Caracterização de uma proteína quinase do fator de início...
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Leonardo da Silva Augusto Caracterização de uma proteína quinase do fator de início de tradução, eIF2α, regulada por heme e envolvida no controle do crescimento e diferenciação de Trypanosoma cruzi São Paulo 2014 Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
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Leonardo da Silva Augusto
Caracterização de uma proteína quinase do fator de
início de tradução, eIF2α, regulada por heme e
envolvida no controle do crescimento e diferenciação
de Trypanosoma cruzi
São Paulo
2014
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
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Leonardo da Silva Augusto
Caracterização de uma proteína quinase do fator
de início de tradução, eIF2α, regulada por heme e
envolvida no controle do crescimento e diferenciação
de Trypanosoma cruzi
Orientador: Prof. Dr. Sergio Schenkman
São Paulo
2014
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
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Augusto, Leonardo da Silva
CARACTERIZAÇÃO DE UMA PROTEÍNA QUINASE DO FATOR
DE INÍCIO DE TRADUÇÃO, eIF2α, REGULADA POR HEME NO
CONTROLE DO CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO Trypanosoma
cruzi.
Leonardo da Silva Augusto- São Paulo, 2014.
xvii,222f.
Tese (Doutorado) Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina.
Programa de Pós-graduação em Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia.
Título em ingles: CHARACTERIZATION OF AN HEME
REGULATED PROTEIN KINASE OF THE TRANSLATION INITIATION
FACTOR, eIF2 α, INVOLVED IN THE CONTROL OF GROWTH AND
DIFFERENTIATION OF Trypanosoma cruzi
1. Trypanosoma cruzi; 2. eIF2α; 3. eIF2α quinase; 4. heme; 5.
ROS.
4
Trabalho realizado na
Disciplina de Biologia Celular, do
Departamento de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia, da
Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de
Medicina, com auxílio financeiro
concedido pela Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo (FAPESP).
5
“CADA SONHO QUE VOCÊ DEIXA PARA TRÁS, É UM FUTURO QUE
DEIXA DE EXISTIR”.
(STEVE JOBS)
6
A minha família que sempre apoiou meus sonhos.
7
Agradecimentos
Aos meus pais Sandra e Ricardo e meu irmão Felipe, por tudo! Nem vou
começar a descrever tudo que fizeram e fazem por mim. Vocês sabem que essa
tese não aconteceria se não fosse por vocês.
A Tatiana Mordente pela amizade, companheirismo, por sempre ter
paciência comigo. Muito obrigado por estar do meu lado nos momentos difíceis
e principalmente nos momentos felizes, você é muito especial, sempre que
precisar estarei aqui para ajudar e te apoiar.
Ao meu orientador, Dr. Sergio Schenkman, sem palavras para
demonstrar o quanto sou grato de trabalhar com ele, vejo ele como um espelho
e o considero como um pai científico. Sempre estarei disposto a trabalhar ao
seu lado e mergulhar em projetos mirabolantes que fascinam. Queria agradecer
imensamente pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório, pelos
ensinamentos, pela paciência e muita paciência, e pela extrema confiança
depositada. Trabalhar com ciência nunca foi tarefa fácil, mas facilita poder
contar com um excelente cientista ao nosso lado.
A Prof.ª Ana Claudia Torrecilhas pela confiança e pela indicação, se não
fosse ela não estaria aqui, muito obrigado por confiar na minha capacidade e
sempre me dar força para seguir em frente.
A Prof.ª Beatriz Castilho por sempre estar disposta a me ajudar com
experimentos relacionados à tradução e pelo ensinamento.
Ao Victor Nussenzweig pelas sugestões no trabalho e na vida.
Ao Nilmar por ser meu amigo e sempre me dar força, e por me encorajar
a terminar o trabalho, e por acreditar “cola na minha que você passa de ano”.
8
Ao Thiago por me ajudar nos experimentos com microscópios, e pelas
conversas.
Ao Min Zhang pelos ensinamentos com as quinases e pelos momentos
engraçados.
A Renata Tonelli pelos primeiros ensinamentos no laboratório do Sergio
Schenkman.
A Mariana pela paciência e apoio na reta final.
Ao Fabricio pela paciência e longas conversas, pelos conselhos e por me
ensinar sempre o lado bom das coisas.
Ao Vinicius apesar de recém-chegado, pelas críticas e sugestões no
trabalho.
A Ana Luiza por estar disposta a me aturar, e me ensinar a ser ‘chefe’.
Ao Bruno Pascoalino por ter paciência e me ensinar como realmente se
faz Biomol.
A Teresa de Jesus por me ajudar sempre no começo da tese e confiar
em mim.
A Sheila Nardelli por me ajudar e sempre estar disposta a dar boas
risadas.
Ao Antônio pelas discussões de experimentos, apoio... e pelas histórias
incríveis que você contava diariamente... elas realmente animam meu dia.
A Claudeci pela ajuda em tudo, seja para comprar, fazer solução, ou ligar
insistentemente para os vendedores quando a gente precisa MUITO daquele
reagente. Obrigada pela amizade e pelo companheirismo, além de ter paciência
com minhas brincadeiras.
9
Ao Claudio pela ajuda nas culturas, infecções, soluções, por estar sempre
disposto a ajudar e pela paciência (e que paciência!!!!).
A Prof.ª Nobuko Yoshida por estar sempre com o laboratório sempre de
portas abertas.
Aos membros do laboratório da Nobuko Yoshida, Maeda, Marina, Evelyn,
Silene, Cidinha e Cristian, por sempre estarem dispostos a ajudarem, pelas
discussões científicas e por sempre ter paciência com minhas danças e
brincadeiras.
A Gaby pela amizade, pelas longas conversas e sempre me apoiar.
Aos alunos do 7 andar pela ajuda e disponibilidade.
A todos os alunos, técnicos e colaboradores que passaram pelo
laboratório ao longo desses anos. Obrigada por tornarem momentos
simplesmente inesquecíveis!
Aos secretários, Márcia, Cristiane, Marcelo e Mércia pela ajuda
fundamental e pela amizade.
Aos professores da Disciplina de Biologia Celular, pelos ensinamentos,
pelo coleguismo e por estarem sempre prontos a ajudar no que for necessário.
Aos técnicos da disciplina, Luisão, Maria, Rose e Américo, por tudo que
vocês fazem diariamente por nós.
A todos os amigos do departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia, professores, alunos, técnicos e secretários. Obrigada pela
contribuição e apoio nessa jornada.
A FAPESP pelo apoio financeiro.
A todos vocês, MUITO OBRIGADO!
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Lista de Abreviaturas
AMP- Ampicilina.
ATF4- Fator de ativação de transcrição 4.
ATP- Trifosfato de adenosina.
BSA- Albumina sérica.
C-terminal- Porção carboxi-terminal.
DAPI- 4,6-diamino-2-fenilindol.
DNA- Ácido desoxiribonucléico.
dNTPs- Trifosfato de desoxiribonucleotídeos.
ds-RNA- dulpa fita de ácido ribonucléico.
DTT- Ditiotreitol.
eEF2- Fator de elongação 2 de eucariotos.
eIF2- Fator de início de tradução 2 de eucariotos.
eIF2B- Fator de início de tradução 2B de eucariotos.
GDP- Difosfato de guanidina.
GST- Glutationa S-transferase.
GTP- Trifosfato de guanosina.
H2O2- Peróxido de hidrogênio.
H3- Histona H3.
H4- Histona H4.
HSP70- Proteína de choque térmico 70.
IPTG- Isopropil beta-D-1-tiogalactopiranosídeo.
LIT- Meio de infusão de fígado e triptose.
Mb- Mega bases.
mRNA- Ácido ribonucleico mensageiro.
N-terminal- Porção amino terminal.
ORF- Fase de leitura aberta.
PBS- Tampão fosfato-salina.
PCR- Reação em cadeia da Polimerase.
RNA- Ácido ribonucleico.
ROS- Espécies reativas de oxigênio.
SFB- Soro fetal bovino.
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TAU- Urina artificial de triatomíneo.
TAU3AG – TAU contendo 3 aminoácidos e glicose
TCEB- Tampão de eletroporação de T. cruzi.
tRNA- Ácido ribonucleico transportador.
tRNAmet - Ácido ribonucleico transportador carregado com
metionina.
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INDICE
1 Introdução .................................................................................................... 16
1.1 Trypanosoma cruzi .............................................................................. 16
1.1.1 Controle da expressão gênica em Trypanosoma cruzi .................... 20
1.2 Síntese proteica ................................................................................... 21
1.2.1 Iniciação .......................................................................................... 22
1.2.2 Elongação ....................................................................................... 23
1.2.3 Terminação ..................................................................................... 24
1.3 Mecanismos de regulação da tradução ............................................... 25
1.4 Proteínas quinases de eIF2 ............................................................... 28
1.5 Fatores de início da tradução em Trypanosoma ................................. 30
1.6 Proteínas quinases de eIF2 em Trypanosoma .................................... 34
1.7 Aquisição de nutrientes pelo T. cruzi ................................................... 36
1.8 Reservossomos e estoque de nutrientes ............................................. 37
2 OBJETIVOS ................................................................................................. 40
3 Materiais e Métodos ..................................................................................... 41
3.1 Trypanosoma cruzi .............................................................................. 41
3.2 Oligonucleotídeos, plasmídeos e anticorpos ....................................... 42
3.3 Western Blot ........................................................................................ 44
3.4 Imunofluorescência .............................................................................. 44
3.5 Geração de parasitas superexpressores de eIF2α .............................. 45
3.6 Geração de nocautes da TcK2 ............................................................ 47
3.7 Etiqueta ............................................................................................... 48
3.8 Construções de plasmídeos para reinserção do gene da TcK2 .......... 48
3.9 Transfecção de T. cruzi ....................................................................... 49
3.10 Ensaios de invasão ........................................................................ 49
3.11 Ensaio de quinase .......................................................................... 50
3.12 Detecção de espécies reativas de oxigênio, H2O2 e peroxidases .. 52
3.13 Atividade de superóxido dismutase (SOD) ..................................... 53
3.14 Análise dos níveis de heme intracelulares e incorporação de
análogos de heme ............................................................................... 53
3.15 Análises estatísticas ....................................................................... 54
4 Resultados ................................................................................................... 55
13
4.1 TceIF2α ............................................................................................... 55
4.1.1 TceIF2α pode ser fosforilada em dois resíduos in vitro pela TcK2. 55
4.1.2 Papel da Ser43 e Thr 169 nos parasitas ......................................... 56
4.1.3 A superexpressão da eIF2, controla o crescimento e a formação de
formas infectivas ...................................................................................... 57
4.1.4 Fosforilação da Serina 43 em resposta a estresse oxidativo .......... 60
4.2 TcK2 .................................................................................................... 62
4.2.1 Caracterização da quinase K2 em T. cruzi ...................................... 62
4.2.2 TcK2 está presente na fração de membrana .................................. 64
4.2.3 TcK2 tem capacidade de se fosforilar e promover a fosforilação de
TceIF2α in vitro ....................................................................................... 66
4.2.4 TcK2 apresenta localização diferente da homóloga de Leishmania sp
67
4.2.5 A TcK2 é expressa em estados diferentes nos estágios de T. cruzi 69
4.2.6 TcK2 responde a carência de heme ................................................ 70
4.2.7 O heme se liga ao domínio quinase da TcK2 .................................. 75
4.2.8 Obtenção de nocautes para TcK2 ................................................... 79
4.2.9 A ausência da quinase afeta o crescimento e diferenciação ........... 82
4.2.10 Ascorbato reverte o fenótipo dos parasitas nocautes ...................... 83
4.2.11 TcK2KO apresentam reservossomos menos elétron densos .......... 87
4.2.12 Ausência da quinase TcK2 causa um desequilíbrio celular através da
geração de ROS ...................................................................................... 88
4.2.13 Reintrodução da TcK2 selvagem mas não da TcK2 inativa reverte as
alterações observadas no nocaute .......................................................... 93
5 Discussão................................................................................................... 100
6 REFERÊNCIAS .......................................................................................... 117
Abstract .......................................................................................................... 126
Author Summary ............................................................................................ 127
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Resumo
Variações ambientais causam uma menor síntese proteica em
detrimento da tradução de determinadas proteínas pela fosforilação da
subunidade α do fator de início de tradução (eIF2α) de eucariotos. Este
mecanismo parece ser também essencial na alternância dos estágios de
desenvolvimento de protozoários parasitas nos seus hospedeiros. Assim, nesta
tese, investigamos o papel da fosforilação de eIF2α na biologia do
Trypanosoma cruzi, o protozoário causador da doença de Chagas. Mostramos
que esta fosforilação é essencial para a geração de formas infectivas.
Diferentemente dos demais eucariotos, o eIF2α de tripanossomas tem um
domínio N-terminal a mais que é fosforilado na serina 43, além do sítio
canônico de fosforilação da treonina 169, equivalente a serina 51 de outros
organismos. A fosforilação de ambos os resíduos está envolvida no
desencadeamento da diferenciação de T. cruzi. Também estudamos uma das
três proteínas quinases de eIF2α preditas no genoma de tripanossomas.
Mostramos que a proteína quinase 2, denominada TcK2, está inserida em
membranas do compartimento endosomal de formas proliferativas do T. cruzi,
onde são estocadas proteínas, lipídeos e heme. O heme se liga a TcK2
causando sua inibição e permitindo a proliferação. Na ausência de heme a
TcK2 é ativada levando a uma parada na síntese proteica e formação de
formas infectivas. A deleção gênica da TcK2 impede a diferenciação e leva os
parasitas a não estocar o heme nos endossomos e sim no citosol, causando a
um aumento dos H2O2 devido a uma inibição dos níveis de peroxidase e
ativação de superóxido dismutase, que resulta em um aumento de espécies
reativas de oxigênio gerando danos aos parasitas. Concluímos que a TcK2 tem
um papel fundamental no desenvolvimento do T. cruzi através do controle da
síntese proteica e do balanço redox em função das quantidades de heme
disponíveis no parasita.
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Summary
Environmental variations cause a decrease in protein synthesis at the
expense of the translation of certain proteins by the phosphorylation of the α
subunit of translation initiation factor (eIF2α) of eukaryotes. This mechanism
also seems to be essential to the alternation of developmental stages of
protozoan parasites on their hosts. Therefore, in this thesis, we investigated the
role of eIF2α phosphorylation in the biology of the Trypanosoma cruzi, the
protozoan that causes Chagas’ disease. We showed that this phosphorylation is
essential for the generation of infective forms. Unlike other eukaryotes, the
eIF2α of Trypanosoma have an N-terminal domain that is phosphorylated at the
serine 43, besides the canonical site of phosphorylation of threonine 169,
equivalent to the serine 51 of other organisms. Phosphorylation of both residues
is involved in triggering the differentiation of T. cruzi. In addition, we study one
of the three eIF2α kinases foretold in the genome of trypanosomes. We showed
that the protein kinase 2, called TcK2, is inserted into the endosomal
compartment membranes of proliferative forms of T. cruzi, where are stored
proteins, lipids and heme. The heme binds to TcK2 causing its inhibition and
enabling proliferation. In the absence of the heme TcK2 is activated leading to a
halt in protein synthesis and formation of infective forms. TcK2 gene deletion
prevented differentiation, and heme was not retained in the endosomes. The
parasite showed increased levels of H2O2 due to the inhibition of peroxidase
and activation of superoxide dismutase activities, which results in an increase of
reactive oxygen species causing damage to parasites. We concluded that TcK2
plays a key role in the development of T. cruzi through the control of protein
synthesis and of the redox balance based on the quantities of heme available
for the parasite.
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 Trypanosoma cruzi
A Tripanosomíase Americana, conhecida popularmente como Doença
de Chagas, é uma importante endemia que é causada pelo Trypanosoma cruzi
(Pereira e Navarro, 2013). A doença de Chagas acomete cerca de 10 milhões
de pessoas em todo mundo. O T. cruzi é um protozoário flagelado, descrito há
mais de um século pelo brasileiro Carlos Chagas, pertencente à ordem
Kinetoplastida, família Trypanosomatidae (Brener, 1973).
O T. cruzi apresenta um ciclo de vida em que o protozoário infecta dois
hospedeiros, sendo um invertebrado (insetos triatomíneos), e outro, um
mamífero (incluindo o ser humano). São descritas quatro formas principais do
protozoário ao longo do ciclo biológico, sendo duas formas presentes no
hospedeiro invertebrado e duas formas presentes no hospedeiro vertebrado.
As duas formas que são encontradas no hospedeiro invertebrado são
denominadas de epimastigotas e tripomastigotas-metacíclicos. As formas
encontradas no hospedeiro vertebrado são amastigotas e tripomastigotas
sanguíneos. Os tripomastigotas não proliferam, mas podem infectar células de
mamífero, enquanto os amastigotas e epimastigotas se reproduzem por fissão
binária (Brener, 1973).
Os triatomíneos infectados eliminam fezes contendo tripomastigotas
metacíclicos quando se alimentam (Figura 1). Quando as fezes contaminadas
atingem mucosas dos olhos, boca, tubo digestivo ou ferimentos, os parasitas ali
depositados são capazes de invadir as células. O processo de invasão é ativo
levando a formação de um vacúolo parasitóforo na célula hospedeira.
17
Figura 1. Esquema do ciclo biológico do Trypanosoma cruzi. Formas tripomastigotas metacíclicos
invadem o hospedeiro mamífero através do contato com mucosas (1). Formas infectivas invadem células onde se transformam na forma replicativa denominada amastigota (2). Formas amastigotas multiplicam por fissão binária (3) e diferenciam-se em formas tripomastigotas (4). Após a picada em um hospedeiro mamífero o inseto pode ingerir formas tripomastigotas (5) que se diferenciam em formas epimastigotas no estômago do inseto (6) e multiplicam-se (7). No final do intestino as formas epimastigotas diferenciam-se em tripomastigotas-metacíclicos (8). Adaptado (www.dpd.cdc.gov.dpdx).
Após algumas horas o vacúolo parasitóforo é degradado liberando
parasitas no citosol da célula hospedeira que se diferenciam na forma
amastigota. Esta forma se multiplica, por fissão binária, até a célula hospedeira
ficar repleta de parasitas quando os amastigotas se transformam em
tripomastigotas com o rompimento da célula. Os tripomastigotas liberados
podem invadir novas células adjacentes ou se difundir pelo hospedeiro através
da corrente sanguínea. Eventualmente, em um novo repasto sanguíneo, os
parasitas podem ser ingeridos por insetos triatomíneos. Uma vez ingeridos pelo
inseto, o protozoário se diferencia na forma epimastigota, que se multiplica por
fissão binária no estômago do inseto. Após a multiplicação os epimastigotas
aderem-se às células do epitélio digestivo do inseto e acabam se diferenciando
na forma metacíclica, que pode ser eliminada com as fezes do vetor reiniciando
o ciclo do parasita (de Souza, 1984).
18
Na natureza, a aquisição da infecção pelo mamífero parece ocorrer
predominantemente por via oral através da ingestão de formas infectivas
presentes em alimentos contaminados com fezes dos insetos transmissores
(Pereira e Navarro, 2013). Além da transmissão através das fezes do inseto,
seres humanos podem infectar-se através de transfusão sanguínea,
transmissão congênita, transplantes de órgãos e acidentes laboratoriais (Figura
2).
Figura 2. Esquema de aquisição da doença. O ser humano pode ser contaminado por meio de acidentes
laboratoriais, transfusão sanguínea, transplante de órgãos e por transmissão congênita.
A infecção humana pode gerar uma fase aguda, seguido de um longo
período assintomático (Andrade, 1991). A fase aguda é marcada por um
número elevado de parasitas na corrente sanguínea enquanto que a
quantidade de parasitas é muito baixa no período assintomático e durante a
fase crônica onde os sintomas da doença de Chagas se manifestam (Coura e
Borges-Pereira, 2010).
19
Os sintomas na fase crônica aparecem em cerca de 30% dos pacientes
infectados levando a lesões cardíacas ou ao desenvolvimento de síndromes
com aumento do esôfago ou do cólon (Coura e Borges-Pereira, 2011; Rassi et
al., 2010). O tratamento é feito por meio de medicamentos como Benzimidazole
e Nifurtimox (Urbina e Docampo, 2003), e grandes esforços vem sendo feitos
para o desenvolvimento de novas drogas, algumas já em testes avançados
(Benaim e Paniz Mondolfi, 2012; Botoni et al., 2013; Genovesio et al., 2011).
