3.45 ppm (t, 2H, CH2), 3.6 ppm (t, 2H,

CH2), 3.75 ppm (t, 2H, CH2), 4.4 ppm (t, 2H, CH2) 7.1 ppm (t, 1H, CH), 7.75 ppm (d, 1H,

CH), 7.9 ppm (d, 1H, CH), 8.25 ppm (s, 1H, CH).13C RMN 300 MHz = 59 ppm (1C, CH3),

64.5 ppm (1C, CH2), 69 ppm (1C, CH2), 71 ppm (1C, CH2), 72 ppm (1C, CH2), , 95 ppm (1C,

CH), 128.5 ppm (1C, CH), 130.5 ppm (1C, CH), 132.5 ppm (1C, CH), 138.5 ppm (1C, CH),

143 ppm (1C, CH),165 ppm (1C, CO).

8.5.5Síntesis de bis(2-(2-metoxietoxi)etil)metoxietoxi)etil3,3'-(2-((2-(2-(2-

cloroetoxi)etoxi)etoxi)carbonil)-1,4-fenilene)bis(eten-2,1-dil)dibenzoato (trímero

fenilenetinileno).

En un matraz de dos bocas provisto de un agitador magnético y una válvula de vidrio

en una de las bocas, se colocaron 0.680g (1.798 mmol) de 2-(2-metoxietoxi)etil 3-

iodobenzoato (6), junto con 0.0210 g(0.089 mmol) de cloruro de trifenilfosfina paladio y

0.00172 g (0.026 mmol) de ioduro de cobre. La boca restante del matraz fue cubierta con un

septum de caucho y mediante la válvula, el material dentro fue liofilizado para eliminar la

humedad y el aire, teniendo una atmósfera de vació se llenó el sistema con nitrógeno.

Posteriormente al sistema se le adicionaron 80 mL de trietil amina desgasificada y

anhidra. El sistema fue calentado a 50°C por un lapso de 15 minutos con agitación y por


43

medio de una cánula se transfirieron al sistema 0.15649g (0.5mmol) de (2-(2-

cloroetoxi)etoxi)etil 2,5- dietinilbenzoato(4) en solución en dimetilformamida (DMF)

previamente desgasificada por medio de burbujeo de nitrógeno; el sistema se mantuvo en

agitación y 90°C durante 17 horas. Se retiró el disolvente y el producto viscoso de color sepia

fue purificado en columna de sílice utilizando cloroformo como eluyente y con una columna

de GPC, empleando empaque de poliestireno para retirar monómero y diacetilenos, se obtuvo

un rendimiento del 57%

1H RMN 300 MHz =3.35 ppm (m, 6H, CH3), 3.55 ppm (t, 4H, CH2), 3.65 ppm (m,

12H, CH2), 3.85 ppm (m, 6H, CH2), 4.5 ppm (m, 6H, CH2) 7.45 ppm (t, 3H, CH), 7.65 ppm (s,

2H, CH), 7.75 ppm (m, 2H, CH), 8.05 ppm (d, 2H, CH), 8.2 ppm (s, 1H, CH), 8.25 ppm (d,

1H, CH). 13C RMN 300 MHz = 43 ppm (2C, CH3), 49 ppm (1C, CH2), 56 ppm (3C, CH2),

59 ppm (3C, CH2), 65 ppm (1C, CH2), 69 ppm (1C, CH2), 70.5 ppm (1C, CH2), 72 ppm (2C,

CH2), 72.5 ppm (2C, CH2), 123 ppm (1C, CH), 129 ppm (3C, CH),131 ppm (1C, CH), 133

ppm (2C, CH), 134 ppm (2C, CH) 134.5 ppm (3C, CH), 135 ppm (3C, CH), 137 ppm (2C,

CH), 165.5 ppm (1C, CO), 166 ppm (2C, CO).

8.5.6.Síntesis del trímero con terminación azida

En un matraz de fondo redondo se colocaron 100 mg (1.24 mmol) de 2-(2-(2-

cloroetoxi)etoxi)etil 5-((2-((2-(2-metoxietoxi)etoxi)carbonil)fenil)etinil)-2-((3-((2-(2-

metoxietoxi)etoxi)carbonil)fenil)etinil)benzoato (7) junto con 80.25 mg (1.24 mmol) de Azida

de sodio con 30 mL de una solución 10:1 Acetona/Agua para mantener soluble el sistema

trímero/azida. La reacción se mantuvo en agitación y 55°C durante 24 horas, el producto de la

reacción se purificó mediante extracción líquido-líquido cloroformo/agua para remover el

remanente de azida de sodio y el subproducto cloruro de sodio en la fase acuosa y el producto

de interés en la fase orgánica, se obtuvo un rendimiento del 91%.

FTIR en KBr 2929 cm-1 (sp3, C-H, asimétrico), 2858 cm-1 (sp3, C-H, simétrico), 2212

cm-1 (N=N), 1687 cm-1 (Flexión, C=O), 1450 cm-1 (sp3, C-H, flexión), 1250 cm-1

(Alargamiento, C-N),1110, 1080 cm-1 (Alargamiento, C-O).


44

8.6 Funcionalización del PGA

8.6.1 Funcionalización de PGA con N-hidroxisuccinimida

En un matraz de dos bocas se colocaron 200 mg (5.79 mmol) de poli(ácido-

glutámico) (PGA), 34 600 Dalton 200 mg (1.8248 mmol) de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 5

mg ( 0.04 mmol) de dimetilaminopiridina (DMAP), el sistema se mantuvo en atmósfera inerte,

al cual se le adicionaron 360 mg (1.70 mmol) de Diciclohexilcarbodiimida (DCC) en un

volumen de 70 mL de Dimetilsulfóxido anhidro. La reacción se mantuvo en agitación y

calentamiento a 80°C durante 120 horas. El sólido final de coloración blanco aperlado se

purificó mediante tres precipitaciones en metanol y centrifugación para recuperar el producto a

5000 rpm durante 15 minutos en una centrifuga peseco, se obtuvo un rendimiento del 69%.

1H RMN 300 MHz =1.15 ppm (m, 1H, CH2), 1.35 ppm (m, 1H, CH2), 1.55 ppm (s,

1H, CH), 1.7 ppm (d, 1H, CH2), 1.8 ppm (d, 1H, CH2) 2.75 ppm (s, 2H, CH2), 8.25 ppm (s,

1H, NH). 13C RMN 300 MHz =25 ppm (1C,), 26 ppm (1C,), 34 ppm (1C,), 49 ppm (1C,),

154 ppm (1C, CO), 156 ppm (1C, CO), 159 ppm (1C, CO).

8.6.2. Modificación de PGA funcionalizado con NHS con propargil amina

Se colocaron 200 mg del PGA funcionalizado con NHS 43 500 Dalton(10) , 860 mg

(95.53mmol, 0.11 mL) de Propargil amina y 224 mg (1.73 mmol, 0.301 mL) de N,N-

Diisopropiletilamina (DIPEA), en un matraz de dos bocas, en una de ellas se colocó un septum

mientras que en la otra, un globo con nitrógeno, con lo cual se mantuvo en atmósfera inerte y

posteriormente se le adicionaron 80 mL de dimetilformamida (DMF) anhídrida mediante una

cánula, el sistema se mantuvo en agitación y calentamiento a 45°C durante 120 horas. El

producto final, un polvo amarillento se purificó mediante precipitaciones en acetona y

centrifugación para recuperar el precipitado a 5000 rpm durante 15 minutos en una centrifuga

peseco, se obtuvo un rendmiento del 89%. 13C RMN 300 MHz = 25 ppm (1C,), 26 ppm

(1C,), 34 ppm (1C,), 38 ppm (1C,), 72.5 ppm (1C,), 74.5 ppm (1C,), 157 ppm (1C, CO),

160.5 ppm (1C, CO).Raman 532 nm. 3300 N-H estiramiento, 2800-3000 estiramiento C-H,

2100-2150 estiramiento C≡C, 1500-1700 estiramiento C=0, 1400-1470 flexión CH2, y flexión

asimétrica CH3


45

8.7 Síntesis del bioconjugado PGA-Trímero

En un matraz de fondo redondo de 100 mL provisto de dos bocas se colocaron 10 mg

de PGA funcionalizado con propargil amina (11), 43 mg (0.55 mmol) de trímero, 0.12 mg

(0.001mmol) de acetato de cobre (Cu(OAc)2 y 0.23 mg (1.5 mmol) de L-Ácido ascórbico,

posteriormente mediante una cánula a través de la boca sellada con un septum se adicionaron

50 mL de dimetilformamida, se mantuvo en agitación y calentamiento a 50°C durando 240

horas. El producto se purificó mediante precipitaciones con metanol y centrifugado a 5000

rpm, el producto resultante presentó una coloración verde y una respuesta fluorescente bajo la

lámpara ultravioleta, se obtuvo un rendimiento del 58%.

1H RMN 300 MHz =1.05 ppm (m, 1H, CH2), 1.25 ppm (m, 1H, CH2), 1.5 ppm (s, 1H, CH),

1.65 ppm (d, 1H, CH2), 1.75 ppm (d, 1H, CH2), 3.25 ppm (m, 6H, CH3), 3.9 ppm (m, 6H,

CH2) 7.45 ppm (s, 1H, CH), 7.6 ppm (m, 3H, CH), 7.8 ppm (m, 2H, CH), 8.05 ppm (d, 2H,

CH), 8.2 ppm (m, 1H, CH), 8.25 ppm (s, 1H, NH).

8.8 Síntesis de la azida de 6(-4-amidofenil α-D manopiranosido)hexanoilo

8.8.1 Síntesisdel 2,5-dioxopirrolidon-1-il 6 bromohexanoato

En un matraz de dos bocas provisto de un septum en una de ellas y en la otra un

embudo de dosificación, se colocaron 0.666 g (5.15 mmol, 0.8980 mL) de Diisopropil,etil

amina (DIPEA), 0.593 g (5.1557 mmol) de N-hidroxisuccinimida y 30 mL de cloruro de

metileno seco. Posteriormente se añadió gota a gota mediante una jeringa 1.0 g (5.15 mmol,

0.72 mL) de cloruro de 6-bromohexanoilo procurando que la temperatura interna no aumente

a más de 2°C mediante el enfriamiento de un baño de hielo y controlando la velocidad de

adición. El sistema se mantuvo en agitación y temperatura ambiente durante 10 horas,

posteriormente se agregó 50 mL de H2O y la fase orgánica se extrajo con CH2Cl2 (2 X 30

mL), se secó con MgSO4, se filtró, se evaporó y se pasó por una columna empacada de sílice

utilizando cloruro de metileno como eluyente (Rf = 0.9), para obtener cristales blancos en 88%

de rendimiento.


46

1H RMN 300 MHz =1.55 ppm (m, 2H, -CH2--Br), 1.8 ppm (m, 2H, -CH2-β-COO),

1.9 ppm (m, 2H, -CH2-β-Br), 2.6 ppm (t, 2H, -CH2-α-COO), 2.85 ppm (2s, 2H, -CH2-suc), 3.4

ppm (t, 2H, -CH2-α-Br), 13C RMN 300 MHz = 24 ppm (1C, CH2), 26 ppm (1C, CH2), 28

ppm (1C, CH2), 31 ppm (1C, CH2), 33 ppm (1C, CH2), , 34 ppm (1C, CH2), 168 ppm (1C,

CO), 169 ppm (2C, CO).

8.8.2. Síntesis de bromuro de 6(-4-amidofenil α-D manopiranosido)hexanoilo

En un matraz de fondo redondo provisto de dos bocas se colocaron 0.259 g (0.921

mmol), de 4-aminofenil α-D manopiranosido, 0.323 g (1.105 mmol) de2,5-dioxopirrolidon-1-

il 6 bromohexanoato y 0.140 g (1.105 mmol, 0.192 mL) de disopropil-etil amina. En una de

las bocas se colocó una válvula con un globo de nitrógeno para generar una atmósfera inerte y

en la otra boca un septum. Al sistema se la adicionaron 80 mL de Dimetilformamida por la

boca del septum mediante la utilización de una cánula.

