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Luana Cristina Faria Carvalho Efeito de ectonucleotidases de Leishmania sobre a produção de IL-1β em células dendríticas Ouro Preto 2018

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Luana Cristina Faria Carvalho

Efeito de ectonucleotidases de Leishmania sobre a produção de IL-1β

em células dendríticas

Ouro Preto

2018

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Universidade Federal de Ouro Preto

Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

Efeito de ectonucleotidases de Leishmania sobre a produção de IL-1β

em células dendríticas

Aluna: Luana Cristina Faria Carvalho

Orientador: Luís Carlos Crocco Afonso

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de

Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos

requisitos para obtenção do título em Mestre em Ciências

Biológicas, área de concentração: Imunobiologia de

Protozoários

Ouro Preto

2018

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Trabalho desenvolvido no Laboratório de Imuno-

parasitologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto

(UFOP), sob a orientação do Prof. Dr. Luís Carlos

Crocco Afonso, com auxílio financeiro da Fundação de

Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

(FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq) e

UFOP.

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“A persistência é o caminho do êxito”

Charles Chaplin

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Agradecimentos

Agradeço а Deus pela dádiva da vida, e por ter ajudado não apenas a manter a fé e a

esperança nos momentos mais difíceis, mas também a conquistar mais uma etapa da minha

vida.

À minha Mãe, por ter me apoiado e por diversas vezes ter me compreendido. Agradeço

ao meu Pai (em memória) pela proteção. Aos meus Irmãos pelo incentivo. Ao Matheus pelo

incentivo, apoio e companheirismo de todos os dias. Aos demais familiares que me apoiaram

em todos os momentos durante minha formação.

Agradeço ao Professor Luís Carlos Crocco Afonso pela orientação, pela confiança

depositada, pela paciência e pelos anos de convivência. Obrigada pelas motivações,

compreensões, direcionamentos e carinho. Tenho a certeza que hoje sou mais madura para

seguir na carreira acadêmica.

Aos meus colegas do LIP, meus sinceros agradecimentos por todos os momentos

vividos juntos, pelas pausas para o “café”, pelos lanches e gordices rsrs. Agradeço em

especial à Míriam, Ive, Flávia e Amanda pelas sugestões, incentivo e amizade. Não poderia

deixar de agradecer a todos os alunos de iniciação científica, em especial ao Flávio pela

amizade e conversas.

Aos técnicos Leandro e Marcorélio por manterem o laboratório em andamento.

Agradeço aos Professores e demais funcionários do NUPEB e à UFOP.

Aos amigos e companheiros que me apoiaram durante essa jornada e a tornaram mais

prazerosa.

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Resumo

Células dendríticas (DC) são essenciais para a montagem da resposta imune inata e para a

conexão das respostas inata e adquirida, inclusive durante a infecção por Leishmania. Vários

estudos têm apresentado a importância da sinalização purinérgica, como o papel das E-

NTPDases do parasito, no processo de infecção. O objetivo deste trabalho foi avaliar se

Leishmania com variações na atividade ENTPDase são capazes de modular a produção de IL-

1β por células dendríticas. A atividade ectonucleotidásica foi avaliada pela hidrólise de fosfato

inorgânico por incubação de formas promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e L. major

com ATP, ADP ou AMP. Observamos que ambas apresentam semelhante atividade enzimática.

Avaliamos a correlação entre liberação de IL-1β por DC infectadas por Leishmania e tratadas

com LPS e ATP e atividade enzimática de Leishmania e verificamos que houve forte

correlação, sobretudo sobre ATP e ADP. Além disso, uma vez reduzida a atividade enzimática,

houve uma redução do percentual de células infectadas. Como adenosina poderia estar

envolvida no processo de indução da liberação de IL-1β verificamos que o tratamento de DC

com análogo de adenosina aumentou a liberação de IL-1β. Verificamos, ainda, que o tratamento

com inibidores dos receptores de adenosina, SCH 58261 (receptor A2a) e MRS 1454 (receptor

A2b) foi capaz de reduzir significativamente a liberação de IL-1β por DC infectadas. Não

obstante, verificamos o envolvimento do receptor P2X7 no processo de geração de IL-1β e

analisamos que o bloqueio do receptor por P2X7 suficiente para reduzir a liberação de IL-1β

pelas DC infectadas tanto por L. amazonensis como por L. major. Concluímos que a ENTPDase

de Leishmania é um importante fator de virulência, capaz de induzir a hidrólise de ATP para

geração de adenosina e estimular o possível curso da infecção em favor do parasito pela

produção de IL-1β.

Palavras-Chave: Célula Dendrítica; Leishmania; Ectonucleotidases; IL-1β.

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Abstratc

Dendritic cells (DC) are essential for the assembly of the innate immune response and for the

connection of innate and acquired responses, including during Leishmania infection. Several

studies have presented the importance of purinergic signaling, such as the role of E-NTPDases,

in the process of infection by parasites of the genus Leishmania. The objective of this work was

to evaluate whether Leishmania with variations in ENTPDase activity are able to modulate the

production of IL-1β by dendritic cells. The ectonucleotidase activity was evaluated by

hydrolysis of inorganic phosphate by incubation of metacyclic promastigote forms of L.

amazonensis and L. major with ATP, ADP or AMP. We observed that both presented similar

enzymatic activity. We evaluated the correlation between IL-1β release by Leishmania-infected

DC and treated with LPS and ATP and Leishmania enzymatic activity and we observed a strong

correlation, especially when ATP and ADP were used as substrates. Furthermore, once the

enzymatic activity was concomitant decrease, there was a reduction in the percentage of

infected cells. As adenosine could be involved in the induction process of IL-1β release we

found that treatment of DC with NECA, an adenosine analogue, was able to increase the release

of IL-1β. In addition, we found that treatment with adenosine receptor inhibitors, SCH 58261

(A2a receptor) and MRS 1754 (A2b receptor) was able to significantly reduce the release of

IL-1β by infected DCs. Nevertheless, we evaluated the involvement of the P2X7 receptor in the

generation of IL-1β and analyzed that the receptor blockade by A730004 was sufficient to

promote the reduction of IL-1β release by DC infected by both L. amazonensis and L. major.

We conclude that Leishmania ENTPDaseis an important virulence factor capable of inducing

ATP hydrolysis to generate adenosine and to stimulate the possible course of infection in favor

of the parasite by the production of IL-1β.

Keywords: Dendritic Cell; Leishmania; Ectonucleotidases; IL-1β.

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Índice

Lista de figuras...................................................................................................................... IX

Siglas....................................................................................................................................... X

1. Introdução......................................................................................................................... 13

2. Revisão bibliográfica........................................................................................................ 14

2.1 Sinalização purinérgica: molécula de ATP e receptores purinérgicos...................... 14

2.2 Ectonucleotidases...................................................................................................... 15

2.3 Características do receptor P2X7: importância do reconhecimento da molécula de

ATP................................................................................................................................... 16

2.4 Inflamassoma e citocina IL-1β.................................................................................. 17

2.5 Leishmanias e fatores de virulência.......................................................................... 19

2.6 Resposta imune frente a infecção por Leishmania.................................................... 21

2.7 Leishmania, células dendríticas e sinalização purinérgica........................................ 22

3. Justificativa....................................................................................................................... 25

4. Objetivos........................................................................................................................... 26

4.1 Objetivo Geral.......................................................................................................... 26 4.2 Objetivos Específicos............................................................................................... 26

5. Materiais e Métodos........................................................................................................ 27

5.1 Cultivo celular........................................................................................................... 27

5.2 Parasitos.................................................................................................................... 27

5.3 Avaliação da atividade enzimática por de hidrólise de nucleotídeos........................ 28

5.4 Infecção de células dendríticas in vitro e ativação da via de IL-1β............................ 28

5.5 Determinação da produção de IL-1β......................................................................... 29

5.6 Análise estatística...................................................................................................... 29

6. Apresentação de Resultados e Discussão.......................................................................

6.1 Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies de Leishmania: Leishmania

(Leishmania) amazonensis e Leishmania (Leishmania) major.............................................. 30

6.2 Parasitos do gênero Leishmania são capazes de induzir a liberação de IL-1β por células

dendríticas tratadas com LPS e ATP............................................................................... 31

6.3 A modulação da atividade enzimática de parasitos do gênero Leishmania reduz a

liberação de IL-1β............................................................................................................ 37

6.4 A adenosina é importante para promover a liberação de IL-1β por células dendríticas

infectadas......................................................................................................................... 40

6.5 A liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas é dependente do receptor

P2X7......................................................................................................................................... 43

7. Conclusão........................................................................................................................... 48

8. Referências bibliogràficas................................................................................................. 49

VIII

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Lista de figuras

Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero

Leishmania............................................................................................................................. 28

Figura 2: Via de liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas............................... 30

Figura 3: Correlação de atividade ectonucleotidásica e liberação de IL-1β após tratamento com

LPS+ATP............................................................................................................................... 32

Figura 4: Infecção de células dendríticas por L. amazonensis e L. major........................... 33

Figura 5: Liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas por L. amazonensis e L. major

na presença de inibidores de ENTPDase................................................................................ 36

Figura 6: Infecção de células dendríticas por L. amazonensis e L. major na presença de

inibidores de E-NTPDase....................................................................................................... 37

Figura 7: Células dendríticas tratadas com NECA são capazes de liberarem IL-1β.............. 39

Figura 8: A adenosina é importante para promover a liberação de IL-1β por células dendríticas

infectadas................................................................................................................................ 40

Figura 9: O receptor P2X7 possui papel na liberação de IL-1β por células dendríticas

infectadas............................................................................................................................... 42

Figura 10: Infecção de células dendríticas por L. amazonensis e L. major na presença de

inibidores de P2X................................................................................................................... 43

Figura 11: Viabilidade de células dendríticas....................................................................... 44

IX

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Siglas e Abreviaturas

ACR: apyrase conserved regions- “regiões conservadas da apirase”

ADO: adenosina

ADP: difosfato de adenosina

AMP: monofosfato de adenosina

ATP: trifosfato de adenosina

ATPe: trifosfato de adenosina extracelular

ATPi: trifosfato de adenosina intracelular

E-NTPDase: ectonucleosídeo 5’-trifosfato difosfohidrolase

GP63- Glicoproteína de Leishmania com 63 kDa de massa molecular

IFN-y: interferon gama

IL: interleucina

iNOS: enzima óxido nítrico sintase induzível

IP3: inositol trifosfato

LPG: lipofosfoglicano

LPS: lipossacarídeo

MAC: complexo de ataque à membrana

NK: natural killer

NLR: receptores to tipo NOD

NTPDase: nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase

PBS: salina tamponada com fosfato

Pi: fosfato inorgânico

ROS: espécies reativas de oxigênio

SFB: soro fetal bovino

SNC: sistema nervoso central

TGF: fator de transformação do crescimento

TLR: Receptor do tipo Toll

TNF: fator de necrose tumoral

X

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1. Introdução

Os nucleotídeos de adenina (ATP, ADP e AMP) e o seu nucleosídeo derivado, a

adenosina, atuam no meio extracelular como moléculas sinalizadoras (Zimmermann, 2001)

envolvidas em diversas funções celulares e alterações fisiológicas da sinalização purinérgica,

que podem resultar em modulação da resposta imune (Burstock, 2003; Bours e cols., 2006).

Estas moléculas sinalizadoras, juntamente com os seus receptores de membrana, compõem o

chamado sistema purinérgico (Burstock, 2003).

Os receptores purinérgicos para nucleotídeos estão envolvidos em processos de

modulação da inflamação e resposta imune (Di Virgilio e cols., 2001) e podem ser divididos

em duas subclasses: acoplados a proteína G, chamados de P2Y, e os ligados a canais iônicos,

designados P2X (Ralevic e Burnstock, 1998). Os receptores para adenosina em mamíferos

podem ser classificados em A1, A2A, A2B e A3 e são amplamente expressos em várias células

imunes (macrófagos, células dendríticas, neutrófilos), funcionando como reguladores

imunológicos (Antonioli e cols., 2014).

Dentre as enzimas do sistema purinérgico, as ectonucleotidases atuam na regulação dos

níveis extracelulares dos nucleotídeos. Dentre elas destacam-se as famílias ecto-nucleosídeo

trifosfato difosfohidrolase (E-NTPDase), responsáveis pela hidrólise de ATP à sua forma

monofosfatada, e a ecto-5’- nucleotidase (E-5'NT) que hidrolisa AMP à adenosina

(Zimmermann, 2001). Estas enzimas são amplamente distribuídas na natureza e já foram

estudadas em diversos micro-organismos (Tripanosoma cruzi, Toxoplasma gondii), dentre eles

em protozoários do gênero Leishmania (Meyer-Fernandes e cols., 1997; Berrêdo-Pinho e cols.,

2001).

Estudos de nosso laboratório sugerem que as ENTPDases de Leishmania possuem papel

importante sobre a sinalização purinérgica do hospedeiro, funcionando como fator de virulência

e exercendo um papel modulador sobre a resposta imune mediada pela geração de adenosina

extracelular a partir da hidrólise de ATP (Marques-da-Silva e cols; 2008; Leite e cols., 2010;

Gomes e cols., 2015).

Na literatura alguns trabalhos já demonstraram que diferentes espécies de Leishmania

são capazes de induzirem a liberação de IL-1β (Lima-Júnior e cols., 2013; Young e cols., 2010),

mas os mecanismos envolvidos neste processo ainda são pouco conhecidos. Assim,

objetivamos verificar se a atividade enzimática de Leishmania possa contribuir para a

modulação da liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas, uma vez que a liberação de

IL-1β é dependente do ATP extracelular (Young e cols., 2010).

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2. Revisão Bibliográfica

2.1 Sinalização purinérgica: molécula de ATP e receptores purinérgicos

A sinalização purinérgica consiste em um conjunto de componentes que possuem papel

importante no processo de modulação da resposta inflamatória e imunológica (Burstock, 2003).

O ATP e outros nucleotídeos e nucleosídeos de adenina são moléculas encontradas no

organismo de mamíferos e são responsáveis por modularem a resposta celular (Burnstock e

cols., 1972; Burnstock e cols., 2006). Sabe-se que o ATP intracelular é primariamente

direcionado para processos energéticos (transporte ativo, biossíntese celular, etc) (Yegutkin,

2008), porém, em situações de injúria, dano celular, apoptose, entre outros, a molécula de ATP

é direcionada para o meio extracelular e, portanto, passa a ser considerada uma importante e

crítica molécula sinalizadora de perigo do sistema purinérgico (Zimmermmen, 2000; Yegutkin,

2008).

Os sinais gerados são capazes de alertar a resposta imune em relação ao dano tecidual

(La Sala, 2003). Estudos já demonstraram que este nucleotídeo está envolvido na adesão de

neutrófilos ao endotélio vascular e consequentemente migração para locais danificados, além

de estimular a fagocitose e ativar os mecanismos microbicidas destas células (Freyer e cols.,

1988; Oryu e cols., 1996; Rounds e cols., 1999). Além disso, tem demonstrado papel importante

no recrutamento de monócitos e na produção de imunomediadores por macrófagos, como IL-

1α, IL-6 (Lemaire e Leduc, 2003), IL-18 (Mehta e cols., 2001), TNF-α (Guerra e cols., 2003),

IL-1β (Mehta e cols., 2001; Ferrari e cols., 2004), ROS (Suh e cols., 2001) e óxido nítrico

(Sperlagh e cols., 1998).