Não é possível eliminar a infecção em todos os indivíduos, principalmente
aqueles na fase crônica, dado a existência de linhagens resistentes do parasita
e/ou problemas de toxicidade das drogas disponíveis (Coura e Borges-Pereira,
2011; Linetzky et al., 2012; Requena-Mendez et al., 2013). Durante a fase
crônica se supõe que existam ninhos de amastigotas que apresentam uma taxa
de multiplicação baixa, assim dificultando a ação de drogas no metabolismo do
parasita (Coura e Borges-Pereira, 2011; Gutierrez et al., 2009; Marin-Neto et
al., 2007). Existem ainda trabalhos que propõe que os sintomas da doença
estejam desvinculados da presença de parasitas e tenham um caráter de
autoagressão dado a alterações do sistema imune ou ainda a alterações
genéticas do hospedeiro (Cunha-Neto et al., 2011; Girones et al., 2005; Leon e
Engman, 2001; Teixeira et al., 2011).
A prevenção da doença de Chagas tem sido feita através da eliminação
do inseto triatomíneo com o uso de inseticidas e melhora nas condições de
habitação, impedindo o contato dos insetos transmissores com o homem
(Pereira e Navarro, 2013). O sucesso no combate à doença de Chagas
também tem sido obtido com testes em bancos de sangue evitando a
transmissão por transfusão sanguínea. Contudo, surtos de transmissão oral, a
20
falta de controle em bancos de sangue em muitos países e a presença de
vetores transmissores próximos aos domicílios mantém a transmissão ativa
(Rassi et al., 2010). Desta forma, a existência de indivíduos assintomáticos que
poderão desenvolver a doença, cuja origem da patologia é ainda controversa,
bem como a disponibilidade de poucas drogas para o tratamento, ainda
justificam estudos sobre esta doença.
1.1.1 Controle da expressão gênica em Trypanosoma cruzi
O genoma dos Tripanossomatídeos apresenta aproximadamente 67 Mb,
que codifica 22.500 proteínas, sendo parte destas proteínas de superfície que
auxiliam na invasão e escape do parasita nos seus hospedeiros (El Sayed et
al., 2005). A transcrição gênica é policistrônica e os RNA mensageiros (mRNA)
são gerados a partir de um pré-mRNA pela poliadenilação na porção 3’ do
transcrito e pela inserção de uma sequência líder a cada sequência de leitura
para proteínas na região 5’ em um processo denominado de “trans-splicing”
(Clayton e Shapira, 2007). Estes processos são necessários para o transporte
do mRNA para o citosol e sua tradução (De Gaudenzi et al., 2011; Teixeira e
DaRocha, 2003). As regiões codificadoras estão dispostas em longos trechos
do cromossomo na mesma fita de DNA e a transcrição é iniciada geralmente
em regiões onde as fases abertas de leitura são divergentes (Martinez-Calvillo
et al., 2010). Nestas regiões há um acúmulo de histonas H3 e H4 acetiladas
que provavelmente permitem a ligação de fatores de início da transcrição
(Cribb et al., 2009; Siegel et al., 2009; Wright et al., 2010). Portanto, não há um
controle de expressão para transcrição a nível de cada mensageiro.
Desta forma os níveis de mRNA presentes nas células acabam sendo
regulados pelo seu processamento, transporte para o citosol e sua
21
estabilização ou degradação (De Gaudenzi et al., 2011). A degradação pode
ocorrer quando não há tradução e é mediada por proteínas que reconhecem
especificamente os diferentes tipos de mRNA a serem expressos numa dada
condição ou estágio de cada parasita (Clayton e Shapira, 2007). Também se
propõe que uma parte dos mRNAs de Trypanosoma que não são traduzidos
podem se acumular em estruturas denominadas grânulos de estresse
(Cassola, 2011). Estas estruturas se formam rapidamente quando as condições
ambientais são modificadas e poderiam levar o parasita a um novo padrão de
expressão gênica para cada condição. Estes grânulos de estresse acumulam
mRNAs, fatores de iniciação, proteínas ligantes de RNA e remodeladoras da
estrutura do mRNA (Dupe et al., 2014; Kramer et al., 2008; Mani et al., 2011),
porém ainda não se conhece de que forma poderia ocorrer um acúmulo
diferencial a cada nova situação.
1.2 Síntese proteica
A síntese proteica em eucariotos é um processo celular na qual os
mRNA são decodificados e traduzidos para a formação de uma sequência
polipeptídica, resultando em uma proteína. A tradução é dividida em etapas:
iniciação, elongação, terminação e reciclagem dos fatores envolvidos. Estes
processos ocorrem nos ribossomos e são mediados por fatores que controlam
e regulam cada uma destas etapas que em procariotos e eucariotos recebem a
denominação de (p) e (e) respectivamente, além do nome da etapa em letras
maiúsculas I, E, ou T, para iniciação, elongação e terminação,
respectivamente.
22
1.2.1 Iniciação
No início da tradução há a formação de um complexo ternário (Figura 3).
Este complexo ternário é constituído pelo fator eIF2, uma molécula de GTP e o
tRNAmet iniciador aminoacilado (Hinnebusch e Lorsch, 2012). O complexo
ternário interage com a subunidade 40S do ribossomo mediado pelos fatores
eIF3, eIF1A e eIF5, formando o complexo pré-iniciador, 43S. O complexo 43S
se associa então a um complexo formado pelo mRNA e a proteínas que se
ligam a poliadenosina (PABP) e ao eIF4E que se liga a modificação de metil-7-
guanosina (m7G) da extremidade 5’ do mRNA agrupadas pelo fator eIF4G.
Com isto, passa a ocorrer a varredura da fita do mRNA até o códon de
iniciação (AUG), quando se forma o complexo 48S. No momento em que o
tRNAmet se pareia com o códon de iniciação no sítio P do ribossomo o GTP
ligado ao fator eIF2 é hidrolisado à GDP pelo eIF5B, desencadeando a
dissociação do fator eIF2 e a ligação da subunidade ribossomal 60S ao
complexo. Com a ligação da subunidade 60S do ribossomo, os fatores de
iniciação (eIF1, 3, 4B, 4F e 5) se associam e o complexo 80S se forma,
permitindo ocorrer o processo de elongação.
23
Figura 3. Esquema ilustrativo do inicio da tradução de eucariotos. Adaptado: (Klann e Dever, 2004)
1.2.2 Elongação
O ribossomo apresenta três sítios de ligação ao tRNA. Os sítios P
(Peptidil), A (Aminoacil) e E (saída) (Figura 4). O começo da elongação é
definido quando o tRNA aminoacilado está presente no sítio A pareando com o
Complexo
ternário
Complexo
pré-iniciador
Complexo
pré-iniciador
Ribossomo
24
códon do mRNA, o que causa mudança de conformação do eEF1,
desencadeando hidrólise e liberação do GTP associado ao complexo (Gorgoni
et al., 2014). A próxima etapa da elongação é a translocação do tRNA do sítio
A para o sítio P do ribossomo, deixando o sítio A vazio para o pareamento de
um novo tRNA com o códon subsequente. Para que o pareamento do próximo
códon ocorra, o ribossomo se desloca três bases do mRNA. Neste momento o
sítio A e P estão carregados propiciando a formação da ligação peptídica entre
os dois aminoácidos, catalisado pela peptidil-transferase. Este processo ocorre
enquanto o ribossomo se desloca pela fita de mRNA até o próximo códon,
desencadeando a translocação do tRNA presente no sítio P para o sítio E
acoplado a defosforilação do fator eEF2.
1.2.3 Terminação
Este processo acontece quando o ribossomo e os fatores de terminação
estão pareados com códon de terminação (STOP códon) no sítio A, causando
a dissociação da cadeia polipeptídica dos ribossomos. Existem alguns fatores
de liberação que se ligam ao sítio A do ribossomo e que auxiliam na
Figura 4. Esquema do processo de elongação de eucariotos. Adaptado; (Van Dyke et al., 2009).
25
dissociação da proteína dos ribossomos (Powell, 2010). Para que um novo
ciclo se inicie é necessária à reciclagem dos fatores associados à tradução.
1.3 Mecanismos de regulação da tradução
A regulação da tradução acontece principalmente durante o processo de
iniciação. Ela ocorre pela disponibilidade e ação dos fatores envolvidos através
de modificações pós-traducionais. Uma das principais formas de controle do
início da tradução decorre da fosforilação do fator de iniciação eIF2 presente no
complexo pré-iniciador. Isto porque, para que haja formação do complexo de
iniciação, o eIF2 deve conter uma molécula de GTP (Shin et al., 2011). Como o
GTP é hidrolisado quando o complexo de iniciação se dissocia após o encontro
com o códon AUG, o eIF2 contendo moléculas de GDP se acumula. Para que
um novo ciclo de tradução ocorra, faz-se necessário a conversão do GDP em
GTP. Esta conversão GDP/GTP é catalisada pelo fator de troca de guanosina
denominado eIF2B, sendo esta conversão inibida quando a subunidade α do
eIF2 é fosforilada, diminuindo assim a disponibilidade de eIF2 para o início da
tradução (Gordiyenko et al., 2013).
O eIF2 é uma proteína que apresenta subunidades denominadas α, β e
γ. A subunidade γ, é responsável pela ligação da proteína ao ribossomo, além
de permitir a ligação do tRNA (Figura 5). Em Saccharomyces cerevisiae, a
subunidade γ, apresenta uma região N-terminal extra em relação aos demais
organismos, sendo essa porção extra de 80 aminoácidos, responsável pela
regulação da atividade da fosfatase que defosforila o eIF2 (Rojas et al., 2014).
26
Figura 5. Estrutura das subunidades do fator eIF2. A seta indica a posição do sítio de fosforilação da
subunidade α (Gordiyenko et al., 2013).
A subunidade α é substrato de proteínas quinases que são ativadas em
condições de estresse celular. Estas quinases fosforilam um resíduo de serina
que inibe a troca de GDP/GTP. A inibição ocorre pela mudança de
conformação no complexo eIF2 e neste caso a subunidade do fator eIF2 liga-se
à subunidade delta do fator eIF2B e não à subunidade épsilon (Gordiyenko et
al., 2013) (Figura 6).
Figura 6. Esquema da interação entre o fator eIF2 e o fator eIF2B. A. O modelo exemplifica as
interações e entre subunidades (linha tracejada em vermelho) e resíduos (linha tracejada em verde e laranja). B. Esquema da interação entre eIF2 e eIF2B baseado no modelo homólogo, exemplificando os
passos da interação (1-2) a subunidade ε-cat do eIF2B promove a liberação de GDP associado a eIF2γ, e a mudança na estrutura (3), permitindo a transferência do GTP (4), e subsequentemente a liberação do eIF2 (5) .
27
A fosforilação do eIF2α e a diminuição da disponibilidade do complexo
ternário levam à inibição da tradução da maioria dos mRNAs.
Consequentemente mRNAs contendo diversos códons de iniciação são assim
preferencialmente traduzidos por aumentar o tempo de residência do complexo
de iniciação (Palam et al., 2011). Entre as proteínas traduzidas nestas
condições estão fatores de transcrição de genes responsáveis para reverter o
estado de estresse em que a célula se encontra. Por exemplo, em mamíferos,
após a fosforilação do eIF2α, a tradução da proteína ATF4 é aumentada
(Rzymski et al., 2009). O mesmo ocorre em leveduras, para a proteína GCN4
(Castilho et al., 2014). O mRNA que codifica o GCN4 apresenta anteriormente
à sua sequência codificadora (ORF) quatro pequenas ORFs, denominadas
“upstream ORF” (uORF). Estas uORFs evitam que haja iniciação da tradução
da ORF principal de GCN4 em condições normais (Hinnebusch, 2005). Quando
o eIF2α é fosforilado, a quantidade de complexos ternários diminui e a tradução
das uORF1 se torna mais lenta devido à demora na formação do complexo
43S. Isso faz com que o complexo 43S forme-se preferencialmente na uORF4
e na ORF principal da GCN4.
O aumento da quantidade de ATF4 leva a transcrição de genes
específicos. Exemplos são as proteínas CHOP e GADD34. A proteína CHOP
causa diminuição da quantidade de Bcl-2, uma proteína anti-apoptótica da
mitocôndria (Palam et al., 2011). Assim, se o estresse perdurar, a célula pode
entrar em apoptose. A GAAD34, por sua vez, é uma subunidade regulatória de
uma fosfatase que especificamente remove a fosforilação de eIF2, revertendo
o efeito do estresse. Além de GAAD34, células de mamíferos expressam
constitutivamente as subunidades regulatórias de fosfatases denominada
28
CReP que também mantem baixo os níveis de eIF2α fosforilado (Kloft et al.,
2012). Já em leveduras a proteína fosfatase responsável pela ligação na
subunidade γ e defosforilação da subunidade α, é uma PP1/GLC7. Isso
acontece em S. cerevisiae devido à presença da região extra na porção N-
terminal da proteína como mencionado acima. As demais leveduras não
apresentam essa extensão, sugerindo haver um mecanismo variável na
regulação da atividade da fosfatase de eIF2 (Rojas et al., 2014).
A iniciação também pode ser controlada pela disponibilidade de
proteínas ligantes do “cap” do mRNA mensageiro (eIF4E) evitando a formação
do complexo de iniciação (Dhalia et al., 2005). Em mamíferos a proteína de
ligação a eIF4E, denominada 4EBP, inibe a formação do complexo. A proteína
4EBP pode ser fosforilada por uma proteína quinase denomina de TOR
derivado do inglês “Target of Rapamycin”. Rapamicina é uma droga
imunossupressora que inibe a ação desta enzima, parando a tradução
(Abraham, 2002; Wullschleger et al., 2006). A quinase TOR é ativada quando
há disponibilidade de aminoácidos na célula, fosforilando a 4EBP, suprimindo o
seu papel inibidor e permitindo haver tradução e crescimento celular (Wang e
Proud, 2009). Este mecanismo é encontrado em metazoários e garante que a
síntese proteica só ocorra se houver disponibilidade de nutrientes.
1.4 Proteínas quinases de eIF2
Em leveduras apenas uma quinase é capaz de fosforilar eIF2α na serina
51. Ela foi identificada pelo fato de mutantes sem a proteína (Δgcn2) não
responderem a estresse de aminoácidos e por possuir domínios ligantes de
RNA de dupla fita (HisRS) capazes de interagir com tRNAs. É por isto chamada
em inglês “general control non-derepressible 2 (GCN2) (Wek et al., 1990). Esta
29
proteína tem como característica apresentar um domínio característico de
histidil-tRNA sintetase (HisRS) na região C-terminal, além de um domínio na
região N-terminal, denominado RWD derivado de “RING finger-containing
proteins, WD-repeat-containing proteins, and yeast (DEAD (DEXD)-like
helicases).” Ela possui também um domínio pseudo-quinase na região N-
terminal da proteína, além do domínio quinase na região central da proteína. A
quinase é ativada em situações de carência de aminoácidos. Esta carência
causa um acúmulo de tRNAs não carregados que se ligam ao domínio HisRS,
resultando na dimerização da quinase e sua ativação com consequente
fosforilação do fator eIF2α (Dever e Hinnebusch, 2005). O estado inibido
decorre da interação do domínio pseudo-quinase com o domínio quinase. Além
da presença de tRNAs não carregados, em S. cerevisiae, a quinase é também
ativada por radiação ultravioleta (UV) (Hinnebusch, 2005).
Em mamíferos, quatro diferentes proteínas quinases são capazes de
fosforilar eIF2α especificamente na serina 51 que está envolvida na ligação de
eIF2B. Além de um homólogo à GCN2, outras três quinases foram
identificadas. Uma delas é chamada de HRI, de “Heme Responsive
Inactivator”. Ela é ativada quando a quantidade de heme citosólico é diminuída
em eritroblastos (Chen e London, 1995). Na região N-terminal e C-terminal da
HRI há sítios de ligação de heme, sendo que somente a ligação no sítio da
região C-terminal é reversível. Em condições de carência de heme, o sítio do
C-terminal fica livre provocando a dimerização da quinase e consequentemente
sua autofosforilação na treonina 485 e ativação da quinase. Há estudos que
apontam a ativação da quinase em ambientes de estresse osmótico ou
oxidativo, independentemente da presença de heme (Han et al., 2001).
30
Outra proteína quinase capaz de fosforilar eIF2 é a PKR (Protein
Kinase R). Esta enzima é ativada pela ligação de RNAs de dupla fita (ds-RNA)
em dois domínios possibilitando a dimerização da quinase e autofosforilação
quando há infecções virais. A parada na tradução é um mecanismo de inibição
da tradução de mensagens do vírus. O domínio quinase na PKR está presente
na região C-terminal (Garcia et al., 2007).
A quarta quinase presente em mamíferos é denominada PERK (Protein
kinase R (PKR)-like Endoplasmic Reticulum Kinase). Esta quinase está
localizada na membrana do retículo endoplasmático, com a porção C-terminal
no citosol da célula e a região N-terminal no lúmen do retículo endoplasmático
(Chakrabarti et al., 2011). A PERK está associada à proteína de ligação a
imunoglobulina (BiP), uma proteína chaperona que auxilia no dobramento de
proteínas presentes no retículo endoplasmático. BiP inibe a ativação da
quinase em condições normais. Em condições de estresse de retículo
endoplasmático causado pela não formação de pontes bissulfeto devido a um
estado mais redutor, há o acúmulo de proteínas mal dobradas e desta forma a
BiP dissocia-se de PERK, para atuar como chaperona. A dissociação de BiP
causa a dimerização da PERK, sua autofosforilação e consequentemente sua
ativação (Chakrabarti et al., 2011).
1.5 Fatores de início da tradução em Trypanosoma
As proteínas envolvidas na regulação da síntese proteica apresentam
grande conservação ao longo da evolução. Homólogos de eIF4A, eIF4E, eIF4G
e subunidades de eIF4F, responsáveis por facilitar o recrutamento da
subunidade menor do ribossomo e o mRNA estão presentes em Leishmania e
Trypanosoma (Tabela I). No entanto, existem quatro homólogos de eIF4E em
31
Leishmania e Trypanosoma brucei, todos com característica de se ligar ao cap
do mRNA (Freire et al., 2011). Cinco homólogos de eIF4G foram detectados,
sendo o eIF4G3 e eIF4G4 responsáveis pela associação com eIF4E, que
também apresenta dois homólogos nestes organismos. Além disso, os eIF4E
tem uma extensão na região N-terminal (Freire et al., 2011). Com isso foram
encontrados dois complexos eIF4E4/eIF4G3/eIF4AI e eIF4E3/eIF4G4/eIF4AI
nos tripanossomatídeos (Freire et al., 2011).
O fator eIF2 apresenta três subunidades, como nos demais organismos,
com as subunidades β e γ altamente conservadas. Isto é compatível com o fato
de se encontrar no genoma as principais subunidades do fator eIF2B
responsável pela troca de GDP/GTP associado ao eIF2γ, ambos conservados
nos tripanossomatídeos. A subunidade α do fator eIF2, no entanto, apresenta
uma região N-terminal extra em relação à subunidade de mamíferos e S.
cerevisiae. O alinhamento dos diferentes eIF2α mostrou que o sítio de
fosforilação na serina 51 em mamíferos corresponde a treonina 169 em T. cruzi
(Tonelli et al., 2011). A fosforilação desta treonina já foi demonstrada em
Leishmania e T. brucei (Cloutier et al., 2012; Kramer et al., 2008; Tonelli et al.,
2011).
32
Figura 7 Alinhamento da sequência de aminoácidos da subunidade α do fator eIF2. Estão presentes no
alinhamento as sequências de aminoácidos das proteínas de Kinetoplastida, de T. gondii, P. falciparum,
H. sapiens, M. musculus e S. cerevisiae, respectivamente. Em preto indicamos a sequência de
aminoácidos semelhantes entre todos os organismos do alinhamento. Em cinza aminoácidos
semelhantes em alguns organismos.
33
Contudo, a análise da região N-terminal extra, sugere a presença de
uma sequência com características similares à encontrada próxima a serina 51
que é fosforilada em mamíferos com os aminoácidos LSRR conservados,
sugerindo assim, a existência de outro possível sítio de fosforilação na serina
43 em T. cruzi e T. brucei, mas não em outros protozoários da ordem
kinetoplastida. Talvez no gênero Trypanosoma a subunidade α apresente uma
segunda função ou uma resposta diferenciada em relação aos níveis de
fosforilação dos dois sítios presentes.
Figura 8 Alinhamento da região N-terminal da subunidade α do fator eIF2. Estão presentes no
alinhamento a sequência de aminoácidos de kinetoplastideos, T. gondii, P. falciparum, H. sapiens, M.
musculus e S. cerevisiae respectivamente. Em preto indicamos as sequências de aminoácidos
semelhantes entre todos os organismos do alinhamento. Em cinza aminoácidos semelhantes em
alguns organismos.