El sistema se mantuvo en agitación y calentamiento a 60 °C durante 48 horas. El

producto, un sólido viscoso de coloración morada se purificó en columna de sílice utilizando

en un primer paso cloruro de metileno para eliminar los restos de reactivo y en un segundo

paso, para recuperar el producto se utilizó metanol y se obtuvo un rendimiento del 91%.

1H RMN 300 MHz =1.25 ppm (m, 2H, CH2), 1.4ppm (m, 2H, CH2), 1.6 ppm (m, 2H, CH2),

2.3 ppm (d, 2H, CH2), 3.65 ppm (d, 2H, CH2) 3.8 ppm (d, 1H, CH2), 5.3 ppm (d,1H,CH), 7

ppm (d, 1H, CH), 7.5 ppm (d, 1H, CH) 9.8 ppm (s, 1H, NH).

8.8.3. Síntesis de la azida de 6(-4-amidofenil α-D manopiranosido) hexanoilo

En un matraz de fondo redondo provisto de una boca se colocaron 400 mg (860 mmol)

de bromuro de 6(-4-amidofenil α-D manopiranosido)hexanoilo (17) junto con 0.140g (2162

mmol) de azida de sodio, al sistema se le adicionó 100 mL de Dimetilsulfóxido y 20 mL de

agua ultrapura, el sistema se dejó en agitación y calentamiento a 50°C durante 24 horas, el

producto final fue purificado mediante precipitaciones en agua para remover los residuos de

azida y el subproducto bromuro de sodio del sistema, se obtuvo un rendimiento del 93%.


47

8.9 Síntesis del bioconjugado PGA-Manosa

Se colocaron 10 mg de PGA funcionalizado con propargil amina, 43 mg de de 6(4-

aminofenil α-D manopiranosido) hexanoilo (18), 0.48 (0.004 mg) de acetato de cobre

(Cu(OAc)2) y 0.92 mg (6 mmol) de L-Ácido ascórbico en un matraz de fondo redondo

utilizando como disolvente dimetilformamida, el sistema se mantuvo en agitación y

calentamiento a 50 °C durando 240 horas. El producto final de coloración sepia se purificó

mediante precipitaciones con metanol y centrifugado a 5000 rpm, se obtuvo un rendimiento

del 54%.

1H RMN 300 MHz=1.05 ppm (m, 1H, CH2), 1.25 ppm (m, 1H, CH2), 1.5 ppm (s, 1H,

CH), 1.65 ppm (d, 1H, CH2), 1.75 ppm (d, 1H, CH2), 2.3 ppm (d, 2H, CH2), 3.4 ppm

(d,2H,CH2), 3.6 ppm (s, 1H, CH), 7.1 ppm (d, 2H, CH) 7.25 ppm (s, 1H, CH), 7.5 ppm (d,

2H, CH), 8.15 ppm (s, 1H, NH).


48

8.10 Formación de partículas de bioconjugado PGA-Trímero por el método de la doble

emulsión

El bioconjugado PGA-trímero se disolvió en clorobenceno (1 mg/mL), una vez disuelto a

totalidad , un mililitro de esta solución se adicionó a un mililitro de agua ultrapura en

agitación, dejando la mezcla final agitando durante 5 minutos. Posteriormente lamezcla se

sonicó durante 5 minutos para formar una emulsión.

Para formar la segunda emulsión, la emulsión previamente formada se adicionó gota

por gota a una solución de dodecilsulfato sódico (1 % w/v). La mezcla se dejó bajo agitación

por 5 minutos y después sónico por otros 5 minutos para formar la segunda

Finalmente esta última emulsión se precipito en 16 mL de agua ultrapura (resistencia, 18

mῼ), dejándose en agitación hasta alcanzar la total evaporación del clorobenceno. La solución

acuosa final fue purificada mediante diálisis utilizando una membrana de acetato de celulosa

contra agua ultrapura y realizando cambios de agua cada 4 horas (con restricción de poro

molecular mayor a 14,000 Dalton) para remover el SDS,5 mL de agua ultrapura en la primera

emulsión, 18 mL de solución de SDS en la segunda emulsión y 48 mL de agua ultrapura para

la evaporación del clorobenceno (Figura 8.1) (Biondi et al. 2013).

Figura 8.1Apariencias de las muestras durante la formación de las emulsiones. 1) Solución

bioconjugado/clorobenceno. 2) primera microemulsión. 3) segunda microemulsión.

1) 2) 3)


49

8.11 Fabricación de nanofibras por electrohilado

En la fabricación de las nanofibras por electrohilado, la preparación del filtro

molecular para la captura y atrapamiento de las células de E. Coli se utilizó PVA de diferente

peso molecular y grado de hidrólisis (Mw=13,000-23000 g/mol (87-89% hidrolizado) y

Mw=126,000 g/mol (98-99%) hidrolizado) como vehículo del bioconjugado γ-PGA/manosa.

Para ello se preparó una solución acuosa 50:50 de la mezcla de ambos polímeros, calentando

en baño maría a 80°C hastasu disolución total, que es el punto donde visualmente no se

aprecia turbidez y la solución es completamente trasparente al ojo desnudo (Hernandez, M.,

2012). La preparación de las nanofibras γ-PGA-manosa yla solución de PVA como vehículos

de este bioconjugado se describen en los siguientes apartados.

8.11.1. Obtención de nanofibras electrohiladas de PVA

Con la solución preparada con la mezcla de los polímeros de PVA se procedió a la

fabricación de nanofibras electrohiladas.Para este propósito se utilizó una configuración del

equipo de electrohilado que consistió en el ensamblaje de una bomba de perfusión (cole-

parmer), una fuente de poder de alto voltaje (capacidad de voltaje hasta 30 kV) y un electrodo

metálico de aluminio (6.0 cm X 6.0 cm X 0.0025 cm de espesor) (Fig. 8. 2.)

Figura 8.2. 1) Bomba de infusión y jeringa con solución 2) Colector de aluminio conectado a

tierra y 3) Fuente de alto voltaje conectada al sistema de la jeringa.

1

)

2

) 3

)


50

Como parámetros de procesado se fijó la jeringa a 10 cm de distancia de la punta de la

aguja (conectada a la fuente de alto poder al colector de aluminio conectado a tierra para de

esta forma generar un campo eléctrico.El flujo volumétrico de la solución de PVA se mantuvó

en 0.3 mL/h y el voltaje a 20kV. .

Las membranas una vez retiradas del colector se sumergieron en metanolpara permitir el

entrecruzamiento físico entre las nanofibras. Las membranas entrecruzadas se secaron a

temperatura ambiente y posteriormente cada una de ellas se corto en cuadros de 3.0 X 3.0 cm.

Estas membranas de nanofibras de PVA se utilizaron como muestras control o blanco en las

determinaciones microbiológica así mismo se caracterización mediante microscopía SEM.

8.11.2 Preparación de membranas de PVA/PGA-Manosa

En la preparación de las membranas conteniendo el bioconjugado PGA-manosa, se

utilizó el procedimiento antes descrito para la preparación de la solución acuosa de PVA, pero

en esta ocasión se agregaron 3.3mg/mL del bioconjugado a la solución de PVA (10 mg/mL).

La dispersión obtenida se sometió a sonicación por 30 minutos con el fin de dispersar lo mejor

posible los macrocristales formados por el bioconjugado y posteriormente la solución fue

electrohilada utilizando las condiciones y parámetros de procesado arriba descritos, las

membranas obtenidas fueron caracterizadas por microscopía electrónica (SEM y TEM) para

analizar la morfología y la dispersión de los agregados de bioconjugado en las membranas de

PVA.

8.12. Evaluación microbiológica de las membranas

Previo al trabajo experimental fue necesaria la preparación de medios nutritivos para la

inoculación y propagación de las variantes de la cepa de Escherichiacoli, ORN 208, 178 y

SS3 (Tabla 8.3) así como la levadura Saccharomyces Cerevisiae, las cuales fueron utilizadas

en la evaluación microbiológica de las membranas. El medio nutritivo que se utilizó fue el

caldo luria, cuya composición se muestra en la tabla 8.4.

Tabla 8.4 Componentes y concentración para la preparación de medio luria.

Componente Concentración

(g/L)

Peptona de caseína 10

Extracto de

levadura

5

Cloruro de sodio 10

Glucosa (D-

manosa)

1

Cloruro de

magnesio

1


51

Para cada una de las cepas se prepararon 50 mL de caldo luria, cada volumen se colocó

en un matraz bafleado provisto de un tapón de algodón y una capucha de papel, dichos medios

fueron esterilizados a 121°C durante 15 minutos en una autoclave Yamato SE-510, una vez

que los medios se encontraron estériles y a temperatura ambiente, con ayuda de un mechero de

Bunsen se adicionó a cada matraz un mililitro de solución de bacterias (del banco de cultivos

del laboratorio) correspondiente a cada una de las cepas; los matraces fueron incubados

durante 48 horas a 37°C y 150 rpm en una incubadora rotatoria new Brunswick

Pasadas las 48 horas, la biomasa se recuperó mediante centrifugación a 25°C y 14 000

rpm en una centrifuga Allegra 25R Beckman coulter, posterior a esto se le hicieron 3 lavados

al precipitado de biomasa con solución 1/500 (medio de cultivo/agua) y finalmente las células

fueron dispersadas en un volumen de 50 mL de solución 1/500, el procedimiento se muestra

en la figura 8.3.

Figura 8.3 1) Matraces bafleados con las cepas inoculadas. 2) recuperación de biomasa

mediante centrifugación. 3) Dispersión final de células.

Se realizó un recuento viable de células a cada una de las dispersiones, haciendo

primeramente una dilución 2/100 (sol. de bacterias/sol. fisiológica) y diluciones 1/10 hasta la

dilución 1010 como se muestra en la figura 8.4

1) 2) 3)


52

Figura 8.4. Procedimiento empleado para la dilución de células para el conteo viable.

El recuento viable consiste en determinar el número de colonias de E. colivisibles en la

superficie del agar, dependiendo del tamaño de colonia puede utilizarse un cuenta colonias o,

en el caso de éste trabajo, un microscopio estereoscópico, el conteo de colonias nos permite

conocer el número de células por unidad de volumen en la solución de análisis, lo anterior

partiendo del supuesto que cada colonia fue originada por una célula viva de la dispersión

original, parámetro conocido como unidad formadora de colonias (UFC).

Para realizar el conteo se tomó un mililitro (para obtener la concentración en UFC/mL) de

cada una de las diluciones que se realizaron y se colocó en una caja petriestéril de poliestireno,

a cada una de las cajas se le vertieron entre 5 y 15 mililitros de agar fundido entre 40 y 60°C

previamente esterilizado a 121°C durante 15 minutos.

Es importante realizar una correcta dispersión de las células en el agar para facilitar el conteo,

se ha observado en trabajos previos que una buena dispersión se consigue girando la caja petri

(cuando el agar aún se encuentra en estado líquido) en círculos en sentido horario y anti

horario, además de un movimiento tipo “ocho” como se muestra en la figura 8.5.


53

Figura 8.5. Procedimiento para obtener una buena dispersión de células en el medio de

cultivo: 1) Sentido anti horario, 2) Sentido horario y3) Tipo ocho.

El agar utilizado para el llenado de las placas utilizadas en los conteos se preparó con las

proporciones mostradas en la tabla 8.5.

Tabla 8.5. Componentes y concentración para la preparación del agar.

Componente Concentración

(g/L)

Peptona de caseína 10

Extracto de levadura 5

Cloruro de sodio 10

Glucosa (D-manosa) 1

Cloruro de magnesio 1

Agar bacteriológico 20

Al agar se le adicionó 1mL de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) 1% w/vpor cada 100 mL

de agar, para así dar a la colonia una coloración rojiza y facilitar su ubicación y conteo.

Para que la colonia presente un tamaño con el que pueda visualizarse de forma

macroscópica (mediante un estereoscopio) las cajas se incubaron por un tiempo de 16 horas a

37°C en una incubadora imperial II labline.