Em células dendríticas, o ATP extracelular induz sua diferenciação para um perfil pró-

inflamatório (La Sala e cols., 2001) e em linfócitos tem sido apontado como uma molécula

indutora de proliferação, ativação de linfócitos T citolíticos e migração de linfócitos ativados

para os locais de inflamação (DosReis e cols., 1986).

Assim, considerando altas concentrações do ATP no meio extracelular durante injúria

celular ou infecção, este irá atuar em receptores específicos na membrana celular, denominados

receptores purinérgicos (Trautmann, 2009). Os receptores purinérgicos podem ser divididos em

receptores P1 e P2. Os receptores P2 podem ser subdivididos em receptores P2X e P2Y. Os

receptores P2X (P2X1-7R) são receptores ionotrópicos, ligados à canais iônicos, que quando

ativados resultam na abertura de um poro na membrana celular, tornando-a permeável a

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passagem de cátions, como ocorre o efluxo de K+ e influxo de Na+, Ca+ (Browne e cols., 2010;

Young, 2010). Estes receptores são encontrados na superfície de diversas células do sistema

imune e são caracterizados por se ligarem ao ATP extracelular (eATP), com variações em sua

sensibilidade. Neste sentido, os receptores P2X1-6 são mais sensíveis ao ATP (1 a 5μM) e os

receptores P2X7 são responsivos a faixas acima de 100μM (Cekic e Linden, 2016).

Os receptores P2Y (P2Y1-14R) são receptores acoplados à proteína G (Di Virgilio e

cols., 2001) e apresentam ampla especificidade. Os receptores P2Y1 e P2Y11 são específicos

para purinas, enquanto P2Y4 e P2Y6 são específicos de pirimidinas. P2Y2 apresenta

seletividade mista e P2Y12 e P2Y13 respondem apenas a ADP e P2Y14 a UDP (Bours e cols.,

2006). Além disso, os receptores P2Y1, P2Y2, P2Y4 e P2Y6 são capazes de aumentar inositol

trifosfato (IP3) e cálcio citosólico (Burnstock, 2007). Recentemente, Martinez e cols (2016)

demonstraram que o receptor P2Y2, um importante modulador de respostas glióticas após lesão

do sistema nervoso central (SNC) é capaz de ser regulado por microdomíneos de membrana,

como as caveolinas (Martinez e cols., 2016).

A adenosina, produto da hidrólise de ATP, é uma importante molécula anti-inflamatória,

e tem sido amplamente investigada devido à sua capacidade de regular a homeostase

imunológica através da ativação de receptores do tipo P1 que são subdivididos em quatro

receptores específicos acoplados à proteína G, classificados como: A1, A2A, A2B e A3, os

quais são amplamente expressos em várias células do sistema imunológico, dentre elas as

células dendríticas (Antonioli e cols., 2014).

Os receptores A2, acoplados à proteína GαS, apresentam alta afinidade pela molécula

de adenosina e são conhecidos por estimularem a enzima adenilato ciclase e consequentemente

favorecerem a produção de AMPc e a ativação de vias de fosforilação de fatores de transcrição

e quinases (Abbracchio e Ceruti, 2007; Cekic e Linden, 2016). Os receptores A1 (acoplado à

proteína Gα1) e A3 (acoplado à proteína GαQ) possuem função inversa aos receptores A2A e

A2B, apresentando baixa afinidade pela molécula de adenosina e sendo capazes de ativarem a

fosfolipase e induzirem aumento de cálcio intracelular (Abbracchio e Ceruti, 2007; Cekic e

Linden, 2016).

2.2 Ectonucleotidases

Como já mencionado, em situações de injúria, as altas concentrações de ATPe são

capazes de estimular uma cascata inflamatória e consequentemente modular a resposta imune

(La Sala e cols., 2003). Estas funções são realizadas por meio de importantes enzimas que estão

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presentes em diversas populações celulares, como macrófagos e células dendríticas (Kumar e

Sharma, 2009). Destacam-se a ectonucleotidase trifosfato difosfohidrolase (ENTPDase), que

hidrolisa o ATP (molécula inflamatória) em ADP e AMP, e também a ecto-5’-nucleotidase que

produz adenosina (anti-inflamatória) mediante a hidrólise de AMP (Zimmermann, 2001).

As enzimas das famílias ENTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleosídeos tri

ou difosfatos à sua forma monofosfatada (AMP). Esta molécula, por sua vez, pode sofrer

hidrólise pela ecto-5’-nucleotidase e também pelas fosfatases alcalinas (Zimmermann e cols.

2000), favorecendo a produção e consequentemente a via de sinalização mediada pela

adenosina. São enzimas que compartilham cinco regiões altamente conservadas, denominadas

“regiões conservadas da apirase”, ACR (ACR 1- 5 apyrase conserved regions), que apresentam

grande importância na estimulação da atividade (Zimmermann, 2000).

A família de NTPDases compreende um grupo de 8 enzimas, que foram até então

descritas, das quais as NTPDase 1,2,3 e 8 são ancoradas na membrana celular e possuem o sítio

catalítico voltado para a porção extracelular. As NTPDases 5 e 6 são conhecidas por serem

secretadas e as NTPDases 4 e 7 são caracterizadas por serem intracelulares e com sítios

catalíticos voltados para o lúmen de organelas (Robson e cols., 2006).

Estas enzimas são, também, encontradas em alguns protozoários, como Toxoplasma

gondii (Asai e cols.,1995), Leishmania amazonensis (Pinheiro e cols., 2006), Trichomonas

vaginalis (Tasca e cols., 2003) e Trypanosoma cruzi (Meyer-Fernandes e cols., 2004) e a ação

sequencial das E-NTPDases e ecto-5’- nucleotidase tem sido caracterizada por modular a

resposta imunológica. Esta cascata enzimática pode ser utilizada por alguns patógenos (Sansom

e cols., 2008), sobretudo por tripanosomatídeos como parasitos do gênero Leishmania, que não

fazem a síntese de novo de purinas (Marr e cols., 1978). Assim, necessitam destas enzimas para

alimentar a via de salvação de purinas, através da recaptação de purinas pré-formadas do

ambiente do hospedeiro e satisfazer suas exigências de nucleotídeos e garantir seu

desenvolvimento (Carter e cols., 2008).

2.3 Características do receptor P2x7: importância do reconhecimento da

molécula de ATP

O receptor P2X7 é um receptor de membrana (Dubyak e Moatassim, 1993; North, 2002)

que apresenta como ligante natural o ATP (Ralevic e Burnstock, 1998; Volonté e cols, 2011).

É importante destacar suas características, pois este é um receptor que apresenta baixa afinidade

pelo ATP e, portanto, somente é ativado em tecidos intensamente inflamados que apresentam

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concentrações de ATP acima de 100μM (Khakh e North, 2012). Atualmente, os estudos

disponíveis na literatura avaliam seus efeitos in vitro utilizando elevadas concentrações de ATP,

que se estendem de 1mM ou valores superiores (La Sala e cols., 2003; Donnelly –Roberts e

Jarvis, 2007; Coddou e cols., 2011). Além disso, estes receptores podem formar poros maiores

que os receptores de sua classe e assim permitir a passagem e secreção de grandes moléculas,

incluindo o próprio ATP (Pellegatti e cols, 2005; Cekic e Linden, 2016).

A ativação do receptor P2X7 está associada com o efluxo de K+ e influxo de Na+ e Ca+,

que tem sido apontado como um cofator para ativação do inflamassoma e secreção de citocinas

inflamatórias por células. A ativação prolongada tem sido associada com a morte celular por

apoptose (Wiley e cols., 2011), sendo que, na ausência do seu ligante, ele pode favorecer a

fagocitose de partículas estranhas ou bactérias como Chlamydia (Darville e cols., 2007) e

possivelmente aumentar a liberação de ATP extracelular para promover uma importante

regulação da resposta imune inata (Wiley e cols., 2011; Morandini e cols., 2014).

A ativação do receptor P2X7 pode induzir várias cascatas de sinalização específicas de

células, incluindo as cascatas de IL-1β (Ferrari e cols., 1997) e NF- κB (Ferrari e cols., 1997),

sendo, portanto, um membro chave no processamento e liberação de citocinas da família IL-1

em células inflamatórias (Chiao e cols., 2008) e, a partir de estudos com camundongos knock-

out para o receptor, foi identificado que sua ausência é responsável por dificultar a liberação de

IL-1β após desafio com LPS e subsequente tratamento com ATP (Labasi e cols., 2002; Ferrari

e cols., 2006).

2.4 Inflamassoma e citocina IL-1β

Hoje, entende-se que para ocorrer apropriada resposta inflamatória é necessária a ação

conjunta de sinais de Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs) e Danos

Moleculares Associados a Patógenos (DAMPs), na qual se enquadram o ATP. A utilização da

molécula de ATP como forma de alerta de perigo é de grande valia, dadas as suas baixas

concentrações extracelulares em condições fisiológicas e altas concentrações extracelulares,

citoplasmáticas e/ou vesiculares em estado de injúria (Di Virgilio, 2007; Junger, 2011; Lamkafi

e Dixit, 2014).

O receptor P2X7 tem demonstrado importância na montagem da resposta inflamatória,

como na liberação de ATP e NO (Sperlàgh e cols., 1998) e também na capacidade de ativar a

translocação de NF- κB para o núcleo (Ferrari e cols., 1997) por uma sinalização dependente

de Myd88 (Liu e cols., 2011), fato de grande importância, visto que a ativação do receptor P2X7

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e a ativação de NF- κB são descritas como necessárias para a produção, maturação e liberação

de IL-18 e IL-1β, citocinas da família IL-1 (Ferrari e cols., 2006).

Mediante aos fatores acima citados deparamos com elementos que participam da cascata

de sinalização subsequente à ativação do receptor P2X7, que também inclui a ativação do

inflamassoma, um complexo proteico composto por um sensor intracelular que tipicamente é

um receptor do tipo NOD (NLR), pró-caspase-1 e molécula adaptadora ASC (Martinon e cols.,

2009; Wen e cols., 2012). O NLRP3, um dos tipos de inflamassomas, vem sendo amplamente

estudado devido à sua associação com doenças inflamatórias crônicas, como gota, doença de

Alzheimer e diabetes tipo II, além de aterosclerose (Wen e cols., 2012).

Dado às suas características, sugere-se que o NLRP3 seja um sensor de dano

(Mariathasan e cols., 2007) responsável pelo reconhecimento de micro-organismos e

perturbações nas membranas de células da resposta imune inata (Mariathasan e cols., 2007;

Chen e cols., 2009). Pouco se sabe sobre os mecanismos que levam a geração do inflamassoma.

O que a literatura nos demonstra é que sua montagem é dependente não somente o efluxo de

potássio (K+) (Franchi e cols., 2007; Hornung, e cols., 2008), mas também da ativação de pró-

caspase 1 em caspase-1 (Piccini e cols., 2008). Uma vez ativada, a caspase-1 é capaz de clivar

a pró-IL-1β (14-KDa) em sua forma biologicamente ativa/madura, IL-1β (17-KDa)

(Fettelschoss e cols., 2011).

Além disso, o mecanismo necessário para levar à ativação do NLRP3 ainda não está

claro, e por se tratar de uma molécula com estrutura complexa, pouco se espera que a via para

ativação do inflamassoma dependa de apenas um estímulo e que ocorra de forma direta

(Netea e cols., 2010). Petrilli e cols. (2007) acreditam que atividades intracelulares, como

indução de hipocalemia e espécies reativas de oxigênio (Zhou e cols., 2011) possam ativar

indiretamente o inflamassoma (Petrilli e cols., 2007). Muñoz-Planillo e cols. (2013) avaliam

que sua ativação possa ocorrer por efluxo de K+. No entanto, tratando-se da via de ativação para

formação e liberação de IL-1β, células tratadas exclusivamente com ATP, são descritas como

sendo incapazes de ativar a caspase-1, sendo necessária a adição prévia de lipopolissacarídeo

(LPS) para indução da ativação do inflamassoma e liberação da citocina (Netea e cols.,

2010). Nesta linha, a indução de NF-kB dependente de transcrição de NLRP3 por ligantes de

receptores Toll-like (TLR) ou citocinas pró-inflamatórias demonstram ser de grande valia para

que a célula inicie a ativação do inflamassoma, antes da presença de ATP (Bauernfeind e cols.,

2009). Não obstante, a participação de canais de panexina-1 para formação de poros é um

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mecanismo que propicia mecanismos indutores da ativação do inflamassoma no citoplasma,

como por exemplo produtos microbianos (Kanneganti e cols., 2007).

As citocinas da família IL-1, à qual a citocina IL-1β pertence, inclui ainda mais 6

ligantes com atividade agonista (IL-1α, IL-18, IL-33, IL-36a, β, γ), três antagonistas dos

receptores (IL-1Ra, IL-36Ra, IL-38) e uma citocina anti-inflamatória (IL-37). Elas estão entre

os mais potentes iniciadores de inflamação e estão amplamente envolvidas em respostas

protetoras contra infecções virais, fúngicas, bacterianas e parasitárias (Dinarello e cols., 2012).

Além disso, alguns estudos demonstram que contribuem para o desenvolvimento de processos

inflamatórios prejudiciais em doenças inflamatórias autoimunes, tais como artrite reumatoide e

diabetes tipo II (Van de Veerdonk e Netea, 2013). De modo geral, todas as células do sistema

imune inato expressam e/ ou são afetadas pelos membros da família IL-1, cuja atuação é

fundamental na diferenciação e função de células linfoides inatas e adaptativas polarizadas

(Garlanda e cols., 2013).

A IL-1β está entre os mais importantes marcadores de indução da resposta inflamatória

(Ferrero-Miliani e cols., 2006). Seus mecanismos de liberação incluem a exocitose de vesículas,

secreção por lisossomas, secreção por autofagia, e modelos não convencionais (não-

vesiculares) que incluem a secreção de proteínas através da membrana plasmática por

translocação direta ou por transportadores de membrana, além da liberação passiva durante a

lise celular (Dinarello e Wolff, 1993; Monteleone e cols., 2015).

IL-1β é produzida por células hematopoiéticas, como monócitos, macrófagos teciduais,

células dendríticas e micróglia cerebral em resposta a diversos estímulos, como infecções

(Petrilli e cols., 2007; Benko e cols., 2008), ativação de receptores do tipo Toll Like (TLR) e de

outras citocinas, tais como o TNF-α e a própria IL-1(Dinarello, 2006; Dinarello, 2011). É uma

citocina envolvida em diversos processos imunológicos, como na indução de mediadores

inatos, como proteínas de fase aguda (IL-6) e quimiocinas (CXCL8-IL-8) (Teixeira e cols.,

2006). Além disso, também tem sido apontada como um fator auxiliar na progressão de doenças

(Wen e cols., 2012).

2.5 Leishmanias e fatores de virulência

Parasitos do gênero Leishmania são intracelulares obrigatórios em hospedeiro

vertebrados, e são responsáveis pelo desenvolvimento da leishmaniose. Esta doença

caracteriza-se pela sua diversidade e complexidade, tanto em termos de distribuição geográfica,

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quanto em na sua variedade de síndromes clínicas, que vão desde lesões cutâneas localizadas

até formas viscerais graves (Sharma e Singh, 2009).