34
Tabela I. Genes relacionados ao início da tradução em T. cruzi
Gene TriTrypDB kDa (T. cruzi) Cromossomo kDa Mamífero
kDa S cerevisiae
eIF2α TcCLB.508153.730 50 36 38 36
eIF2γ TcCLB.503819.30 53 41 52 53
eIF2β TcCLB.507063.20 38 28 38 38
eIF4E1 TcCLB.506127.170 28 39 25 25
eIF4E2 TcCLB.511353.40 26 40
eIF4E3 TcCLB.511353.40 28 40
eIF4E4 TcCLB.421959.10 36 32
eIF4A1 TcCLB.510155.180 49 32 45 37
eIF4G1 TcCLB.506739.10 120 3 190
eIF4G2 TcCLB.508277.340 113 7 80 110
eIF4G3 TcCLB.508837.130 68 25 160 65
eIF4G4 TcCLB.508837.130 69 25
eIF4G5 TcCLB.508989.90 84 12
eIF1A TcCLB.511367.360 49 5 17
1.6 Proteínas quinases de eIF2 em Trypanosoma
Em tripanossomatídeos existem três quinases com características de
fosforilar eIF2α, semelhantes respectivamente à GCN2, PERK, e HRI. Elas
foram denominadas respectivamente de K1, K2 e K3. No entanto, a K2 de T.
brucei tem uma localização diferente na célula, próxima a bolsa flagelar e não
no retículo endoplasmático (Moraes et al., 2007). Já a proteína quinase
homóloga à PERK de Leishmania infantum está localizada no retículo
endoplasmático e apresenta um papel chave na diferenciação para formas
amastigotas do parasita (Cloutier et al., 2012). O papel desta enzima está
relacionado à sua capacidade de promover a fosforilação de eIF2α, que é
necessário para a diferenciação do parasita. Isto é compatível com nossos
resultados, onde mostramos que formas epimastigotas de T. cruzi que
superexpressam eIF2α contendo uma mutação no sítio de fosforilação
apresentam diminuição na diferenciação para tripomastigotas-metacíclicos
35
(Tonelli et al., 2011). No entanto, apesar de estar localizada no retículo
endoplasmático, a LinPERK não responde a estresse causado por um agente
redutor, o ditiotreitol (DTT), um típico ativador das PERKs de mamíferos (Chow
et al., 2011). Estes fatos demonstram que em tripanossomatídeos as proteínas
quinases de eIF2α devem ter se especializado para permitir que cada parasita
reconheça estímulos diferentes, já que durante o ciclo de vida passam por
ambientes distintos. Recentemente a TbK3 foi caracterizada por meio de
ensaio de imunoprecipitação, evidenciando sua associação com TRF4, um
proteína que está associada à TATA-binding protein na região do SL em T.
brucei. A TbK3 está associada ao retículo endoplasmático e em situações onde
o pH é alterado a proteína vai para o núcleo e regula a fosforilação da TRF4
(Hope et al., 2014).
Também em outros parasitas protozoários estas proteínas quinases tem
papel no controle da tradução. Por exemplo, em plasmódio, o protozoário
causador da malária humana, nocautes para quinase denominada eIK2 deixam
de fosforilar eIF2α, levando a uma perda de infectividade do protozoário (Zhang
et al., 2010; Zhang et al., 2013). Esta seria uma forma de resposta ao
mecanismo de estresse necessário para a diferenciação do parasita na
glândula salivar do mosquito. Outra proteína quinase que responde a carência
de aminoácidos é a PfeIK1 (Fennell et al., 2009). Recentemente foi descrita
uma quinase de Plasmódio que seria ortóloga a PKR de mamíferos. Ela foi
denominada PK4 e tem como principal função fosforilar a serina 59 do fator
eIF2α do parasita, levando a uma parada na síntese de proteínas no estágio
esquizonte e, portanto, controlar o ciclo eritrocitário do protozoário (Zhang et
al., 2012). Taquizoítos de Toxoplasma gondii expressam uma proteína quinase
36
de eIF2α denominada TgIF2K-A que é similar à PERK. Esta quinase se localiza
no retículo endoplasmático e está associada à BiP/GRP78, sendo capaz de
responder ao tratamento de tunicamicina e levando a célula a ter altos níveis
de fosforilação de eIF2α. A fosforilação de eIF2 neste organismo causa a
formação de bradizoítos que são formas latentes deste parasita (Narasimhan et
al., 2008). Outra quinase presente em T. gondii é a TgeIF2-B que apresenta um
mecanismo de ativação identificado apenas em T. gondii (Park et al., 2013).
Além dessas quinases são descritas TgIF2K-C e TgIF2K-D. TgIF2K-D é
homóloga a GCN2 e é importante na manutenção do parasita no ambiente
extracelular durante o ciclo de vida (Joyce et al., 2010). Não está bem clara a
função da TgIF2K-C, e sugere-se que seja uma segunda quinase do tipo GCN2
(Konrad et al., 2011).
1.7 Aquisição de nutrientes pelo T. cruzi
Ao longo do seu ciclo de vida, o T. cruzi enfrenta mudanças ambientais
com grandes diferenças na disponibilidade de nutrientes. Por exemplo, no tubo
digestivo do inseto vetor o parasita encontra um ambiente rico em nutrientes
derivados do sangue do hospedeiro mamífero. Isso faz com que o parasita se
multiplique e acumule nutrientes. Com o decorrer do tempo, a quantidade de
nutrientes no tubo digestivo diminui porque o inseto só se alimentará
novamente quando todo o conteúdo intestinal se esgotar (Lara et al., 2007).
Esta diminuição de nutrientes é apontada como o que causa a diferenciação
para formas infectivas que serão eliminadas com as fezes dos insetos
(Contreras et al., 1985).
A obtenção de nutrientes pode ocorrer através da incorporação através
do citóstoma, uma abertura na região anterior deste Trypanosoma (Cupello et
37
al., 2011) ou de endocitose através da bolsa flagelar presente em todos os
Kinetoplastida (Lara et al., 2007). Proteínas adicionadas no meio de cultura de
epimastigotas entram no parasita através do citóstoma e se acumulam em
endossomos secundários denominados reservossomos. Além disto, este
compartimento é importante para o acúmulo de nutrientes como colesterol, que
é internalizado e estocado nos reservossomos formando inclusões lipídicas,
estimulando a proliferação de epimastigotas (Pereira et al., 2011).
Por outro lado, são descritos diversos transportadores de membrana
responsáveis pela incorporação de aminoácidos, bases nitrogenadas e
açúcares nos tripanossomatídeos (Lara et al., 2007). Por exemplo, a forma
amastigota intracelular apresenta altos níveis de transportadores de prolina que
leva ao acúmulo e uso deste aminoácido neste estágio (Tonelli et al., 2004). Já
a glicose é absorvida preferencialmente por transportadores mais expressos
nas formas proliferativas epimastigotas (Silber et al., 2009).
Dentre os nutrientes necessários para o desenvolvimento do T. cruzi
está a molécula de heme que não é sintetizada pelo protozoário (Cupello et al.,
2014). O heme é importante para a formação de diversos complexos
enzimáticos essenciais a suas vias metabólicas (Nogueira et al., 2011). Entre
eles se encontram os diversos citocromos que atuam na cadeia respiratória e
enzimas do metabolismo de óxido-redução como as peroxidases.
1.8 Reservossomos e estoque de nutrientes
Reservossomos são organelas elétron densas e presentes na região
posterior da forma epimastigota do T. cruzi (Figura 9). Estas organelas são
locais de acúmulo de macromoléculas e já foi demonstrado que contém
lipídios, heme além de hidrolases digestivas (Cunha-e-Silva et al., 2006;
38
Pereira et al., 2011; Sant'Anna et al., 2009; Sant'Anna et al., 2008; Yoshida,
2008). Uma enzima abundante e presente nos reservossomos é a cruzipaína,
uma cisteína protease que participa de processos catabólicos na forma
epimastigota (Yoshida, 2008).
Figura 9. Esquema da forma epimastigota de Trypanosoma cruzi. A imagem ilustra principais organelas
da parasita (Souza, 2008).
Durante a diferenciação para a forma metacíclica os reservossomos
desaparecem e a cruzipaína passa a ser secretada, participando nos
processos de invasão celular por formas tripomastigotas (Yoshida e Cortez,
2008). Como a diferenciação ocorre quando os epimastigotas são colocados
em ambientes com poucos nutrientes, sugere-se que os reservossomos sejam
consumidos em processos autofágicos e que estes eventos estejam
associados com a diferenciação (Alvarez et al., 2008). Desta forma, é possível
que exista uma relação entre a síntese proteica e a degradação dos
reservossomos e que a presença das quinases de eIF2α esteja envolvida
nestes processos. Não existem, contudo muitos trabalhos sobre o envolvimento
39
de eIF2α nas vias de endocitose. Alguns trabalhos mostram que esta proteína
teria um papel no tráfego de vesículas de células após a infecção com
Staphylococcus aureus (Kloft et al., 2012).
40
2 OBJETIVOS
Baseado no exposto acima fica evidente que as alterações ambientais
podem estar causando sinais que levam o T. cruzi a um novo programa de
expressão gênica e consequentemente sua diferenciação. Assim, a nossa
hipótese é de que haja alteração da tradução e possivelmente alguns mRNA
sejam traduzidos preferencialmente como consequência da disponibilidade de
nutrientes e/ou da presença de fatores ambientais específicos. Para
demonstrar a validade desta hipótese, nesta tese procuramos verificar se a
fosforilação de eIF2 de T. cruzi tem um papel neste processo e quais os sinais
e quais as proteínas quinases estão envolvidas. Com o objetivo de responder
estas questões procuramos mais especificamente:
1. Avaliar o papel da fosforilação de eIF2α no crescimento e na
diferenciação da forma epimastigota na forma tripomastigota
metacíclica.
2. Verificar o papel da serina 43 de eIF2α em T. cruzi.
3. Caracterizar o papel da proteína quinase K2 de T. cruzi.
4. Identificar os sinais que induzem a ativação da K2 de T. cruzi.
41
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Trypanosoma cruzi
A forma epimastigota do T. cruzi (cepa Y) foi cultivada à 28ºC em meio
de infusão de fígado e triptose (LIT) (Camargo, 1964) acrescido de 10% de
soro fetal bovino (SFB) e 10 mg/mL de hemina. Para diferenciação em
tripomastigotas-metacíclicos, os epimastigotas em fase exponencial de
crescimento (1 x 107/mL) foram coletados e centrifugados a 2.000 g por 10 min
e ressuspensos na concentração de 5 x 108 parasitas/mL em meio
mimetizando a composição da urina do inseto vetor (TAU) (Contreras et al.,
1985). O meio TAU continha 190 mM NaCl, 17 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM
CaCl2, 8 mM tampão fosfato, pH 6,0. Após 2 h à 28ºC, os parasitas foram
diluídos em meio TAU suplementado com 2,5% de bicarbonato de sódio, 500
U/mL de penicilina, 10 mM prolina, 50 mM ácido glutâmico, 2 mM ácido
aspártico, 10 mM glicose e incubados à 28ºC por 96 h (Contreras et al., 1985).
Após 96 h os tripomastigotas metacíclicos foram purificados por colunas de
DEAE-celulose como descrito em (Stiles e Kierszenbaum, 1986).
As formas tripomastigotas sanguíneas foram obtidas a partir de células
LLCMK2 (ATTC-CCL5) e cultivadas em meio de Eagles modificado por
Dulbecco contendo 1 g/L de glicose (DMEM) e 10% de SFB, à 37oC em
atmosfera de 5% de CO2. Os tripomastigotas eram recolhidos do meio de
cultura 5 dias após a infecção das células. Amastigotas intracelulares foram
obtidos 72 h após infecção, através da lise de células LLCMK2 como descrita
anteriormente (Marques et al., 2011).
42
3.2 Oligonucleotídeos, plasmídeos e anticorpos
Os oligonucleotídeos, plasmídeos e anticorpos utilizados neste trabalho
estão listados na tabela II, III e IV.
Tabela II . Oligonucleotídeos utilizados neste trabalho
Oligo Sequência Função eif2FX 5’ TCTAGAATGTCGTACTACCATCACC Amplifica o TceIF2α na direção sense
com o sítio XbaI
eif2 RBg 5’ GCAACGTGACATACAATGGATCTCACC Amplifica o TceIF2α na direção anti-sense
eifSA 5’ CGTCATCCAACCCTCGCGCGGAGAAAACTCACC Amplifica o TceIF2α na direção sense inserindo uma mutação no códon que codifica a serina 43
eif2RH 5’ AAGCTTTCAATCTGTCTCATCATC Amplifica o TceIF2α na direção anti-sense com o sítio HindIII
5k2fowApaI 5’ GGGCCCACACGGAAGCGAGCAAACAC Amplifica a região 5’ UTR da TcK2 na direção sense com o sítio ApaI
5revXbaI 5’ AGATCTTTAGGGAAAAATGCCACAG Amplifica a região 5’ UTR da TcK2 na direção anti-sense com o sítio XbaI
3'K2fowSal 5’ GTCGACTCAAAACACATGACGCGC Amplifica a região 3’ UTR da TcK2 na direção sense com o sítio SalI
3K2RevSac 5’ GAGCTCTTCCATTGGTGTCCATC Amplifica a região 3’ UTR da TcK2 na direção anti-sense com o sítio SacI
5K2fow 5’ GGGCCCACACGGAAGCGAGCAAACAC Amplifica TcK2 na direção sense
G418Rev 5’ AAGCTTGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATA Amplifica gene de geneticina na direção anti-sense
HigroR 5’ CAGCTGGATAAGGAAACGGG Amplifica gene de higromicina na direção anti-sense
BlastRev 5’ CAGGTCGCTATGTTCAGTCCAC Amplifica gene de blasticidina na direção anti-sense
5’ GAATTCCCAGCAGTTCCA AAAGCCCGA Amplifica a região do domínio quinase na TcK2 na direção sense
5’ CTCGAGTCGACCCGGCTGTCGCAGGGCTTTAACGA
Amplifica a região do domínio quinase na TcK2 na direção anti-sense
K2TcXbaFor 5’ TCTAGAATCTGCCTCCAGTGATGG Amplifica a região c-terminal da TcK2 na direção sense com sítio XbaI
K2TcNotRev 5’ GGCCGCTTACGATTTTTTCTC Amplifica a região c-terminal da TcK2 na direção anti-sense com sítio NotI
K2TcBam 5’ GGATCCTGTGTTTTGAGTAAACTC Amplifica a região c-terminal da TcK2 na direção sense inserindo um sítio BamHI
43
K2TcNotFor 5’ GCGGCCGCATAAATTGCGCG Amplifica a região c-terminal da TcK2 na direção anti-sense inserindo um sítio NotI
TceiF2-K2mut_rev
5’ CATCTGCTATACGAATAGCCGCGACGGCGTAGG Amplifica a região C-terminal da TcK2 para obtenção da mutação K695A na direção anti-sense.
Tck2mut_fow 5’ CCTACGCCGTCGCGGCTATTCGTATACCAGATG Amplifica a região C-terminal da TcK2 para obtenção da mutação K695A na direção sense.
Tck2XBAfow 5’ GCTCTAGATGCCGGATGCCTCTATTCG Amplifica a região a TcK2 para obtenção na direção sense, inserindo um sítio XbaI.
TcK2XhoIrev 5’ GCCTCGAGTCATGTGTTTTGAGGTAAAC Amplifica a região a TcK2 para obtenção na direção sense, inserindo um sítio XhoI.
Tabela III - Plasmídeos utilizados e produzidos nesta tese
Plasmídeo Gene clonado Origem p33 TceIF2α - Wt
- Ser43Ala - Thr169Ala - Ser43ala/Thr169Ala (2Mut)
(Ramirez et al., 2000)
pDEST-17-G TceIF2α – Wt pET14b TceIF2α - Ser43Ala
- Thr169Ala - Ser43ala/Thr169Ala (2Mut)
pGEMTeasy-G418 TcK2KO pROCK TcK2 full e TcK2 Mut K695A
Tabela IV – Anticorpos utilizados nesta tese.
Anticorpo Diluição IF Diluição WB Procedência
HA 1:1000 1:1000 Covance (anticorpo monoclonal HA.11
Clone 16B12)
Histag 1:500 Roche (anticorpo monoclonal)
Tubulina 1:50000 Produzido durante o doutorado por
Leonardo Augusto
Cruzipaína 1:5000 (Monteiro et al., 2001) (Anticorpo produzido
em coelho doado pelo Prof. Dr. Julio
Scharfstein)
HSP70 1:20000 (McDowell et al., 1998) (anticorpo
produzido em coelho)
BiP 1:5000 (Bangs et al., 1993) (anticorpo
produzido em coelho)
2KD 1:1500 Produzido pela Dr. Teresa de Jesus
mAb 5D10 1:200 Monoclonal produzido pela Dr. Teresa
de Jesus
mAb 2C2 1:1000 (Andrews et al., 1987) (anticorpo
monoclonal produzido no laboratório)
44
3.3 Western Blot
Para os Western Blot os parasitas eram coletados por centrifugação a
2000 g por 5 min, ressuspensos em PBS, e centrifugados uma vez mais. Os
precipitados contendo os parasitas foram lisados em tampão de amostra para
gel de poliacrilamida e SDS (SDS-PAGE) e submetidos à eletroforese no
sistema MiniProtean III da BioRad (Laemmli, 1970). Após a eletroforese, as
proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose por 2 h a 90 V no
sistema de transferência úmido BioRad utilizando tampão 2,5 mM Tris base e
19,2 mM de glicina contendo 20% de Metanol. As membranas foram
bloqueadas por 1 h com PBS contendo 5% de leite em pó desnatado (Molico,
Nestle) contendo 0,1% de Tween-20 e, em seguida, incubadas com anticorpo
primário diluído em PBS contendo 0,1% de Tween-20 por 1 h. As membranas
foram lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween-20 por 15 min cada
lavagem e então incubadas por 1 h com o anticorpo secundário conjugado com
peroxidase (Invitrogen) diluído a 1:10000 em PBS. As membranas foram
lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween-20, cada uma por 10 min,
e incubadas por 3 min com solução para ECL (Millipore). Por fim esta
membrana foi exposta a um sistema de aquisição de imagens (Li-COR
Odyssey).
3.4 Imunofluorescência
Para os ensaios de imunofluorescência, os parasitas foram recolhidos
por centrifugação a 2000 g por 5 a 10 min, lavados em PBS, e ressuspensos
em PBS para a concentração de 5 x 106/mL. Esta suspensão de parasitas era
adicionada sobre lâminas de vidro e assim mantida por 5 min a temperatura
ambiente. O excesso de solução era removido e os parasitas aderidos ao vidro
45
fixados com paraformaldeído a 4% em PBS por 20 min, seguido de tratamento
por 5 min com PBS contendo Triton-X100 a 0,1% para permeabilização. As
lâminas eram então lavadas com PBS e incubadas durante 30 min em PBS
contendo albumina de soro bovino (BSA) a 2%. As lâminas eram depois
incubadas com os anticorpos primários por 1 h à temperatura ambiente. Os
anticorpos eram removidos e as lâminas lavadas três vezes com PBS, e
novamente incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de coelho, ou de
camundongo conjugados a Alexa-fluor 488 ou 594 (Invitrogen, diluídos a
1:1000 em PBS). Na solução contendo o conjugado eram adicionados 10 μM
de DAPI para coloração de núcleo e cinetoplastos. Essa etapa era feita em
temperatura ambiente e no escuro. As lâminas eram depois lavadas em PBS
sucessivas vezes e montadas com Prolong Gold (Invitrogen). Os parasitas
marcados foram visualizados em microscópio de fluorescência Olympus BX-61.
Imagens eram adquiridas a cada 0,2 m no eixo Z usando uma objetiva de
100X, abertura numérica de 1,40, com o software Cell^M (Olympus Europe) e
posteriormente desconvoluídas usando o software Autoquant X 2.2 (Media
Cybernetics).
3.5 Geração de parasitas superexpressores de eIF2α
O DNA plasmidial pDESTeIF2α-6xHistag, foi utilizado como molde para
amplificar o gene de eIF2α por reação de polimerase em cadeia (PCR). Foram
feitas três construções inseridas no plasmídeo p33 todas contendo uma cauda
de histidina. Uma delas continha o gene original, outra a serina 43 substituída
por uma alanina (eIF2α S43A), outra a treonina 169 substituída por uma
alanina (eIF2α T169A). Uma quarta tinha a substituição da serina 43 e treonina
169 por alaninas (eIF2α 2MUT) (Figura 8). Inicialmente, o gene para expressar
46
a proteína mutada na serina 43 foi gerado a partir de dois fragmentos de PCR.