Para llevar a cabo los recuentos se comenzó con la división de las cajas por la parte

posterior, para así realizar conteos por sectores y facilitar la obtención de los datos,

posteriormente mediante la utilización del microscopio estereoscópico (40X) se marcaron las

colonias como se muestra en la figura 8.6.


54

Figura 8.6Recuentos viable en placa a) división de la caja por sectores. b) Conteo en

estereoscopio c) Micrografías 40X de colonias de E. coli.

En base a los valores de la solución inicial (1/200) de la dispersión de bacterias obtenidos

del primer recuento para cada cepa, se calculó el volumen necesario de dicha solución para

ajustar una solución problema con una concentración aproximada de 2500 UFC/mL y se

realizó un recuento viable para corroborar dicha concentración de unidades formadoras de

colonia por mililitro (UFC/mL).

Para el montaje de la prueba microbiológica, se utilizaron 13 viales con 4 mL de solución

de células de concentración 2500 UFC/mL en donde se introdujeron las membranas de 3X3

cm, para cada una de las cepas, 3 de ellos para la membrana blanco a tiempo inicial (T0), 3

para el blanco a 12 horas (T12), 3 para la evaluación de las membranas de bioconjugado y 3

para sus replicas y uno como control (sin membrana) a 12 horas, éste último con el fin de

monitorear el crecimiento celular propio inherente ya que al estar presentes en un medio 1/500

y a la temperatura óptima de crecimiento se presenta un crecimiento celular el cual puede ser

monitoreado a través del control.

El recuento se llevó a cabo a T0 para los viales con las membranas blanco para cada una de

las cepas y a T12 de igual modo para los blancos, las 3 membranas de bioconjugado, sus

replicas y para el control; Todas las membranas fueron etiquetadas y guardadas para su

posterior evaluación por microscopia electrónica de barrido (SEM).

Los conteos fueron realizados hasta la dilución 107, lo anterior contemplando el

crecimiento celular debido al medio nutritivo 1/500 y la temperatura de 37°C.

a) b)

c)


55

Para garantizar la existencia y ausencia de fimbrias tipo I en las cepas de E. colise

realizó una prueba previa de aglutinación, la cual se describe a continuación.En el caso de la

cepa 208 dada su modificación genética (ausencia de fimbria) es de esperarse que no se

presente aglutinación con las células de la levadura, sien embargo dado que la cepas 178 y

SS3 si desarrollan fimbria se espera que si se presente aglutinación, de igual modo se evaluó la

capacidad aglutinante de la levadura con una solución de concanavalin A.,

En una caja de cultivo celular se designaron 4 espacios, el primero de ellos se asignó a la

cepa de E. Coli. 208, el segundo para la cepa 178, el tercero para la cepa SS3 y por último el

cuarto se designó a la levadura S. Cerevisiae, los volúmenes y concentraciones de las

soluciones que se emplearon así como la aglutinación que debe presentarse se muestran en la

tabla 8.6.

Tabla 8.6. Prueba del ensayo de aglutinación de las cepas de E. Colien presencia de células de

Saccharomices cerivicia.

Composición Aglutinación

Prueba 1 100 μL de solución 6.5X108 UFC/mL de E. Coli 208.

100 μL de solución 6X106 U/mL de S. cerevisiae

200 μL de solución fisiológica estéril.

Negativa

Prueba 2 100 μL de solución 6.5X108 UFC/mL de E. Coli 178.

100 μL de solución 6X106 U/mL de S. cerevisiae


Positiva

Prueba 3 100 μL de solución 6.5X108 UFC/ mL de E. Coli SS3.

100 μL de solución6X106 U/mL de S. cerevisiae.


Positiva

Prueba 4 100 μL de solución 50% w/v de Concanavalin A.

100 μL de solución 6X106 U/mL de S. cerevisiae.


Positiva

La aglutinación se evaluó en un microscopio invertido Nikon eclipse TS100, en el caso de

las cepas E. coli 178 y SS3 al igual que para la levadura S. cerevisiae la aglutinación se pudo

observar incluso de forma macroscópica.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

56

IX. RESULTADOS Y DISCUSIONES

9.1 Síntesis del trímero fenilenetinileno

En este trabajo se diseñó y sintetizó el trímerobis(2-(2-metoxietoxi)etil) 3,3'-(2-((2-(2-

(2-cloroetoxi)etoxi)etoxicarbonil)-1,4-fenilen)bis(etilen-2,1-diil)dibenzoato, aquí identificado

como trímero fenilenetinileno, rígido y portador de secuencias glicólicas de forma que fuera

soluble en solventes polares. La cadena glicol de la parte central termina con un grupo cloro, a

fin de que en una segunda etapa se pueda convertir este grupo en una azida, y posteriormente

mediante química click se pueda adicionar al biopolímero poli(ácido -glutámico). Para esto,

es necesario también establecer las condiciones de funcionalización del poli(ácido -

glutámico) de forma que porte grupos acetilenos en la estructura. Con este último material, y

mediante vía química click, se le va adicionar la biomolécula; 4-aminofenil α-D

manopiranosida, la cual tiene una alta afinidad de reconocimiento con las fimbrias; en

particular con la Fim H presente en las cepas de la bacteria E. coli uropatógena.

El estudio como materiales en estado condensado, del trímero, del poli(ácido -

glutámico)-trímero fenilenetinileno, y del poli(ácido -glutámico)- 4-aminofenil α -D

manopiranosidase espera que: el trímero sea amfifílico y presente fluorescencia, la cual se

pueda detectar cuando se funcionalice el poli(ácido -glutámico), y que con éste último se

puedan forman partículas fluorescentes del tipo micela. Igualmente, se espera que con el

poli(ácido -glutámico)- 4-aminofenil α -D manopiranosida se puedan formar nanofibras que

sirvan para formar membranas capaces de atrapar selectivamente bacterias patógenas

portadoras de FimH.

Por lo anterior mencionado, primeramente se detalla la síntesis del trímero cuyas

unidades fenilenetinileno estarán sustituidas por cadenas glicólicas, esto con la finalidad de

impartirle una mayor solubilidad al sistema en solventes polares, mientras que la parte rígida

conjugada, permitirá organizarse en micelas, esto último tanto por estar funcionalizado al PGA

(hidrofílico) como por emplear mezclas adecuadas de solventes polares-no-polares.

El biopolímero PGA es cercano en estructura a una proteína natural, por lo tanto el

sentar las bases de su bio-conjugación dará pauta a extender dicha funcionalización a proteínas

de uso comercial con aplicaciones para el desarrollo de biosensores, con la ventaja adicional

de estar marcado con un fluoróforo en sitios muy específicos.


57

9.1.1. Ruta de síntesis

La ruta de síntesis para la obtención del trímero de fenilenetinilenose muestra en la

figura 9.1., como primer paso se realizó una esterificación del ácido 2,5-dibromobenzóico(1)

con el 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etanol (2) qué por acción conjunta de la DCC/DMAP se

obtiene el producto 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-dibromobenzoato (3), el cual mediante un

acoplamiento del tipo Sonogashira con Pd(0) se forma el 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5

bis((trimetilsilil)etinil)benzoato (4), posteriormente mediante una desprotección del

trimetilsilil con fluoruro de tetrabutil amonio se obtiene el 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-

dietinilbenzoato (5).

De forma paralela se sintetiza el monómero que permite la formación del trímero (9).

Para tal fin se lleva a cabo la esterificación del ácido 3-yodobenzóico (6) con el di(etilen

glicol) metil éter (7) generándose así el 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato (8). En un

último paso, el cloro de la cadena central se convierte en azida (10).

Figura 9.1. Ruta de síntesis para obtener el trímero del tipo fenilenetinileno portador de un

grupo azida.


58

Figura 9.2Ruta de síntesis para obtener el 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato.

9.1.2 Mecanismos de reacción involucrados en la síntesis del trímero

9.1.2.1. Mecanismo de reacción del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-dibromobenzoato

La metodología empleada en ésta etapa es la correspondiente a la esterificación de

Steglitch, en la cual en el primer paso, el ácido carboxílico reacciona con la dimetilamino

piridina, para formar con ello un intermediario susceptible a un ataque núcleofilico por parte

de la carbodiimida. Posteriormente dicho grupo (ácido-diimida) es atacado nucleofílicamente

por el alcohol, eliminando la diimida en forma de diciclohexilurea (DCU) y en el último paso,

la desprotonación del carbonilo da lugar al éster como producto final (Figura 9.3).

Figura 9.3. Mecanismo de reacción de Steglitch para la esterificación de ácidos carboxílicos

con alcoholes por efecto de la DCC y DMAP.

.


59

9.1.2.2. Mecanismo de reacción del 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato

El mecanismo involucrado en la síntesis del 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato es

exactamente igual a la descrita en la sección 9.4. , basada en la esterificación de Steglitch.

Figura 9.4. Mecanismo de reacción de Steglitch para la esterificación de 6 con 7.

9.1.2.3. Mecanismo de reacción del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil

2,5bis((trimetilsilil)etinil)benzoato.

La reacción para la obtención del monómero 4 con terminaciones en

trimetilsililetinilenos en ambos extremos, se llevó a cabo siguiendo la metodología del

acoplamiento entre un halogenuro de arilo y un acetileno terminal de acuerdo al ciclo

catalítico de Sonogashira. Dicho procedimiento consiste en cuatro etapas: La primera (1)

corresponde a la reducción del paladio (II) a paladio (0) con la formación de diacetilenos

como subproductos, (2) la adición oxidativa del halogenuro de arilo sobre el paladio (0), el

cual forma un complejo pentacoordinado. (3) Este complejo es atacado por el nucleófilo

(acetiluro de cobre) dando lugar a un nuevo complejo, Figura 9.5. Por último (4) se lleva a

cabo la eliminación reductiva de los grupos arilo y etinileno, acoplándose dichas especies y

regenerando la especie catalítica de paladio (0).


60

Figura 9.5. Ciclo catalítico de Sonogashira para el acoplamiento entre un acetileno y un

halogenuro de arilo.

9.1.2.5. Mecanismo de reacción de la desprotección del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5

bis((trimetilsilil)etinil)benzoato.

Para continuar con la ruta de síntesis es necesario realizar la desprotección de los

grupos acetileno, la cual se lleva a cabo por efecto del fluoruro de tetrabutil amonio. En

general estos grupos son muy lábiles a una gran variedad de ácidos y bases, sin embargo

gracias a que el ion fluoruro tiene una gran afinidad por el átomo de silicio, su desprotección

se lleva a cabo de forma, cuantitativa, selectiva, a temperatura ambiente y muy rápida. En una

primera etapa se forma un fluorosilicato pentavalente, el cual es eliminado formando el

fluoruro de trimetilsilil quedando los acetilenos con carga negativa, la cual se estabiliza con el

butilamonio, Figura 9.6. La presencia de agua tiene dos papeles, el de protonar y el de

descomponer el fluoruro de tetrametilsilil formando el ácido fluorhídrico quien al mismo

1

2

3

4


61

tiempo cataliza la desprotección de otra molécula sililada, regenerando así el ciclo. Su carácter

activo, permanece hasta agotar al reactante o bien por la adición de silica gel a la reacción.

Figura 9.6. Mecanismo de reacción para la desprotección de acetilenos protegidos con grupos

trimetilsilil por la acción del fluoruro de tetrabutilamonio.

Si F H2O+ HF + Si OH

Si OH SiHO+ Si O Si

Figura 9.7. Mecanismo de reacción para la desprotección de acetilenos protegidos con grupos

trimetilsilil por la acción del fluoruro de tetrabutilamonio.


62

9.1.2.6 Mecanismo de reacción involucrado en la formación del trímero

El acoplamiento para la formación del trímero mediante la reacción de Sonogashira, es

idéntico al de la reacción para la síntesis del monómero con terminación acetileno (Sección

9.1.2.1), Figura 9.8.

Figura 9.8. Mecanismo de reacción para la formación del trímero.


63

9.1.2.8. Mecanismo de reacción de la azida del trímero

Esta reacción obedece a una reacción de sustitución nucleofilica del tipo SN2, en dicha

reacción el electrón de enlace C-Cl es cedido al cloro quedando el carbono como un

carbocatiónel cual es posteriormente atacado por el grupo N3 de carga negativa formándose la

funcionalidad Azida, durante un paso intermedio, ambas especies se encuentran (ipso) unidas

al carbono terminal para posteriormente presentarse la eliminación del átomo de cloro y con

ello la formación de cloruro de sodio.