Estes parasitos dimórficos possuem um ciclo de vida heteroxênico, cuja forma de

transmissão ao hospedeiro vertebrado faz-se através da hematofagia de fêmeas de

flebotomíneos infectados e subsequente ação fagocítica por células do Sistema Mononuclear

Fagocitário (Silveira, 2008). Ao picar um hospedeiro vertebrado infectado, no momento do

repasto sanguíneo, a fêmea do vetor ingere células parasitadas com formas amastigotas do

hospedeiro vertebrado (Neves, 2004). No intestino do vetor, as células se rompem e as formas

amastigotas liberadas se diferenciam em formas promastigotas, as quais serão transmitidas para

um hospedeiro mamífero não infectado. Durante um novo repasto sanguíneo, a fêmea infectada

irá regurgitar, dentro da pele do hospedeiro vertebrado, as formas promastigotas e sua saliva

(Schlein e cols., 1992), que apresenta anticoagulantes, vasodilatadores (maxidilan) (Kamhawi,

2000), nucleotídeos e adenosina (Ribeiro e cols., 1999; Figueiredo e cols., 2016) que atuam

efetivamente no favorecimento da progressão da infecção (Charlab e cols., 1999). Isto pode ser

verificado emem camundongos que foram infectados com L. braziliensis, que dificilmente

infectam estes animais, mas na presença de saliva foi capaz de aumentar/progredir

significativamente a infecção (Lima e Titus, 1996). No hospedeiro vertebrado, essas formas

infectarão as células do sistema fagocítico, diferenciando-se em as amastigotas, forma

desprovida de flagelo aparente (Chang e cols., 1990). Essas formas amastigotas sobrevivem e

se replicam por divisão binária no ambiente ácido do fagolisossomo,e, assim os parasitos

liberados parasitarão novas células (Brittingham e Mosser, 1996).

Dentre as várias espécies conhecidas, destacamos a Leishmania amazonensis,

prevalente em inúmeras regiões do Brasil, cuja síndrome clínica comum são lesões cutâneas,

caracterizadas por serem limitadas, ulcerosas ou não, e lesões cutâneas difusa, caracterizadas

pela não ulceração e larga distribuição pelo corpo, em geral em indivíduos anérgicos e

Leishmania major, cuja infecção cutânea é caracterizada por ser limitada e controlada pelo

sistema imune (Grimaldi e Tesh, 1993).

De acordo com a literatura, muitos estudos indicam a importância de moléculas de

superfície do parasito Leishmania para a garantia da sua internalização e sobrevivência. Dentre

estas moléculas podemos destacar a GP63 e o lipofosfoglicano (LPG) (Brittingham e

cols.,1995). Além disso, nosso grupo tem demonstrado a importância da ENTPDase no

estabelecimento da infecção por Leishmania (Maoli e cols., 2004; Marques-da-Silva e

cols.,2008; De Souza e cols., 2010; Gomes e cols., 2015).

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A infecção por Leishmania é capaz de liberar ATPe, principalmente pelo rompimento

de macrófagos parasitados, rompimento de barreiras físicas, etc. Assim como as células,

protozoários também são passíveis de possuir ENTPDases em sua superfície. Estas enzimas,

como já mencionado, auxiliam na redução da concentração do ATP extracelular (pró-

inflamatório), fato que nos chama atenção, uma vez que, a ENTPDase de Leishmania pode,

deste modo, alterar a resposta imune (Langston e cols., 2003). Recentes estudos demonstram

um papel especial das ENTPDases como fatores de virulência de agentes patogênicos, incluindo

parasitos. Essa correlação foi bem evidenciada por trabalhos com Toxoplasma gondii

(Silverman e cols., 1998), Legionela pneumophila (Sansom e cols., 2007), Trypanosoma cruzi

(Bisaggio e cols, 2003; Fietto e cols., 2004; Meyer-Fernandes e cols., 2004; Santos e cols.,

2008) e Leishmania (Maioli e cols., 2004; Marques-da-Silva e cols., 2008; Gomes e cols., 2015)

e de outros protozoários (Meyer-Fernandes, 2002).

2.6 Resposta imune frente à infecção por Leishmania

Levando em consideração a ação inicial do sistema imunológico, temos que o primeiro

infiltrado inflamatório é caracterizado pela presença de neutrófilos (Mócsai, 2013), que são

responsáveis por destruírem os parasitos após sua fagocitose e promover o recrutamento de

novos neutrófilos, mediante a produção de IL-8 e de macrófagos e monócitos através da

produção de MIP-1α e MIP-1β (Awasthi e cols., 2004). Estudos relatam ação contraditória de

defesa por neutrófilos frente à infecção, uma vez que, ele pode atuar tanto no combate como na

permanência do parasito (Aga e cols., 2002; Afonso e cols., 2008; Ribeiro-Gomes e cols.,

2012).

Sabe-se que a interação inicial de formas promastigotas dos parasitos do gênero

Leishmania com macrófagos, sua principal célula hospedeira, é crucial para o estabelecimento

da infecção no hospedeiro, assim como a ligação de amastigotas com outros macrófagos é

necessária para a sobrevivência do parasito e consequente desenvolvimento da patogênese

(Alexander e Russel, 1992). Assim temos que, os macrófagos podem controlar a infecção

através de mecanismos que envolvem a produção de IL-12, que por sua vez estimula linfócitos

e células NK a produzirem IFN-γ, que em sinergismo com TNF agem na estimulação dos

próprios macrófagos favorecendo a produção de intermediários reativos de oxigênio, que são

substâncias alvos para a eliminação do parasito (Kane e Mosser, 2000). Além disso, os

macrófagos quando ativados podem produzir óxido nítrico (NO), através da enzima óxido

nítrico sintase induzível (iNOS), e também intermediários reativos de oxigênio (ROS) pela

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oxidase fagocitária, que são substâncias tóxicas para o parasito (Liew e cols., 1990; Murray,

1982; Abbas, 2008).

No entanto, a interação Leishmania-macrófagos promove a ausência de uma resposta

pró-inflamatória e consequente inibição do processo de produção dos componentes tóxicos

necessários para a eliminação dos parasitos, que acabam por entrar de forma silenciosa nos

macrófagos (Lodge e Descoteaux, 2005; Mosser e cols., 1996). Este fato pode se relacionar à

presença de moléculas de superfície da Leishmania, como gp63, que é capaz de se ligar a vários

receptores de macrófagos, como MAC-1 e CR3 (Brittingham e cols., 1999) e LPG, que podem

interagir não somente com receptores p150/95 e CR3, mas também promover a inibição da

fusão do fagossomo ao lisossomo e favorecer a sobrevivência do parasito (Desjardins e cols.,

1997).

Outras células importantes são os linfócitos. A resposta de linfócitos específicos para

Leishmanias é dependente da espécie e das características do hospedeiro. Assim, mediante a

infecção, linfócitos T CD4+ são ativados e podem se diferenciar em células do tipo Th1,

caracterizadas pela produção de citocinas inflamatórias, como IFN-γ e TNF-α, que contribuem

para controle do parasito. Células Th2 são caracterizadas por produzirem e liberarem citocinas

como IL-4, IL-5 e IL-13. A classe de linfócitos T CD8+ também está envolvida no controle da

infecção, que ocorre através da produção de IFN-γ, que também pode ser produzida por células

NK (Mougneau e cols., 2011).

2.7 Leishmania, células dendríticas e sinalização purinérgica

A montagem de uma resposta imune efetiva nos vertebrados é também dependente das

células dendríticas (DC), uma classe de células derivadas da medula óssea encontradas no

sangue, epitélios e tecidos linfoides. De modo geral, as DCs trabalham como sentinelas,

apresentando sensores moleculares e uma maquinaria de processamento de antígenos de suma

importância para reconhecer patógenos, integrar informações químicas e orientar a

especificidade, a magnitude e a polaridade das respostas imunes subsequentes (Steinman, e

cols., 2003; Collin e cols., 2013)

Nos tecidos linfoides, as DC promovem o processamento de antígenos e a apresentação

dos peptídeos extracelulares, via MHC II, e intracelulares através de MHCI, que são

fundamentais para a atividade de linfócitos (Coquerelle e Moser, 2010). Estas células são

capazes, ainda, de secretar citocinascomo IL-12 que podem contribuir para a polarização dos

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linfócitos de fenótipo Th1 e, assim, promover a montagem de uma resposta pró-inflamatória

(Maldonado-López e Moser, 2001).

Durante a infecção por Leishmania células dendríticas podem apresentar alteração na

expressão de importantes marcadores de superfície, como é o caso da infecção por Leishmania

amazonensis que é capaz de modular a expressão de MHCII, CD80, CD86, CD40, a produção

de IL-10 e de IL-12 (Qi e cols., 2001; Prina e cols., 2004; Favali e cols., 2007; Figueiredo e

cols., 2012). Além disso, Hermida e cols. (2014) demonstraram que esta espécie pode prejudicar

a migração de células dendríticas do sítio inflamatório para o linfonodo drenante e assim

impedir as respostas imunes subsequentes.

Embora muitos estudos sejam realizados, pouco se conhece sobre os mecanismos pelos

quais estão envolvidos na modulação da resposta imune frente a interação Leishmania e célula

dendríticas.

Nosso laboratório tem trabalhado e demonstrado a evidência de que Leishmania com

diferentes expressões e atividades de ectonucleotidases são capazes de subverter a resposta

imune celular mediante à hidrólise de ATP para geração de adenosina. Nesse sentido,

demonstramos que Leishmania amazonensis apresenta maior atividade ectonucleotidásica que

a Leishmania braziliensis e a Leishmania major (Marques-da-Silva e cols.,2008). Em

camundongos C57BL/6, a infecção por L. amazonensis leva ao desenvolvimento de lesões

crônicas que não se curam espontaneamente. Ao contrário, a infecção por L. braziliensis ou L.

major, neste modelo, leva ao desenvolvimento de lesões menores e com cura espontânea

(Maioli e cols., 2004; Marques-da-Silva e cols.,2008).

Além disso, demonstramos que a diminuição da atividade ectonucleotidásica acarreta

diminuição da capacidade infectante desses parasitos (Gomes e cols., 2015). A relação entre o

nível de atividade ectonucleotidásica e a capacidade infectante desses parasitos parece ser

determinada pela produção de adenosina no meio extracelular, já que a adição desta substância

no momento da infecção por L. amazonensis promove uma redução na sua capacidade de

hidrolisar nucleotídeos, tornando-os menos virulentos in vivo (Souza e cols., 2010). Ainda,

demonstramos que a infecção por L. amazonensis prejudica ativação de DC (diminuição da

expressão de MHCII, CD86 e CD40) e posterior desencadeamento de uma resposta celular

específica, cujo efeito foi dependente de ectonucleotidases e da ativação do receptor A2b, fato

que não foi encontrado para as espécies L. braziliensis e L. major (Figueiredo e cols., 2012).

A partir destes trabalhos, surgiu a hipótese de avaliar se Leishmanias com diferentes

atividades de ectonucleotidases são capazes de modular a resposta de células dendríticas frente

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a produção e liberação de IL-1β, uma importante citocina inflamatória resultante do processo

de formação e ativação de inflamassomas e que vem sendo amplamente estudada, como já

explicado anteriormente.

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3. Justificativa

Sabe-se da importância do conhecimento dos marcadores de virulência no entendimento

dos mecanismos imunoparasitológicos da infecção por parasitos do gênero Leishmania e no

consequente desenvolvimento de vacinas e estratégias diagnósticas. Trabalhos do nosso grupo

já demostraram a importância das E-NTPDases de promastigotas de Leishmania na modulação

da resposta imune celular pela ação dessas enzimas na degradação de ATP e o acúmulo de

AMP, que pode ser degradado pela 5’-nucleotidase, levando à geração de adenosina. Assim,

torna-se necessário o conhecimento de novos mecanismos envolvidos na modulação da resposta

imune perante a relevância das E-NTPDases de parasitos do gênero Leishmania neste processo.

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4. Objetivos

4.2 Objetivo Geral:

Avaliar se Leishmania com variações na atividade ENTPDase são capazes de

modular a produção de IL-1β por células dendríticas.

4.3 Objetivos Específicos:

4.3.1 Verificar se a liberação de IL-1β é dependente da atividade de ENTPDase de

Leishmanias;

4.3.2 Analisar se Leishmanias tratadas com DIDS ou adenina são capazes de induzir a

liberação de IL-1β;

4.3.3 Analisar a participação do receptor P2X7 na liberação de IL-1β por células

dendríticas infectadas ou não;

4.3.4 Avaliar participação de receptores de adenosina A2A e A2B durante o processo de

produção de IL-1β em células dendríticas infectadas por Leishmania.

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5. Material e Métodos

5.1 Cultivo celular

Células dendríticas foram diferenciadas a partir de células da medula óssea (BOLTZ –

NITULESCU e cols 1987; LUTZ e cols.,1999). Fêmures e tíbias foram obtidos de camundongo

C57BL/6, por lavagem com seringa e agulha 30G, sendo imersos em álcool 70°GL por 2

minutos, seguidos por imersão em PBS/5% SFB, pH7,2. A suspensão de células foi

centrifugada a 210xg/4°C/10minutos e as células foram ressuspensas em meio RPMI (Sigma-

Aldritch) suplementado com 10% de SFB (SFB – Cultilab, Campinas, SP, Brasil), L-glutamina

2mM (Sigma –Aldritch), penicilina G 100U/ml (Sigma –Aldritch), bicarbonato de sódio e

mercaptoetanol (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suécia) 50μM, pH 7,2. As células foram

plaqueadas em placas de Petri a uma concentração de 3x106células/ml e incubadas a 37°C/5%

CO2. O fator de diferenciação celular, GM-CSF (ImmunoTools), foi adicionado nos dias 0, 3,

6 e 8, a uma concentração de 4ng/ml. No 9º dia células não aderentes foram coletadas para fins

experimentais. Os procedimentos adotados neste estudo foram aprovados pela Comissão de

Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP) pelos

números de protocolos 2012/02 e 2013/51.

5.2 Parasitos

Formas promastigotas da cepa MHOM/IL/80/Friedlin Leishmania (Leishmania) major e

formas promastigotas da cepa IFLA/BR/67/PH8 Leishmania (Leishmania) amazonensis foram

cultivadas à 25ºC, em meio de Grace (Sigma Aldrich, Inc, St. Louis, MO, USA) suplementado

com 10% de soro fetal bovino inativado (SFB – Cultilab, Campinas, SP, Brasil), L-glutamina

2mM (Sigma Aldritch) e penicilina G 100 U/ml (Sigma Aldritch), em pH 6,5. Promastigotas

metacíclicas foram enriquecidas a partir de parasitos em fase estacionária (5º dia de

crescimento) por centrifugação em gradiente de Ficoll. Assim, os parasitos foram lavados duas

vezes com salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, a 1540 x g/ 4°C/ 10 minutos e o

precipitado foi ressuspenso em meio DMEM (Sigma-Aldrich), pH 7,2 e posteriormente

sobreposto em Ficoll 400 (Sigma Aldrich) 10%. A preparação foi centrifugada a 1070 x g/

25°C/ 15 minutos. Posteriormente, parte do sobrenadante enriquecido de promastigotas

metacíclicos foi retirado e os parasitos novamente lavados para fins experimentais, conforme

descrito por Marques-da-Silva e cols. (2008).