O primeiro fragmento com 788 pares de base (pb) foi obtido utilizando os
oligonucleotídeos eif2FX e eif2 RBg. O segundo fragmento com 1146 pb foi
obtido utilizando os oligonucleotídeos eifSA e eif2RH. Os dois fragmentos de
PCR foram purificados com PureLink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) e
fundidos em uma nova reação de PCR utilizando os iniciadores externos de
ambas as reações anteriores (eif2FX e eif2RH). Para construção do gene para
a proteína com a substituição da treonina 169 por uma alanina, o mesmo
procedimento descrito acima foi feito com os oligonucleotídeos eif2FX e eif2
RBg para o primeiro fragmento e eifTA169 e eif2RH para o segundo fragmento.
Os fragmentos foram igualmente unidos por PCR com os oligonucleotídeos
Eif2FX e eif2RH. Para a obtenção da proteína com dupla mutação, na serina
43 e treonina 169 por alanina, utilizamos como molde a construção eIF2
S43A, repetindo o processo utilizado para gerar a mutação para a treonina 169.
Os PCRs foram feitos com Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity
(Invitrogen). Os produtos finais dos PCR foram clonados no vetor pGEM®-T
easy (Promega) e utilizados para transformar E. coli DH5. As colônias
selecionadas em meio Luria Brentani (LB) em 2% ágar contendo 50 g/mL de
ampicilina foram inoculadas em 3 mL de meio LB líquido contendo 50 g/mL de
ampicilina e os plasmídeos purificados por lise alcalina (Sambrook et al., 1989).
Os DNAs plasmidiais foram analisados por digestão com enzimas de restrição
e aqueles com o padrão de digestão esperado foram sequenciados com
iniciadores internos do vetor pGEM. Os padrões de digestão foram analisados
por eletroforese em gel de agarose 0,8% contendo brometo de etídeo 0,001%
em tampão Tris-acetato-EDTA (TAE). O sequenciamento para confirmação das
47
sequencias foi feito com 100 ng do DNA plasmidial, 10 pmoles dos primers
sense e anti-sense no equipamento Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer.
Os fragmentos contendo as sequências esperadas foram clonados no vetor
p33 nos sítios de restrição XbaI e HindIII. Como os genes foram amplificados a
partir do eIF2 contendo cauda de histidina na região N-terminal, os mutantes
também conservaram esta etiqueta no N-terminal. Os plasmídeos obtidos de
cada um dos mutantes foram preparados em maior quantidade utilizando-se o
sistema de purificação QIAprep Spin MIniprep Kit (Qiagen) para ser inserido em
epimastigotas de T. cruzi, como descrito mais adiante.
3.6 Geração de nocautes da TcK2
As construções dos cassetes para o preparo de parasitas nocautes para
proteína quinase de eIF2α K2 (TcCLB.506559.129), foram realizadas a partir
da clonagem dos genes de resistência à geneticina, higromicina ou blasticidina,
flanqueados pelas regiões 5’ e 3’ não traduzidas da K2 (respectivamente,
5’UTR e 3’UTR). O vector pGEM-T easy contendo o gene de resistência a
geneticina flanqueado pelos sítios XbaI e SalI utilizado para clonagem do
cassete foi cedido pelo Prof. Dr. Carlos Renato Machado da Universidade
Federal de Minas Gerais, Brasil. A região 5’UTR foi amplificada utilizando como
molde o DNA genômico de formas epimastigotas cepa Y. Os oligonucleotídeos
utilizados foram 5k2fowApaI e 5revXbaI. A região 3’UTR foi amplificada
utilizando oligonucleotídeos 3'K2fowSal e 3K2RevSac. Estas regiões UTR
foram clonadas entre o gene de resistência de geneticina. Para substituir a
segunda cópia do gene da Tc-K2 o gene de resistência foi a higromicina ou a
blasticidina, também inseridas no vetor pGEM-T flanqueada pelos sítios XbaI e
48
SalI. Os plasmídeos obtidos foram confirmados pelo padrão de restrição e
utilizados para transfecção após serem linearizados com a enzima SalI.
Após a seleção com os respectivos antibióticos, os parasitas foram
clonados por diluição limitante. A substituição do gene da proteína quinase K2
pelo gene de resistência em cada etapa foi confirmada por PCR, utilizando
oligonucleotídeos que amplificam a região do domínio quinase da proteína e
que amplifiquem a região 5’UTR e um fragmento corresponde ao gene de
resistência. Para isto foram utilizados os iniciadores 5K2fow para região 5’UTR
e G418Rev para G418, o primer HigroR e BlastRev para Blast, e para o
domínio TcK2-KD-pGEX5X-1(F) e TcK2-KD-pGEX5X-1(R).
3.7 Etiqueta
Para a obtenção de parasitas contendo uma etiqueta endógena de HA
na proteína quinase K2, foi preparado um plasmídeo derivado do pTEX (Kelly
(Kelly et al., 1992), contendo uma sequência de nucleotídeos para expressar o
epítopo do gene do vírus da hemaglutinina (HA) entre os sítios BamHI e XhoI.
Em paralelo, a sequência correspondente a TcK2 foi amplificada utilizando
oligonucleotídeos K2TcXbaFor / K2TcNotR e K2TcNotFor (5’-
GCGGCCGCATAAATTGCGCG) / K2TcBam e clonados sequencialmente no
plasmídeos pTEX-HA para introduzir um sítio de NotI permitindo assim
linearizar e transfectar os parasitas. Os plasmídeos foram confirmados por
análise de restrição e sequenciamento.
3.8 Construções de plasmídeos para reinserção do gene da TcK2
Para a obtenção de parasitas superexpressores da TcK2 o gene da K2
foi clonado no plasmídeo pROCK entre os sítios XbaI e XhoI. Para obtenção da
proteína quinase mutada no sítio de ativação, foram desenhados dois pares de
49
oligos Tck2mut_fow e TceiF2-K2mut_rev (Tabela II), com substituição de um
nucleotídeo para alteração da lisina 695 por uma alanina. O primeiro ciclo de
PCR foi feito para a obtenção da mutação, um segundo PCR foi realizado para
a obtenção da proteína inteira com iniciadores que flanqueavam o gene TcK2
(Tck2XBA_fow e TcK2XhoIrev). Os plasmídeos foram confirmados por análise
de restrição e sequenciamento.
3.9 Transfecção de T. cruzi
Culturas de epimastigotas de T. cruzi em fase exponencial de
crescimento (1 x 107/mL) foram centrifugadas por 10 min a 2000 g, lavadas
uma vez com tampão de eletroporação TCEB (NaCl 137 mM, HEPES 21 mM
pH 7, KCl 5 mM, Na2HPO4 5,5 mM e glicose 0,77 mM) (Ramirez et al., 2000) e
cada 5 x 106 parasitas ressuspensos em 200 µL de TCEB. A esses 200 µL de
suspensão eram adicionados 40 μg dos plasmídeos a serem transfectados em
uma cubeta de eletroporação de 4 mm, mantida no gelo, e a mistura submetida
ao programa T. cruzi U033 do eletroporador Amaxa (Lonza). Após o pulso, as
células eram diluídas em meio LIT contendo 10% de soro fetal bovino. Dois
dias depois eram adicionados à cultura, 200 g/ml de geneticina G418, 200
g/mL de higromicina B, ou 5 g/mL de blasticidina para a seleção conforme o
caso. Para aumentar a eficiência de seleção os parasitas eram mantidos em
LIT contendo 20% de SFB.
3.10 Ensaios de invasão
Os ensaios de invasão celular foram realizados em placas de 24 poços
contendo lamínulas de vidro circular de 13 mm de diâmetro. Em cada poço
eram adicionadas 2 × 104 células LLCMK2 em 1 mL de meio DMEM com 10%
SFB e os experimentos realizados 24 h após. Para os ensaios de invasão, o
50
meio era removido de cada poço e 2 x 105 parasitas em 0,5 mL de meio DMEM
contendo 10% de SFB eram adicionados às células. Duas horas após, os
parasitas eram removidos, os poços lavados com PBS e as lamínulas fixadas
pela adição de 4% de paraformaldeído em PBS à temperatura ambiente por 20
min. Em seguida as lamínulas eram lavadas e montadas em reagente “Prolong
Gold” contendo antibranqueador (Invitrogen) na presença de DAPI. As
preparações eram observadas em microscópio Olympus (BX-61). Nos
experimentos em que se mediu a quantidade de parasitas internalizados e
aderidos às células, as lamínulas foram processadas por imunofluorescência
como descrito acima utilizando um anticorpo que reconhece a proteína de
superfície de formas amastigotas, o Anticorpo monoclonal 2C2 (Andrews et al.,
1987). O número de parasitas internalizados era contado examinando-se 500
células.
3.11 Ensaio de quinase
Para realizar os ensaios de quinase utilizamos como substrato as
proteínas recombinantes dos genes de eIF2α do T. cruzi (TcCLB.508153.730)
expressas em E. coli. O correspondente ao fator eIF2α original foi também
derivado do gene clonado no plasmídeo pDEST-17 nos sítios XbaI e HindIII
com uma etiqueta de seis histidinas (Tonelli et al., 2011). Também foram
utilizados os genes mutados preparados para a superexpressar a proteína em
T. cruzi descrito acima. Os genes mutados foram obtidos dos respectivos
plasmídeos p33 e clonados nos sítios XbaI e HindIII do plasmídeo pET14b
(Novagen). A enzima foi preparada somente com a parte do gene que codifica
o domínio quinase da TcK2 amplificada por PCR usando os iniciadores TcK2-
KD-pGEX5X-1(F) e TcK2-KD-pGEX5X-1(R) e clonado entre os sítios EcoRI e
51
XhoI do plasmídeo pGEX5X-1 (GE), para gerar uma fusão com a proteína
glutationa S-transferase (GST).
As proteínas que apresentavam histidina como “tag” foram expressas
em E. coli BL21DE3. Clones de bactéria que apresentavam o plasmídeo
pDEST-eIF2α ou pET14b com os genes de eIF2 mutado, foram utilizados
para o crescimento de um pré-inoculo em 5 mL de meio LB contendo 100
g/mL de ampicilina (LB/Amp) mantidos por 16 h à 37ºC. As culturas eram
então diluídas em 500 mL de LB/Amp e incubadas por aproximadamente 4 h a
37oC, quando atingiam uma densidade que correspondia 0,6 unidades de
absorbância a 550 nm. Neste momento, as bactérias eram colocadas em gelo
por 30 min e posteriormente incubadas com 0,5 mM de isopropil β-D-1-
tiogalactopiranosideo (IPTG), sob agitação, à 25ºC por 16 h. Após o
crescimento e a indução da expressão, as bactérias eram centrifugadas a 5000
g por 15 min, o precipitado ressuspenso em 25 mL do tampão A (50 mM Tris-
HCl pH 8, 0,3 M de NaCl e 0,1 mM de PMSF) e submetido à lise por duas
passagens em French Press (pressão de 2000 psi). Os lisados eram
posteriormente centrifugados a 15000 g por 20 min e os sobrenadantes
coletados e aplicados em uma coluna de níquel-agarose (Qiagem) pré-
equilibrada com o tampão A. A coluna era lavada com tampão A contendo de
50 mM de imidazol e a proteína ligada na coluna eluída com tampão A
contendo 500 mM de imidazol (pH 6).
O domínio quinase da TcK2 recombinante foi expresso pelo plasmídeo
pGEX-5X-1 em E. coli DE3 BL21 como descrito acima. A proteína
recombinante foi purificada em coluna de GST-Sepharose (GE) pré-equilibrada
em PBS e eluída no mesmo tampão contendo 0,1 M glutationa e
52
posteriormente dialisadas em tampão quinase 1X (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 50
mM NaCl) por 18 h a 4oC.
O ensaio de quinase foi realizado na presença de 5 µg/mL de eIF2α, 1
µg/mL de TcK2, 10 mM MgCl2, 10 µCi de [γ32 P] ATP (3000 Ci/mMol, Perkin
Elmer), 0,5 mM ATP e tampão quinase 1X, à 37ºC por 1 h. Ao final da reação
foi adicionado tampão de amostra para SDS-PAGE e as amostras submetidas
a eletroforese. Após a corrida, os géis foram corados com Coomassie R-250,
descorados, secos a vácuo e expostos a um écran para ser revelado no
aparelho de fosfor-imagem Typhon 9200 (GE).
3.12 Detecção de espécies reativas de oxigênio, H2O2 e peroxidases
O equivalente a 2 x 107 parasitas era coletado por centrifugação, e os
parasitas ressuspensos em 1 mL de PBS contendo 5 µM de CellRox
(Invitrogen). Após 30 min de incubação os parasitas eram centrifugados e
fixados com 4% de paraformaldeído por 20 min. Depois de fixados, os
parasitas eram ressuspensos em 1 mL de PBS e analisados em citômetro de
fluxo FACS Accuri C6 (BD Biosciences). A quantidade de ROS foi determinada
pela fluorescência relativa no canal FL-4, após a contagem de 10000 eventos.
Como controle, utilizamos parasitas não marcados. A fluorescência basal foi
subtraída da fluorescência das amostras tratadas.
Para detecção dos níveis de peróxido de hidrogênio, 2 x 107 parasitas
em 1 mL de meio LIT, foram incubados com 1 U de peroxidase na presença de
2 µM Amplex Red (Invitrogen) por 30 min. Os parasitas eram centrifugados e o
sobrenadante utilizado para medir a fluorescência, com excitação 530 nm e
emissão 590 nm no leitor de placa SpectraMax M3 (Molecular Devices). A
atividade total de peroxidase foi medida utilizando o sobrenadante do lisado de
53
2 X 107 parasitas/mL em 50 µL de tampão contendo 50 mM NaCl, 20 mM Tris-
HCl (pH 7,4) e 1% Triton-X100. A atividade foi determinada após a incubação
por 30 min do sobrenadante com 2 µM Amplex Red (Invitrogen) e 2 mM H2O2.
A quantificação de fluorescência foi realizada no leitor SpectraMax M3
(Molecular Devices) com emissão 530 nm e excitação 590 nm. Foram
realizadas três triplicatas biológicas e técnicas para cada parâmetro.
3.13 Atividade de superóxido dismutase (SOD)
O equivalente a 1 x 107 parasitas era coletado por centrifugação e o
precipitado formado ressuspenso em 200 µL de tampão SOD (50 mM fosfato
de potássio e 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Os parasitas eram submetidos à
sonicação em um aparelho da Active Motif, com três ciclos de 20 s cada. As
reações foram feitas a 25ºC em placa de 96 poços, contendo em cada reação
25 µL do lisado de parasitas, 10 mg/mL β-nicotinamida adenina dinucleotídeo
(NADH2) (Sigma) e 28 mg/mL azul de nitrotetrazólio (NBT) (Sigma). Para iniciar
a reação foram adicionados 25 µl de 3,3 mM fenazina de metilsulfato (Sigma).
A atividade de SOD foi determinada pela redução do azul de nitrotetrazólio, na
cinética de absorbância a 560 nm, como descrito por Ewing e Janero (1995).
3.14 Análise dos níveis de heme intracelulares e incorporação de
análogos de heme
Utilizou-se o método descrito por Miguel et al. (2013). Para isto, 2 x 107
células foram coletadas e lavadas em PBS. O precipitado foi ressuspenso em
10 mM Tris-HCl pH 7,4 contendo um coquetel de inibidores de proteases
(cOmplete Protease “Inhibitor Cocktail Tablets”). As células foram lisadas por
três ciclos de congelamento e descongelamento. O material insolúvel foi
removido após centrifugação a 10.000 g por 15 min, e 840 µl foram transferidos
54
para um tubo novo contendo 1 M de NaOH e 200 µl de pirimidina. Os níveis de
heme foram determinados após a adição de 2 mg de ditionato de sódio e leitura
a 450 nm no leitor Spectra Max M3.
A incorporação de análogo fluorescente de heme, Zn (II) Mesoporfirina
IX (Frontier Scientific), foi realizada com a incubação de 10 M de porfirina em
PBS contendo 2 x 107 parasitas por 5 min, seguida da adição de heme como
um competidor. Após 30 min as células foram lavadas com PBS gelado e
lisadas em PBS contendo 0,5% de Triton-X100. A fluorescência da porfirina foi
analisada em excitação de 405 nm e emissão de 578 nm no leitor Spectra Max
M3.
3.15 Análises estatísticas
Os experimentos foram realizados em triplicatas biológicas e os dados
apresentados correspondem a média e desvio padrão. Estes valores foram
utilizados para estimar a significância estatística utilizando o teste t de Student
feitas através do programa Prism 6 (Graphpad).
55
4 RESULTADOS
4.1 TceIF2α
4.1.1 TceIF2α pode ser fosforilada em dois resíduos in vitro pela TcK2
Verificamos que eIF2α é codificado por apenas uma ORF (TriTrypDB,
TcCLB.508153.730) predizendo uma proteína com aproximadamente 50 kDa.
Esta proteína tem uma região N-terminal extra (Figura 7) de tal forma que a
fosforilação na serina 51 passa a corresponder a treonina 169 em
tripanossomatídeos. Como já mencionado na introdução, a região extra N-
terminal possui um motivo LSRR compatível com um possível resíduo (serina
43), que poderia ser fosforilado pelas proteínas quinases de eIF2 (Figura 8).
Para verificar se este segundo sítio de fosforilação poderia ser um
substrato para as proteínas quinases de eIF2 de T. cruzi, nós geramos
proteínas recombinantes correspondentes a TceIF2α com os sítios de
fosforilação preservados (WT), ou mutados na serina 43 (S43A) ou treonina
169 (T169A), ou com ambas as mutações na mesma proteína (S43A/T169A). A
substituição pela alanina, evita a fosforilação. As proteínas recombinantes
apresentavam uma cauda de seis histidinas na região N-terminal (His6x-eIF2α),
facilitando sua purificação em coluna de níquel-agarose.
Além dos substratos descritos acima produzimos a proteína
recombinante correspondente ao domínio quinase de uma das proteínas
quinases de eIF2α presentes em T. cruzi, a TcK2. O domínio quinase estava
em fusão com C-terminal da glutationa S-transferase (GST) para a sua
purificação em coluna de glutationa-Sepharose, além de permitir a sua
ativação, uma vez que a proteína GST tende a se dimerizar. As proteínas
56
foram purificadas e usadas para realização de um ensaio de atividade de
proteína quinase in vitro. Como podemos verificar na Figura 10, quando
incubamos a proteína His6x-eIF2α com a quinase GST-TcK2 na presença de
ATP [γ-32P], detectamos que houve fosforilação das proteínas sem mutações
(WT), e das eIF2 mutadas em um sítio (S43A ou T169A). Contudo, não foi
possível detectar a fosforilação na proteína com a mutação nos dois possíveis
sítios de fosforilação. Estes dados indicam que eIF2 de T. cruzi pode ser
fosforilada in vitro pela TcK2 nos dois sítios de fosforilação.
4.1.2 Papel da Ser43 e Thr 169 nos parasitas
Havíamos verificado que a mutação na treonina 169 (Thr 169) inibia a
diferenciação de epimastigotas em metacíclicos, possivelmente por evitar a
parada na tradução quando as células eram incubadas em um meio carente
em nutrientes (Tonelli et al., 2011). Para verificar se a serina 43 (Ser43) teria
também um papel neste processo geramos parasitas superexpressores de
Comassie
eIF2α
TcK2-GST
eIF2α
Figura 10. TceIF2α apresenta um sítio adicional de fosforilação. Ensaios de quinase utilizando 0,1
μg do domínio quinase da TcK2 em fusão com GST (TcK2-GST) e como substrato 1 μg de eIF2α recombinante na forma selvagem (WT) ou mutada na serina 43 (S43A), na treonina 169 (T169A) ou com a dupla mutação (S43A/T169A) na presença de [γ32P]-ATP. Após incubação de 1 h a 37oC as amostras foram fracionadas em SDS-PAGE, coradas com azul de Coomassie e expostas a filme de Raios X. O painel superior mostra a autorradiografia e a parte inferior o gel corado com Coomassie R250. Os símbolos (+) indicam as canaletas contendo TcK2-GST e os símbolos ( -) as canaletas incubadas sem TcK2-GST.
50 kDa
50 kDa
57
TceIF2α selvagem (WT), mutado na serina 43 (S43A) ou na treonina 169
(T169A), ou duplo mutado na Serina 43 e Treonina 169 (S43A/T169A).