Figura 9.9. Mecanismo de reacción para la azida del trímero.

9.1.3. Caracterización por 1HRMN

La espectroscópica de resonancia magnética nuclear de protón es de gran utilidad, ya

que permite determinar el entorno que rodea a los átomos de hidrógeno y de alguna manera

corroborar las estructuras químicas de los compuestos obtenidos. Cabe señalar, que la

asignación de las señales tanto para los espectros de protón como los de carbono se realizaron

tomando en cuenta simulaciones generadas en los paquetes computacionales chemdraw y

Mestrec nova. A continuación se muestran cada uno de los espectros correspondientes a los

compuestos sintetizados, y se describe la asignación y desplazamiento de las señales


64

.

Figura 9.10. Espectros de 1H RMN comparativos de las diferentes moléculas intermediarias

para la síntesis del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-bis(etinilbenzoato), en cloroformo.

En la figura 9.10. se presentan los espectros de 1H RMN de los tres productos

intermediarios para la obtención del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-bis(etinilbenzoato).

Prácticamente, los espectros se pueden dividir en tres partes, la región alifática, la región

aromática y la región de grupos funcionales tanto del trimetilsililacetileno como del etinileno.

La región alifática correspondiente a la cadena glicólica prácticamente no cambia con respecto

a los sustituyentes en el anillo bencénico, así se pueden observar claramente en los tres

espectros los protones alfa al éster como un triplete a 4.45 ppm, seguido de los protones beta

al éster a 3.85 ppm, los beta al cloro se centran a 3.75 ppm, mientras que los alfa al cloro

aparecen a 3.6 ppm. Nótese que los cuatro metilenos de la cadena central son químicamente

iguales y generan un singulete como multiplicidad a 3.7 ppm. En la región aromática, la

molécula con terminación trimetilsililetinileno (B) hay dos cambios sustanciales con respecto

al espectro de la materia prima (A): i) la multiplicidad de los protones aromáticos en donde

aparece un singulete a 7.95 ppm para el protón vecino al éster (a), mientras que los protones

vecinos al triple enlace ahora son químicamente equivalentes generan un singulete a 7.50 ppm

(b) y ii) la aparición de los protones del trimetilsilil que resonan a 0.24 ppm (h). Sin embargo,

la hidrólisis de estos grupos da lugar a la aparición de los protones acetilénicos a 3.2 y 3.5 ppm

(h, i).

b)

a)

c)


65

9.1.3.2. 1H RMN del 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato

Para el caso del 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato se logró identificar de forma

clara las señales correspondientes a los protones de la molécula. En lo que respecta a la cadena

glicólica todos los metilenos son diferentes y sobresalen los alfa al éster como un triplete a 4.4

ppm y el singulete del metilo a 3.25 ppm. En la región aromática, el protón 2 que parece dar

un singulete como señal, en realidad se ve afectado tanto por el yodo como por el éster y son

dos singuletes a 8.25 ppm (a). Posteriormente aparece un doble de dobles a 7.9 ppm (b), al

igual que el protón vecino al yodo a 7.75 ppm (c), mientras que para el protón (d) da como

multiplicidad un triplete a 7.1 ppm. En general, la molécula presenta todas las señales

esperadas.

Figura 9.11. 1H RMN del -(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato en CDCl3


66

9.1.3.3. Caracterización del Trímero

Una vez confirmada la estructura de los productos de las diferentes etapas, se procedió

a llevar a cabo la síntesis del trímero, cuya estructura genera señales en el espectro de protón

muy particulares, figura9.12. Si bien un tanto más compleja su interpretación, sin embargo en

comparación a los espectros de los precursores, se logra observar que el espectro está

compuesto por la complementación de las señales, así por ejemplo se pueden apreciarse las

señales principales de la cadena glicólica con un ensanchamiento debido al dinamismo y

sobrelapamiento de los metilenos, destacan principalmente los protones alfa al éster CH--O-

C=O (g) como un triplete a 4.5 ppm, el singulete del metilo (k) a 3.25 ppm, mientras que los

protones alfa al cloro (j) -CH--Cl resonan a 3.55 ppm.

Figura 9.12. 1H RMN del Trímero en CDCl3.

Las señales en la región aromática son más complejas, evidentemente debido al

incremento en el número de protones. Sin embargo se pueden distinguir claramente los

protones vecinos a los esteres (posición 2) en donde los externos resonan a 8.45 ppm (dos

singuletes (a)), mientras que el interno (otro singulete (b)) a 8.41 ppm. Los protones

terminales al trímero (c) resonan como un duplete a 7.98 ppm. Los protones vecinos al triple

enlace (posición 4 fenilos externos) aparecen como dos dobletes a 7.80 ppm (d). El singulete

es asignado a los dos protones en posición 4 y 5 respecto al ester del fenilenetinileno central

(e) y por último aparece un triplete de los protones en posición 5 de ambos fenilos externos (f).


67

9.1.4. Caracterización por RMN 13C

Comprobada la estructura molecular de cada intermediario por Resonancia Magnética

Nuclear de 1H, se prosiguió a su corroboración por RMN 13C. Cabe señalar que la asignación

de las señales de todos los compuestos se basó en el cálculo teórico de sus desplazamientos

empleando paquetes de simulación “Spartan 04” y “Chemdraw 3D”.

9.1.4.1. Caracterización de las especies intermedias

En la figura 9.13.se presentan los espectros del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-

dibromobenzoato 3, 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5 bis((trimetilsilil)etinil)benzoato 4 y 2-(2-

(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5- dietinilbenzoato 5 correspondientes a la ruta sintética descrita en

la figura 9.1.

El espectro de la materia prima, el ácido 2,5-dibromo benzoico si bien no se muestra,

éste presenta como señales además de sus seis carbonos aromáticos, el carbono del ácido

carboxílico a 169 ppm. El resto de los espectros presentan señales en común relacionadas a la

cadena 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etilo, sin embargo destaca el carbón unido al cloro a 43 ppm

(m, p, o) y el –CH2-α-COO unido al éster a 64 ppm. Particularmente, en el espectro del 2-(2-

(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5 bis((trimetilsilil)etinil)benzoato 4 se aprecia la señal de los

sustituyentes del trimetilsililacetileno Si-CH3 (q) a 0 ppm los, mientras que los cuatro

carbonos etinilenos (h, i, j y k) aparecen a 97.56, 102.15, 102.97 y 103.5 ppm. Estas últimas

señales (i, j, k, h) se ven desplazadas a campo alto después de haber realizado la desprotección

del TMS, situándose ahora entre 81.55 y 82.11 ppm (h, i), tal y como se observa en el espectro

de la Figura 9.13. (b). En cuanto a la región aromática, se puede ver que hay cuatro carbones

diferentes y dos son químicamente iguales, por lo que se observa prácticamente una señal para

cada protón. Así mismo, la señal del carbono del grupo éster (j) aparece cercana a 165 ppm.


68

Figura 9.13. Espectros de 13 C RMN comparativos de moléculas intermediarias para la

síntesis del 2-(2-(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-bis(etinilbenzoato) (c), en CDCl3

b)

a)

c)


69

9.1.4.2. Caracterización del 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato

Figura 9.14. 13C RMN del 2-(2-metoxietoxi)etil 3-yodobenzoato.

En la figura 9.14. podemos observar los desplazamientos químicos correspondientes a

las señales de la molécula con terminación yodo. En la región de la cadena glicólica resaltan

principalmente el pico alfa al éster a 64.5 ppm y del metilo a 59 ppm, mientras que en la

región aromática, destaca el carbón del yodo a 95 ppm y a 165 ppm se asigna el carbón del

carbonilo.

9.1.4.3. Caracterización del Trímero

El espectro de carbono del trímero observamos al igual que en el espectro del protón el

conjunto de señales de los monómeros, se observa una asignación de señales similares a las de

los monómeros con ligeros cambios en el desplazamiento, sobre todo la desaparición de la

señal del carbón del yodo a 95 ppm.

Figura 9.15.Espectro de 13C RMN del trímero de feniletinileno.


70

9.1.5. Caracterización por FT-IR

9.1.5.1. Caracterización de la azida del trímero de fenilenetinileno

La información que nos resulta relevante de la siguiente comparación de espectros (Figura

9.1.5.1 ) es una banda que aparece en la región de los 2212 números de onda asignada a la

vibración del doble enlace nitrógeno-nitrógeno en la azida de sodio (b) a diferencia del

espectro (a) donde no se logra observarse dicha señal, la molécula correspondiente a este

espectro posee una terminación cloro donde se llevo a cabo la sustitución con la azida, con lo

cual tenemos evidencia de que tal acción se realizó y que la molécula del espectro b) puede

utilizarse posteriormente en las reacciones de química click ya que cuenta con la funcionalidad

azida.

Figura 9.16. Espectros de FT-IR correspondientes al: a) trímero con la cadena con

terminación en cloro, y b) el trímero con la cadena con terminación en azida.

9.2. Funcionalización del poli(ácido -glutámico)


En la figura 9.17. se describe la ruta de síntesis que se siguió para funcionalizar el

poli(ácido-glutámico)(PGA) con propargil amina. Primeramente, se llevó a cabo una

esterificación del PGA con la N-hidroxisuccinimida por la acción deshidratante del complejo

DCC/DMAP para formar el (PGA)-N-O-hidroxisuccinimida13, el cual es un buen grupo

saliente y selectivo al ataque nucleofílico de una amina primaria para formar una amida. Así

posteriormente y bajo esta idea se llevó a cabo una amidación con la propargil amina 14 y

obtener el (PGA)-propargil amida 15.

b)

a)


71

9.2.2. Mecanismos de reacción

9.2.2.1 Mecanismo de reacción de la funcionalización del poli(ácido-glutámico)con N-

hidroxisuccinimida

El mecanismo de reacción para la funcionalización de PGA se basa primeramente en la

esterificación de Stegltich, tal como se describió en la sección 9.1.2.1. en la síntesis del 2-(2-

(2-cloroetoxi)etoxi)etil 2,5-dibromobenzoato.

.

Figura 9.17. Mecanismo de reacción para la esterificación del PGA

9.2.2.2. Mecanismo de reacción en la amidación del PGA

La síntesis de este producto se lleva a cabo mediante una sustitución núcleofilica, para

lo cual la N-O-hidroxisuccinimida es sustituida por el grupo propargil amina generándose la

amida correspondiente y el NHS como subproducto.

Figura 9.18 .Mecanismo de reacción para la formación del (PGA)-propargil amida.


72

9.2.3 Caracterización por 1H RMN

9.2.3.1. Caracterización del PGA funcionalizado con N-hidroxisuccinimida

El polímero PGA (a) también fue caracterizado por Resonancia Magnética Nuclear de

Protones (1H RMN) como referencia pero en su forma de sal y fue disuelto en oxido de

deuterio (D2O), del cual se tomó como referencia el pico que se sitúa a 4.78 ppm., nótese que

el resto de las bandas no están bien definidas, sino que están más bien anchas y lo cual es una

característica de los polímeros. Además, cabe señalar que los protones correspondientes tanto

del ácido carboxílico como el de la amina no son visibles ya que el polímero está en su forma

de sal de sodio. La identificación de la estructura se basa pues en la multiplicidad que generan

los protones , y (aquí identificados como a, b y c). Los protones a generan un triplete que

se sitúa a 4.08 p.p.m., mientras que los protones b y b’ se desacoplan mostrando dos

multipletes independientes a 2.01 y 1.90 p.p.m. respectivamente. Finalmente los protones c,

aparecen como un triplete a 2.03 p.p.m.. Tanto la multiplicidad como la posición de las señales

concuerdan bien con lo reportado en la literatura.