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5.3 Avaliação da atividade enzimática por hidrólise de nucleotídeos

A avaliação da capacidade de hidrólise de nucleotídeos por L. amazonensis e L. major foi

realizada por método colorimétrico de dosagem de fosfato inorgânico liberado pela incubação

dos parasitos com ATP, ADP ou AMP. Este método tem como procedimento a incubação dos

parasitos íntegros durante 1 hora a 30ºC em tampão de reação contendo os seguintes reagentes:

NaCl 116 mM, KCl 5,4 mM, 5,5 mM de D-glicose, 5 mM de MgCl2 e com 50 mM de tampão

Hepes-Tris, na presença de 5mM de ATP, ADP ou AMP (Sigma Aldrich) (Bisaggio e

cols.,2003). O processo reativo se inicia com a adição das formas promastigotas vivas em fase

estacionária e tem sua paralisação através da adição de HCl 0,2 M (Fietto e cols., 2004). Para

fins de determinação da hidrólise inespecífica, e, portanto, obter um grupo controle, os parasitos

foram adicionados depois que a reação foi interrompida. Após interrupção da reação, a

suspensão de parasitos foi submetida à centrifugação que possibilitou sua sedimentação, e

permitiu a partir de alíquotas do sobrenadante a medição do fosfato inorgânico liberado (Pi)

(Ekman e Jager, 1993).

5.4 Infecção de células dendríticas in vitro e ativação da via de IL-1β

Células dendríticas viáveis (avaliação por azul de trypan) foram plaqueadas em placas de

24 poços contendo lamínulas circulares (tratadas com poli-L-lisina (10μg/ml) em tampão borato

(0,1 M) para aderência celular) a uma concentração de 106células/ml e foram previamente

tratadas com lipopolissacarídeo (Sigma- aldrich) para sua ativação, a uma concentração de

50ng/ml por um período de 5h. Após este estágio as células foram lavadas 2 vezes no próprio

meio, pH 7,2. Em seguida, formas promastigotas metacíclicas foram co-incubadas com células

dendríticas na proporção de 3 parasitos por célula, a 33ºC/5% CO2, por 3h e 3h à 37ºC/5%CO2

na presença de 1mM de ATP (Sigma.Aldrich). Após 6h finais de tratamento e infecção o

sobrenadante da cultura foi coletado.

Em alguns experimentos, células dendríticas foram previamente incubadas com inibidor

do receptor de P2X7 (A740003) a uma concentração 50nM por 30 minutos antecedentes à

infecção. Em outros experimentos antagonistas de receptores de adenosina A2A e A2B,

SCH58261 e MRS1754, respectivamente, foram adicionados 30 minutos antes da infecção por

Leishmania a uma concentração de 5μM. Ambos, SCH58261 e MRS1754, foram diluídos em

dimetilsufóxido, que também foi adicionado aos grupos controle.

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29

5.5 Determinação da produção de IL-1β

Os sobrenadantes das culturas de células dendríticas foram coletados após 6 horas de

tratamento e infecção e os níveis de IL-1β foram dosados por ELISA utilizando um kit para

ensaio em sanduíche conforme as instruções do fabricante (BD Biosciences).

5.6 Análise estatística

Os dados foram submetidos à análise estatística por test t de Student ou ANOVA One-Way

seguida de pós-teste de Tukey com o auxílio do programa Prism 5.0 (GraphPad Software, La

Jolla, CA, EUA). Valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente

significantes.

Page 30: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

30

6. Apresentação de Resultados e Discussão

6.1 Atividade ectonucleotidásicade: Leishmania amazonensis e Leishmania

major

Nosso grupo tem trabalhado e demonstrado a evidência de que parasitos com diferentes

expressões e atividades de ectonucleotidases são capazes de modular diferentemente a resposta

imune celular em função da hidrólise de ATP (Marques-da-Silva e cols., 2008; Gomes e cols.;

2015). A fim de verificar se promastigotas metacíclicas de Leishmania amazonensis e

Leishmania major apresentam diferentes atividades enzimáticas, submetemos estas espécies a

um ensaio de atividade ectonucleotidásica, e os seus resultados estão apresentados na Figura

1.

Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero Leishmania. Promastigotas

metacíclicas da cepa de Leishmania amazonensis (PH8) e Leishmania major (Friedlin) foram cultivados por 5 dias

em meio suplementado, centrifugados e incubados com ATP, ADP ou AMP por 1 hora a 30ºC. A atividade

ectonucleotidásica foi avaliada pela quantidade de fosfato inorgânico liberado. Os dados apresentados referem-se

a média e desvio-padrão de três repetições independentes. Análise estatística realizada por One-Way ANOVA,

seguido de teste Tukey em comparação ao grupo controle. NS: não significativo.

Nossos dados demonstram que L. amazonensis e L. major apresentam atividade

enzimática semelhante para todos os nucleotídeos avaliados (Figura 1). Diferente do que

Marques-da-Silva e cols. (2008) demonstraram, a atividade ectonucleotidásica de L.

amazonensis não foi maior do que a de L. major, para nenhum dos nucleotídeos avaliados.

As informações contidas na literatura sugerem que as ectonucleotidases sejam

importantes fatores de virulência, uma vez que podem favorecer o estabelecimento de infecções

através da inativação de possíveis respostas protetoras do hospedeiro, por meio da utilização de

Page 31: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

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nucleotídeos (Fietto e cols., 2004). No entanto, a manutenção dos parasitos em meio de cultura

pode interferir na atividade ectonucleotidásica e consequente virulência. Meyer-Fernandes e

cols. (2002) relataram que a atividade ecto-ATPásica de um isolado primário de Trichomonas

vaginalis foi cerca de 3 vezes mais elevada que a verificada em um isolado mantido in vitro por

muitos anos. De Souza e cols. (2010) avaliaram que cepas de L. amazonensis cultivadas por

longos períodos são passíveis de alterar sua atividade enzimática.

Entretanto, nosso resultado não interfere na condução deste trabalho, uma vez que, foi

avaliada a influência da atividade enzimática de Leishmania e não a resposta espécie-

dependente.

6.2 Parasitos do gênero Leishmania são capazes de induzir a liberação de IL-1β por

células dendríticas tratadas com LPS e ATP.

A liberação de IL-1β in vitro é classicamente avaliada através da estimulação de células

com ligantes dos receptores do tipo Toll (TLR), como o LPS, que favorece a tradução da

proteína pró-IL-1β e, também, a ativação do receptor P2X7 pela molécula de ATP, que leva a

clivagem da pró-IL-1β e a liberação da sua forma madura (Perregaux e cols., 1992; Netea e

cols., 2010). Considerando que alguns trabalhos já conseguiram ativar a via de secreção de IL-

1β apenas pelo pré-tratamento das células com LPS (Lima –Júnior e cols., 2013; Charmoy e

cols., 2016) e posteriormente infectando-as, decidimos criar um modelo que fosse coerente com

os dados da literatura (Figura 2).

Podemos observar, conforme a Figura 2A, que o prévio tratamento de células

dendríticas por 5 horas com LPS (50ng/ml), e posterior infecção com L. amazonensis e L. major

não foi suficiente para induzir a liberação de IL-1β. Acreditamos, que a necessidade de altas

concentrações de ATP para ativar o receptor P2X7, conforme a literatura nos informa (La Sala

e cols., 2003; Coddou e cols., 2011) possa ter influenciado na não indução da via de secreção

de IL-1β, conforme dados da Figura 2A. Não podemos deixar de citar, que no momento do

repasto sanguíneo o flebotomíneo além de inocular parasitos Leishmania sobre a pele do

hospedeiro, é capaz de regurgitar a sua microbiota intestinal, e ,assim favorecer não somente a

ativação do inflamassoma e a liberação de IL-1β, mas também a infiltração de neutrófilos no

local da infecção (Dey e cols., 2018). Em contrapartida, a figura 2B nos mostra que o tratamento

com ATPe (1mM) no momento da infecção induz uma liberação da citocina de forma

significante. Neste contexto, estudos sobre células dendríticas humanas revelaram que a IL-1β

pode ser liberada a partir destas células tanto por exocitose de lisossomas secretoras (Gardella

Page 32: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

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e cols., 2001), quanto por extravasamento de microvesículas da membrana plasmática

(Pizzirani e cols., 2007) após tratamento com ATP. Não sabemos ao certo o motivo para esta

liberação de IL-1β, mas alguns trabalhos com outras células, como neutrófilos (Joosten e cols.,

2009) e mastócitos (Mizutani e cols., 1991) já demonstraram que algumas proteases podem ter

papel fundamental na regulação da atividade de IL-1β, porém a proteólise nesses locais que

levam a ativação da IL-1β geram uma atividade muito mais fraca em comparação com a

ativação por caspase-1 (Black e cols., 1988; Hazuda e cols., 1990).

Figura 2: Liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas. (A) Células dendríticas foram cultivas em

meio suplementado e estimuladas por 5h com LPS (50ng/ml), lavadas e infectadas por promastigotas metacíclicas

de L. amazonensis e L. major na proporção de 3 parasitos para 1 célula por 6 horas. (B) Células dendríticas foram

cultivas em meio suplementado por 5h, lavadas e infectadas por L. amazonensis e L. major na proporção de 3

parasitos para 1 célula na presença de 1mM de ATP por 6 horas. Após este período o sobrenadante foi coletado

para dosagem de IL-1β por método de ELISA. Os dados apresentados referem-se a média e desvio-padrão de três

repetições independentes. Foi utilizado teste estatístico One-Way ANOVA, seguido de teste Tukey em

comparação ao grupo controle, *p˂0,05.

A

Page 33: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

33

A partir destes resultados e considerando a via clássica de liberação de IL-1β, decidimos

para os ensaios subsequentes estimular as células dendríticas tanto com LPS quanto com ATP.

Temos o conhecimento de que o processo de infecção celular por Leishmania pode

promover o enriquecimento do meio extracelular com moléculas do interior das células, como

o extravasamento ATP. Esta molécula de ATP, uma vez no meio extracelular, pode ser

hidrolisada pelas ENTPDase de parasitos do gênero Leishmania e, consequentemente, gerar

adenosina, uma molécula anti-inflamatória e que poderia funcionar como uma molécula

reguladora da resposta imune em favor da infecção. A partir destas informações, decidimos

verificar se a atividade ectonucleotidásica de Leishmania estaria correlacionada com um

aumento na liberação de IL-1β pelas células dendríticas infectadas. Para isto, as promastigotas

metacíclicas de L. amazonensis e L. major foram direcionadas tanto para infecção em células

dendríticas, previamente tratadas com LPS e posteriormente com ATPe, como também para o

ensaio de atividade ectonucleotidásica.

Nossos resultados, conforme apresentado na Figura 3, demonstram que L. amazonensis

e L. major são capazes de induzir a liberação de IL-1β através da hidrólise de nucleotídeos.

Assim, verifica-se que houve correlação entre a hidrólise de ATP e ADP com a liberação de

IL-1β por DC infectadas, tanto por L. amazonensis, como por L. major, uma vez que foram

encontrados valores de r2=0,8581 e valor de p 0,0079; r2=0,6483 e valor de p=0,0532,

respectivamente. Não foram encontradas correlações significativas para a hidrólise de AMP e

produção da citocina IL-1β. Perfil semelhante foi encontrado para células dendríticas infectadas

e tratadas apenas com ATP (dados não mostrados).

Page 34: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

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Figura 3: Correlação de atividade ectonucleotidásica e liberação de IL-1β após tratamento com LPS+ATP.

Células dendríticas foram cultivas em meio suplementado e estimuladas por 5h com LPS (50ng/ml), lavadas e

infectadas por promastigotas metacíclicas L. amazonensis e L. major na proporção de 3 parasitos para 1 célula na

presença de 1mM de ATP por 3 horas à 33°C e 3 horas à 37°C. Após este período o sobrenadante foi coletado

para dosagem de IL-1β por método de ELISA. A atividade enzimática foi analisada por liberação de fosfato após

incubação dos parasitos por 1h na presença de ATP, ADP e AMP. Os dados apresentados são referentes a três

repetições independentes. Valores de r2 e p foram obtidos por análise por regressão linear considerando valores

estatisticamente significantes quando p<0,05.

Considerando que tanto L. amazonensis quanto L. major foram capazes de induzir a

liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas, decidimos avaliar se a IL-1β liberada

poderia auxiliar no controle da infecção por estes parasitos, uma vez que é considerada uma

citocina pró-inflamatória. Observamos, como apresentado na Figura 4 que mesmo diante da

produção desta citocina não houve redução da infecção celular. O número de amastigotas por

células infectadas também não se alterou (dados não mostrados).

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Assim temos que, apesar da IL-1β ser considerada uma citocina pró-inflamatória, apenas

sua presença não é suficiente para promover a redução da infecção em DC infectadas por

Leishmania. Este fato não nos surpreende, visto que uma de suas atribuições estaria relacionada

com o recrutamento celular, como de macrófagos (Rider e cols., 2011).

Figura 4: Infecção de células dendríticas por L. amazonensis e L. major. Células dendríticas foram pré-tratadas

com LPS 50ng/ml por 5 horas, lavadas e infectadas com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e L. major

na presença de 1mM ATP durante 3 horas à 33° e posteriormente por 3h à 37°C. A porcentagem de células

infectadas foi avaliada por contagem em microscópio óptico. Os dados apresentados referem-se a média e desvio-

padrão de três repetições independentes. Foi utilizado teste estatístico One-Way ANOVA, seguido de teste Tukey.

Dado que a molécula de ATP é de grande importância para a liberação de IL-1β,

acreditávamos que a infecção poderia reduzir a liberação desta citocina, visto que, parasitos

Leishmania possuem em sua superfície ectonucleotidases que são capazes de hidrolisar o ATP

extracelular e, consequentemente gerar adenosina, que poderia influenciar na modulação

negativa da liberação da IL-1β. Entretanto, nossos resultados, de forma interessante, nos

revelam uma correlação positiva entre a hidrólise de nucleotídeos de ATP e ADP com a

liberação de IL-1β.

À princípio, não esperávamos encontrar relação entre a 5’-nucleotidase, através da

hidrólise de AMP e a liberação de IL-1β, uma vez que o mais importante seria justamente a

hidrólise da molécula de ATP para modular negativamente a liberação da IL-1β. Mas este fato

nos intriga, visto que um possível papel da molécula de adenosina, produto final da hidrólise

de ATP por ectonucleotidases de Leishmania, tem sido levantado como importante para

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sustentar a liberação de IL-1β (Ouyang e cols., 2013). Isto nos levou a verificar o papel da

adenosina em ensaios experimentais subsequentes.