Na Figura 11, observamos que havia a superexpressão da TceIF2α
detectada por anticorpos que reconheciam a cauda de histidina presente nas
proteínas superexpressas, mas não nos parasitas não transfectados (Y). A
superexpressão foi confirmada também quando utilizamos o anticorpo anti-
eIF2α total, que reconheceu tanto a proteína endógena como a superexpressa,
esta última presente em maior quantidade que a proteína endógena, levando-
se em conta que a carga no gel medida pela reatividade do anticorpo anti β-
tubulina foi semelhante nos diferentes parasitas (Figura 11).
4.1.3 A superexpressão da eIF2, controla o crescimento e a formação de
formas infectivas
Quando analisamos o crescimento dos parasitas contendo os diferentes
genes de eIF2α, verificamos que a taxa de crescimento foi menor nos parasitas
contendo a mutação na T169A e o duplo mutante (S43A/T169A) comparado
Anti-histag
Anti-eIF2α
Anti-β-tubulina
Y WT S43A T169AS43A/
T169A
Figura 11. Expressão da TceIF2α nas diferentes linhagens de T. cruzi. Western blot com de
amostras de parasitas não transfectados (Y), ou de superexpressores da TceIF2α WT, S43A, T169 e S43A/T169A. O painel superior mostra o Western blot com anticorpo anti-6Xhis. O segundo painel mostra o Western blot com anticorpo anti-eIF2α, demonstrando a superexpressão da proteína nos diferentes parasitas. O painel inferior mostra o western blot com anticorpo anti-β-tubulina. As diluições dos anticorpos estão na tabela IV.
58
com os demais parasitas (Figura 12). Esse resultado nos sugeriu que o sítio de
fosforilação na treonina 169 seria importante para o controle do crescimento de
formas epimastigotas de T. cruzi em condições normais.
Como já observado em L. infantum, P. falciparum e T. gondii a
fosforilação de eIF2 é uma etapa importante para o desenvolvimento do ciclo
de vida do parasita (Cloutier et al., 2012; Zhang et al., 2013), controlando a
permanência no ambiente extracelular e o processo de diferenciação para
formas infectivas (Joyce et al., 2010). Com base nisso, analisamos os fenótipos
dos parasitas superexpressores com relação a capacidade de diferenciação na
forma infectiva, tripomastigota-metacíclica. Para isso submetemos os parasitas
a metaciclogênese (diferenciação in vitro) (Contreras et al., 1985). Após 96
horas, observamos que a diferenciação dos parasitas superexpressores de
TceIF2α mutado nos sítios de fosforilação (S43A, T169A e S43A/T169A) foi
Figura 12. Taxa de crescimento dos parasitas superexpressores de TceIF2α. Gráfico mostrando o
crescimento relativo (média ± desvio padrão, n = 3) dos parasitas superexpressores de TceIF2α. Parasitas não transfectados (Y), superexpressores de eIF2α WT, S43A, T169A e S43A/T169A. O símbolo (*) indica p < 0,05 calculado a partir do teste t de Student.
59
menor que a dos parasitas não transfectados (Y) (Figura 13). Por outro lado os
parasitas superexpressores da proteína selvagem (WT) apresentaram uma
taxa de diferenciação maior que os demais parasitas, indicando que a
fosforilação de ambos os resíduos é importante para a diferenciação.
Também analisamos a capacidade de invasão celular desses parasitas.
Verificamos que mesmo utilizando a mesma quantidade de parasitas
adicionados às células, houve uma menor invasão das células de mamífero no
caso de tripomastigotas-metacíclicos superexpressores de eIF2α mutado
quando comparado ao selvagem ou aos parasita não transfectados (Figura
14). Estes dados apontam que além de ser necessários para a diferenciação,
Y WT S43A T169A S43A
T169A
30
20
10
0
Meta
cyclic
s (%
)M
eta
cíc
lico
s(%
)
Figura 13. Taxa de diferenciação de epimastigotas em metacíclicas é afetada por mutações nos sítios de fosforilação de eIF2. O gráfico mostra a porcentagem média ± desvio padrão de metacíclicos
obtidos após 96 h de incubação em meio TAU-3AG a partir de epimastigotas não transfectados (Y), ou de superexpressores de TceIF2α WT, S43A, T169A ou S43A/T169A (n = 3). O símbolo * indica valores de p < 0,05 e ** de p < 0,001 relativos ao valor de Y e calculados a partir do teste t de Student.
60
os parasitas que se diferenciam tem um fenótipo alterado quanto a sua
infectividade.
4.1.4 Fosforilação da Serina 43 em resposta a estresse oxidativo
Mostramos que os tripanossomatídeos apresentam dois prováveis sítios
de fosforilação de TceIF2α, enquanto os demais organismos possuem apenas
um sítio. Com base nesta informação e sabendo que a fosforilação de eIF2α
ocorre em resposta a algum estresse sofrido pela célula, submetemos os
parasitas a diferentes tipos de estresse. Com tratamento por 1 h na presença
de 100 M de H2O2, verificamos que havia formação de espécies reativas de
D
0
20
40
60
Y WT S43A T169A S43A
T169A
Infe
ction o
fce
lls (
%)
Cé
lula
sin
fecta
da
s(%
)
Figura 14. Taxa de infecção celular dos parasitas superexpressores de eIF2α. O gráfico indica da
porcentagem (média ± desvio padrão) do número de células LLC-MK2 infectadas com os parasitas não transfectados (Y) ou superexpressores de TceIF2α WT, S43A, T169A e S43A/T169, após 24 horas da invasão (n=3). Os símbolos * indicam valores de p < 0,05 em relação a Y e WT, calculado pelo teste t de Student.
61
oxigênio (ROS) maior nos parasitas superexpressores da proteína mutada na
serina 43 (S43A) em relação aos demais (Figura 15).
Em contrapartida os parasitas T169A apresentaram menor produção de
ROS. Quando acompanhamos o crescimento dos parasitas na presença de
H2O2, observamos que os parasitas superexpressores de eIF2α selvagem e
mutado na treonina 169 apresentavam maior resistência ao tratamento com
H2O2 em relação aos parasitas não transfectados (Y) ou aos superexpressores
das outras mutações, S43A e S43A/T169A (Figura 16). Estes resultados
sugerem que a fosforilação da serina 43 seja mais importante para a resposta
ao estresse oxidativo em formas epimastigotas de T. cruzi, e que os dois sítios
teriam funções diferentes nos parasitas.
Figura 15. Formação de ROS nos parasitas superexpressores de TceIF2α. Parasitas não
transfectados (Y), ou superexpressores de eIF2α WT, S43A, T169A e S43A/T169A não tratados (barras brancas) ou tratados com H2O2 (barras pretas) por 1 hora. O ROS foi medido com o kit CellROX® Deep Red Reagent Invitrogen, como descrito em métodos. Os valores são médias ± desvio padrão de 3 experimentos. Os números acima das barra representam a porcentagem de diferença entre as amostras não tratadas e tratadas.
62
Experimentos estão sendo planejados para verificar se a fosforilação da
serina 43 estaria envolvida no controle da síntese proteica como verificamos
para a treonina 169 (Tonelli et al., 2011). Para isto analisaremos os perfis
polissomais dos diferentes mutantes na presença de estresses como o
carenciamento nutricional e presença de H2O2.
4.2 TcK2
4.2.1 Caracterização da quinase K2 em T. cruzi
Nesta segunda parte deste trabalho focamos os nossos estudos na
caracterização de uma das quinases presente em T. cruzi. Como já
mencionado, os tripanossomatídeos apresentam em seu genoma três ORFs
que codificam diferentes quinases de TceIF2α. Inicialmente o objetivo era a
caracterização das três quinases presentes no parasita e procuramos obter
parasitas nocautes para as três quinases. Obtivemos parasitas simples nocaute
para a TcK1 e duplo nocaute para TcK2. O nocaute para a TcK3 não foi obtido
até o presente momento, sugerindo que o gene da TcK3 possa ser essencial
Figura 16. Efeito da H2O2 no crescimento de parasitas expressando eIF2α selvagem e mutado nos sítios de fosforilação. Parasitas não transfectados (Y), ou superexpressores de eIF2α WT, S43A, T169A
e S43A/T169A foram cultivados por 4 dias na presença das concentrações de H2O2 indicadas no gráfico. Após este período os parasitas foram contados em câmera de Neubauer. Os números correspondem a média ± desvio padrão (n =3).
63
em epimastigotas. Como em nosso laboratório já existiam anticorpos para
TcK2, começamos caracterizando esta quinase.
A homóloga de T. brucei, a TbK2, havia sido parcialmente caracterizada
pelo nosso grupo em colaboração com o grupo da Dra. Beatriz A. Castilho
(Moraes et al., 2007). Em ambos tripanossomatídeos a K2, apresenta um
domínio transmembranar próximo à região N-terminal, e um domínio quinase
na região C-terminal da proteína (Figura 17). A presença do domínio
transmembranar indicaria que esta quinase seria similar às proteínas quinases
PERK de mamíferos. A PERK é uma quinase que responde a estresse de
retículo endoplasmático, por estar localizada neste compartimento celular
(Chakrabarti et al., 2011).
Para caracterizar a TcK2, utilizamos anticorpos gerados pela imunização
com fragmentos desta proteína expressos na forma de proteína recombinante.
Utilizamos dois anticorpos que reconhecem a TcK2; um dos anticorpos foi
obtido do soro de coelho imunizado com o domínio quinase (TcK2KD) e outro,
um anticorpo monoclonal gerado a partir do baço de camundongos imunizados
com porção N-terminal da proteína (mAb5D10). Quando utilizamos estes
Figura 17. TcK2 tem um arranjo topológico similar a PERK. Esquema representativo da quinase TcK2
de T. cruzi e PERK de mamíferos (MmPERK). SS: peptídeo sinal, TMD: Domínio transmembrana, KD: domínio quinase. 5D10 indica a região utilizada para a obtenção do anticorpo monoclonal.
64
anticorpos em Western Blot contendo um extrato total de epimastigotas,
percebemos que ambos reconheceram duas bandas acima de 120 kDa,
correspondentes ao tamanho esperado da quinase TcK2 (Figura 18). Podemos
observar que outras bandas foram reconhecidas, porém com menor afinidade.
A partir de então resolvemos utilizar o anticorpo Tck2KD em ensaio de Western
Blot.
4.2.2 TcK2 está presente na fração de membrana
Por apresentar um domínio transmembranar, era esperado que a TcK2
não esteja na fração solúvel, correspondente ao citosol, e sim associada às
membranas do parasita. Para confirmar esta hipótese, desenhamos ensaios de
fracionamento celular separando frações de proteínas citossólicas, das
proteínas associadas à membrana. Como podemos ver na figura 19, a TcK2
estava presente na fração de extraída com detergentes, claramente distinta da
proteína Hsp70 que é solúvel, sugerindo que a quinase é uma proteína de
membrana em epimastigotas do T. cruzi. Este dado é compatível com a
Figura 18. Validação de dois anticorpos contra TcK2. Western blot com um extrato total
correspondente a 1 x 107 epimastigotas de T. cruzi utilizando o anticorpo que reconhece o domínio
quinase da TcK2 (KD), ou o anticorpo monoclonal 5D10 que reconhece a porção N-terminal da quinase TcK2. À direita está representado a posição de migração dos padrões de massa molecular em kDa.
65
proteína ortóloga de L. infantum (LinPERK), que apresenta um domínio
transmembranar e é homóloga a proteína quinase de eIF2α encontrada no
retículo endoplasmático de mamíferos (PERK) (Chow et al., 2011).
Experimentos de fracionamento diferencial com digitonina confirmaram
esta hipótese e mostraram que também nas formas tripomastigotas, a TcK2
está nas membranas, apesar de ser solubilizada em menores quantidades de
detergente (Figura 20). Estes dados sugerem que a TcK2 pode estar associada
à membrana de alguma organela do parasita, não sendo solúvel no citosol, e
que o tipo de organela pode ser diferente nas diversas formas do parasita.
Figura 19. A quinase TcK2 está presente na fração de membrana das formas epimastigotas.
Western blot do sobrenadante de epimastigotas submetidos a congelamento/degelamento para obter a fração solúvel (ou citossólica); da fração solúvel em detergente não iônico que corresponde a fração de proteínas associadas às membranas e o precipitado (pellet) após a extração com detergentes utilizando anti-TcK2 (KD) ou anti-Hsp70.
Figura 20. A quinase TcK2 está presente na fração de membrana das formas epimastigotas. Western
blot das frações obtidas a partir da lise do parasita por digitonina utilizando anti-TcK2 (KD), anti-Hsp70 ou anti-BiP. (B) Formas tripomastigotas sanguíneas foram submetidas a lise por digitonina.
66
4.2.3 TcK2 tem capacidade de se fosforilar e promover a fosforilação de
TceIF2α in vitro
Como já mostramos anteriormente, ensaios de quinase foram feitos com
o domínio quinase de TcK2 ligado à GST e a TceIF2α contendo uma cauda de
histidina (His6x-eIF2α). A fosforilação só ocorreu quando incubamos TceIF2α
com γ-ATP-[32P] na presença de GST-TcK2 (Figura 21). Também verificamos
que a quinase foi capaz de se autofosforilar, uma vez que detectamos
marcação de uma banda superior no gel que correspondia ao tamanho da
proteína recombinante TcK2KD. Esta autofosforilação é típica de quinases de
eIF2α, decorrente de sua dimerização por GST (Chakrabarti et al., 2011; Dever
e Hinnebusch, 2005; Dey et al., 2005; Garcia et al., 2007).
A existência de formas fosforiladas da TcK2 pode ser inferida em formas
epimastigotas do T. cruzi quando verificamos que em extratos de parasitas
tratados com fosfatase alcalina (CIAP) havia uma diminuição na intensidade da
banda superior no Western blot em relação à banda de maior migração no gel
(Figura 22a). Para confirmar que a banda superior no Western blot seria uma
forma fosforilada da TcK2, nós cultivamos epimastigotas na presença de
Figura 21. TcK2 é capaz de fosforilar TceIF2α e se autofosforilar in vitro. Ensaio de quinase in vitro
utilizando proteína recombinante da quinase TcK2-GST e 6xhis-TceIF2α, como controle utilizamos a proteína GST purificada, incubadas 1 hora na presença de [γ
32P]-ATP. O painel superior é uma
autorradiografia contendo uma banda referente a fosforilação do TceIF2α (banda inferior) e uma banda superior referente a fosforilação da TcK2. O painel inferior mostra o gel corado com Azul de Coomassie com a banda de 6xhis-TceIF2α como normalizador.
67
caliculina A, um inibidor de fosfatase de proteínas. Notamos neste caso um
acúmulo da banda superior nas células tratadas (Figura 22b). Estes dados
sugerem que a TcK2 seria uma quinase de eIF2α, e apresentaria a capacidade
de se autofosforilar in vitro, podendo esta fosforilação justificar a existência das
duas bandas observadas por Western Blot. O fato de não obtermos total
defosforilação com o tratamento com fosfatase, ou só a forma de menor
migração após o tratamento com caliculina A poderia indicar que diversas
fosforilações ou outras modificações pós-traducionais estivessem ocorrendo na
TcK2, como por exemplo glicosilação. Ensaios para detectar este tipo de
modificação foram realizados, mas sem sucesso. Além disso, a quinase TcK2
pode ter sido modificada por palmitoilação, já que sua homóloga em T. brucei
apresenta essa modificação (Emmer et al., 2011).
4.2.4 TcK2 apresenta localização diferente da homóloga de Leishmania sp
Para verificar a localização da quinase K2 em T. cruzi realizamos
ensaios de imunofluorescência. A partir destes ensaios pudemos observar que
Figura 22. TcK2 é fosforilada in vivo. Western blot com extratos de epimastigotas tratados por 1 hora
na ausência (-) ou presença (+) de CIAP ou obtidos de parasitas incubados por 6 hora na ausência (-) ou presença (+) de 10 nM de caliculina A. O painel superior é um Western blot representativo de três experimentos independentes que permitiram gerar relações entre TcK2 de menor / a TcK2 de maior migração no gel. Os símbolos * indicam que as diferenças são estatisticamente significativas (p < 0,005).
68
a TcK2 está presente em compartimentos endossomais, não se colocalizando
com marcador de retículo endoplasmático (BiP), em epimastigotas (Figura 23).
O mesmo ocorre com a marcação dos amastigotas, porém as estruturas
observadas foram menores quando comparado aos epimastigotas. Nas formas
infectivas (tripomastigotas metacíclicos e sanguíneos), a TcK2 apresentou-se
igualmente em pequenas vesículas espalhadas pelo citosol, com alguma
colocalização com a proteína BiP. Em todos os estágios, porém, fica evidente
não ter uma localização no retículo endoplasmático.
Para confirmar se a localização celular observada da TcK2 de fato
correspondia à enzima, inserimos por recombinação homóloga no próprio gene
da TcK2 um segmento de DNA codificando o epítopo da proteína
hemaglutinina do vírus da influenza humana (HA) na sua região C-terminal. A
construção para recombinação foi feita para selecionarmos eventos de
inserção através da expressão do gene de resistência a geneticina (G418).
DAPI BiP TcK2 DIC Merge
TR
IPO
AM
AM
ETA
EP
I
Figura 23. A marcação de TcK2 não se localiza nos sítios marcados com a proteína BiP. A figura
mostra o imagens deconvoluídas de Imunofluorescência de formas epimastigotas (Epi), tripomastigotas metacíclicas (Meta), amastigotas (Ama) e tripomastigotas derivado de células de mamífero (Trypo), utilizando anticorpos anti-TcK2 (vermelho) ou anti-BiP (verde). Os núcleo e cinetoplasto foram corados com DAPI e estão mostrados em azul. As imagens de contraste diferencial de interferência (DIC) e a sobreposição das imunofluorescências (Merge) estão também apresentadas. Barras = 5 µm.
69
Realizamos assim, ensaios de imunofluorescência utilizando anticorpos que
detectam a proteína endógena (mAb5D10) e a etiqueta HA e, que havia um
alto grau de colocalização das duas marcações nos parasitas selecionados
confirmando a localização da TcK2 (Figura 24).
4.2.5 A TcK2 é expressa em estados diferentes nos estágios de T. cruzi
Ensaios de RT-PCR, nos permitiram demonstrar a presença de mRNA
da TcK2 em todas as fases do ciclo de vida do T. cruzi (Figura 25).
Figura 24. TcK2 está localizada no reservossomos. Imunofluorescência de Epimastigotas não
transfectados (WT) ou de parasitas contendo “tag” endógeno do epítopo HA no C-terminal da TcK2, utilizando anticorpos anti-TcK2 (verde) e anti-HA (vermelho). O núcleo e cinetoplasto estão em azul (DAPI) e à direita estão as imagens de DIC sobrepostas às fluorescências. Barras = 5 µm.
TcK2
Tubulina
Exp
ressã
ore
lativa
AMA TRIPO EPI META
Figura 25. TcK2 é transcrita em todas as formas do parasita. RT-PCR das formas replicativas
epimastigotas (EPI) e amastigotas (AMA), e formas infectivas (tripomastigotas-metacíclicos (META) e sanguínea (TRYPO). Os painéis mostram géis de agarose corados com brometo de etídeo de amostras de RNA total dos diferentes estágios de T. cruzi submetidas a RT-PCR utilizando oligonucleotídeos para amplificar a porção 5’ do mRNA da TcK2 (painel superior), ou oligonucleotídeos para amplificar a porção 5’ do mRNA de α-tubulina. O gráfico é relação entre a intensidade da banda da TcK2 e da α-tubulina.
70
A expressão da proteína também foi verificada em extratos de parasitas
das formas infectivas e não-infectivas por Western Blot (Figura 26). Contudo, o
que nos chamou atenção foi que a relação entre a banda de menor e maior
migração TcK2 era diferente em cada estágio. Este fato indicaria que em
formas infectivas a TcK2 poderia estar mais fosforilada, o que seria compatível
com um estado ativado nestas formas e uma menor taxa de tradução destas
formas (Ferreira et al., 2008). Assim, quando ativa, a TcK2 poderia fosforilar
mais o eIF2α, o que causaria uma diminuição ou alteração de seletividade da
tradução. É interessante notar que a fosforilação da TcK2 durante a formação
de formas infectivas também foi evidenciada em análises de fosfoproteômica,
onde a TcK2 foi detectada fosforilada, após 96 h de estresse nutricional
(Marchini et al., 2011).
4.2.6 TcK2 responde a carência de heme
As quatro quinases presentes em mamíferos são ativadas em resposta a
diferentes tipos de estresse. Sabendo que a TcK2 estaria mais fosforilada
TcK2[P]
TcK2
Tubulina
EPI META AMA TRIPO
Figura 26. A TcK2 é expressa em todas as formas do parasita mas apresenta diferenças de migração. Western blot de extratos das diferentes formas do T. cruzi utilizando anti-TcK2 e anti-α-
tubulina, No painel superior o anticorpo anti-TcK2 detecta duas bandas uma de menor migração (TcK2[P]
) e outra de maior migração (TcK2). Gráfico representa a média ± desvio padrão da relação entre TcK2
[P]/
TcK2 de três experimentos independentes.