En los otros tres espectros podemos observar las señales de los metilenos de la unidad

repetitiva de PGA entre 1 y 2 ppm, y nótese que ahora funcionalizado el PGA es posible ver

una banda entre 8 y 8.2 ppm correspondiente al protón de la amina (f). A este respecto,

también podemos observar en el espectro (b) una señal aproximadamente a 2.7 ppm que

atribuimos a los protones metílicos de la hidroxisuccinimida, la cual como es de esperarse

desaparece en el espectro c), dando pauta a afirmar que la sustitución de la propargil amina se

llevó a cabo. Sin embargo, es necesario mencionar que resulta un tanto imposible identificar el

protón acetilénico en el espectro c), ya que en la región entre 2.8 y 3 se superpone con la señal

de la humedad presente en el disolvente deuterado, no obstante en el espectro de carbón se

logra identificar claramente los carbones etinilenicos y posteriormente en la sección 9.2.5. se

analiza también la identificación del triple enlace mediante espectroscopia Raman. Para el

caso del espectro d) correspondiente al bioconjugado (PGA)-trímero podemos observar

además de los desplazamientos del PGA y del trímero, dos señales características de la

bioconjugación; esto es un singulete a 7.4 ppm (i) del protón del heterociclo del triazol

formado por la reacción entre la azida y el acetileno mediante la química clik, y el metileno de

la propargil amina a 3.95 ppm.


73

Figura 9.19. Espectros comparativos de 1H RMN con respecto al bioconjugado PGA-

Trímero.


74

9.2.4 Caracterización por RMN 13C

9.2.4.1. Caracterización del PGA funcionalizado con N-hidroxisuccinimida

Figura 9.20.Comparación de espectros del PGA

El análisis de la funcionalización del PGA por 13C RMN reveló información

complementaria que no se pudo obtener por protón, en particular para el caso del (PGA)-N-O-

hidroxisuccinimida, espectro (a) y del (PGA)-propargil amida, espectro (b).El (PGA)-N-O-

hidroxisuccinimida muestra como principales características los tres carbonilos de los que está

compuesta la molécula a 159, 156 y 154 ppm, siendo los de la -O-N-succinimida el pico a 154

ppm (e). Después de la sustitución de la succinimida por la propargil amina, (PGA)-propargil

amida, espectro (b), en la región de los carbonilos, solo quedan los del PGA y se presentan

claramente las señales correspondientes al etinilo (f y g) a 72.5 y 74.4 ppm. Además se puede

identificar el metileno característica de la propargilamida a 38 ppm.

c)

a)

d)

b)


75

9.2.5. Caracterización por espectroscopia RAMAN

La espectroscopia Raman brinda información sobre las vibraciones de una molécula al

igual que el IR pero a través de un proceso previo de excitación. Para esto es necesario que las

vibraciones den lugar durante la excitación un cambio en la polarizabilidad de la molécula, la

cual corresponde al momento dipolar inducido por un campo eléctrico. En los equipos

modernos, el campo eléctrico es generado por el láser de excitación. La intensidad de un pico

Raman entonces depende de la intensidad de la polarizabilidad, la cual a su vez depende del

momento dipolar de la molécula pero también de la intensidad del campo eléctrico. Siendo

necesaria una excitación, entonces la respuesta Raman se acompaña siempre de la

fluorescencia, que da lugar a una línea de base pronunciada en el espectro Raman. Por lo tanto

es importante seleccionar adecuadamente la longitud de onda de excitación del láser y su

potencia para incrementar la señal Raman y reducir la fluorescencia. En nuestro caso, el triple

enlace es el grupo susceptible de inducirle una polarizabilidad y se puede ver en el espectro de

la Figura 9.21. la banda que aparece a 2100 cm-1 confirmando su presencia dentro del

polímero.

Figura 9.21. Espectro Raman 532 nm del PGA funcionalizado con propargil amina.


76

9.3. Síntesis del bioconjugado PGA-Trímero


La figura 9.22. Muestra la ruta de síntesis que se siguió para la obtención del

bioconjugado PGA-Trímero, dicha ruta consiste en un solo paso mediante química clik entre

el trímero portador del grupo azida y el (PGA)-propargil amida.

Figura 9.22. Ruta de síntesis para la obtención del bioconjugado PGA-Trímero.

9.3.2. Mecanismos de reacción del bioconjugado PGA-Trímero

La reacción obedece el mecanismo de Huisgen Sharpless “click triazol”. La reacción

comienza con el acomplejamiento del cobre con el acetileno terminal. Posteriormente se forma

un enlace entre el nitrógeno de la azida y el complejo de cobre, cerrando el ciclo entre el

nitrógeno final y el carbono del acetileno. En un segundo paso se elimina el cobre del ciclo y

se forma el triazol 1,3. En el último paso, el cobre es sustituido por un protón y regenerado el

catalizador.


77

Figura 9.23. Ciclo catalítico de Huisgen Sharpless para funcionalizar el PGA con el trímero

fluorescente


78

9.3.3. Análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC)

El análisis térmico llevado a cabo por DSC desde –20 °C hasta los 180 °C, arrojó los

siguientes resultados: i) el polímero en su forma ácida presenta una transición muy amplia que

va desde los 27 °C hasta los 146 °C, ii) el PAG presenta una entalpía de energía muy elevada,

del orden de 63.39 J/g y iii) una temperatura de fusión de 88 °C. Este comportamiento se debe

a que hay una fuerte interacción inter e intramolecular del polímero en su forma ácida, Figura

9.24 a.

Por su parte, el DSC del trímero, Figura 9.24b, presenta las siguientes características: se

pueden observar 3 transiciones, 2 de primer orden y una de segundo. La de segundo orden se

presenta aproximadamente a los 6°C (tomando como indicio el cambio en la pendiente debido

a un cambio en el volumen molar, es decir debido a la Tg). Es necesario recordar que en los

polímeros la Tg se entiende como la temperatura por debajo de la cual el polímero se

comporta como un material vítreo, y por arriba de la cual se comporta como un material

elástico. Este concepto solo es aplicable a polímeros amorfos, ya que si el polímero tiene un

alto grado de cristalinidad, este cambio no puede ser apreciable. A nivel molecular esto puede

entenderse de la siguiente manera: se considera que a temperaturas muy bajas los átomos que

constituyen la cadena polimérica solamente pueden vibrar alrededor de posiciones

determinadas. A medida que se eleva la temperatura, el movimiento molecular es mayor hasta

que al llegar a la Tg del polímero es posible que se muevan secciones de las cadenas y el

material presente un comportamiento elástico (similar al del cuero). Obviamente, el

movimiento molecular genera un volumen determinado, así la Tg se entiende también como la

temperatura por debajo de la cual el volumen libre se mantiene constante, mientras que por

arriba, el volumen es mayor. El movimiento molecular se puede así identificar en un

termograma (DSC) mediante un cambio en la pendiente generado por el flujo de calor.

Obsérvese a 114 °C, la temperatura de fusión con una entalpia de fusión del orden de 12.7 J/g,

la cual es típica de encontrar en moléculas del tipo fenilenetinileno. Por último, en esta misma

figura se observa otra transición a 166°C con una entalpia muy baja de 0.63 J/g. En general,

este comportamiento es la que exhibe un cristal líquido, sin embargo con la información con la

que se cuenta en este trabajo no es posible definir el tipo de su mesofase, por lo tanto se

recomienda en trabajos posteriores obtener sus patrones de difracción SAXS en función de la

temperatura y de estudiar por microscopia en luz polarizada.

Enlo que concierne al bioconjugado, Figura 9.24c, se observan dos cambios significativos,

tanto respecto al PGA como al trímero; 1) una temperatura de transición vítrea a 50.2 °C, la

cual es una huella del trímero y una fusión a 125 °C con una entalpia muy baja de 7.48 J/g.

También sería recomendable hacer estudios de difracción de rayos X para determinar el

empaquetamiento del trímero y de las cadenas del PGA.


79

Figura 9.24. Termogramas de: a) PGA en su forma ácida, b) trímero fenilenetinileno y c)

bioconjugado PGA-trímero, obtenidos en un Analizador Diferencial de Barrido (DSC) a una

velocidad de calentamiento de 10 °C/min en atmósfera de nitrógeno.

9.4. Síntesis del bioconjugado PGA-azida de 6(-4-amidofenil α-D

manopiranosido)hexanoilo

Dado que la química “click” resultó ser efectiva para funcionalizar el PGA, es rápida y

sobre todo selectiva, entonces se decidió evaluarla empleando una biomolécula. A este

respecto la 4-aminofenil a-D manopiranoside reconoce selectivamente a las Fim H presentes

en las paredes celulares de la bacteria E. coli, por lo tanto al portar el PGA esta biomolécula

permitiría desde el desarrollo de membranas hasta fibras y filtros para eliminar esta bacteria.


En la figura 9.25. se describe la ruta de síntesis para la obtención de la manosida

portadora del grupo azida, la cual permitirá en una segunda etapa llevar a cabo su

bioconjugación con el (PGA)-propargil amida mediante química click.

-25 0 25 50 75 100 125 150 175

Flu

jo d

e c

alo

r (w

/g)

exo

>

Temperatura (°C)

f = 7.48 J/g

125 °C

Tg = 50.2°C

f = 12.7 J/g

f = 0.63 J/g

166 °C

114 °C

88 °C)

Tg = -2.1°C

f = 63.4 J/g


80

Figura 9.25.. Ruta de síntesis para obtener la funcionalización del PGA con la manosida vía

química click.

9.4.2. Mecanismos de reacción

La reacción obedece a una reacción de adición sobre el carbón saturado del carbonilo

del bromuro de 6-hexanoilo. La reacción de adición forma un alcóxido tetrahédrico como

intermedio de la reacción, para dar lugar a un buen grupo saliente dado que el átomo de

oxígeno está cargado negativamente y unido al átomo de carbono central. El grupo alcóxido

revierte al grupo carbonilo y expulsa al grupo saliente, en este caso el cloro, posterior a ello se

hace la desprotonación del oxigeno para dar la formación final del cloruro de hidrogeno

(Vollhardt, 1994).


81

Figura 9.26. Mecanismo de reacción de la activación del ácido carboxílico con la N-

succinimida como grupo saliente y selectivo para la sustitución por aminas.

La reacción de sustitución nucleofilica de la 4-aminofenil a-D manopiranosida sobre el

2,5-dioxopirrolidon-1-il 6-bromohexanoato; compuesto anterior da lugar a la formación de

una amida de forma selectiva y recuperándose la NHS como subproducto de la reacción.

Figura 9.27. Mecanismo de reacción del tipo sustitución nucleofílica de la amina de la

manosida sobre el dioxopirrolidon formando el enlace amida.

En cuanto a la formación del grupo azida a partir del bromo alquilo, ésta obedece a una

reacción de sustitución nucleofilica. La azida ataca el carbón del bromo formando un

intermedio que incluye al nucleofilo y a la especie saliente (el bromo), para finalmente formar

con el sodio la especie final y como subproducto bromuro de sodio.


82

Figura 9.28. Mecanismo de reacción involucrado en la formación de la azida en el 6(4-

amidofenil α-D manopiranosido) hexanoilo.

La reacción sigue el mecanismo de descrito en la sección 9.3.2. para el bioconjugado de PGA-

trímero.

Figura 9.29. Mecanismo de reacción para la formación del bioconjugado PGA-Manosa vía

química click.


83

9.4.3. Caracterización por 1H RMN9.4.3.1. Caracterización por 1H RMN del bromuro de

6(-4-amidofenil α-D manopiranosido) hexanoilo

Figura 9.30. Espectros de 1H RMN para: el 2,5-dioxopirrolidon-1-il 6 bromohexanoato y el

bromuro de 6(-4-amidofenil α-D manopiranosido)hexanoilo.