Assim, a partir destes resultados conseguimos verificar que a infecção de células

dendríticas por Leishmania é capaz de induzir a produção de IL-1β. Na literatura, alguns

trabalhos também demonstraram que a infecção por estes parasitos é capaz de induzir a

liberação desta citocina, mas o papel desta citocina ainda é controverso. Charmoy e cols. (2016)

demonstraram que a liberação de IL-1β por macrófagos derivados de medula óssea infectados

por 6 horas e tratados com LPS (50ng/ml) é diretamente proporcional a quantidade de parasitos

de L. major isolado de pacientes com lesões crônicas. Além disso, revelam que em ensaios de

infecção in vivo em camundongos C57BL/6, a IL-1β esteja influenciando no recrutamento de

neutrófilos para o local da infecção, fato que desempenha um papel crucial no desenvolvimento

de uma forma não cicatrizante de leishmaniose cutânea em camundongos convencionalmente

resistentes. Neste contexto, Fernandéz-Figueroa e cols. (2012) demonstraram que um aumento

na produção in vitro de IL-1β por monócitos e uma expressão sérica aumentada desta citocina,

correlacionou-se com a gravidade da doença, por ser significativamente maior em pacientes

com leishmaniose cutânea difusa fortemente infectados com Leishmania mexicana. Por outro

lado, Xiu e cols. (2007), demonstram que células dendríticas tratadas com LPS (100ng/ml) e

infectadas por L. amazonensis e L. major são capazes de aumentar proporcionalmente a

liberação de IL-1β e esta liberação estaria induzindo maior expressão de CD40 e CD83,

importantes marcadores de ativação de células dendríticas. Não menos importante,

demonstraram que o tratamento de IL-1β em doses crescentes também é capaz de aumentar o

percentual de células dendríticas produtoras de IL-12p40. Além disso, Lima-Júnior e cols.

(2013) demonstraram que a infecção por L. amazonensis em macrófagos derivados de medula

óssea é capaz de induzir a produção e liberação de IL-1β por estas células. Além disso, relatam

a importância da ativação do inflamassoma NLRP3 e consequente ativação de caspase-1 para

favorecer liberação de IL-1β, que nesta infecção, é passível de promover a resistência à presença

de L. amazonensis através da produção de óxido nítrico.

Assim, tendo conhecimento que a ectonucleotidase de parasito possa estar envolvida no

processo de liberação de IL-1β, propomos inibir a atividade da enzima e verificar possíveis

modulações.

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6.3 A modulação da atividade enzimática de parasitos do gênero Leishmania

reduz a liberação de IL-1β

Considerando que a ectonucleotidase possa estar envolvida na liberação de IL-1β,

decidimos modular a atividade desta enzima e verificar possíveis modulações na liberação de

IL-1β por células dendríticas infectadas.

Tripanossomatídeos, como parasitos do gênero Leishmania, não fazem a síntese de novo

de nucleotídeo purínicos, e por isso dependem de ectonucleotidases para alimentar a via de

salvação de purinas (Carter e cols., 2008). Assim, quando são crescidos em meio contendo

adenina exógena são capazes de aumentar o crescimento e satisfazer os requisitos de purinas

para o seu desenvolvimento, reduzindo consequentemente sua atividade enzimática (Serafim e

cols., 2012; Gomes e cols., 2015). O tratamento com DIDS (4,40-diisothiocyanatostilbene 2,20-

disulfonic acid), um inibidor de ectonucleotidase, após a obtenção das formas promastigotas

metacíclicas, também é capaz de reduzir a atividade enzimática (Meyer-Fernandes e cols.,

1987; Berredo-Pinho e cols., 2001).

Assim, a fim de promover a modulação da atividade enzimática das espécies de

Leishmania, cultivamos as cepas em meio de cultura suplementado com 5mM de adenina por

5 dias ou inibimos diretamente a atividade da enzima por tratamento com 100μM de DIDS por

1 hora antecedente à infecção para posteriormente avaliar interferência na liberação de IL-1β.

Conforme dados da figura 5, tanto o tratamento com DIDS, como o tratamento com

adenina foram capazes de diminuir a liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas por

e L. major e estimuladas com LPS e ATP quando comparadas com o grupo apenas infectado e

estimulado. Mas para L. amazonensis não foi significativo.

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Figura 5: Liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas por L. amazonensis e L. major na presença

de inibidores de E-NTPDase. Células dendríticas foram pré-tratadas com LPS 50ng/ml por 5 horas, lavadas e

infectadas com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e L. major na presença ou ausência de DIDS 100μM

(por 1 hora) ou adenina 5mM (5 dias) e ATP 1mM durante 3 horas à 33°C e posteriormente por 3h à 37°C. A

produção de IL-1β foi avaliada por método de ELISA. Os dados apresentados referem-se a média e desvio-padrão

de três repetições independentes. Foi utilizado teste estatístico One-Way ANOVA, seguido de teste Tukey em

comparação ao grupo controle, *p˂0,05 e **p>0,01.

Interessantemente, nossos resultados sugerem que a atividade enzimática do parasito

seja importante para garantir a ativação da via de síntese de IL-1β, visto que a modulação da

atividade do parasito foi capaz de modular negativamente a liberação desta citocina.

Em seguida, avaliamos se a redução da atividade da enzima seria capaz de diminuir a

infecção em células dendríticas (Figura 6). Observamos que tanto o tratamento com DIDS,

como o com adenina também foram capazes de reduzir a taxa de infecção em células

dendríticas.

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Figura 6: Infecção de células dendríticas por L. amazonensis e L. major na presença de inibidores de E-

NTPDase. Células dendríticas foram pré-tratadas com LPS 50ng/ml por 5 horas, lavadas e infectadas com

promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e L. major na presença ou ausência de DIDS 100μM (por 1 hora),

cultivadas ou não com adenina (5mM) e ATP 1mM durante 3 horas à 33°C e posteriormente por 3h à 37°C. Os

dados apresentados referem-se a média e desvio-padrão de três repetições independentes. Foi utilizado teste t

student em relação ao grupo controle, *p˂0,05.

Nossos dados, ainda enfatizam a importância da ectonucleotidase de Leishmania na

capacidade de interação celular e consequente habilidade infecciosa e de sobrevivência. Em

macrófagos infectados houve uma redução da taxa de infecção frente a presença de parasitos

que apresentem baixa atividade enzimática ou que tenham sofrido modulação das enzimas

(Gomes e cols., 2015). Além disso, Pinheiro e cols. (2006) e Santos e cols. (2009)

demonstraram a relevância das ENTPDase de parasitos para processos de adesão e

internalização pela célula hospedeira.

Assim, considerando que a Leishmania é capaz de hidrolisar o ATP extracelular para

ter como produto final a adenosina, e que há uma correlação entre a hidrólise de nucleotídeos e

a liberação de IL-1β, conforme apresentado na Figura 3, decidimos avaliar a participação da

adenosina no processo de secreção de IL-1β, visto que alguns trabalhos já demonstraram sua

importância no processo de ativação do inflamassoma e, consequentemente indução da

liberação de IL-1β (Chiu e cols., 2014; Ouyang e cols., 2013).

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6.4 A adenosina é importante para promover a liberação de IL-1β por células

dendríticas infectadas

A produção de IL-1β é um passo central em uma ampla gama de respostas inflamatórias

(Ouyang e cols., 2013). Levando em consideração que a ENTPDase de Leishmania pode

hidrolisar ATP e, pela participação da 5’-nucleotidase, gerar adenosina, decidimos analisar se

células dendríticas seriam capazes de aumentar a produção de IL-1β frente a adição de NECA,

um análogo de adenosina.

Como esperado, células dendríticas tratadas apenas com NECA não são capazes de

induzir a liberação de IL-1β (Figura 7), visto que, como já citado na literatura, são necessários

2 sinais, LPS e ATP para o processamento e liberação desta citocina. Em contrapartida, células

dendríticas tradadas com NECA e LPS foram capazes de aumentar a produção de IL-1β em

relação ao grupo controle tratado apenas com LPS, o que sugere uma participação da adenosina

na indução da via de IL-1β. Diferente do que esperávamos, o tratamento de células dendríticas

com LPS+ATP+NECA não foi capaz de aumentar a liberação de IL-1β em relação ao seu grupo

controle. Nossos resultados demonstram que a adenosina possa ser importante na indução da

liberação de IL-1β.

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Figura 7: Células dendríticas tratadas com NECA são capazes de liberar IL-1β. Células dendríticas foram

pré-tratadas com LPS 50ng/ml por 5 horas, lavadas e/ ou tratadas com NECA 1μM e ATP 1mM por durante 3

horas à 33°C e posteriormente por 3h à 37°C. A produção de IL-1β foi avaliada por método de ELISA. Os dados

apresentados referem-se a média e desvio-padrão de três repetições independentes. Foi utilizado teste estatístico t

student, em comparação ao grupo controle, ***p˂0,0001.

Neste contexto, considerando que a infecção em células dendríticas por parasitos do

gênero Leishmania poderia atuar na modulação da produção de IL-1β pela produção de

adenosina, resolvemos avaliar por qual receptor a molécula de adenosina estaria atuando. Para

isto, cultivamos as células em meio contento inibidores dos receptores de adenosina, SCH

58261 (receptor A2A) e MRS 1754 (receptor A2B) (Figura 8).

Curiosamente, ambos tratamentos com inibidores de do receptor de adenosina foram

suficientes para reduzir significativamente a produção de IL-1β, tanto por grupos de células

dendríticas estimuladas não-infectadas, como por grupos estimulados- infectadas.

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Figura 8: A adenosina é importante para promover a liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas.

Células dendríticas foram pré-tratadas com LPS 50ng/ml por 5 horas. Posteriormente foram lavadas e tratadas 30

min antes da infecção com SCH 58261 (5μM) e MRS1754 (5μM). Foram infectadas com promastigotas

metacíclicas de L. amazonensis e L. major na presença de ATP 1mM durante 3 horas à 33°C e posteriormente por

3h à 37°C. A produção de IL-1β foi avaliada por método de ELISA. Os dados apresentados referem-se a média e

desvio-padrão de três repetições independentes. Foi utilizado teste estatístico One-Way ANOVA, seguido de teste

Tukey, ***p< 0,0001.

Curiosamente, nossos dados revelam uma nova função da molécula de adenosina no

processo de infecção por Leishmania e liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas.

Ao contrário do que imaginávamos, a adenosina, conhecida por suas propriedades anti-

inflamatórias, tem participação no aumento dos níveis da citocina pró-inflamatória IL-1β.

Apesar de não termos dados que confirmem esta hipótese, acreditamos que a adenosina esteja

sustentando a formação de um ambiente altamente inflamatório que favoreça o recrutamento

celular e replicação do parasito.

Nossos dados demonstram pela primeira vez que a infecção por L. amazonensis e L.

major são capazes de induzir a secreção de IL-1β através da influência da adenosina. Na

literatura, temos que Chiu e cols. (2014) avaliaram o papel da adenosina como uma possível

molécula indutora de comportamentos semelhantes a ansiedade, e demonstraram que a

adenosina ao se ligar no seu receptor é capaz de induzir a liberação de IL-1β por duplicar a

atividade de caspase-1 no cérebro de camundongos machos, através de uma via dependente de

canais de potássio sensível a ATP, proteína quinase A (PKA) e via receptor A2A de adenosina.

Ouyang e cols. (2013) demonstraram que a adenosina, apesar de não substituir os sinais

fornecidos por estímulos, tais como LPS ou ATP, possui capacidade de sustentar a atividade do

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inflamassoma através de uma via dependente de AMPc / PKA / CREB / HIF-1α, em macrófagos

peritoneais murinos.

Neste contexto, comparando com outros trabalhos que avaliam a participação da

adenosina, podemos verificar o envolvimento do receptor de adenosina A2B na modulação da

resposta imunológica em favor da instalação de um ambiente anti-inflamatório, que é capaz de

interferir negativamente na produção de óxido nítrico por macrófagos infectados por L.

amazonensis e reduzir a produção de IL-12, de forma a favorecer a permanência do parasito

(Gomes e cols., 2015). Além disso, em células dendríticas, a infecção por L. amazonensis inibe

a ativação destas células através do receptor de adenosina A2B, seguindo a cascata de

sinalização por AMPc, PI3K eERK1 /2 e impedindo, portanto, etapas subsequentes da resposta

imune para eliminação do parasito (Figueiredo e cols., 2017).

Assim, nos deparamos com situações diferentes, mas que demonstram um possível

papel da adenosina em favor do estabelecimento da infecção por parasitos do gênero

Leishmania.

6.5 A liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas é dependente do

receptor P2X7

O receptor P2X7 tem um papel importante na resposta inflamatória, uma vez que sua

ativação nas células do sistema imune (macrófagos, monócitos, células NK, linfócitos T e B e

também em células dendríticas (Mutini e cols., 1999; Gu e cols., 2001; Gu e cols., 2004)

funciona como um segundo sinal para a secreção da citocina IL-1β madura (Perregaux, 1994;

Ferrari, 1996; Sanz e Di Virgilio, 2000; Ferrari e cols., 2006).

Assim, considerando que a infecção por parasitos do gênero Leishmania é capaz de

induzir a liberação de ATP e também promover a hidrólise de ATP decidimos avaliar a

participação do receptor P2X7 (Figura 9).

Conforme apresentado na Figura 9, o tratamento de células dendríticas com o inibidor

do receptor P2X7 (A730004 a 50nM) foi capaz de modular negativamente a liberação da

citocina IL-1β por células tratadas e infectadas por L. amazonensis e L. major. Este resultado

sugere que é necessária a ativação do receptor P2X7, na presença de altas concentrações de

ATP, para a liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas por Leishmania. Além disso,

este resultado associado aos dados da Figura 7, nos permite levantar a hipótese de que o a baixa

indução da liberação de IL-1β por DC tratadas com LPS e NECA seja proveniente da não

ativação de P2X7, visto que não houve adição de ATP neste grupo.

Page 44: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

44

Figura 9: O receptor P2x7 possui papel na liberação de IL-1β por células dendríticas infectadas. Células

dendríticas foram pré-tratadas com LPS 50ng/ml por 5 horas, lavadas e tratadas com 50nM de A730004 por 30

minutos antes da infecção e mantidos por 6h. Posteriormente infectadas com promastigotas metacíclicas de L.

amazonensis e L. major na presença de ATP 1mM durante 3 horas à 33°C e posteriormente por 3h à 37°C. A

produção de IL-1β foi avaliada por método de ELISA. Os dados apresentados referem-se a média e desvio-padrão

de três repetições independentes. Foi utilizado teste estatístico One-Way ANOVA, seguido de teste Tukey em

comparação ao grupo controle, ***p˂0,0001.

Considerando a participação do receptor P2X7 no processo de liberação de IL-1β,

verificamos sua possível capacidade de favorecer a fagocitose, visto que ele tem sido descrito

como sendo importante para induzir a eliminação de alguns micro-organismos (Coutinho-Silva

e cols., 2003). Assim, avaliamos o percentual de células infectadas por contagem ao

microscópio óptico e verificamos que sua ativação não está envolvida com o aumento da

fagocitose em células dendríticas infectadas (Figura 10).

Em seguida decidimos avaliar se a ativação do receptor P2X7, em virtude da alta

concentração de ATPe, seria responsável por induzir a apoptose celular por aumentar a

permeabilização e formação de poros nas membranas celulares permitindo a passagem de

grandes moléculas e, subsequentemente favorecendo processos subsequentes de apoptose

celular (La Sala e cols., 2003; Donnelly –Roberts e Jarvis, 2007; Coddou e cols., 2011). Para

isto, uma contagem de células viáveis foi realizada por exclusão em azul de tripan (0,4%

Sigma). De acordo com a Figura 11 o tratamento com uma alta concentração de ATP não

interferiu no percentual de células viáveis nos grupos tratados com ATP ou LPS+ATP e/ou

infectados.

Page 45: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

45

Figura 10: Infecção de células dendríticas por L. amazonensis e L. major na presença de inibidores de P2X7.