71
durante a formação de formas infectivas, e que durante este processo o que
ocorre é a diminuição de nutrientes presentes na parte terminal do tubo
digestivo do inseto, desenhamos experimentos para investigar que tipo de
estresse estaria causando a ativação da quinase. Como as formas
proliferativas requerem heme para proliferação e as infectivas não proliferam e
sobrevivem a condições que não contém heme, tentamos verificar se havia
diferença de migração da TcK2 no gel em epimastigotas mantidos em meios
com diferentes quantidades de heme. Cultivamos os parasitas nas seguintes
condições: sem acrescentar hemina ao meio LIT, em meio LIT com adição de
10 µg/mL, ou 30 µg/mL de hemina. Em nosso laboratório mantemos
rotineiramente os parasitas em meio LIT contendo 10 µg/mL de hemina. Na
presença de maiores concentrações de hemina, os parasitas cresceram mais
(Figura 27), confirmando trabalhos da literatura que mostram que a hemina
estimula o crescimento dos parasitas por meio da ativação da CAMKII
(Nogueira et al., 2011).
Pa
rasita
s/m
L (
x1
06)
Tempo (h)
Figura 27. Efeito da adição de hemina no crescimento de epimastigotas. A figura mostra a média ±
desvio padrão (n = 3) do número de epimastigotas mantidos em meio de cultivo sem suplementação (), ou suplementado com 10 (p) ou com 30 μg/mL hemina.
72
Sem adição de hemina, a marcação por imunofluorescência da TcK2 foi
detectada espalhada pelo citosol; ao contrário do que ocorreu no meio LIT com
10 µg/mL (Figura 28). Esta mudança de localização também foi observada para
a cruzipaína, uma proteína encontrada no interior dos reservossomos (Cunha-
e-Silva et al., 2006; Sant'Anna et al., 2008), sugerindo que estas organelas ou
não estariam sendo formadas, ou estaria “vazias” na ausência de hemina.
Para distinguir entre estas duas hipóteses, observamos os parasitas
cultivados com ou sem adição de hemina por microscopia eletrônica de
transmissão. Como está ilustrado na figura 29, os parasitas cultivados na
presença de hemina apresentaram organelas elétron-densas na região
posterior, destacado por setas. Estas organelas podem ser consideradas
marcações típicas de reservossomos, presentes nas formas epimastigotas de
T. cruzi. Por outro lado, parasitas cultivados em meio LIT sem adição de
hemina apresentaram na região posterior organelas elétron-luzentes. Neste
caso os reservossomos estariam presentes, porém com conteúdo alterado e
+ H
em
ina
-H
em
ina
Figura 28. TcK2 se espalha pelo citosol em meio sem adição de hemina. Imunofluorescência de
epimastigotas de T. cruzi mantidos em meio LIT sem adição de hemina (-Hemina) ou meio contendo 10 µg de hemina por mL, utilizando anticorpos anti-TcK2 (verde) ou anti-cruzipaína (vermelho). A figura mostra a marcação do núcleo e cinetoplasto em azul (DAPI), a mistura dos canais verde e vermelho (Merge) e as imagens correspondentes de DIC indicando o campo selecionado em pontilhado para as imunofluorescências. Barras = 5 µm.
73
formando corpos multivesiculares, típicos de vacúolos autofágicos. Inferimos
que nestas condições, os reservossomos não estariam mais estocando heme
em seu interior e a TcK2 poderia estar sendo ativada devido à ausência de
algum nutriente.
Quando analisamos por Western blot os extratos dos parasitas
cultivados na presença ou ausência de hemina, observamos que no segundo
caso os parasitas apresentavam predominância da TcK2 na forma de menor
migração, possivelmente mais fosforilada e similar a que era observada nas
formas tripomastigotas (Figura 30).
+ Hemina - Hemina
Figura 29. Parasitas cultivados na ausência de hemina apresentam estruturas vacuolares eletronluzentes enquanto que na presença de hemina estas estruturas são eletrondensas. Micrografia eletrônica das formas epimastigotas de T. cruzi mantidas em meio de cultivo suplementado com hemina (+ Hemina) ou sem suplementação (- Hemina). As setas indicam vesículas na região posterior do parasita denominada reservossomos. Barras = 2 μm.
74
Para confirmar se a TcK2 estaria de fato sendo ativada pela ausência de
heme, incubamos os parasitas em solução salina tamponada (PBS) por 6
horas. Após este período de incubação verificamos que a forma de menor
migração da quinase passava a predominar (Figura 31), sugerindo que a
enzima poderia estar sendo fosforilada. Quando a incubação em PBS foi feita
na presença de hemina, o aumento da forma de menor migração foi inibida.
Estes resultados sugeriram que o heme teria a capacidade de inibir a
autofosforilação da quinase e que o fator responsável pela sua ativação seria a
ausência de heme como o que acontece para a HRI de mamíferos (Chen,
2007). Porém a HRI, diferentemente da TcK2, está no citosol.
+ Hemina - Hemina
+ Hemina - Hemina
Figura 30. Parasitas cultivados na ausência de hemina apresentam uma diminuição da TcK2 não fosforilada. Western blot com extrato de parasitas cultivados em meio LIT com suplementação de 10
µg/mL (+ Hemina) ou sem suplementação de hemina (-Hemina) , utilizando anticorpo anti-TcK2 e anti-β-tubulina. O gráfico mostra a relação entre a banda de menor e maior migração no gel. O símbolo (*) indica diferença estatisticamente significativa (p < 0,005) entre os valores, baseado no teste t de Student.
75
4.2.7 O heme se liga ao domínio quinase da TcK2
A quinase HRI apresenta dois sítios de ligação à heme, um sítio
reversível e um irreversível. Quando a quantidade de heme diminui no interior
da célula, o heme dissocia-se da quinase favorecendo a sua ativação (Chen e
London, 1995). Assim, investigamos se a TcK2 apresentaria sítios putativos de
ligação à heme. Através do software BindHeme (Liu e Hu, 2011), estimamos
que inúmeros resíduos da TcK2 apresentariam afinidade de ligação ao heme,
principalmente no domínio quinase, onde haveria duas sequências de
aminoácidos com alta afinidade de ligação (Figura 32).
TcK2[P]
TcK2
Tubulina
LIT PBS PBS+Hemina
LIT PBS PBS+Hemina
TcK
2[P
] /TcK
2
Figura 31. Parasitas mantidos em PBS tem um aumento da banda de menor migração que é inibidor pela adição de hemina. Western blot de extratos de duas culturas de epimastigotas cultivados
em meio LIT (LIT) ou incubados por 6 horas com PBS ou PBS contendo 30 µg/mL de hemina. Os blots foram revelados com anti-TcK2 e anti-β-tubulina. O gráfico mostra a relação entre TcK2
[P]/Tck2 do
experimento feito em triplicata. Os símbolos (*) indicam diferenças significativas relativas ao LIT (p < 0,005) determinada pelo teste t de Student.
76
Para confirmar se existiria ligação de heme ao domínio quinase da TcK2,
incubamos o heme com a proteína recombinante GST-TcK2 purificada. No
espectro de absorção de luz notamos a formação de um pico típico para
interação de heme com proteínas após 410 nm (banda de Soret), não
observado para a proteína GST ou na quinase sem adição de heme (Figura
33).
Utilizamos diferentes concentrações de heme e verificamos que a
ligação é saturável, apresentando uma constante de associação da ordem de
10 M (Figura 34). Esses dados comprovam que o heme se liga à quinase
Sítios de ligação a heme
Figura 32. TcK2 apresenta sítio putativos de ligação a heme. Esquema da TcK2, abaixo no gráfico
os picos em preto representam os aminoácidos que apresentam afinidade para ligação de heme. A sequência da quinase foi analisada com base no software BindHeme (Liu R and Hu J., 2011). As setas indicam os possíveis locus de ligação a heme dentro do domínio quinase.
Absorb
ância
Comprimento de onda (nm)
Figura 33. Espectro da absorção de luz indica que a GST-TcK2 liga-se ao heme. Os espectros foram
obtidos a 25oC em uma solução de PBS contendo quando indicado 10 ug/mL de heme, na presença ou
ausência de 10 ug/ml de GST (glutationa-S-tranferase) ou 10 ug/mL de TcK2 incubado com heme e TcK2. A ligação do heme à proteína é detectada por um pico em aproximadamente 410 nm, denominado banda de Soret.
77
TcK2 no seu domínio quinase, mas até o presente momento não comprovamos
se também haveria a ligação de heme na região N-terminal da quinase,
possivelmente localizada no lúmen dos reservossomos.
Em seguida realizamos os ensaios de quinase in vitro na presença de
heme e análogos de heme para verificar se a ligação era capaz de inibir a
atividade da TcK2. De fato, o heme inibiu a fosforilação de eIF2 (Figura 35).
Mais importante, os análogos de heme, formados pelo anel porfirínico
sem o ferro, ou com outros metais não inibiram a atividade nas concentrações
utilizadas mostrando que o efeito era específico para o heme (Figura 36). Estes
Absorb
ãncia
rela
tiva
(420
/38
0n
m)
[hemina] (μM)
Figura 34. Curva de ligação da TcK-GST a heme. A figura mostra a diferença de absorção a 420 nm
em função da concentração de heme incubado com GST-TcK2a 10 µg/mL a 25oC em PBS. A linha foi
gerada pela predição de um sítio de ligação utilizando o software Prisma 6, gerando uma Kd de 10 µM.
Protoporfirina
Figura 35. Heme inibe a atividade da TcK2 in vitro. Ensaio de quinase in vitro utilizando como substrato
a proteína recombinante His6X-TceIF2α (1 μg) e onde indicado o equivalente a 0,2 μg da GST-TcK2 em 50 uL de tampão e 1 nCi de [
32P]-γ-ATP na ausência ou presença de 1 μg de heme (Fe-Protoporfirina), ou
de seus análogos: Protoporfirina (Proto), Mesoporfirina (Meso) e Sn (V)-protoporfirina (Sn (V)). O painel superior é uma autorradiografia, mostrando a fosforilação do TceIF2α. O painel inferior é o gel de Coomassie com a banda de 6xHis-TceIF2α.
78
resultados sugerem que a TcK2 liga-se ao heme na região do domínio quinase
e esta ligação inibe sua atividade, e consequentemente a fosforilação de eIF2α.
Já havíamos mostrado que a parada no início da tradução causada pela
fosforilação de eIF2 é um das etapas necessárias para a diferenciação dos
parasitas de epimastigotas para tripomastigotas metacíclicos (Tonelli et al.,
2011). Uma vez que TcK2 foi inibida pelo heme, e poderia ser uma das
quinases que estariam fosforilando o eIF2, submetemos os parasitas à
diferenciação na presença de heme e seus análogos. Como pode ser visto na
figura 37, apenas a presença de heme, e não os seus análogos, inibiu a
formação de tripomastigotas-metacíclicos, sugerindo que a ligação específica
do heme à TcK2 e inibição de sua ativação estaria de fato inibindo a
diferenciação em T. cruzi.
A
C
B
D
Figura 36. Estrutura do heme e seus análogos. (A) Fe-protoporfirina. (B) Protoporfirina. (C) Mesoporfirina e (D) Estanho protoporfirina.
79
4.2.8 Obtenção de nocautes para TcK2
Para entender melhor o papel da quinase na resposta ao heme no T.
cruzi, nós geramos primeiramente parasita simples-nocautes, onde
substituímos o gene da TcK2 pelo gene de resistência a geneticina (-/+).
Posterirormente, nós substituímos o segundo alelo do gene da TcK2 pelos
genes de resistência a higromicina, ou a blasticidina, e obtivemos duas
linhagens de duplos nocautes (-/-; geneticina/higromicina, ou
geneticina/blasticidina) (Figura 37a). Os clones resistentes a estes antibióticos
mostraram ter perdido o gene da TcK2, que não pode ser amplificado por PCR
utilizando iniciadores que amplificam o domínio quinase da TcK2. Só obtivemos
amplificação nos parasitas selvagens, nos nocautes parciais (+/-), mas não nos
duplo nocautes (Figura 38b). Quando utilizamos iniciadores que amplificam
parte da região 5’UTR e o início da região que codifica os genes de resistência
(blasticidina ou higromicina) foi possível observar uma banda com
Me
tacíc
licos
(%)
Figura 37. Heme inibe a formação de metacíclicos. Os valores correspondem à porcentagem de
metacíclicos ± desvio padrão (n = 3) após 96 horas de incubação dos parasitas em meio TAU3AAG na ausência (Cont) ou presença de 10 μg/mL de heme ou seus análogos. O símbolo (*) indica diferença significativa ( p < 0,001), baseado no teste t de Student.
80
aproximadamente 500 pares de base nos parasitas nocautes (TcK2KO blast e
higro), mas não nos parasitas selvagens (WT) (Figura 38b), demonstrando
sucesso na obtenção do parasita nocaute para TcK2.
A partir da confirmação de que havíamos removido o gene, os parasitas
foram utilizados em experimentos de Western blot e imunofluorescência para
demonstrar a ausência da expressão da TcK2. No Western blot, nós
verificamos expressão da quinase TcK2 nos parasitas selvagens, mas não nos
parasitas nocautes para TcK2 (Figura 39).
Figura 38. Obtenção dos parasitas nocautes para TcK2. (A) Esquema da estratégia de obtenção dos
parasitas nocautes pela substituição do gene da TcK2 por um gene de resistência (geneticina e blasticidina ou higromicina). (B) Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR para confirmação da substituição gênica. No gel da esquerda foram usados os oligonucleotídeos indicados pelas setas da esquerda na parte A da figura, e indicam a inserção dos genes de neomicina (Neo) e Higromicina (Hygro). O gel da direita mostra a eliminação do gene da TcK2 usando os oligonucleotídeos indicados à direita da parte A da figura. As seguintes amostras de DNA foram usadas no gel: WT, parasita selvagem; -/+, parasita simples nocaute onde ocorreu a substituição de uma cópia do gene da TcK2 pelo gene de geneticina e -/-, parasitas nocautes derivados da substituição da segunda cópia do gene da TcK2 pelo gene de higromicina. À esquerda está mostrado o tamanho dos fragmentos obtidos.
81
Da mesma forma só foi possível detectar a expressão da TcK2 nos
parasitas selvagens (WT), na imunofluorescência (Figura 40). Mesmo com a
ausência da TcK2 nos nocautes (TcK2KO) houve a formação de
reservossomos, observado pela marcação da região posterior do parasita com
cruzipaína, indicando que a quinase não é essencial no processo de formação
desta estrutura.
TcK2
Tubulina
Figura 39. Confirmação do nocaute de TcK2 por Western blot. Western blot com extrato contendo o
equivalente a 2 x 107 parasitas selvagens (WT), nocaute parcial (-/+) ou nocautes das duas cópias do
gene (-/-), utilizando anticorpos anti-TcK2 e anti-tubulina como normalizador.
Figura 40. Confirmação do nocaute de TcK2 por imunofluorescência. Imunofluorescência de
parasitas selvagens (WT) e parasitas nocautes (TcK2KO), utilizando anticorpos anti-cruzipaína (vermelho) ou anti-TcK2 (verde). As imagens também mostram a coloração por DAPI como marcador de núcleo e cinetoplasto, e DIC das região utilizadas (linhas pontilhadas) para as fluorescências. Barra = 5 µm.
82
4.2.9 A ausência da quinase afeta o crescimento e diferenciação
Parasitas selvagens, nocautes parciais e nocautes completos da TcK2
foram submetidos à diferenciação em meio TAU para obtermos
tripomastigotas-metacíclicos. Como podemos observar na figura 41, parasitas
simples nocautes e duplo nocaute para TcK2 apresentaram uma taxa de
diferenciação inferior a dos parasitas selvagens provavelmente porque havia
menor fosforilação de eIF2 induzida pelo estresse de acordo com os nossos
dados mostrando o papel de eIF2 neste processo (Tonelli et al., 2011).
No entanto, além de afetar a diferenciação, os parasitas nocautes
completos, mas não os nocautes parciais para quinase TcK2 apresentaram um
atraso no crescimento em relação aos parasitas selvagens (Figura 42). Este
fenótipo não era esperado, pois seria de se esperar que o parasita não
estivesse respondendo a estresse durante o crescimento.
Meta
cíc
licos
(%)
Células
Figura 41. A ausência da TcK2 inibe a formação de metacíclicos. Porcentagem de metacíclicos
obtidos após 96 h de incubação de epimastigotas selvagens (WT), simples nocaute (-/+) ou nocaute (-/-) da TcK2, mantidos em meio TAU3AAG. Os valores são média ± desvio padrão de triplicatas. Os símbolos (*) indicam diferenças significativas (p < 0,001) em relação ao WT, baseado no teste t de Student.
83
4.2.10 Ascorbato reverte o fenótipo dos parasitas nocautes
Inúmeras tentativas para reverter o fenótipo dos nocautes de TcK2 foram
feitos para compensar a existência de um possível estresse em condições
consideradas normais. Por exemplo, os parasitas nocautes foram cultivados na
presença de excesso de heme, mas sem sucesso. Assim, cultivamos os
parasitas na presença de antioxidantes, como ascorbato e N-acetil-cisteína
(NAC), já que espécies reativas de oxigênio são normalmente produzidas pelo
parasita em crescimento e o nocaute poderia ser mais sensível a estas
espécies (Souza et al., 2009). De fato, a adição de 10 µM a 1 mM de ascorbato
reverteu o crescimento (Figura 43a). No entanto, a reversão, com 1 mM
ocorreu somente no início do crescimento durante os 3 primeiros dias de
tratamento e não houve reversão com 10 mM. Esses dados sugerem que a
falta da quinase TcK2 estaria causando um desequilíbrio oxidativo, que poderia
ser revertido pela presença do ascorbato, mas não de NAC. Quando o
ascorbato foi removido, o crescimento dos parasitas nocautes se manteve por
Para
sitas
/mL (
x10
6)
Tempo (dias)
Figura 42. A falta da TcK2 impede o crescimento de epimastigotas. Curva de crescimento de
epimastigotas selvagens (WT), simples nocautes (-/+) e nocaute da TcK2(-/-) mantidos em meio LIT. Os valores correspondem a média ± desvio padrão de triplicatas e os símbolos (*) indicam diferenças significativas (p < 0,001), estimadas pelo teste t de Student.
84
até 7 dias e após este período o parasita nocaute voltou a crescer lentamente
(Figura 43b).
Como o fenótipo de reversão persistia por 7 dias, submetemos os
parasitas pré-tratados com ascorbato à metaciclogênese na presença ou na
ausência de ascorbato. Como pode ser visto na Figura 44, houve uma reversão
parcial na diferenciação dos parasitas nocautes, sugerindo que a ausência da
TcK2 afeta outras vias que levam a diferenciação.
Pa
rasita
s/m
L (
x1
06)
Tempo (dias) Tempo (dias)
Figura 43. Ascorbato reverte o crescimento dos parasitas nocautes. (A) Curva de crescimento de
epimastigotas de T. cruzi selvagens (WT) ( ) ou do nocaute da TcK2 (-/-) cultivados em meio LIT (=) ou
acrescido de 10 µM (q), 1 mM (p), ou 10 mM (n) de ascorbato, ou 5 mM de N-acetil-cisteína (NAC, u) a
28oC. (B) Formas epimastigotas WT ( ) ou nocaute da TcK2 mantidas em meio LIT sem (=) ou com
ascorbato (u) foram colocadas novamente em meio LIT sem ascorbato e incubadas pelos dias indicados. A Seta indica o dia em que as células foram diluídas 10X. Os valores são média ± desvio padrão de experimentos feitos em triplicata.
85
Como mesmo assim obtivemos os tripomastigotas-metacíclicos,
utilizamos estes parasitas em ensaios de infecção da linhagem celular
LLCMK2, e notamos que os parasitas nocautes apresentavam baixa
capacidade de infecção quando comparado com parasitas selvagens. Por outro
lado, parasitas nocautes cultivados na presença de ascorbato apresentaram
infecção superior que os parasitas selvagens submetidos ao mesmo
tratamento, demonstrando que o balaço oxidativo é essencial para obter
sucesso na infecção por T. cruzi (Figura 45).