En lo que corresponde al espectro del 2,5-dioxopirrolidon-1-il 6 bromohexanoato,

Figura 9.30., aparecen primeramente las señales del los protones alfa al bromo (f) que se

centran a 3.4 ppm y los del ester (b) a 2.6 ppm. Los protones beta a ambos grupos se centran a

1.9 (e) y 1.88 (c) ppm, respectivamente. Por último se encuentran los protones gama (d) a 1.5

ppm, mientras que los protones del grupo saliente; la succinimida (a) se caracterizan por dar

un singulete como multiplicidada 2.88 ppm. Ahora bien, en el espectro de la 6(4-amidofenil α-

D manopiranosido) hexanoilo, se observan además de las señales propias del 2,5-

dioxopirrolidon-1-il 6 bromohexanoato, las que corresponden a los protones tanto de la

manosa misma como de su sustituyente aromático. Como puede apreciarse en el espectro, se

observa un singulete amplio a 9.8 ppm, el cual integra para un protón que correspondeal

grupoamida de la molécula. El sistema AB de los fenilos da como multiplicidad dos dupletes a

7.5 (i) y 7 ppm (h). Respecto a las señales producidas por el monosacárido destacan las

siguientes: a) La que produce el protón anomérico (Hanomérico) a 5.32 ppm (g) como un

singulete que integra para un protón, b) las señales de los grupos hidroxilo a 5.04, 4.85, 4.77 y

4.49 ppm, cabe mencionar que cada una integra para dos protones. Y por último c) El

singulete a 3.82 ppm del protón (f) de la estructura cíclica (H-Man) que integra para unprotón.

Las señales producidas por el resto de los protones de la estructura cíclica de la manosa (entre

3.67 y 3.47 ppm) se encuentran parcialmente traslapadas con la señal del agua del solvente. De

hecho, es conocido que en algunos casos ocurra una deuteración de los –OH con el solvente.


84

Obsérvese como desaparecieron los protones de la N-succinimida. En general, se ha obtenido

información suficiente para concluir que la molécula del 6-bromo hexanoilo se encuentra

sustituida por el derivado aromático de la -D-manopiranósida.

9.4.4. Caracterización por RMN 13C

9.4.4.1. Caracterización del 2,5-dioxopirrolidon-1-il 6 bromohexanoato.

9.31Espectro13C del 2,5-dioxopirrolidon-1-il 6 bromohexanoato

En la Figura 9.31. se presenta el espectro de 13C del 2,5-dioxopirrolidon-1-il 6

bromohexanoato. El 13C permite diferenciar los carbones de los carbonilos presentes en la

estructura. De hecho, se puede observar que los carbones de la N-succinimida a 169 ppm son

más intensos por efectos aditivos con respecto al carbón del benzoato a 168 ppm. El carbón

del bromo se presenta a 34 ppm.

9.4.5. Caracterización por FT-IR de la azida de 6(-4-amidofenil α-D

manopiranosido)hexanoilo

Ahora, la conversión del bromo a grupo azida, fue más evidente por espectroscopia de

infrarrojo, ya que la señal N3 es muy sensitiva, tal y como se puede observar en la Figura 9.32.


85

Figura 9.32. Comparación de espectros de infrarrojo a) 6(-4-amidofenil α-D

manopiranosido)hexanoilo b) azida de 6(-4-amidofenil α-D manopiranosido)hexanoilo.

La información relevante que podemos obtener de esta comparación es la banda que

aparece a 2177 cm-1 debido a la vibración del doble enlace nitrógeno-nitrógeno existente en la

azida (espectro b), el cual no está en el primer espectro (a). Otra de las señales de importancia

son la vibraciones del grupo –O-H entre 3200 – 3500 cm-1 como una banda ancha, la

presencia de dichos grupos hidroxilo libres en la molécula, son de suma importancia durante el

desarrollo de los ensayos de reconocimiento bacteriano, ya que éstos interaccionan

directamente con la bacteria, específicamente con la proteína FimH que se encuentra en las

puntas de las fimbrias bacterianas.

b)

a)


86

9.5 Caracterización por 1H RMN del bioconjugado

Figura 9.33. 1H RMN del bioconjugado PGA-manosa.

En la Figura 9.33. correspondiente al bioconjugado PGA-manosa, igualmente

observamos las señales características de las moléculas individuales pero en particular resalta

la señal en 7.2 ppm que es indicativo de la bioconjugación, ya que los protones del triazol dan

como multiplicidad este singulete, después de la reacción de química click

9.6.1. Microscopíaelectrónica de barrido de las partículas PGA-trímero

La figura 9.34., muestra varias micrografías de las partículas obtenidas según se describe en la

sección de desarrollo experimental. La morfología de las partículas es predominante esférica,

aunque también se aprecian de tipo cilíndricas y algunas las menos de tipo amorfo. El

intervalo de tamaño de la partículas es muy disperso desde 15 µm hasta 1.2 µm la de menor

tamaño. El promedio de la mayoría de las partículas es de aproximadamente 4 µm. En las

micrografías el fondo oscuro corresponde al sustrato sobre el que se depositaron las partículas

para su observación (oxido de aluminio) proveniente del porta muestras, el cual tiene mayor

densidad electrónica que las mismas partículas.

b)

a)


87

Figura 9.34. Micrografía SEM de las partículas del bioconjugado PGA-trimero:agua (1:1).a).

aspecto superficial de una partícula, b) aglomerado de partículas, c). partículas esféricas y

amorfas, y d) aspecto de una partícula de tamaño medio.

La formación de partículas PGA-trímero se puede explicar por naturaleza amfifilica del

bioconjugado en donde es de esperarse que el PGA por sus características hidrófilas este en

contacto con el medio acuoso rodeando al trimero, como se ha sugerido para un sistema

similar para la preparación de nanopartículascon un sistema amfifilico basado PGA-acetato de

fenilalanina(Takami et al. 2005).

Por otra parte los resultados relacionados con la pobre dispersión, tamaño heterogéneoy la

diferencia en morfología de las particulas pueden atribuirse a diferentes causas. Por ejemplo es

posible que la agitación mecánica no haya sido lo suficientemente alta para proporcionar la

energía necesaria para dispersar el material polimérico en heterofase. Tampoco se hizo un

análisis sistemático de la relación agua/PGA-trimero, factor que se ha demostrado ser muy

importante en la dispersión y estabilización de particulas, al igual que la viscosidad de ambas

fases (Arshady, 1992) También se ha reportado que laselección del solvente utilizado en la

disolución de los polímeros amfifilicos es otro de los factores que influye en el tamaño,

a) b)

c) d)


88

morfología y propiedades fisicoquímicas de las partículas (Jung et al. 2003). (Ryu et al. 200)

En nuestro caso solo se utlizó el clorobenceno y aunque es muy buen solvente para la

disolución del PGA-trímero,este solvente no es soluble en agua en donde prácticamente no

hay difusión del disolvente en el medio acuoso, pudiendo afectar de esta manera el tamaño y

morfología de las partículas. Aunque no se determino el potencial zeta es posible que este sea

parcialmente negativo como consecuencia de la presencia de los grupos carboxílo localizados

en regiones cercanas a la superficie. El valor del potencial zeta es una caracteristica muy

importante de las partículas, puesto que puede tener efecto en la estabilidad de la partícula.

Esto se entiende que es debido a que se evita la agregación de las partículas, debido a que

estas tienen la misma carga dando origen a una repulsión entre ellas (Feng & Guang,

2001).Otro aspecto que no se considero en este trabajo es determinar la distribución de los

grupos carboxílo en la superficie de las partículas. El PGA a pH ligeramente ácidos o alcalinos

se presenta como una sal que es soluble en agua, sin embargo a pH bajos (<4.0) los grupos

carboxilos se ionizan adquiriendo una carga negativa. En la formación de partículas se sugiere

que estos últimos estan localizados cerca de la superficie de estas estructuras(Akagi,et al.

2005).

Con el método anterior conseguimos obtener partículas de PGA-trímero, sin embargo estas

no se obtuvieron de forma homogénea con amplia polidispersidad, con morfologías no

siempre esféricas, pero sobre todo con tamaños relativamente altos. Estos incovenientes

limitan su aplicación en áreas como la biomedicina, en donde se pudieran usar como

trazadores fluorescentes de la liberación de determinado farmaco. Asi como también en el

marcaje celular para la obtención de imagénes fluorescentes.

Entonces decidimos continuar con esta invetigación de formatal que nos diera pautas o un

enfoque hacia la obtención de estructuras de menor tamaño en la escala de los nanómetros.

Una alternativa fue reducir la relación bioconjugado PGA-trímero:agua (1:5), el cual es uno de

los parametros que deben ser considerados para la obtención de partículas con morfología

mejor definida, menor polidispersidad y en lo general la obtención de partículas de menor

tamaño, que incluso se puede alcanzar la escala de los nanómetros.(Arshady, 1992).


89

El cambio de la relación de bioconjugado PGA-trimero con respecto al agua (5:1) permitió

la obtención de nanoparticulas, predominantemente esféricas (Figura 9.35).

.

Figura 9.35. MicrografíasSEM de partículas bioconjugado PGA:trímero:agua (1:5)

Como se describio previamente, la fluorescencia es una la herramientas de mucha

utilidad en bioanálisis y bioimagén (Giepmans et al. 2006). En este trabajo de tesis se logró

construir una plataforma a partir de un oligómero conjugado hidrófobo y un polímeo

negativamente cargado (PGA), biopolímero de origen natural, para obtener un bioconjugado

capaz de organizarse en forma de partículas y nanopartículas fluorescentes. El diseño de este

tipo de estructuras es muy prometedora para estudios de bioimagen celular debido a la

amplificación de la señal de fluorescencia debido a una respuesta colectiva de un

sistema(Duan et al. 2010). Recientemente se han preparado varios polímeros conjugados como

marcadores en imagenes de células vivas que tienen como ventajas sobre otros sistemas

(puntos cuáticos, fluoroforos orgánicos de bajo peso molecular) para este propósito su alta

fluoresencia, buena fotoestabilidad y muy baja toxicidad (Li et al. 2009). Sin embargoen este

trabajo se presenta por primera vez un bioconjugado a partir de un trímero conjugado

hidrófobo y un polímero natural aniónico (PGA). Aunque aun se requiere la recolección de

más datos a través de diversas técnicas, pensamos que por su estructura, este sistema puede

tener características similares a sus contrapartes, preparados con polímeros conjugados

solubles en agua. Esto si consideramos que rendimiento cuántico del oligómero es


90

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

0

5

10

15

20

Fre

cu

en

cia

(%

)

Diámetro ()

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0

5

10

15

20

25

30

35

Fre

cu

en

cia

(%

)

Diámetro (nm)

reltivamente alto, el bajo peso molecualar y la hidrofobicidad puede permir una mejor

interacción con la membrana de las células vivas, por otra parte el PGA es conocido por ser un

polímero biodegradable, biocompatible, no tóxico, pudiendo esto facilitar el metabolismo y

eleminación de estas estructuras. Además, la presencia de la enorme cantidad de grupos amino

libres en las nanopartículas puede ser un punto de anclaje de diferentes fármacos, dirigidos a

diferentes tejidos u orgános.

9.6.2. Análisis de distribución de tamaño

Los datos de los histogramas que se presentan en la figura 9.36 se obtuvieron mediante

el análisis de las micrografías anteriores con la ayuda del software Imagej.

Figura 9.36. Histogramas de distribución de tamaño de partículas.

En la imagen superior de la figura anterior se observa un agregado de partículas de escala

de las micras obenidas mediante la primer metodología de doble microemulsión, tanto en la

micrografía como en el histograma podemos observar que el tamaño de mayor abundancia

ronda entre 0.7 y 1.1 micras de diámetro, por el contrario en el análisis de la imagen inferior se

puede observar que existe una mejor distribución de las partículas y su tamaño se ha reducido

en un orden de magnitud teniendo un tamaño de mayor abundancia entre los 20 y los 25

nanómetros.


91

9.6.3. Análisis por microscopía de barrido laser confocal

Una de las propiedades esperadas al preparar el bioconjugado PGA-trímero y

posteriormente las partículas a partir del mismo, era que estas estructuras mantuvieran sus

propiedades ópticas de absorción y fotoluminiscencia. Además de la espectroscopia de

fluorescencia una de las técnicas más prácticas y útiles para detectar la emisión de luz por un

dispositivo o estructura molecular es la microscopia de barrido laser confocal (LCSM).