Células dendríticas foram pré-tratadas com LPS 50ng/ml por 5 horas, lavadas e pré-tratadas com 50nM de

A730004. Posteriormente infectadas com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e L. major na presença

ou ausência de A730004 e ATP 1mM durante 3 horas à 33° e posteriormente por 3h à 37°C. Os dados apresentados

referem-se a média e desvio-padrão de três repetições independentes. Foi utilizado teste estatístico One-Way

ANOVA, seguido de teste Tukey.

Esta informação condiz com as análises realizadas por Coutinho-Silva e cols (1999) que

demonstraram que a incubação de células dendríticas com ATPe somente é capaz de mediar a

apoptose a partir de doses superiores a 2mM. Não menos importante, Moore e Gmatlashewski,

(1994) observaram que a infecção intracelular por Leishmania donovani em macrófagos

derivados de medula óssea é capaz de inibir a apoptose celular, fato que também poderia

justificar a manutenção da viabilidade celular.

Page 46: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

46

Figura 11: Viabilidade de células dendríticas. Células dendríticas foram pré-tratadas com LPS 50ng/ml por 5

horas, lavadas. Posteriormente infectadas com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e L. major na

presença de ATP 1mM durante 3 horas à 33° e por 3h à 37°C. A viabilidade celular foi avaliada por azul de tripan.

Os dados apresentados referem-se a média e desvio-padrão de três repetições independentes. Foi utilizado teste

estatístico One-Way ANOVA, seguido de teste Tukey.

De fato, nossos resultados enfatizam a importância do receptor P2X7 na secreção de IL-

β por células dendríticas infectadas por Leishmania A ativação do receptor P2X7 tem sido

relacionada com a eliminação de micro-organismos, como Mycobacterium tuberculosis em

macrófagos humanos (Kusner e Adams, 2000) e também de Chlamydia trachomatis em

macrófagos peritoneais murinos (Coutinho-Silva e cols., 2003) de forma dependente da

molécula de ATP. Além disso, Lees e cols. (2010) verificaram que a infecção por Toxoplasma

gondii em macrófagos derivados de camundongos knock-out para o receptor P2X7 (P2X7R-/-)

são incapazes de eliminar o parasito tão efetivamente quanto os macrófagos de camundongos

do tipo selvagem. Fato que não foi encontrado em nossos resultados através da análise da taxa

de infecção de células dendríticas (Figura 10) e que pode ser esclarecido pelo fato das células

dendríticas não terem função direta em promover a morte de micro-organismos.

O conjunto de dados obtidos nos permite propor, que o ATP extracelular seja importante

para inicializar a ativação da via de secreção de IL-1β, a partir da ativação do receptor P2X7, e

que a adenosina gerada a partir da hidrólise de ATP por ectonucleotidase de Leishmania seja

importante para sustentar a liberação desta citocina. Neste contexto, nossos dados demonstram

que a ENTPDase de Leishmania é uma enzima importante para favorecer a indução da liberação

de IL-1β, visto que, o bloqueio da atividade da ectonucleotidase e a tentativa de modulação da

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47

expressão da mesma são capazes não somente de reduzir a liberação de IL-1β por células

dendríticas infectadas, mas também interferir na capacidade destas células em internalizar estes

parasitos. Além disso, mostramos que a infecção por L. amazonensis e por L. major em células

dendríticas, previamente tratadas com LPS e ATP, é capaz de criar um ambiente inflamatório

a partir da produção de adenosina, que diferente do que esperávamos, contribui para a liberação

de IL-1β, uma citocina conhecida por suas propriedades pró-inflamatórias. Nossas perspectivas

são descobrir se a liberação de IL-1β está favorecendo o processo de recrutamento celular, como

de neutrófilos (Dey e cols., 2015) e assim influenciando na multiplicação dos parasitos em

novas células hospedeiras, visto que, naturalmente os parasitos replicam por divisão binária

dentro das células que se encontram, podendo promover o rompimento da membrana

plasmática destas e reinfectar a novas células.

Por fim enfatizamos a importância do conhecimento dos mecanismos moduladores da

resposta imune frente à instalação da Leishmaniose, que está fortemente correlacionada com

uma efetiva atuação da resposta imunológica montada pelo hospedeiro acometido.

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48

7. Conclusão

Os dados obtidos nos permitem demonstrar que tanto a infecção por L. amazonensis

como por L. major em células dendríticas são capazes de promover a liberação de IL-1βde

forma dependente da atividade ectonucleotidásica de Leishmania que auxilia na produção de

adenosina que atua via receptores A2A e A2B e também pelo receptor P2x7.

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49

8. Referências bibliográficos

ABBAS, Abul K; LICHTMAN Andrew H; PILLAI, Shiv. (2008) Imunologia Celular e

Molecular - Editora Elsevier - 6ª edição.

ABBRACCHIO M.P. & CERUTI S. (2007) P1 receptors and cytokine secretion. Purinergic

Signalling 3, 13-25.

AFONSO L et al CI. (2008) Interactions with apoptotic but not with necrotic neutrophils

increase parasite burden in human macrophages infected with Leishmania amazonensis.

J Leukoc Biol. Aug;84(2):389-96.

AGA E et al. (2002). Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by

the intracellular parasite Leishmania major. Journal of Immunology (Baltimore, Md:

1950);169:898–905.

ALEXANDER, J.; RUSSELL, D. G. (1992) The interaction of Leishmania species with

macrophages. Advan. Parasitol. 31, 175-254.

ANTONIOLI L, et al. (2014) Adenosine and inflammation: what's new on the horizon? Drug

Discov Today. Aug;19(8):1051-68. Epub 2014 Mar 6.

APTE, R. N. AND VORONOV, E. (2008). Is interleukin-1 a good or bad

‘guy’ in tumor immunobiology and immunotherapy? Immunol. Rev.

222:222.

AWASTHI A, MATHUR RK, SAHA B. (2004). Immune response to Leishmania infection.

The Indian Journal of Medical Research. ;119:238–258

BAUERNFEIND FG, HORVATH G, STUTZ A, ALNEMRI ES, MACDONALD K, et al

(2009) NF-kB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3

inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183: 787-79.

BENKO S, PHILPOTT D, GIRARDIN S. (2008). The microbial and danger signals that

activate Nod like receptors. Cytokine 43: 368–373.

BEN-SASSON, S. Z. et al (2009). IL-1 acts directly on CD4 T cells to enhance their

antigen-driven expansion and differentiation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106,

7119–7124.

BISAGGIO D.F., PERES-SAMPAIO C.E., MEYER-FERNANDES J.R. & SOUTO-

PADRON T. Ecto-ATPase activity on the surface of Trypanosoma cruzi and its possible

role in the parasite-host cell interaction. Parasitol.Res. 91, 273-282. (2003)

Page 50: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

50

BISWAS SK, LOPEZ-COLLAZO E. (2009) Endotoxin tolerance: new mechanisms,

molecules and clinical significance. Trends Immunol. 2009 Oct;30(10):475-87.

BLACK, R.A., KRONHEIM, S.R., CANTRELL, M., DEELEY, M.C., MARCH, C.J.,

PRICKETT, K.S., WIGNALL, J., CONLON, P.J., COSMAN, D., HOPP, T.P., ET AL. (1988).

Generation of biologically active interleukin-1 beta by proteolytic cleavage of the inactive

precursor. J. Biol. Chem. 263, 9437–9442.

BOURS MJ, DAGNELIE PC, GIULIANI AL, WESSELIUS A, DI VIRGILIO F (2011) P2

receptors and extracellular ATP: a novel homeostatic pathway in inflammation.

Front Biosci (Schol Ed) 3: 1443–1456. 235

BOURS, M.J.L. E.L.R. SWENNEN, F. DI VIRGILIO, B.N. CRONSTEIN, P.C.

(2006), DagnelieAdenosine 5'-triphosphate and adenosine as endogenous signaling

molecules in immunity and inflammation Pharmacol. Ther. 112 pp. 358-404.

BRITTINGHAM A & MOSSER D.M. (1996) Exploitation of the complement system by

Leishmania promastigotas. Parasitol Today 12. 444-447.

BRITTINGHAM A, MORRISON CJ, MCMASTER WR, MCGWIRE BS, CHANG

KP, MOSSER DM. (1995) Role of the Leishmania surface protease gp63 in complement

fixation, cell adhesion, and resistance to complement-mediated lysis. J Immunol. Sep 15;

155(6):3102-11.

BRITTINGHAM A., CHEN G., MCGWIRE B.S., CHANG K.P. e MOSSER D.M. (1999)

Interaction of Leishmania gp63 with cellular receptors for fibronectin. Infect.Immun. 67,

4477-4484.

BROWNE LE, JIANG LH, NORTH RA (2010) New structure enlivens interest in P2X

receptors. Trends Pharmacol Sci. ;31:229–237.

BURNSTOCK G, CAMPBELL G, SATCHELL D, SMYTHE A.(1970) Evidence that

adenosine triphosphate or a related nucleotide is the transmitter substance released by

non-adrenergic inhibitory nerves in the gut. Br J Pharmacol; 40:668–688.

BURNSTOCK G, KNIGHT GE.(2004) Cellular distribution and functions of P2 receptor

subtypes in different systems. Int Rev Cytol240:31–304.

BURNSTOCK G, SATCHELL DG, SMYTHE A. A (1972) Comparison of the excitatory

and inhibitory effects of nonadrenergic, non-cholinergic nerve stimulation and

exogenously applied ATP on a variety of smooth muscle preparations from different

vertebrate species. Br J Pharmacol; 46:234–242.

Page 51: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

51

BURNSTOCK G. (2003). Purinergic receptors in the nervous system Curr. Top. in

Membranes. Vol. 54. Purinergic Receptors and Signallinged. Schwiebert, E.M. pp. 307–

368.San Diego: Academic Press.

BURNSTOCK G. (2007) Physiology and pathophysiology of purinergic

neurotransmission. Physiol Rev. 87:659–797.

BURNSTOCK, G (2002) Purinergic signaling and vascular cell proliferation and death.

Arterioscler Thromb Vasc Biol 22:364–373.

BURNSTOCK, G. (2006). Purinergic signalling. British Journal of

Pharmacology, 147(Suppl 1).

CEKIC C, LINDEN J. (2016) Purinergic regulation of the immune system. Nat Ver

Immunol. 16(3):177–92.10.1038/nri.2016.4.

CHANG, KP; CHAUDHURI, G; FONG, D. (1990).Molecular determinants of Leishmania

virulence. Ann Rev Microbiol. 44, 499-529.

CHARLAB R, VALENZUELA JG, ROWTON ED, RIBEIRO JMC.(1999) Toward an

understanding of the biochemical and pharmacological complexity of the saliva of a

hematophagous sand fly Lutzomyia longipalpis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ;96:15155–

15160

CHARLAB, R; J.G. VALENZUELA, E.D. ROWTON, J.M.RIBEIRO. (1999)Toward an

understanding of the biochemical and pharmacological complexity of the saliva of a

hematophagous sand fly Lutzomyia longipalpis. Proc Natl Acad Sci USA, 96 , pp. 15155-

15160.

CHARLES A. DINARELLO, AND SHELDON M. WOLFF (1993) The Role of Interleukin-

1 in Disease N Engl J Med 328:106-113.

CHARMOY M, HURRELL BP, ROMANO A, LEE SH, RIBEIRO-GOMES F, RITEAU

N, MAYER-BARBER K, TACCHINI-COTTIER F, SACKS DL (2016) The Nlrp3

inflammasome, IL-1β, and neutrophil recruitment are required for susceptibility to a

nonhealing strain of Leishmania major in C57BL/6 mice. Eur J Immunol. Apr;46(4):897-

911.

CHEN, G., SHAW, M.H., KIM, Y.G. & NUNEZ, G. (2009) NOD-like receptors: role in

innate immunity and inflammatory disease. Annu. Rev. Pathol. 4, 365–398.

CHIAO CW, TOSTES RC, WEBB RC. (2008) P2X7 receptor activation amplifies

lipopolysaccharide-induced vascular hyporeactivity via interleukin-1 beta release. J

Pharmacol Exp Ther. Sep;326(3):864-70.

Page 52: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

52

CHIU GS, DARMODY PT, WALSH JP, MOON ML, KWAKWA KA, BRAY

JK, MCCUSKER RH, FREUND GG. (2014) Adenosine through the A2A adenosine

receptor increases IL-1β in the brain contributing to anxiety. Brain Behav

Immun. 2014 Oct;41:218-31.

CODDOU C., YAN Z., OBSIL T., HUIDOBRO-TORO J. P. AND STOJILKOVIC S. S.

(2011). Activation and regulation of purinergic P2X receptor channels. Pharmacol.

Rev. 63, 641-683.

COLLIN, M., MCGOVERN, N., & HANIFFA, M. (2013). Human dendritic cell

subsets. Immunology, 140(1), 22–30.

COQUERELLE C, MOSER M.. DC. (2010) DC subsets in positive and negative regulation

of immunity. Immunol Rev. Mar;234(1):317-34.

COUTINHO-SILVA R, et al. (2003). Inhibition of chlamydial infectious activity due to

P2X7 receptor-dependent phospholipase D activation. Immunity 19:403–412.

COUTINHO-SILVA R, PERSECHINI PM, BISAGGIO RD, PERFETTINI JL, NETO AC,

KANELLOPOULOS JM, MOTTALY I, DAUTRY-VARSAT A, OJCIUS DM (1999)

P2Z/P2X7 receptor-dependent apoptosis of dendritic cells. Am J Physiol 276: C1139-47.

COUTINHO-SILVA R, PERSECHINI PM. (1997) P2Z purinoceptor-associated pores

induced by extracellular ATP in macrophages and J774 cells Am J Physiol. 1997 Dec;273(6

Pt 1):C1793-800.

CUMBERBATCH,R.J. DEARMAN, R.W. GROVES, C. ANTONOPOULOS, I. KIMBER.

(2002) Differential regulation of epidermal Langerhans cell migration by interleukins

(IL)-1alpha and IL-1beta during irritant- and allergen-induced cutaneous immune

responses Toxicol Appl Pharmacol, 182 , pp. 126-135.

D.R. FREYER, L.A. BOXER, R.A. AXTELL, R.F. TODD Stimulation of human

neutrophil adhesive properties by adenine nucleotides J Immunol, 141 (2) (1988), pp. 580-

586

DA SILVA R, SACKS DL. (1987) Metacyclogenesis is a major determinant

of Leishmania promastigote virulence and attenuation. Infection & Immunity;55:2802–

2806.

DE SOUZA, E.A. DE ASSIS, R.S. GOMES, E.A. DE MARQUES DA

SILVA, M.N. MELO, J.L. FIETTO, L.C. AFONSO. (2010) The influence of

ectonucleotidases on Leishmania amazonensis infection and immune response in C57B/6

mice. Acta Tropica, 115, pp. 262-269.

Page 53: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

53

DESJARDINS M. & DESCOTEAUX A. (1997) Inhibition of phagolysosomal biogenesis by

the Leishmania lipophosphoglycan. J.Exp.Med. 185, 2061-2068.

DEY R, JOSHI AB, OLIVEIRA F, PEREIRA L, GUIMARÃES-COSTA AB, SERAFIM

TD, DE CASTRO W, COUTINHO-ABREU IV, BHATTACHARYA P, TOWNSEND

S, ASLAN H, PERKINS A, KARMAKAR S, ISMAIL N, KARETNICK M, MENESES

C, DUNCAN R, NAKHASI HL, VALENZUELA JG, KAMHAWI S (2018). Gut Microbes

Egested during Bites of Infected Sand Flies Augment Severity of Leishmaniasis via

Inflammasome-Derived IL-1β. Cell Host Microbe. Jan 10;23(1):134-143.e6.