Meta
cíc
licos
(%)
Figura 44. O ascorbato reverte parcialmente a formação de metacíclicos nos parasitas nocautes para TcK2. Os epimastigotas foram cultivados em meio LIT por 4 dias na presença (barra preta) ou
ausência (barra branca) de ascorbato (10 µM) antes de ser induzidos a se diferenciar em metacíclicas. A figura mostra o número relativo ± desvio padrão (n = 3) de metacíclicos após 96 horas em meio TAU3AAG. Um asterisco indica diferenças estatisticamente significativas entre os selvagens (WT) e os mutantes nocaute (null) e o asterisco duplo entre o null com ou sem ascorbato. Em ambos os casos o valor de p < 0,001 baseado no teste t de Student.
86
Notamos também que os parasitas nocautes apresentaram a
capacidade de se diferenciar em amastigota no interior das células. No entanto
estas formas amastigotas apresentaram uma taxa de multiplicação muito baixa,
praticamente nula, mesmo quando os parasitas nocautes eram previamente
cultivados em ascorbato (Figura 46). Este conjunto de dados nos sugeriu que
a ausência da quinase TcK2 seria importante para o crescimento de
epimastigotas e diferenciação em tripomastigotas-metacíclicos, para a invasão
celular pelos metacíclicos e para a proliferação de amastigotas. Por outro lado
a TcK2 não seria requerida para a formação de amastigotas a partir dos
tripomastigotas-metacíclicos.
Céula
sin
fecta
das
(%)
Figura 45. Parasitas nocautes apresentam deficiência na infecção que além de ser revertida é aumentada por ascorbato. A figura mostra a porcentagem ± desvio padrão (n = 3) de células LLC-MK
2 infectadas após 24 horas depois de uma infecção de duas horas com o
mesmo número de parasitas selvagens e nocautes obtidos de culturas diferenciadas de epimastigotas selvagens (WT) ou nocautes para TcK2 (null) pré-incubados (barras pretas) ou não (barras brancas) com 10 µM de ascorbato. Um asterisco indica diferenças estatisticamente significativas entre os selvagens e os mutantes nocaute (null) e o asterisco duplo entre o null com ou sem ascorbato. Em ambos os casos estas diferenças tem um valor de p < 0,001
baseado no teste t de Student.
87
4.2.11 TcK2KO apresentam reservossomos menos elétron densos
Como a ausência da quinase TcK2 não interferiu na formação dos
reservossomos, como demostrado na figura 40, nós procuramos verificar a
ultraestrutura destas células. Assim, os parasitas nocautes foram cultivados na
presença ou ausência de ascorbato e processados para microscopia de
transmissão. Ficou nítido que os parasitas nocautes apresentavam estruturas
compatíveis com o tamanho e localização dos reservossomos, mas estes
estavam muito mais elétronluzentes que as estruturas encontradas nos
parasitas selvagens (Figura 47). Além disso, na ausência da quinase,
observamos a presença de corpos multivesiculares nos reservossomos. Estas
alterações, no entanto, não foram revertidas quando os parasitas eram
crescidos na presença de ascorbato, indicando mais uma vez que a TcK2 não
atuaria na formação dos reservossomos. Aparentemente, havia um menor
Pa
rasita
sin
tra
ce
lula
res/
cé
ula
sin
fecta
da
s
Figura 46. Ausência da TcK2 inibe a multiplicação intracelular. A figura mostra o número de
amastigotas por célula LLC-MK2 ± desvio padrão (n = 3) ao longo do tempo. As células foram infectadas por duas horas na presença de 1 x 10
6 metacíclicos por ml obtidos como indicado no topo da figura,
lavadas e incubadas em meio de cultura DMEM contendo 10% de soro fetal bovino.
88
acúmulo de moléculas eletrondensas, possivelmente heme nos reservossomos
na ausência da quinase.
4.2.12 Ausência da quinase TcK2 causa um desequilíbrio celular através da
geração de ROS
Para entender como o ascorbato estaria revertendo o efeito da falta da
TcK2, analisamos as células nocautes em relação ao acúmulo de espécies
ativas de oxigênio (ROS). Primeiramente como a TcK2 é uma quinase que
responde a heme, analisamos a quantidade de heme citossólico nos parasitas
selvagens e nocautes. Notamos assim, um aumento nos níveis de heme
Figura 47. Os parasitas nocautes para TcK2 apresentam corpos multivesiculares ao invés de estruturas eletrondensas. Micrografias eletrônicas de epimastigotas selvagens (WT), nocautes (TcK2-
null) ou nocautes cultivados com 10 µM de ascorbato. As setas indicam organelas endossomais denominadas reservossomos. Barra = 2 µm.
89
intracelulares, apoiando a ideia de que a ausência de quinase impediria a
estocagem de heme no interior dos reservossomos (Figura 48).
Uma vez que os nossos dados indicavam que a estocagem de heme nos
reservossomos estaria sendo prejudicada na ausência da TcK2, analisamos a
internalização de heme nos parasitas através da incorporação de análogos
fluorescentes. A incorporação do heme apresentou-se maior parasitas
nocautes (Figura 49). Esta incorporação do análogo foi específica, uma vez
que era diminuída na presença de heme tanto nos parasitas selvagens como
nos nocautes. Desta forma, a ausência da TcK2 estaria impedindo a
internalização do heme nos reservossomos e permitindo seu acúmulo no
citosol dos parasitas.
Hem
e(n
mol/10
8célu
las)
Figura 48. Parasitas nocautes acumulam heme na fração solúvel das células, e este acúmulo não é revertido por ascorbato. A figura mostra a quantidade de heme liberado após lise branda por
epimastigotas selvagens (WT) ou nocautes para TcK2 (null), mantidos em meio LIT na ausência (barras brancas) ou na presença de ascorbato (barras pretas). Os valores foram obtidos como descrito na seção de Materiais e Métodos e correspondem a média de triplicatas ± desvio padrão. O asterisco sobre as barras indica diferença estatisticamente significativa ( p < 0,005) entre os parasitas WT e nocaute.
90
O heme se complexa e atua como cofator essencial de citocromos e
peroxidase. Por outro lado, o heme é utilizado para obtenção de ferro que é
um cofator da superóxido dismutase. O excesso de heme e consequentemente
de ferro poderia assim estar alterando os níveis de superóxido dismutase e
peroxidases, o que causaria alterações no balanço redox de nos níveis de
espécies reativas de oxigênio no parasita (Mittra e Andrews, 2013; Mittra et al.,
2013). De fato, a ausência da quinase TcK2 causou uma diminuição da
atividade de peroxidases do T. cruzi (Figura 50).
Zn
(II)
Me
so
po
rfirin
aIX
in
co
rpo
raçã
o
(flu
ore
scê
ncia
rela
tiva
)
Figura 49. Ausência da TcK2 não afeta a incorporação do análogo de heme, que é inibido pelo heme. As barras mostram o valor médio ± desvio padrão da fluorescência relativa de Zn(II) Mesoporfirina
IX (análogo de heme) incorporada nos parasitas selvagens (WT) e nocautes para TcK2 (null) realizados em triplicatas na ausência (barras brancas) ou na presença de heme (10 µg/mL, barras pretas) utilizado como competidor. O asterisco sobre a barra indica diferença estatisticamente significativa (p < 0,005) entre os parasitas WT e nocaute ou no nocaute na ausência e presença de heme (p < 0,005 em ambos os casos).
91
Também causou um aumento na atividade da Fe-superóxido dismutase
(Fe-SOD) (Figura 51) quando comparado com a atividade dos parasitas
selvagens.
Ativid
ad
ed
e p
ero
xid
ase
(mU
/10
7cé
lula
s)
Figura 50. Parasitas nocautes apresentam menor atividade específica de peroxidase. Os valores
das barras indicam as atividades específicas de peroxidase medidas em triplicata na fração solúvel de epimastigotas selvagens (WT) ou nocautes para TcK2 (null). A barra com asterisco indica diferença significativa (p<0,005) entre as duas linhagens.
Ativid
ade
Fe
SO
D
(U/1
07
cé
lula
s)
Figura 51. Ausência da TcK2 aumenta a atividade da Fe-superóxido dismutase. Os valores das
barras indicam as atividades específicas de Fe-SOD medidas em triplicata em lisados de epimastigotas selvagens (WT) ou nocautes para TcK2 (null). A barra com asterisco indica diferença significativa (p < 0,005) entre as duas linhagens.
92
Estas alterações poderiam levar a um aumento dos níveis de H2O2, o
que de fato ocorreu (Figura 52). É importante notar que estes efeitos não foram
modificados pela presença de ascorbato.
Já os níveis de ROS se mostraram elevados nos parasitas nocautes, e
puderam ser revertidos na presença de ascorbato (Figura 53). Portanto, a
redução do crescimento dos parasitas nocautes para TcK2 estaria
correlacionada com o aumento dos níveis de ROS, provavelmente produzidas
pelos níveis aumentados de H2O2, o qual pode reagir com o ferro ou o cobre
livre para gerar radicais hidroxilo, causando danos parasita.
Figura 52. Na ausência da TcK2 ocorre um aumento dos níveis de H2O2 liberados pelas células. Os
valores representam os níveis de H2O2 em pmol epimastigotas selvagens (WT) ou nocautes (null), mantidas na ausência (barras brancas) ou na presença de 10 μM de ascorbato (barras pretas). A barra com asterisco indica diferença significativa (p < 0,005).
93
4.2.13 Reintrodução da TcK2 selvagem mas não da TcK2 inativa reverte as
alterações observadas no nocaute
Como quatro linhagens independentes foram geradas, duas por
substituição do gene pelos genes que codificam para resistência à geneticina e
higromicina e duas pelos genes de geneticina e blasticidina, nós tínhamos
confidência que os efeitos observados no nocaute eram devidos a falta da
TcK2. Mas, não era possível excluir a possibilidade que tivéssemos eliminado
em todas elas outra proteína que estaria causando os efeitos observados. Além
disso, até este momento, não podíamos saber se o efeito do nocaute se dava
pela ausência da atividade ou pela simples falta da proteína na célula. Para
distinguir entre estas duas possibilidades e excluir que a substituição gênica
Nív
eis
de
RO
S
(Ce
llRO
X)
(x1
0-3
)
Figura 53. Os níveis de espécies ativas de oxigênio nos parasitas nocautes são mais elevados. A
figura mostra os níveis (média ± desvio padrão, n = 3) de ROS intracelular de parasitas selvagens (WT) ou nocautes para TcK2 (null) mantidas na ausência (barras brancas) ou na presença de 10 μM de ascorbato (barras pretas) utilizando o Kit Cell ROX (Invitrogen). A barra com asterisco indica diferença significativa (p < 0,005).
94
tenha produzido algum artefato, reintroduzimos o gene da TcK2 nos parasitas
nocautes.
Foram feitas duas construções no vetor pROCK que se integra no lócus
do gene de tubulina. Uma das construções possuía o gene selvagem e a outra
o gene codificando para a TcK2 com uma mutação que por similaridade
causava a inativação da quinase (K695A) conforme esquematizado na figura
54.
Observamos que os parasitas nocautes transfectados com ambos os
gene da TcK2 expressavam quantidades semelhantes de proteína detectada
por Western Blot, o que não ocorria no nocaute. Além disso apenas o parasita
selvagem e o Addback da proteína selvagem mostraram um aumento de
intensidade na marcação da banda de menor migração no gel quando
cultivados em PBS (Figura 55).
K695A
TcK2
5’ 3’
Figura 54. Esquema mostrando a mutação na lisina 695 para inativação da quinase. As setas indicam a posição dos iniciadores utilizados para construção dos mutantes.
95
É interessante notar que a banda superior nos parasitas TcK2KO+K2
Mut (inativa) estava presente, mas em menor intensidade, e não aumentado
quando o heme foi retirado do meio.
Os parasitas TcK2KO+K2 Mut (inativa) e TcK2KO+K2 Full apresentaram
fenótipos distintos. Enquanto os parasitas contendo a proteína mutada
apresentavam menor capacidade de diferenciação, como os nocautes, os
parasitas com a enzima selvagem reintroduzida se comportaram como os
parasitas selvagens (Figura 56).
Controle PBS
Figura 55. A TcK2 selvagem e mutada é reexpressa nos parasitas nocautes em quantidades semelhantes aos parasitas selvagens. Western blot de extratos de epimastigotas selvagens (WT),
nocaute (-/-), ou de parasitas nocautes que expressam a TcK2 selvagem (Addback WT) ou TcK2 inativa (Addback KD),cultivados em LIT (Controle) e em PBS por 6h. O painel superior mostra a reatividade com anticorpo anti-TcK2 e o painel inferior com anti-tubulina.
* *Me
tacíc
lico
s(%
)
Figura 56. A re-expressão da TcK2 ativa, mas não a inativa, restaura a capacidade de formação de metacíclicos. A figura mostra a porcentagem de metacíclicos ± desvio padrão (n = 3) obtidos de
epimastigotas selvagens (WT), nocautes (-/-), ou dos nocautes transfectados com a quinase ativa (Addback Wt) ou inativa (Addback KD).
96
O mesmo foi verificado para o crescimento (Figura 57).
Mesmo com a diferença entre os fenótipos, ambas as linhagens de
parasitas apresentaram marcação da TcK2 nos reservossomos. Em ambos os
casos a TcK2 apresentou-se colocalizada com a cruzipaína, um marcador
típico de reservossomos (Figura 58).
Para
sitas/m
L (
10
6)
Tempo (h)
Figura 57. A inserção da proteína quinase ativa nos parasitas nocautes restaura o crescimento.
Curva de crescimento dos parasitas selvagens (WT), parasitas nocautes (-/-), ou parasitas nocautes transformados com a TcK2 inteira (Addback Wt) ou a TcK2 inativa (Addback KD). Os experimentos foram feitos em triplicata e os números apresentados correspondem a média ± desvio padrão.
97
Os parasitas TcK2KO+K2 Full também tiveram os níveis de ROS
similares aos níveis encontrados nos parasitas selvagens, enquanto os
parasitas TcK2KO+K2 Mut (inativa) apresentam níveis de ROS semelhantes ao
Figura 58. A TcK2 expressa nos parasitas nocautes apresenta localização semelhante à dos parasitas selvagens. Imunofluorescência de parasitas selvagens (WT) ou parasitas nocautes que
expressam o gene completo da TcK2 (Addback Wt) ou da gene mutado na lisina 695 para alanina, que inativa a TcK2 (Addback KD), utilizando anticorpos anti-TcK2 (verde) ou anti-cruzipaína (vermelho). As células também foram marcadas com DAPI (azul) para indicar o núcleo e cinetoplasto que está sobreposto à imagem de DIC. Barras = 5 µm.
98
dos parasitas nocautes (Figura 59). Estes resultados indicaram claramente que
o efeito da falta da TcK2 se deve a sua atividade enzimática.
Para provar que a banda fosforilada da TcK2 é um sinal de ativação da
quinase, realizamos ensaio de quinase in vitro. Para isso cultivamos os
parasitas por 6 horas no meio LIT ou em PBS. Os parasitas foram lisados e
imunoprecipitados com o anticorpo que reconhece o domínio quinase da TcK2.
O imunoprecipitado foi incubado com o proteína recombinante do eIF2α. Como
podemos verificar na figura 60, apenas os parasitas selvagens mantidos em
PBS tem a capacidade de fosforilar o substrato, sugerindo que o estresse por 6
horas em PBS, a quinase esta mais ativa e é capaz de fosforilar a subunidade
α do fator eIF2.
Nív
eis
de
RO
S
(Ce
llRO
X)
(x1
0-3
)
* *
Figura 59. Parasitas nocautes que expressam a quinase ativa apresentam níveis de ROS semelhantes ao dos parasitas selvagens. A figura mostra os níveis de ROS ± desvio padrão (n = 3) de
epimastigotas selvagens (WT), nocautes (-/-), na ausência (barras brancas) ou presença de 10 μM de ascorbato (barras pretas), ou dos nocautes transfectados (barras cinzas) com a quinase ativa (Addback Wt) ou inativa (Addback KD).
99
Figura 60. Parasitas selvagens cultivados em PBS por 6 horas apresentam a capacidade de fosforilar o fator eIF2α. (+/+) selvagens, (-/-) nocautes para TcK2.
100
5 DISCUSSÃO
Nesta tese evidenciamos o papel da fosforilação da subunidade alfa do
fator de início de tradução 2 no crescimento do T. cruzi e na sua diferenciação
em tripomastigotas metacíclicos em resposta a estresses nutricionais e
oxidativos. Demonstramos que além da treonina 169, já descrita como o
aminoácido que é fosforilado (Tonelli et al., 2011), a serina 43, localizada no
domínio amino terminal adicional do eIF2 e tem um papel chave no processo
de diferenciação, relacionado ao controle de estresse oxidativo. Além disso,
caracterizamos uma das quinases envolvidas nestas fosforilações. Esta
quinase atua como sensor da quantidade de heme entre o citosol e o interior de
endossomos(reservossomos), regulando o início da tradução. Sua ausência
causa uma menor captação de heme no interior dos reservossomos e este se
acumula no citosol. Este acúmulo, desregulado, leva a aumento dos níveis de
H2O2 com consequente formação de espécies reativas de oxigênio.
A fosforilação de eIF2α é um dos processos que controlam o início da
tradução em diversos organismos. Em vários protozoários a fosforilação de
eIF2 é também uma das principais etapas de controle do ciclo biológico, onde
ocorrem alterações morfológicas, estruturais e bioquímicas das células (Zhang
et al., 2013). Já foi mostrado que a parada da síntese proteica como
consequência da fosforilação de eIF2 decorrente de estresse nutricional é
relevante para a diferenciação de Leishmania sp (Cloutier et al., 2012), T.
gondii, Plasmodium sp (Chow et al., 2011; Zhang et al., 2010; Zhang et al.,
2012). Propõe-se que esta parada na síntese proteica seja importante na
formação de formas latentes destes parasitas, ou que genes específicos sejam
ativados como consequência da expressão de proteínas a resposta ao
101
estresse. Contudo, diferentemente do que ocorre em leveduras, ou em
mamíferos, onde determinados genes são preferencialmente traduzidos
causando uma série de eventos na célula (Palam et al., 2011), não está claro
em nenhum dos parasitas já estudados, quais genes são expressos e como
ocorrem as transformações celulares. Os nossos resultados ainda não
respondem estas questões, mas avançam no entendimento das respostas
decorrentes da ativação das proteínas quinases que levam a fosforilação de
eIF2 do T. cruzi como discutiremos a seguir.
A subunidade alpha do eIF2 de T. cruzi, apresenta sequência e tamanho
distinto da proteína de mamíferos e levedura, sendo semelhante somente entre
os Kinetoplastida. A principal diferença é a presença de uma porção extra na
região N-terminal da proteína. É interessante também notar que somente nas
espécies do gênero Trypanosoma há um possível sítio de fosforilação nesta
região, correspondente à serina 43 (Ser43) do T. cruzi. Este sítio é flanqueado
por aminoácidos similares aos encontrados no entorno do sítio de fosforilação
de eIF2 de leveduras ou de mamíferos (Figura 7 e 8). A serina 43 é sempre
substituída por alanina em Leishmania e diversos outros Kinetoplastida.
Nesta tese mostramos que a fosforilação na serina 43 TceIF2α ocorre in
vitro, quando verificamos que somente o duplo mutante para a serina 43 e
treonina 169 que não foi fosforilado. Além disto, verificamos que a
superexpressão, três vezes maior do mutante na serina 43 em relação à
proteína endógena, desencadeou uma significativa diminuição na formação de
tripomastigotas metacíclicos e na diminuição da invasão celular, mostrando que
este sítio tem de fato um papel importante. A presença de dois sítios de
fosforilação em eIF2 de T. cruzi pode ser importante para responder a
102
diferentes tipos de estresse. Os nossos resultados sugeriram que a fosforilação
na serina 43, por exemplo, estaria mais associada à resposta a estresse
oxidativo, uma vez que os parasitas superexpressando eIF2 mutado neste
sítio não se tornam mais resistentes a água oxigenada. É preciso, contudo
ainda demonstrar se a mutação na serina 43 pode previnir ou não o
desaparecimento de polissomos após algum tipo de estresse, como é o caso
dos mutantes na treonina 169 (Tonelli et al., 2011), para concluirmos que este
segundo sítio afeta o início da tradução. O fato de que a fosforilação de eIF2
pode ser induzida em diversas condições, talvez em mais de um sítio, é
apoiado pelo fato de que em experimentos com T. brucei submetidos a choque
térmico, ainda ocorre parada na síntese proteica mesmo em parasitas mutados
na treonina 169 (Kramer et al., 2008), sugerindo que a parada na tradução em
algumas condições poderia requerer também a fosforilação na serina 43.