Contando con el equipo y laser de la longitud de onda apropiado para el análisis de la muestra

fue posible observar la emisión de luz a una longitud de onda de 523nm apreciando

claramente la morfología e intensidad de luz emitida de las partículas obtenidas

La figura 9.37. muestra las micrografías obtenidas por microscopía de barrido

laserconfocal de una muestra de partículas de bioconjugado PGA-Trímero. La imagen 9.37(a)

se aprecia la fluorescencia de las partículas presentes. Para asegurarnos que efectivamente la

brillantez de las partículas es debida a la excitación y posterior emisión del trímero

bioconjugado con el PGA se adquirió una imagen en modo reflexión, en donde se observa la

ausencia de la brillantez registrada en la imagen previa [9.37(b)]. Para corroborar estas

observaciones se construyó una imagen compuesta, sobrelapando las imágenes de emisión y

reflexión [9.37(c)].

Figura 9.37. Imágenes de microscopia confocal a) Fluorescencia, b) Reflexión, c) imagen

compuesta.

En la exploración de otro campo a mayor magnificación se observa con mayor detalle

la emisión de las partículas PGA-trímero (Figura 9.38), el comportamiento luminiscente de las

partículas, inicialmente vemos la imagen de fluorescencia en donde solo se observa dicho

fenómeno en la región que en la imagen de reflexión muestra corresponder a una partícula de

bioconjugado PGA-Trímero.

a) b) c)


92

Figura 9.38. Imágenes de microscopía confocal a) Fluorescencia, b) Reflexión, c) imagen

compuesta

9.7. Fabricación de membranas electrohiladas de poli(vinil alcohol)/PGA-manósido para

el atrapamiento y retención de Escherichia coli uropatógena

En este trabajo de tesis también se planteo la bioconjugación del PGA con el manosido

(4-Aminofenil α-D-manopiranosido). Como se mencionó en secciones anteriores se eligió este

biopolímero por sus destacables propiedades biológicas y la versatilidad para llevar a cabo

reacciones variadas con un amplio número de compuestos[(Ronget al, 2008), (Matsusaki et

al., 2004), (Bhatt et al. 2003),( Matsusaki et al., 2002)].Por otra parte, el manosido utilizado

en este trabajo es capaz de fijarse a los sitios de reconcimiento proteico presentes en la apice

de la fimbria tipo I (FimH) de E. Coli, de forma similar o análoga a otras estructuras derivadas

de la manosa [(Baek et al. 2000), (Car et al., 2014)]Una vez sintetizado y caracterizadoel

bioconjugado PGA-manósido se procedió a realizar el electrohilado de este biopolímero

modificado con PVA para obtener membranas de nanofibras esperando presumiblemente con

la manosa expuesta sobre la superficie de la nanofibras, dada su naturaleza hidrófila. El

proceso de electrohilado se llevo a cabo, según se detalló previamente en la parte

experimental. Una vez obtenidas las membranas se procedió a su caracterización mediante

técnicas de microscopia SEM para determinar la morfología y la distribución del tamaño del

diámetro de las nanofibras. Con estas membranas electrohiladas de PVA/PGA-manósido

también se realizaron ensayos microbiológicos para determinar su capacidad de

reconocimiento, atrapamiento y retención de células de E. coli portadoras de la fimbria Tipo I

o cepa mutante, en donde estas estructuras no se expresan y en consecuencia no son

uropatógenas.

a) b) c)


93

9.7.1 Microscopía electrónica de barrido

La figura 9.39. muestra imágenes SEM de membranas de las nanofibras de PVA y de

PVA/PGA-manósidoambas electrohiladas. La morfología de las nanofibras de PVA es de tipo

cilindro con pocas regiones de ensanchamiento o deformidades tipo gota, conocidos en la

literatura como defectos estructurales y como se ha reportado son consecuencia del ajuste fino

de los parámetros del proceso de electrohilado [(Fig. 9.39. (a)] (Schiffman & Schauer, 2008)

Resultados similares se obtuvieron al electrohilar el PVA/PGA-manósido [Fig. 9.39.(b)], pero

se aprecia un aumento ligeramente mayor de defectos que con el PVA solo. Por otra parte la

distribución del tamaño de las nanofibras electrohiladas siguen diferente comportamientos.

Mientras que en las nanofibras electrohiladas de la membrana de PVA, se presenta una

distribución normal con un ligero desplazamiento de la curva hacia la región de menor tamaño

de diámetro. El tamaño promedio de las nanofibras para este sistema, se ubica en el intervalo

de 130-150 nm, con tamaño mínimo de 70 nm y máximo de 210 nm ([Fig. 9.39.(c)] Por el

contrario las nanofibras de la membrana PVA/PGA-manósido, el comportamiento de la

distribución de tamaño es muy errático, hecho que se podría atribuirse a una distribución no

del todo homogénea en la solución de PVA o la posible interacciones moleculares entre ambos

polímeros (Fig. 9.7.1.1. (d))[(Shenoyet al.,2005)(Deitzel et al., 2001) (Valencia et al. 2010)].

Figura 9.39.Micrografías SEM donde se muestra la morfología de las nanofibras en las

membranas de: (a) PVA,(b) PVA/PGA-manósido, c) distribución de tamaño fibras PVA y d)

distribución de tamaño fibras PVA/PGA-manósido.

50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330

0

5

10

15

20

25

30

Fre

cu

en

cia

(%

)

Diámetro (nm)

130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 350 3700

5

10

15

Fre

cu

en

cia

(%

)

Diámetro (nm)

a) b)

c) d)


94

Una vez electrohilados los polímeros PVA y PVA/PGA-manósido, las membranas

formadas se sumergieron en un recipiente. Las fibras electrohiladas de PVA y PVA/PGA al

ser sumergidas en agua a temperatura ambiente sufren cambios radicales en su apariencia y

morfología. En ambos sistemas las fibras empiezan a hincharse por efecto de la presencia de

agua, poco tiempo después la apariencia fibrosa no tejida de las membranas empieza a

desvanecerse y a disminuir el tamaño y número de poros. Este proceso se puede explicar

relativamente fácil, todos los componentes poliméricos utilizados en el electrohilado para la

formación de las membranas son materiales hidrófilos altamente solubles en agua. En las

membranas electrohiladas empieza difundir el agua, iniciando el hinchamiento de los

polímeros en forma tal que las nanofibras entran en contacto uniéndose unas a otras,

generándose una tendencia a la desaparición de la apariencia fibrosa y disminución del tamaño

y número de poros (Fig. 9.40).

Figura 9.40Imágenes de micrografía SEM de nanofibras de PVA electrohiladas: a)

nanofibras recién electrohiladas y b) nanofibras electrohiladas después de sumergirlas en agua

por una hora (Yao,et al 2003).

Tomando en consideración lo previamente descrito se decidió someter las membranas a un

proceso de entrecruzamiento con el propósito de preservar su estructura fibrosa original para

evitar el hinchamiento y desaparición de los poros, en la medida de lo posible. Las principales

características de las membranas formadas con nanofibras electrohiladas es el aumento del

área superficial con respecto al volumen, al desaparecer la estructura fibrosa el área superficial

se ve afectada, disminuyendo considerablemente con respecto al volumen. Esto puede traer

como consecuencia que la eficiencia en un buen número de aplicaciones como es la liberación

controlada de fármacos, biosensores, ingeniería de tejidos, filtros y otras muchas aplicaciones

(Schiffman & Schauer, 2008).

El proceso de entrecruzamiento al que se sometieron las nanofibras de PVA y PVA/PGA-

manosido se llevo a cabo mediante sumersión en una solución de metanol concentrado, tal y

como se describe en la parte experimental de este trabajo. Para verificar la efectividad del

proceso de entrecruzamiento, las membranas electrohiladas de los polímerosarriba

mencionados se sumergieron en un baño de agua, colocando un lote tratados con metanol y


95

otro sin tratamiento alguno (Fig. 9.41). Uno de los mecanismos propuestos para explicar el

entrecruzamiento originado por la presencia de metanol, se explica debido a la difusión de las

moléculas de este alcohol que se mezclan con las moléculas de agua,desplazándolas de la

estructura interna de las fibras. Aparentemente, este proceso favorece la formación de enlaces

no covalentes del tipo puentes de hidrógeno entre las moléculas de los polímeros. La

formación de estos nuevos enlaces sustituye a los previamente formados entre el agua y los

polímeros de las nanofibras electrohiladas. Es importante recalcar que el entrecruzamiento

descrito es de naturaleza meramente físico, y en él no se utilizan agentes químicos de

entrecruzamiento que pudieran reaccionar con las cadenas de polímero expuestas en la

superficie de las nanofibras y se evita modificar la estructura química y propiedades

fisicoquímicas de estos polímeros y nanofibras. En otras palabras la adición de metanol

favorece el ordenamiento de las cadenas de los polímeros en la superficie de las nanofibras,

incrementado de esta forma el grado de cristalinidad de los polímeros y esto conduce a una

mejora de las propiedades mecánicas y también se evita la pérdida de los poros y de la

estructura fibrosa de las membranas [(Kenawy et al. 2007)(Yao et al., 2003)]

Figura 9.41.Imágenes de micrografía SEM de nanofibras de PVA electrohiladas: a)

nanofibras electrohiladas sin entrecruzar, b) nanofibras de sumergidas en metanol por una

hora, c) nanofibras entrecruzadas después de mantenerlas sumergidas en agua por tres días.

Un cuestionamiento que nos surgió durante el proceso de entrecruzamiento de las

nanofibras de PVA y de PVA/PGA-manósido, fue saber hasta qué grado de afectación y

profundidad de las membranas ocurre el entrecruzamiento por la acción del contacto de las

nanofibras con el metanol. Para dar respuesta a esta pregunta las nanofibras de ambos sistemas

fueron analizadas mediante microscopia electrónica de barrido acoplado a undetector de

electrones secundarios (Fig. 9.7.1.4). Como se mencionóanteriormente la observación de las

nanofibras de los polímeros electrohilados después de haber sometidos a tratamiento con

metanol, las nanofibras muestran un ensanchamiento con relación a las fibras sin tratamiento y

también se pueden apreciar una especie de cavidades (Fig. 9.42.(a)). Sin embargo cuando estas

mismos materiales se observaron por SEM con la ayuda del detector de electrones

secundarios, en las micrografías se puede apreciar que en la estructura interna de las

membranas conservó su morfología original, similar a la que se presenta inmediatamente

después de electrohilar el polímero, estas observaciones sugieren que la modificación

únicamente ocurre en las capas externas de las nanofibras de las membranas poliméricas (Fig.


96

9.42 (b)). La única diferencia que pudimos apreciar fue el cambio en el tamaño de las

nanofibras en las membranas (Fig 9.42).

Figura 9.42.Imágenes SEM, analizadas con detector de electrones secundarios de las

membranas de nanofibras electrohiladas de PVA: a) Membrana recién electrohilada, b)

membrana entrecruzada con metanol c) Análisis de las membranas mediante detección con

electrones secundarios.

9.8 Evaluación de las membranas electrohiladas con elbioconjugado PVA/PGA-

manosido como herramienta de reconocimiento y atrapamiento de cepas de E. coli

uropatogéna

9.8.1 Ensayos microbiológicos

Se evaluó la capacidad de interacción y atrapamiento de cepas de E. coli uropatógena

de las membranas del bioconjugado del poli(ácido γ-glutámico)-4-aminofenill α-D-

manopiranosida co-electrohiladas con PVA. En este ensayo se utilizaron tres tipos de cepas de

E. coli, la descripción de las mismas se presento anteriormente en la tabla 8.4.

La tabla 9.1 muestralos resultados de las evaluaciones microbiológicas con las

membranas electrohiladas de PVA y PVA/PGA-manosido.Dichos valores corresponden a un

valor promedio de los conteos viables de colonias en cada una de las cepas crecidas en placas

Petri con agar nutritivo, dichas colonias provenientes de la solución final de los viales al inicio

y a las 12 horas de haber iniciado incubación. Los detalles del ensayo se describieron

ampliamente en la sección de la parte experimental.

a) b)

A B c a) b) c)


97

Tabla 9.1. Resultados de las pruebas microbiológicas para la evaluación de membranas en

medio nutritivo 1/500

Medio nutritivo 1/500

Descripción Bt0 BT12PVA T12PVA/PGA-

manosido

ORN 208 2,458 14,745,000 19,793

ORN 178 2,624 66,750 54

SS3 2,707 2,058,056 17,500

Los datos de tabla claramente muestran que en las membranas de PVA electrohilada después

de doce horas de incubación (Bt12) el crecimiento celular es muy abundante en la cepa ORN

208, en la cepa SS3 el crecimiento es siete veces menor que esta última. Por el contrario en la

cepa ORN 178 es 220 y 30 veces menor con respecto a las cepas ORN 208 y SS3. Estos

resultados se pueden atribuír dado que el crecimiento pudiera estar asociado a la capacidad de

la adhesión mecánica de las células de E. coli a las membranas electrohiladas de PVA, pero

también puede ser efecto de la genética de estas cepas y como consecuencia de ello el

metabolismo es más activo en una de ellas con respecto a las otras. Cuando estas cepas se

crecieron en el mismo medio (medio nutritivo diluído 500 veces) en presencia de las

membranas del bioconjugado se aprecia una disminución dramática en el número de UFC/mL.