DI VIRGILIO F. (2007). Liaisons dangereuses: P2X(7) and the inflammasome. Trends

Pharmacol. Sci.28 465–472.

DINARELLO CA, WOLFF SM (1993). The role of interleukin-1 in disease. N Engl J

Med;328:106–113.

DINARELLO CA. (2006) Interleukin 1 and interleukin 18 as mediators of inflammation

and the aging process. Am J Clin Nutr.Feb;83(2):447S-455S.

DINARELLO CA. (2011) Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory

Diseases. Blood.117:3720–3732.

DINARELLO, C. A (1996). Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood 87, 2095–2147.

DIVIRGILIO F., CHIOZZI P., FERRARI D., FALZONI S., SANZ J.M., MORELLI A.,

TORBOLI M., BOLOGNESI G., BARICORDI O.R. Nucleotide receptors: an emerging

family of regulatory molecules in blood cells. Blood. 2001;97:587–600.

DONNELLY-ROBERTS DL, JARVIS MF. (2007) Discovery of P2X7 receptor-selective

antagonists offers new insights into P2X7 receptor function and indicates a role in chronic

pain states. Br J Pharmacol. ;151:571–579.

DOSREIS, G.A. A.F. NOBREGA, R.P. (1986) Purinegic modulation of T-lymphocyte

activation: differential susceptibility of distinct activation steps and correlation with

intracellular 3′,5′-cyclic adenosine monophosphate accumulation. Cell

Immunol. Aug;101(1):213-31.

Page 54: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

54

FALKOFF RJ, MURAGUCHI A, HONG JX, BUTLER JL, DINARELLO CA, FAUCI AS.

(1983) The effects of interleukin 1 on human B cell activation and proliferation J

Immunol. Aug;131(2):801-5.

FAVALI C, TAVARES N, CLARENCIO J, BARRAL A, BARRAL-NETTO M, BRODSKYN

C. (2007) Leishmania amazonensis infection impairs differentiation and function of human

dendritic cells. J Leukoc Biol.82:1401–1406.

FERNÀNDEZ-FIGUEROA EA, RANGEL-ESCAREÑO C, ESPINOSA-MATEOS

V, CARRILLO-SÀNCHEZ K, SALAIZA-SUAZO N, CARRADA-FIGUEROA G, MARCH-

MIFSUT S, BECKER I. (2012) Disease severity in patients infected with Leishmania

mexicanarelates to IL-1β. PLoS Negl Trop Dis.

FERRARI D, CHIOZZI P, FALZONI S, DAL SM, MELCHIORRI L, BARICORDI OR, DI

VF.(1997) Extracellular ATP triggers IL-1 beta release by activating the purinergic P2Z

receptor of human macrophages. J Immunol159:1451–1458 .

FERRARI D, PIZZIRANI C, ADINOLFI E, LEMOLI RM, CURTI A, IDZKO M, PANTHER

E, DI VF.(2006) The P2X7 receptor: a key player in IL-1 processing and release. J Immunol

2006;176:3877–3883.

FERRARI, D., M. VILLALBA, P. CHIOZZI, S. FALZONI, P. RICCIARDI-CASTAGNOLI,

F. DI VIRGILIO. (1996) Mouse microglial cells express a plasma membrane pore gated by

extracellular ATP. J. Immunol. 156:1531.

FERRERO-MILIANI L, NIELSEN OH, ANDERSEN PS, GIRARDIN SE. (2007) Chronic

inflammation: importance of NOD2 and NALP3 in interleukin-1β generation. Clinical

and Experimental Immunology.;147(2):227-235.

FETTELSCHOSS, A., KISTOWSKA, M., LEIBUNDGUT-LANDMANN, S., BEER, H.-D.,

JOHANSEN, P., SENTI, G., … KÜNDIG, T. M. (2011). Inflammasome activation and IL-

1β target IL-1α for secretion as opposed to surface expression. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, 108(44), 18055–18060.

FIETTO J.L., DEMARCO R., NASCIMENTO I.P., CASTRO I.M., CARVALHOT.M., DE

S.W., Bahia M.T., Alves M.J. & Verjovski-Almeida S.(2004) Characterization and immune

localization of an NTP diphosphohydrolase of Trypanosoma cruzi. Biochem.

Biophys.Res.Commun. 316, 454-460.

Page 55: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

55

FIGUEIREDO AB, SOUZA-TESTASICCA MC, AFONSO LC. (2016)

Purinergic signaling and infection by Leishmania: A new approach to evasion of the

immune response. Biomed J. 2016 Aug;39(4):244-250Epub 2016 Sep 21. Review.

FIGUEIREDO AB, SERAFIM TD, MARQUES-DA-SILVA EA, MEYER-FERNANDES

JR, AFONSO LC.(2012) Leishmania amazonensis impairs DC function by inhibiting CD40

expression via A2B adenosine receptor activation Eur J Immunol. 2012 May;42(5):1203-15.

FRANCHI, L., KANNEGANTI, T.D., DUBYAK, G.R. & NUNEZ, G. (2007) Differential

requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by

intracellular and extracellular bacteria. J. Biol. Chem. 282, 18810–18818

FREDHOLM BB, IJZERMAN AP, JACOBSON KA, LINDEN J, MULLER CE.(2011)

International union of basic and clinical pharmacology. Nomenclature and classification

of adenosine receptors—an update. Pharmacol Rev;63:1e34.

G. BURNSTOCK, (1972) Purinergic nerves, Pharmacol. Rev. 24. 509–581.

GARDELLA,S.C; ANDREI, L.V. LOTTI, A. POGGI, M.R. TORRISI, M.R. ZOCCHI, A. R

UBARTELLI (2001) CD8+ T lymphocytes induce polarized exocytosis of secretory lysosomes by

dendritic cells with release of interleukin-1β and cathepsin D. Blood, 98, pp. 2152-2159

GARLANDA, C., DINARELLO, C. A., & MANTOVANI, A. (2013). The interleukin-1

family: back to the future. Immunity, 39(6), 1003–1018.

GOMES RS, DE CARVALHO LC, DE SOUZA VASCONCELLOS R, FIETTO

JL, AFONSO LC. (2015) ENTPDase(ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) of

Leishmania amazonensis inhibits macrophage activation. Microbes Infect. Apr;17(4):295-

303.

GRIMALDI G., JR. & TESH R.B. (1993) Leishmaniases of the New World: current

concepts and implications for future research. Clin.Microbiol.Rev. 6, 230-250.

GU BJ, SLUYTER R, SKARRATT KK, SHEMON AN, DAO-UNG LP, FULLER

SJ, BARDEN JA, CLARKE AL, PETROU S, WILEY JS. (2004) An Arg307 to Gln

polymorphism within the ATP-binding site causes loss of function of the human P2X7

receptor. J Biol Chem. Jul 23;279(30).

GU BJ, ZHANG W, WORTHINGTON RA, SLUYTER R, DAO-UNG P, PETROU

S, BARDEN JA, WILEY JS. (2001) A Glu-496 to Ala polymorphism leads to loss of

function of the human P2X7 receptor. J Biol Chem. Apr 6;276(14).

Page 56: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

56

GUERRA, A.N; FISETTE, L; PFEIFFER, Z.A.; QUINCHIA-RIOS, B.H ; PRABHU, U

; AGA, M et al. (2003) Purinergic receptor regulation of LPS-induced signaling and

pathophysiologyJ Endotoxin Res, 9 (4) (2003), pp. 256-263

HASKÓ, GYÖRGY, AND PÀL PACHER. (2008) “A2A Receptors in Inflammation and

Injury: Lessons Learned from Transgenic Animals.” Journal of leukocyte biology 83.3

447–455. PMC. Web. 23 Oct. 2017.

HAZUDA, D.J., STRICKLER, J., KUEPPERS, F., SIMON, P.L., AND YOUNG, P.R. (1990).

Processing of precursor interleukin 1 beta and inflammatory disease. J. Biol. Chem. 265,

6318–6322.

HERMIDA, M. D.; DORIA, P. G.; TAGUCHI, A. M.; MENGEL, J. O.; DOS-SANTOS,

W.(2014). Leishmania amazonensis infection impairs dendritic cell migration from the

inflammatory site to the draining lymph node. BMC.Infect.Dis., v. 14, n. 450.

HORNUNG, V. et al. (2008) Silica crystals and aluminum salts activate the NALP3

inflammasome through phagosomal destabilization. Nat. Immunol. 9, 847–856.

J Leukoc Biol, 60 (1) (1996), pp. 77-80

JOOSTEN, L.A., NETEA, M.G., FANTUZZI, G., KOENDERS, M.I., HELSEN, M.M.,

SPARRER, H., PHAM, C.T., VAN DER MEER, J.W., DINARELLO, C.A., AND VAN DEN

BERG, W.B. (2009). Inflammatory arthritis in caspase 1 gene-deficient mice: contribution

of proteinase 3 to caspase 1-independent production of bioactive interleukin- 1beta.

Arthritis Rheum. 60, 3651–3662.

JUNGER, W. G.( 2011) Immune cell regulation by autocrine purinergic signalling. Nature

Reviews Immunology, v.11, n.3, Mar.

KAMHAWI, S. (2000) The biological and immunomodulatory properties of sandfly saliva

and its role in the establishment of Leishmania infections. Microbes and Infection, 2, 1765–

1773.

KANE M.M. & MOSSER D.M. (2000) Leishmania parasites and their ploys to disrupt

macrophage activation. Curr.Opin.Hematol. 7, 26-31.

KANNEGANTI TD, LAMKANFI M, KIM YG, CHEN G, PARK JH, FRANCHI

L, VANDENABEELE P, NÚÑEZ G. (2007) Pannexin-1-mediated recognition of bacterial

molecules activates the cryopyrin inflammasome independent of Toll-like receptor

signaling. Immunity. Apr;26(4):433-43.

Page 57: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

57

KANNEGANTI TD1, LAMKANFI M, NÚÑEZ G. (2007) Intracellular NOD-like receptors

in host defense and disease. Immunity. Oct;27(4):549-59.

KHAKH B. S., NORTH R. A. (2012). Neuromodulation by extracellular ATP and P2X

receptors in the CNS. Neuron 76, 51–69.

KHAKH BS, NORTH RA. (2006) P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and

disease. Nature;442:527–532.

KIRLEY T.L., YANG F. & IVANENKOV V.V. (2001) Site-directed mutagenesis of human

nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 3: the importance of conserved glycine

residues and the identification of additional conserved protein motifs in eNTPDases. Arch

Biochem Biophys. 395, 94-102.

KUMAR V, SHARMA A (2009) Adenosine: an endogenous modulator of innate immune

system with therapeutic potential. Eur J Pharmacol. Aug 15;616(1-3):7-15.

KUSNER, D. J., AND J. ADAMS. (2000). ATP-induced killing of virulent Mycobacterium

tuberculosis within human macrophages requires phospholipase D. J. Immunol. 164:379-

388.

LA SALA A., FERRARI D., DI VIRGILIO F., IDZKO M., NORGAUER J., GIROLOMONI

G (2003). Alerting and tuning the immune response by extracellular nucleotides. J.

Leukoc. Biol. 2003;73:339–343.

LA SALA, A., FERRARI, D., CORINTI, S., CAVANI, A., DI VIRGILIO, F., GIROLOMONI,

G. (2001) Extracellular ATP induces a distorted maturation of dendritic cells and inhibits

their capacity to initiate Th1 responses. J. Immunol. 166, 1611–1617

LABASI JM, PETRUSHOVA N, DONOVAN C, MCCURDY S, LIRA P, PAYETTE MM,

ET AL.(2002) Absence of the P2X7 receptor alters leukocyte function and attenuates an

inflammatory response. J Immunol. ;168:6436–6445.

LALIBERTE, R. E., J. EGGLER, AND C. A. GABEL (1999) ATP treatment of human

monocytes promotes caspase-1 maturation and externalization. J. Biol. Chem.

274:36944

LANGSTON H.P., KE Y., GEWIRTZ A.T., DOMBROWSKI K.E. & KAPP J.A. (2003)

Secretion of IL-2 and IFN-gamma, but not IL-4, by antigens pecific T cells requires

extracellular ATP. J.Immunol. 170, 2962-2970.

Page 58: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

58

LEMAIRE,I; LEDUC,N. (2003) Purinergic P2X7 receptor function in lung alveolar

macrophages: pharmacologic characterization and bidirectional regulation by Th1 and

Th2 cytokines. Drug Dev Res, 59 (2003), pp. 118-127

LICHTMAN AH, CHIN J, SCHMIDT JA, ABBAS AK. (1988) Role of interleukin 1 in the

activation of T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. Dec;85(24):9699-703.

LIEW F.Y., MILLOTT S., PARKINSON C., PALMER R.M. & MONCADA S. (1990)

Macrophage killing of Leishmania parasite in vivo is mediated by nitric oxide from L-

arginine. J.Immunol. 144, 4794-4797.

LIMA HC, TITUS RG (1996). Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous

lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infect Immun

64: 5442-5445.

LIMA-JUNIOR DS, COSTA DL, CARREGARO V, CUNHA LD, SILVA AL, MINEO

TW, GUTIERREZ FR, BELLIO M, BORTOLUCI KR, FLAVELL RA, BOZZA MT, SILVA

JS, ZAMBONI DS (2013) Inflammasome-derived IL-1β production induces nitric oxide-

mediated resistance to Leishmania. Nat Med. Jul;19(7):909-15.

LIU J, YANG AR, KELLY T, PUCHE A, ESOGA C, JUNE HL, JR, et al. (2011) Binge

alcohol drinking is associated with GABAAα2-regulated Toll-like receptor 4 (TLR4)

expression in the central amygdala. Proc Natl Acad Sci USA.;108:4465–4470.

LODGE, Robert; DESCOTEAUX, Albert (2005) Modulation of phagolyso some biogenesis

by the lipophosphogly can of Leishmania - Clinical Immunology 114, 256– 265.

MAIOLI T.U., TAKANE E., ARANTES R.M., FIETTO J.L. & AFONSO L.C. (2004)

Immune response induced by New World Leishmania species in C57BL/6 mice.

Parasitol.Res. 94, 207-212.

MALDONADO-LÓPEZ R, MOSER M. (2013) Dendritic cell subsets and the regulation of

Th1/Th2 responses. Immunology. Sep;140(1).

MALDONADO-LOPEZ, R. & MOSER, M. (2001). Dendritic cell subsets and the regulation

of Th1/Th2 responses. Semin Immunol 13, 275–282.

MARIATHASAN, S., MONACK, D.M. (2007) Inflammasome adaptors and sensors:

intracellular regulators of infection and inflammation. Nat. Rev. Immunol., v. 7, p. 31-40.

MARQUES-DA-SILVA E.A., OLIVEIRA J.C., FIGUEIREDO A.B., LIMA JUNIOR D.S.,

CARNEIRO C.M., FIETTO J.L.R. & AFONSO L.C.C. (2008) Extracellular nucleotide

Page 59: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

59

metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection.

Microbes Infect. 10, 850-857.

MARTINEZ, N. A., AYALA, A. M., MARTINEZ, M., MARTINEZ-RIVERA, F. J.,

MIRANDA, J. D., & SILVA, W. I. (2016). Caveolin-1 Regulates the P2Y2 Receptor

Signaling in Human 1321N1 Astrocytoma Cells. The Journal of Biological

Chemistry, 291(23), 12208–12222. http://doi.org/10.1074/jbc.M116.730226.

MARTINON F, MAYOR A, TSCHOPP J. (2009)The inflammasomes: Guardians of the

body. Annu Rev Immunol;27:229–265.

MEHTA, V. B., J. HART, AND M. D. WEWERS (2001) ATP-stimulated release of

interleukin (IL)-1β and IL-18 requires priming by lipopolysaccharide and is independent

of caspase-1 cleavage. J. Biol. Chem. 276:3820.

MEYER- FERNANDES J. R. (2002) Ecto-ATPases in protozoa parasites: looking for a

funciotion. Parasitol, Int 51,299-303.

MEYER-FERNANDES JR, SAAD-NEHME J, PERES-SAMPAIO CE, BELMONT-FIRPO

R, BISAGGIO DF, DO COUTO LC, FONSECA DE SOUZA AL, LOPES AH, SOUTO-

PADRÓN T.(2004) A Mg-dependent ecto-ATPase is increased in the infective stages of

Trypanosoma cruzi. Parasitol Res. May;93(1):41-50.

MIZUTANI, H., SCHECHTER, N., LAZARUS, G., BLACK, R.A., AND KUPPER, T.S.

(1991). Rapid and specific conversion of precursor interleukin 1 beta to an active IL-1

species by human mast cell chymase. J. Exp. Med. 174, 821–825.

MÓCSAI, ATTILA.(2013) Diverse novel functions of neutrophils in immunity,

inflammation, and beyond. J Exp Med Jul 1; 210(7): 1283–1299.

MOSSER, DAVID; ROSENTHAL, LOUIS A. 1; SUTTERWALA, FAYYAZ S.; KEHRLI,

MARCUS E. (1996) Leishmania major-Human Macrophage Interactions: Cooperation

between Mac-1 (CD11b/CD18) and Complement Receptor Type 1 (CD35) in Promastigote

Adhesion. Infect Immun. 64, 2206–2215.

MOUGNEAU E., BIHL F., GLAICHENHAUS N. (2011). Cell biology and immunology of

Leishmania. Immunol. Rev. 240,

MURRAY H.W. (1982) Cell-mediated immune response in experimental visceral

Leishmaniasis. II. Oxygen-dependent killing of intracellular Leishmania donovani

amastigotes. J.Immunol. 129, 351-357.

MUTINI C, FALZONI S, FERRARI D, CHIOZZI P, MORELLI A, BARICORDI

OR, COLLO G, RICCIARDI-CASTAGNOLI P, DI VIRGILIO F. (1999) Mouse dendritic

Page 60: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

60

cells express the P2X7 purinergic receptor: characterization and possible participation in

antigen presentation. J Immunol. Aug 15;163(4):1958-65.

NETEA MG, SIMON A, VAN DE VEERDONK F, KULLBERG BJ, VAN DER MEER

JW, JOOSTEN LA. (2010) IL-1beta processing in host defense: beyond the

inflammasomes. PLoS Pathog. Feb 26;6(2):e1000661.

NEVES DP (2004). Parasitologia Humana. 11ª edição. Editora Atheneu. São Paulo.

ORYU, M, SAKAMOTO, H; OGAWA, Y; TANAKA, S; SAKAMOTO, N (1996) Effects of

released products from platelets on neutrophilic adhesion to endothelial cells and nylon

fibers. J Leukoc Biol.jul;60(1):77-80

OUYANG X, GHANI A, MALIK A, WILDER T, COLEGIO OR, FLAVELL

RA, CRONSTEIN BN, MEHAL WZ. (2013).

Adenosine is required for sustained inflammasome activation via the A₂A receptor and

the HIF-1α pathway. Nat Commun. ;4:2909.

PALETTA-SILVA R, VIEIRA DP, VIEIRA-BERNARDO R, MAJEROWICZ D, GONDIM

KC, VANNIER-SANTOS MA, LOPES AH, MEYER-FERNANDES JR. (2011) Leishmania

amazonensis: characterization of an ecto-3'-nucleotidase activity and its possible role in

virulence. Exp Parasitol. Nov;129(3):277-83.

PELEGRIN P, SURPRENANT A. (2006) Pannexin-1 mediates large pore formation and

interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. EMBO J. Nov 1; 25(21):5071-

82.

PELLEGATTI P, FALZONI S, PINTON P, RIZZUTO R, DI VIRGILIO F (2005) A Novel

Recombinant Plasma Membrane-targeted Luciferase Reveals a New Pathway for ATP

Secretion. Mol Biol Cell 16: 3659–3665.

PERREGAUX, D., C. A. GABEL. (1994). Interleukin-1β maturation and release in

response to ATP and nigericin. J. Biol. Chem. 269:15195

PERREGAUX, D., J. BARBERIA, A. J. LANZETTI, K. F. GEOGHEGAN, T. J. CARTY,

AND C. A. GABEL (1992) IL-1β maturation: evidence that mature cytokine formation

can be induced specifically by nigericin. J. Immunol. 149:1294.

PÉTRILLI V, PAPIN S, DOSTERT C, MAYOR A, MARTINON F, TSCHOPP J. (2007)

Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium

concentration. Cell Death Differ. Sep;14(9):1583-9.

Page 61: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

61

PICCINI, S.A. CARTA, S. TASSI, D. LASIGLIÉ, G.FOSSATI, A. RUBARTELLIAT.

(2008). ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands

and induces IL-1β and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. Jun

10;105(23):8067-72.

Pizzirani, C.; Ferrari, D; Chiozzi, P; Adinolfi, E; Sandonà, D; Savaglio, E; Di Virgilio, F (2007)

Stimulation of P2 receptors causes release of IL-1β-loaded microvesicles from human dendritic

cells. Blood, 109, pp. 3856-3864

PRINA, E.; ABDI, S. Z.; LEBASTARD, M.; PERRET, E.; WINTER, N.; ANTOINE, J. C.

(2004) Dendritic cells as host cells for the promastigote and amastigote stages of

Leishmania amazonensis: the role of opsonins in parasite uptake and dendritic cell

maturation. J.Cell Sci., v. 117, n. Pt 2, p. 315-325,

PULTE ED, BROEKMAN MJ, OLSON KE, DROSOPOULOS JH, KIZER JR, ISLAM

N, MARCUS AJ (2007) CD39/NTPDase-1 activity and expression in normal leukocytes.

Thromb Res.;121(3):309-17.

QI H, POPOV V, SOONG L. (2001) Leishmania amazonensis-dendritic cell interactions in

vitro and the priming of parasite-specific CD4(+) T cells in vivo. J Immunol.167:4534–

4542.

RALEVIC V, BURNSTOCK G (1998) Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol

Rev 50:413–492.

RIBEIRO J.A (1999). Adenosine A2A receptor interactions with receptors for other

neurotransmitters and neuromodulators. Eur. J. Pharmacol.375:101–113.

RIBEIRO, J.M.C., P.A . ROSSIGNOL, AND A . SPIEHNAN. (1986). Bloodfinding strategy

of a capillary-feeding sandfly, Lutzomyia longipalpis . Comp. Biochem . Physiol. 83 :683ª.

RIBEIRO-GOMES F., PETERS N. C., DEBRABANT A., SACKS D. A. (2012). Efficient

capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-

Leishmania response. PloS Pathog. 8:e1002536 10.1371

RIDER P, CARMI Y, GUTTMAN O, BRAIMAN A, COHEN I, VORONOV E, WHITE MR,

DINARELLO CA, APTE RN. ((2011) IL-1α and IL-1β recruit different myeloid cells and

promote different stages of sterile inflammation. J Immunol. 2011 Nov 1;187(9):4835-43.

doi: 10.4049/jimmunol.1102048. Epub 2011 Sep 19.

Page 62: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

62

ROBSON SC, SÉVIGNY J, ZIMMERMANN H. (2006) The ENTPDasefamily of

ectonucleotidases: Structure function relationships and pathophysiological significance.

Purinergic Signal. Jun;2(2):409-30.

ROUNDS, L.L. LIKAR, E.O. HARRINGTON, K.C. KIM, A. SMEGLIN, K. HEINS, E

COLS. (1999), Nucleotide-induced PMN adhesion to cultured epithelial cells: possible role

of MUC1 mucin.Am J Physiol, 277 (5 Pt 1)

SANSOM FM, NEWTON HJ, CRIKIS S, CIANCIOTTO NP, COWAN PJ, D'APICE

AJ, HARTLAND EL.(2007) A bacterial ecto-triphosphate diphosphohydrolase similar to

human CD39 is essential for intracellular multiplication of Legionella pneumophila. Cell

Microbiol. Aug;9(8):1922-35.

SANTOS RF, POSSA MA, BASTOS MS, GUEDES PM, ALMEIDA MR,

DEMARCO R, et al. (2009) Influence of ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase

activity on Trypanosoma cruzi infectivity and virulence. PLoS

Negl Trop Dis ;3:e387.

SANZ JM, DI VIRGILIO F. (2000) Kinetics and mechanism of ATP-dependent IL-1 beta

release from microglial cells. J Immunol.164:4893–4898.

SCHLEIN, Y; JACOBSON, RL; MESSER, G. (1992).Leishmania infections damage the

feeding mechanism of the sand fly vector and implement parasite transmission by bite.

ProcNatlAcadSci U S A. 89, 9944-9948.

SCHULTE G. E FREDHOLM B.B. (2003) Sinalling from adenosine receptors to mitogen-

activated protein kinases. Cell Signal. 15:813-27.

SHARMA, UMAKANT; SINGH, SARMAN. (2009) Imunobiology of Leishmaniasis. Indian

Journal of Experimental Biology.47, 412-423.

SILVEIRA, FERNANDO T;. MÜLLER, SILVIA R; SOUZA, ADELSON A.A. DE;

LAINSON, RALPH; GOMES; D. LAURENTI, CLAUDIA M.C., MARCIA; CORBETT,

CARLOS E.P. (2008) Revisão sobre a patogenia da leishmaniose tegumentar americana

na Amazônia, com ênfase à doença causada por Leishmania (V.) braziliensis E Leishmania

(L.) amazonensis.22, 9-19

SMITH TM, CARL SAL, KIRLEY TL (1999) Mutagenesis of two conserved tryptophan

residues of the E-type ATPases: inactivation and conversion of an ecto-apyrase to an Ecto-

NTPase. Biochemistry 38:5849–5857.

Page 63: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

63

SPERLAGH B, HASKO G, NEMETH Z, VIZI ES. (1998) ATP released by LPS increases

nitric oxide production in raw 264.7 macrophage cell line via P2Z/ P2X7

receptors. Neurochem Int. 1998;33:209–21.

SPERLÀGH B, MAGLÓCZKY E S, VIZI E S, FREUND T F. (1998) The triangular septal

nucleus as the major source of ATP release in the rat habenula: a combined

neurochemical and morphological study. Neuroscience.;86:1195–1207.

SPERLAGH, B; HASKO, G; NEMETH, Z; VIZI, E.S. (1993) ATP released by LPS

increases nitric oxide production in raw 264.7 macrophage cell line via P2Z/P2X7

receptors Neurochem Int, 33 (3), pp. 209-215.

STEINMAN RM, HAWIGER D, NUSSENZWEIG MC. (2003). Tolerogenic dendritic cells.

Annu Rev Immunol 21: 685 –711.

STEINMAN, R. M. (2003) The control of immunity and tolerance by dendritic cells. Pathol.

Biol. 51, 59–60.

STYLIANOU, E. AND SAKLATVALA, J. (1998). Interleukin-1. Int.

J. Biochem. Cell Biol. 30:1075.

SUH, B.C. ; KIM, J.S.; NAMGUNG, U.; KIM, H. HA, K.T. (2001) P2X7 nucleotide

receptor mediation of membrane pore formation and superoxide generation in human

promyelocytes and neutrophils. J Immunol. Jun 1;166(11):6754-63

T. JAKOB, M.C. Udey. (1998) Regulation of E-cadherin-mediated adhesion in

Langerhans cell-like dendritic cells by inflammatory mediators that mobilize Langerhans

cells in vivo J Immunol, 160 , pp. 4067-4073.

TAKENOUCHI T, SEKIYAMA K, SEKIGAWA A, FUJITA M, WARAGAI M, SUGAMA

S, IWAMARU Y, KITANI H, HASHIMOTO M (2010) P2X7 receptor signaling pathway

as a therapeutic target for neurodegenerative diseases. Arch Immunol Ther Exp

(Warsz). Apr;58(2):91-6

TEIXEIRA MJ, TEIXEIRA CR, ANDRADE BB, BARRAL NETTO M, BARRAL A (2006)

Chemokines in host-parasite interactions in Leishmaniasis. Trends Parasitol 22: 32–40.

TRAUTMANN, A. (2009) Extracellular ATP in the immune system: more than just a

“danger signal”. Sci. Signal. 2, pe6.

VAN DE VEERDONK, F.L. M.G. NETEA. (2013) New Insights in the immunobiology of

IL-1 family members Front Immunol, 4 (167) pp. 1-11.

Page 64: em células dendríticas · VII . 10 Índice Lista de figuras ... VIII . 11 Lista de figuras Figura 1: Atividade ectonucleotidásica de diferentes espécies do gênero ... ADP e AMP)

64

WANG TF, GUIDOTTI G. (1996) CD39 is an ecto-(Ca2+, Mg2+)-apyrase. J Biol

Chem.271:9898–901.

WEN H, TING JP, O'NEILL LA. (2012) A role for the NLRP3 inflammasome in metabolic

diseases – did Warburg miss inflammation. Nat Immunol.13:352–357

WILEY JS, SLUYTER R, GU BJ, STOKES L, AND FULLER SJ (2011) The human P2X7

receptor and its role in innate immunity. Tissue Antigens 78:321–332.

XIN, LIJUN YONGGUO LI, AND LYNN SOONG1. (2007) Role of Interleukin-1 in

Activating the CD11chigh CD45RB Dendritic Cell Subset and Priming Leishmania

amazonensisSpecific CD4 T Cells In Vitro and In Vivo. INFECTION AND IMMUNITY, p.

5018–5026 Vol.

YAN Z., KHADRA A., LI S., TOMIC M., SHERMAN A., STOJILKOVIC S. S.

(2010). Experimental characterization and mathematical modeling of P2X7 receptor

channel gating. J. Neurosci. 30.

YEGUTKIN GG (2008) Nucleotide- and nucleoside-converting ectoenzymes: Important

modulators of purinergic signalling cascade. Biochim Biophys Acta.

YOUNG M. T (2010). P2X receptors: dawn of the post-structure era. Trends Biochem. Sci.

ZHOU,R. A.S. YAZDI, P. MENU, J. TSCHOPP. (2011) A role for mitochondria in NLRP3

inflammasome activation Nature, 469 pp. 221-225.

ZIMMERMANN H. (2000) Extracellular metabolism of ATP and other nucleotides.

Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 362, 299-309

ZIMMERMANN H. (2001) Ectonucleotidases: Some recente developments and note on

nomenclature, Drug Dev Res; 52:44-56.