En parte esta disminución del crecimiento se podría explicar como un efecto del cambio de la

morfología externa de las membranas medio de cultivo utilizado en este ensayo. Sin embargo,

otra posibilidad se puede atribuir a una interacción específica por reconocimiento molecular de

la fimbria Tipo I de E. coli. La comparación de datos entre las membranas control de PVA

electrohilada con relación a las membranas de PVA/PGA-manosido electrohiladas, mostraron

los siguientes resultados: en la cepa ORN 208 que es una cepa mutada en el gen fim H hay una

disminución de745 veces, en la cepas ORN 178 y SS3 la disminución en la UFC/mL es de

1236 y 117 veces, respectivamente, después de que las cepas se incubaron por 12 horas. A

excepción de la cepa 178 donde el valor refleja los datos esperados; en las otras dos cepas esto

no ocurre así, se esperaría que en la cepa ORN 208, la UFC/mL presentará un valor mucho

más alto y lo contrario debería esperarse con la cepa SS3, debido a que en esta cepa la fimbria

Tipo I, no está alterada y conserva su capacidad de interacción con la manosa, mediante el

reconocimiento molecular en el dominio específico de esta proteína(Aprikian et al. 2007).

Los datos anteriores nos hicieron pensar que quizá en alguna forma el medio cultivo

interfirió con los resultados obtenidos. Para descartar esta posibilidad se decidió realizar un

experimento similar, pero en esta ocasión sustituyendo el caldo nutritivo (diluído 500 veces)

por una solución fisiológica. La tabla 9.2 resume los resultados obtenidos, en esta ocasión los

datos obtenidos concuerdan con lo originalmente esperado. A pesar de que en las tres cepas el

inoculo (Bt0) fue relativamente similar, el crecimiento que se observa después de doce horas

de incubación con las membranas del bioconjugado (T12PVA/PGA-manosido) es muy

diferente en la cepa ONR 208 con respecto a las otras dos cepas. En la cepa ONR 178 el

crecimiento es nulo y en la cepa SS3 este es 240 veces más bajo que el que ocurre con

respecto a las membranas control (PVA) y 57 veces más bajo que el inoculo (BT0). Por otra


98

parte en la cepa ONR 208 prácticamente no hay cambios en UFC/mL, esto se puede atribuír a

la mutación inducida en el gen fim H de la fimbria tipo I de esta cepa, carece de la capacidad

de interaccionar con la FIM H. En contraste, el conteo nulo en la cepa ONR 178 y

extremadamente bajo en la cepa SS3, sugiere que estas dos cepas expresan las fimbrias tipo I

con capacidad de formación de un enlace específico a ciertos compuestos de tipo manosido

(Guo et al. 2012).

Tabla 9.2. Resultados de las pruebas microbiológicas para la evaluación de

membranas en solución fisiológica.

La presencia de las moléculas de manosa unidas covalentemente al γ-PGA son indicio de

un reconocimiento molecular específicoa nivel de las fimbrias tipo I de estas cepas, debido a

que ambas expresan las fimbrias Tipo I con capacidad de unirse a ciertos manósidos.(Harris et

al. 2001). Estos resultados consideramos que son muy importantes, debido a que es posible

utilizar este tipo de sistemas como un filtro para el atrapamiento de cepas de E.

coliuropatógena o como biosensores para detectar la presencia de estos microorganismos en

muestras contaminadas de alimentos, líquidos, medicamentos y otros más.

9.8.2. Evaluación de las membranas de PVA y PVA/PGA manosido por medio de

microscopía electrónica de barrido

Las membranas que fueron sumergidas en la solución de bacterias de cada una de las

cepas, se evaluaron por microscopía electrónica de barrido (SEM), para obtener una mayor

evidencia para confirmar que efectivamente las cepas de E. Colique expresan el genotipo wild

type de las fimbrias tipo I se adhieren a las membranas electrohiladas que contienen el

manosido del bioconjugado sintetizado en este trabajo.

La figura9.43. muestra las micrografías de la membrana electrohiladas del bioconjugado

PVA/ PGA-manosa posterior a la sumersión en una suspensión de células de la cepa ONR de

E. coli. Previo a estas observaciones se realizaron lavados a la membrana con solución

fisiológica para remover cualquier célula que no se hubiese adherido por interacciones de las

fimbrias con el bioconjugado presente en las membranas electrohiladas. En ésta, las

micrografía no se aprecia la presencia de células de este microorganismo depositadas o unidas

en a la membrana. Este hecho se puede ser debido como se ha mencionado antes a la

mutación del gen fim H de las fimbrias tipo I, con lo cual no e posible que haya una unión

específica entre la proteína Fim H y la terminación manosa del bioconjugado.

Solución fisiológica

Descripción Bt0 BT12PVA T12PVA/PGA-

manosido

ORN 208 2,100 2,706 2,641

ORN 178 1,889 1,969 0

ORN SS3 2,340 98,333 41


99

Figura 9.43. Micrografía SEM de la membrana PVA/Bioconjugado sumergida en solución de

bacterias ORN 208.

Por otra parte en la figura 9.44. podemos observar la micrografía correspondiente a la

membrana de bioconjugado/PVA sumergida en la solución de bacterias de la cepa ORN 178 y

lavada con solución fisiológica, en dicha imagen podemos observar cuerpo cilíndrico de forma

alargada que se encuentra fijado a una de las fibras que conforman la membrana. Podemos

afirmar que se trata de una bacteria de E. coli debido a la reducción de la presencia de

artefactos gracias al lavado de la membrana y de que no se presentan cuerpos similares en las

membranas blanco (micrografías sección 9.7.1.) además de que las dimensiones de dicho

objeto corresponden a las reportadas para una bacteria de E. Coli.


de bacterias ORN 178.


100

Por último en la figura 9.45. podemos observar del lado izquierdo una micrografía a bajas

magnificaciones de un grupo considerable de cuerpos alargados y cilíndricos acomodados de

forma continua, del lado derecho con el doble de magnificaciones se observa que dichos

cuerpos poseen la dimensión reportada para una bacteria de e. Coli.Dado que se realizó un

lavado con solución fisiológica posterior al sumergir la membrana en solución de bacterias, las

probabilidad de que se trate de algún otro tipo de artefacto es baja o casi nula; dado que las

células poseen una reserva de nutrientes con la cual pueden continuar con su ciclo vital

reproductivo podemos asumir el acomodo continuo a la división celular partiendo de una

célula adherida a la membrana y a la inmovilización de las generaciones siguientes.


de bacterias de la cepa salvaje SS3.

9.8.3 Análisis por microscopía electrónica de transmisión

En base a la micrografías obtenidas mediante SEM (Sección 9.7.2.), donde se muestra a las

cepas de E. coli depositadas sobre las fibras de las membranas mostrando una distribución

aleatoria y que dada la sensibilidad del mapeo elemental mediante EDS por microscopia

electrónica de barrido no fue la suficiente para identificar las zonas de las fibras en las que se

encontraban los cristales del bioconjugado (mediante la ubicación de nitrógeno). Se recurrió a

la evaluación de las fibras mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM por sus

siglas en ingles) para la identificación visual de dichos cristales.

Debido a la naturaleza diferente de ambos elementos (fibras de PVA y cristales de

bioconjugado) no fue necesaria la realización de algún tipo de tinción o contraste previos al

análisis.

En la figura 9.45. se muestra un comparativo de imágenes entre un cristal de bioconjugado

y un defecto de electrohilado, lo anterior para descartar que los cuerpos que se encuentran


101

embebidos entre las fibras pudiesen ser defectos del electrohilado. En la figura a) se muestra

un cristal de bioconjugado de aproximadamente 200 nanómetros de diámetro, mientras que en

la imagen b) se aprecia claramente un defecto del electrohilado, a simple vista puede verse su

diferencia morfológica sin posibilidad de confusión entre dichos elementos.

Figura 9.46. comparación gráfica entre un cristal de bioconjugado PGA/manosa embebido en

una fibra de PVA (a) y un defecto de electrohilado (b).

De igual modo podemos apreciar En la figura 9.46. la morfología propia de las fibras de PVA

presentando el bioconjugado únicamente en forma de cristales a lo largo de las fibras.

Figura 9.47. Micrografías TEM de las fibras de PVA en las regiones que no presentan

cristales de bioconjugadoa) Nanofibra sencilla 20nm y b) fibra fusionadas perpendicularmente

100 nm.

a) b)

a) b)


102

Mediante el análisis por TEM se lograron identificar cristales alargados amorfos que

van desde los 60 hasta los 500 nm de longitud aproximadamente, todos ellos embebidos en las

fibras de PVA, lo cual permite suponer que en estos cristales es donde se lleva a cabo la

adherencia de las bacterias sobre la superficie de las membranas.

Figura 9.48. Cristales de bioconjugado PGA/manosa embebidos en nanofibras de PVA, a)

cristal embebido en la periferia de la nanofibra 50nm, b) cristal embebido en nanofibra 500nm,

c) cristal embebido en posición perpendicular a la nanofibra 50nm, d) cristal embebido en

posición paralela a la nanofibra.

a) b)

c) d)

CONCLUSIONES

103

X. CONCLUSIONES

• Se funcionalizó el PGA con propargil amina para su posterior bioconjugación.

• Se sintetizó el trímero de fenilenetinileno para su bioconjugación con el PGA para la

formación de partículas luminiscentes.

• Se sintetizó una molécula con terminación manosa para su bioconjugación con el PGA

para su incorporación en membranas de PVA.

• Se logró la fabricación de membranas electrohiladas de PVA/PGA-Manosa

• Se evaluó la inmovilización de E. coliuropatógena en las membranas mediante pruebas

microbiológicas y por microscopia electrónica.

TRABAJO A FUTURO

104

XI. TRABAJO A FUTURO

Si bien en este trabajo de tesis se logró la síntesis, bioconjugación y fabricación de

dispositivos, solo se evaluó la aplicación de uno de ellos (el filtro de bacterias) y por tanto es

necesario que en trabajos posteriores se estudie como un posible acarreador de fármacos a las

partículas polímericas PGA-trímero fabricadas en este trabajo, mediante pruebas de liberación

y citotoxicidad para evaluar la factibilidad de emplear dichas nanoestructuras como sistemas

de acarreo, de forma adicional es necesario estudiar las variables (relación solución:agua) en la

metodología para fabricar las nanopartículas (la doble emulsión) para obtener estructuras de

mejor tamaño, morfología mayoritariamente esférica y de distribución de tamaño estrecha.

De igual modo el trabajo expresado en este documento requiere de optimización en

todas sus etapas, la síntesis requiere de una optimización en las rutas y en los procesos en aras

de reducir costos y aumentar la viabilidad de su utilización como filtro, así mismo la

fabricación de las membranas requiere de un análisis profundo en lo que respecta a las

propiedades mecánicas y evaluar si el PVA es el mejor material para dicho fin, o si puede

sustituirse por algún otro con mejores características mécanicas; Por último se recomienda

repetir el trabajo expuesto en el documento para observar la reproducibilidad de los resultados.

BIBLIOGRAFÍA

105

XII. BIBLIOGRAFÍA

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