A presença de um domínio adicional na região N-terminal pode ter sido
um ganho de função durante a evolução e que no caso do gênero
Trypanosoma houve manutenção do sítio extra de fosforilação, enquanto que
este se perdeu nas outras espécies. Inicialmente, o prolongamento da região
N-terminal através de uma duplicação gênica poderia, por outro lado, ter
ocorrido com uma função distinta como é o caso da extensão da região N-
terminal da subunidade γ do mesmo complexo eIF2, que apresenta uma função
de ligação e ativação da fosfatase, responsável por defosforilar do eIF2α em S.
cerevisiae, função que foi perdida nas demais leveduras (Rojas et al., 2014). É
importante salientar que tentamos por diversas vezes superexpressar no T.
cruzi uma forma deletada da porção N-terminal do eIF2, sem sucesso. Em
todos os casos, nunca foi possível obter parasitas resistentes às drogas de
103
seleção, o que poderia sugerir que a falta da região extra N-terminal é
essencial para o funcionamento do complexo. A utilização de um sistema
induzível de expressão poderá no futuro nos ajudar a determinar se a remoção
do N-terminal extra do eIF2 é viável ou não. Existem trabalhos ainda não
pulicados que descrevem duas isoformas de eIF2α em peixes, porém sem
função definida para cada isoforma, sugerindo também haver dupla fosforilação
nestes organismos (Translational Control Meeting. Cold Spring Harbor 2012
pag183).
Outro aspecto importante relacionado à fosforilação de eIF2 em
Trypanosoma é que a sequência que as quinases reconhecem na maioria dos
eucariotos apresenta uma serina flanqueada por uma leucina e duas argininas
(LSRR). Essa sequência é diferente em tripanossomatídeos (VTRR) (Tonelli et
al., 2011). Isto provavelmente não altera a estrutura do sítio, pois ambos os
aminoácidos apresentam uma cadeia apolar e estrutura similar, mas indica que
há diferenças no sítio de reconhecimento das quinases, compatível com o fato
que in vitro o eIF2 de T. brucei não é fosforilada pela quinase PKR, somente
pela K2 deste organismo (Moraes et al., 2007). Desta forma, não se pode
excluir a possibilidade do sítio presente na região N-terminal possa ser
fosforilado especificamente por uma das quinases (K1, K2 ou K3) ou mesmo
por outras proteínas quinases dos parasitas. Além disso, é possível que a
fosforilação da serina 43 seja dependente de uma e da treonina 169 de outra
quinase.
O fenótipo de diminuição na formação de tripomastigotas-metacíclicos e
na taxa de infecção celular, encontrado nos parasitas superexpressores de
eIF2α corrobora com dados da literatura que demonstraram a importância do
104
controle da tradução na manutenção de parasitas no ambiente intracelular ou
extracelulares nos diferentes hospedeiros (Cloutier et al., 2012; Joyce et al.,
2010). Especialmente em L. infantum a regulação através da fosforilação do
fator eIF2α e ativação da quinase LinPERK (Chow et al., 2011; Cloutier et al.,
2012), regula a diferenciação para formas infectivas, como o que vimos em
nosso trabalho.
Por outro lado, a resposta ao estresse oxidativo por meio da fosforilação
de eIF2 ocorre quando células de mamífero são tratadas com arsenito. O
arsenito ativa a HRI (quinase de eIF2α, que responde a heme) em resposta a
formação de ROS promovendo a diminuição na tradução (Proud, 2005). Os
nossos resultados mostram que os superexpressores de eIF2 selvagem ou
mutado na treonina 169 são mais resistentes ao tratamento com H2O2, isso
poderia ser explicado pelo fato que um excesso de sítios a serem fosforilado
diminuiria a parada do crescimento pela não inibição da tradução nestes casos.
Portanto, uma caracterização dos sinais que levam a fosforilação de cada um
dos resíduos de eIF2, dos efeito destas fosforilações no início da tradução e
das proteínas quinases envolvidas é necessária para uma melhor
compreensão destes processos.
Nesta tese tínhamos como metas ainda averiguar o papel de cada uma
das quinases do T. cruzi. Decidimos incialmente caracterizar a TcK2 pelo fato
desta enzima apresentar características e localização celular diferente em T.
brucei quando comparada a outros eucariotos (Moraes et al., 2007). Além
disso, só foi possível obter nocautes completos da TcK2. Obtivemos nocautes
parciais da TcK1, que serão futuramente estudados, mas não conseguimos
selecionar parasitas nem com somente uma das cópias eliminadas da TcK3.
105
Os nossos resultados mostraram que a TcK2 apresenta-se associada a
membranas e está localizada em vesículas endossomais, chamadas
reservossomos nas formas epimastigotas. Isto porque a marcação obtida foi
idêntica à marcação com cruzipaína. O fato de que a enzima só pode ser
solubilizada dos parasitas na presença de detergentes indicou que ela está
provavelmente inserida na membrana desta organela provavelmente com o
domínio quinase voltado para o citosol, uma vez que se espera que o eIF2
seja citossólico. Neste caso, o N-terminal da quinase estaria localizado no
lúmen dos reservossomos. A localização da enzima nos reservossomos na
forma epimastigota foi evidenciada pela sua distribuição na região posterior do
parasita e pela sua colocalização com a cruzipaína presente nestas organelas.
Esta localização foi confirmada, pois a mesma localização foi obtida com a
enzima contendo epitopo para HA e pelo fato de que a fluorescência
desapareceu nos parasitas nocautes.
Vale ressaltar que a localização da TcK2 é de alguma forma similar a da
TbK2 de T. brucei, que está na região da bolsa flagelar, e que em
determinadas condições se espalha pelo lisossomo dos parasitas (Moraes et
al., 2007). Ambas estão assim, localizadas nas vias relacionadas aos
processos endocíticos destes parasitas, diferentemente da localização da
PERK de mamíferos (Chakrabarti et al., 2011) e também da LinPERK de
Leishmania sp (Chow et al., 2011). Estas últimas se localizam no retículo
endoplasmático. Curiosamente, a quinase LinPERK não responde a estresse
causado pelo DTT, apesar de responder a tapsigargina (Chow et al., 2011) o
que é típico para PERK. Como a tapsigargina causa liberação de Ca2+ do
retículo endoplasmático, a ativação da LinPERK poderia ocorrer por alterações
106
celulares, e não pelo dobramento incompleto de proteínas e exposição
cisteínas livres como é o caso da PERK. Desta forma, fica evidente que as
quinases de kinetoplastida podem ter um mecanismo de ativação distinto da
quinase PERK e dependente do tipo de vida e da forma como os nutrientes são
captados em cada protozoário.
Por isto foi importante neste trabalho demostramos o papel da TcK2 in vitro
e sua ativação através da autofosforilação. A ativação das quinases geralmente
acontece a partir da autofosforilação. Isso provavelmente também acontece
com a TcK2, já que podemos verificar uma banda marcada na posição de
migração da proteína recombinante quando ela foi incubada com -[32P]-ATP.
Esta ativação ocorreu porque a quinase foi expressa em fusão com a GST que
promove a formação de dímeros, mecanismo usual de ativação de quinases.
Além disto, mostramos que a quinase no parasita encontra-se parcialmente
ativada. Isto porque ela é detectada como duas bandas em Western Blot e a
banda de menor migração é convertida na de maior migração por tratamento
com a fosfatase (CIAP), enquanto que o efeito oposto é visto após incubarmos
o parasita com um inibidor de fosfatase. Mais ainda, detectamos uma
distribuição de bandas alterada em parasitas submetidos a estresse nutricional,
com uma diminuição da banda de maior migração, compatível com ativação da
quinase por fosforilação. Além disso, podemos notar uma distribuição das duas
bandas de modo diferencial durante os distintos estágios do parasita, sugerindo
que a quinase possa estar em diferentes estados de ativação ao longo do seu
ciclo de vida. Isto estaria de acordo com uma diminuição no nível de tradução
nas formas infectivas, tripomastigotas metacíclicos e sanguíneos, que
107
apresentam menor tradução em relação a formas epimastigotas e amastigotas
(de Godoy et al., 2012).
Os nossos resultados mostraram que tanto mRNA, como a proteína
estão presentes em todas as fases do ciclo de vida do parasita. No entanto
existem claramente diferenças na sua localização. A TcK2 está nos
reservossomos de formas epimastigotas e em vesículas grandes nas formas
amastigotas. Já nas formas infectivas, a quinase foi detectada em estruturas
menores, possivelmente vesículas espalhadas ao longo do citosol. Em todos
os casos, a sobreposição da marcação com o retículo endoplasmático foi
mínima, o que sugere que a quinase esteja associada com vesículas
endossomais e tenha tamanhos e comportamentos diferentes de acordo com o
estágio do parasita. Isto está de acordo com o que foi proposto para o T. cruzi,
onde o fluxo de nutrientes é alterado dependendo das condições nutricionais e
do metabolismo dos diferentes estágios do parasita (Teixeira et al., 2012). Os
epimastigotas proliferam dentro do tubo digestivo do inseto vetor adquirem
nutrientes principalmente através do citóstoma. Estes nutrientes derivam do
sangue em digestão e se acumulam nos reservossomos. Nos amastigotas,
aparentemente não há acúmulo de reservas e o parasita deve consumir
rapidamente os nutrientes obtidos do citosol da célula hospedeira. Já nas
formas tripomastigotas, o fluxo seria revertido e o parasita deve suprir a sua
membrana plasmática de proteínas para a invasão (Teixeira et al., 2012).
Um dos nutrientes que devem ser adquiridos do hospedeiro é o heme,
uma vez que o T. cruzi, como outros Tripanossomatídeos, não é capaz de
sintetizar esta molécula (Cupello et al., 2014). Existem evidências de que o
heme seja incorporado no T. cruzi através de receptores ABC (Cupello et al.,
108
2011). Uma vez no citosol do parasita, o excesso de heme seria transportado
para os reservossomos, que aparecem tanto mais eletrondensos quanto maior
o conteúdo de heme do meio de cultura (Cunha-e-Silva et al., 2006). Ainda não
se sabe como o heme é transportado para os reservossomos e se poderia
também ser incorporado diretamente via o citóstoma e a rede de endossomos
(Cupello et al., 2014), uma vez que não estão descritos transportadores de
específicos de heme em T. cruzi presente na membrana dos reservossomos.
Verificamos que quando cultivávamos formas epimastigotas em meio LIT sem
a adição de hemina, a quinase TcK2 que estava presente nos reservossomos,
espalhava-se pelo citosol e ficava mais fosforilada. Além disso, quando
analisamos o conteúdo dos reservossomos por microscopia eletrônica,
parasitas mantidos em meio sem a adição de hemina apresentavam organelas
eletronluzentes, apoiando a ideia de que o heme é estocado neste
compartimento. Como verificamos que o heme estimula a proliferação celular,
possivelmente através da ativação de CamKII do parasita (Nogueira et al.,
2011), pressupomos que haja uma inter-relação entre o crescimento celular e o
controle da síntese proteica por meio da regulação da TcK2, uma vez que a
TcK2 apresentou a banda superior predominante nos parasitas cultivados em
meio LIT sem a adição de hemina. Esta possibilidade foi confirmada quando
verificamos que a banda de maior migração da quinase era menos alterada se
adicionávamos heme aos parasitas mantidos em PBS. Tal resultado nos
indicou haver uma associação da fosforilação e possível ativação em resposta
a heme.
Através de uma análise de bioinformática, verificamos que a TcK2
apresentaria sítios putativos de ligação a heme. Mais importante, mostramos
109
que a atividade da quinase foi inibida in vitro na presença de heme. Os nossos
resultados de espectroscopia diferencial também mostraram que a parte da
TcK2 contendo o domínio quinase liga-se com alta afinidade ao heme,
apresentando uma constante de dissociação de 10 M. Isto nos sugeriu que a
TcK2 teria um comportamento semelhante a quinase HRI e não à PERK,
mesmo apresentando a região transmembranar e estando presente no
compartimento endossomal. A quinase HRI apresenta dois sítios de ligação à
heme, um na região N-terminal e um na região C-terminal, sendo o sítio
próximo a região C-terminal de associação reversível em relação à ligação ao
heme (Han et al., 2001). A ligação neste segundo sítio é que inibe a HRI. Desta
forma, uma melhor caracterização da ligação de heme não só ao domínio
catalítico, mas também a região N-terminal da TcK2, possivelmente inserida
dentro do endossomo, identificando os sítios envolvidos, poderá ajudar a
compreender melhor como ocorre esta inibição e qual é o papel do heme na
enzima no parasita.
Em nosso trabalho mostramos que o heme inibiu a formação de
tripomastigotas metacíclicos e que esta inibição pode ter relação com a inibição
da atividade da TcK2. Não podemos, contudo, descartar que a presença do
heme iniba a diferenciação in vitro também atuando em outros processos
metabólicos do parasita.
Em Leishmania sp foi verificado que a aquisição de heme depende de
uma proteína denominada LHR1 (Leishmania Heme Response 1) presente em
formas promastigotas. LHR1 é uma proteína essencial para o desenvolvimento
deste parasita. Este transportador localiza-se na membrana plasmática e em
membranas do compartimento endossomal ácido (Miguel et al., 2013).
110
Parasitas com uma cópia a menos de LHR1 diferenciam-se em formas
amastigotas, porém não desenvolvem a infecção intracelular (Miguel et al.,
2013). Além de transportadores de heme, em Leishmania sp foram descritas
proteínas de membranas responsáveis pela absorção de ferro pela sua
redução através da proteína LFR1 e absorção do vacúolo parasitóforo para o
citosol do parasita via a proteína LIT1 (Flannery et al., 2011; Jacques et al.,
2010). Parasitas com nocautes gênicos para LFR1 ou LIT1 são deficientes na
formação de formas infectivas (Huynh e Andrews, 2008). Já em T. brucei está
descrito um transportador de haptoglobina-hemoglobina que está localizado na
região da bolsa flagelar, onde ocorre endocitose e que poderia transportar
heme (Higgins et al., 2013). Transportadores semelhantes poderiam existir em
T. cruzi e deverão no futuro ser caracterizados.
O heme e o ferro estão associados com o desenvolvimento da fase
intracelular em Leishmania sp. Estes parasitas utilizam o Fe2+ para o
metabolismo da mitocôndria e no lisossomo (Huynh e Andrews, 2008). No
citosol o Fe2+ é um cofator para superóxido dismutase, responsável pela
transformação do radical superóxido (O2-) em peróxido de hidrogênio e
oxigênio utilizando um próton (H+). Desta forma, é também esperado que a
adição de heme possa ter inúmeros efeitos no T. cruzi.
Para entender a relação entre a presença de heme e TcK2, geramos
parasitas nocautes para esta enzima. Uma vez que a fosforilação de eIF2 é
importante para diferenciação, como esperado, os parasitas nocaute parcial e
total tiveram uma taxa de diferenciação progressivamente menor que a dos
controles.
111
No entanto, as linhagens sem a presença da TcK2 apresentaram uma
diminuição no crescimento em relação aos parasitas selvagens. Isto pode ser
explicado devido ao acúmulo de heme no citosol que desencadearia um
desequilíbrio oxidativo celular, através do aumento de ROS e de níveis de
H2O2. Observamos que a adição de ascorbato em baixas concentrações (10
M) restaurava o crescimento do parasita, e que este efeito perdurava por
alguns dias se o ascorbato fosse removido, sugerindo que o ascorbato
eliminava momentaneamente um componente do meio extracelular. Esta ideia
é apoiada por informações do Dr. Martin Taylor da London School of Tropical
Medicine and Hygiene que nos comunicou que nunca conseguiu detectar
incorporação de ascorbato em T. brucei ou T. cruzi. O fato de não ocorrer
reversão do crescimento em concentrações maiores de ascorbato seria então
compatível com um efeito duplo, oxidante e antioxidante, desta molécula em
função da sua concentração (Lane e Richardson, 2014).
Adicionalmente, os nossos resultados sugeriram que o alvo do ascorbato
era a redução de Fe2+ para Fe3+ inibindo a reação de Fenton do primeiro com
H2O2. Nesta reação são gerados radicais superóxido (OH) que reagem
fortemente com diversas moléculas biológicas, causando danos, por exemplo,
nas ligações duplas presentes nos fosfolipídios das membranas e promovendo
um aumento de sua permeabilidade e dissipação de gradientes de potencial
necessários para o funcionamento adequado das células (Akanni et al., 2014).
Constatamos que de fato nos nocautes da TcK2 havia um aumento dos
níveis de heme nas células, aparentemente na fração citossólica. Também
verificamos haver um aumento da incorporação de um análogo de heme. Como
nas imagens de microscopia eletrônica dos parasitas nocautes, os
112
compartimentos endossomais apareceram menos densos, concluímos que o
heme se acumularia no citosol na falta da TcK2. Isto poderia estar acontecendo
ou porque a TcK2 estaria diretamente envolvida na atividade de um
transportador, como por exemplo o LHR1 (cujo homólogo existe no genoma de
T. cruzi), ou indiretamente através da diminuição de sua tradução, ou de outros
fatores, quando o eIF2 é menos fosforilado. É possível que algumas
proteínas, talvez contendo pequenas fases de leitura sejam menos traduzidas
quando eIF2 não é fosforilado (Palam et al., 2011), e este seria o caso dos
transportadores de heme para os reservossomos.
Em paralelo, detectamos um grande aumento nos níveis de atividade de
superóxido dismutase e de H2O2 nos nocautes, este último como consequência
da diminuição da atividade de peroxidase nas células. Isto faria com que
peróxido fosse liberado pelo parasita causando danos no parasita, inibindo o
crescimento. A H2O2 no meio de cultura reagiria com o Fe2+ através da reação
de Fenton. Esta ideia é apoiada pelos resultados de que nos parasitas
nocautes tratados com ascorbato não houver alteração do conteúdo dos
reservossomos observado por microscopia de transmissão, e nem houve
reversão dos níveis de H2O2, mas sim, ocorreu a diminuição dos níveis de
espécies reativas de oxigênio (ROS) totais.
Não temos ainda uma explicação do porque ocorrem as alterações nos
níveis de SOD e peroxidase no nocaute. Uma explicação plausível é de que o
nível de tradução destas enzimas sejam controladas diretamente pela
fosforilação de eIF2. Outra possibilidade é de que a quinase tenha outro
substrato além do eIF2 que possa regular outras vias de sinalização na célula.
Em outros organismos existem trabalhos que sugerem que a quinases de
113
eIF2 possam fosforilar outros substratos (Cullinan et al., 2003), porém esta é
uma possibilidade que requer uma demonstração mais sólida. Em todo caso,
em kinetoplastida esta possibilidade não pode ser descartada. Outra
possibilidade é de que a presença de heme afete diretamente as peroxidases e
SOD, além dos sistemas de detoxificação de espécies reativas por meio das
redutases, particularmente da via de tripanotiona redutase. Não há no genoma
uma ORF que codifique para a enzima heme oxigenase, responsável por
degradar a hemina liberando o ferro, mas este pode acontecer por outras vias
ou enzimas ainda não caracterizadas (Cupello et al., 2014). Se este processo
ocorrer, como seria esperado para o aproveitamento do ferro, é possível que o
excesso de heme leve a um excesso de ferro no citosol, causando aumento na
atividade das SODs do T. cruzi que dependem somente deste metal para sua
atividade, ao contrário de outros eucariotos (Miller, 2012). Por outro lado, o
heme é requerido para a atividade da heme peroxidase presente em
Trypanosoma (Cupello et al., 2014) e a sua presença em excesso poderia de
alguma forma causar inibição desta enzima.
A produção de ROS nem sempre está associada a um ambiente de
estresse em T. cruzi. Epimastigotas crescem em ambiente com grande
quantidade de heme, como já mencionado acima, produzindo níveis de ROS
intracelulares elevados. Diversos trabalhos vêm mostrando que formas
epimastigotas cultivadas em meios com quantidade de heme crescente se
multiplicam mais, devido ao aumento de ROS intracelular, e esta reposta é
mediada por outra quinase, a CamKII (Nogueira et al., 2011). Como o parasita
não sintetiza heme e requer ferro para o crescimento, a incorporação destas
114
moléculas deve ser feita ao mesmo tempo em que ocorre o controle dos níveis
de espécies reativas.
Para melhor entender o mecanismo da TcK2 nas formas epimastigotas no
controle do balanço de heme e consequentemente no equilíbrio do ROS
intracelular, nós re-expressamos a quinase selvagem (WT) e a quinase inativa
(KD) nos nocautes. Ambas as linhagens apresentaram as duas bandas no
Western Blot e localização da proteína nos reservossomos. É importante
salientar que nos re-expressores da quinase inativa, a banda superior foi
sempre menos intensa e não aumentava em condições de carenciamento para
heme. Este resultado poderia ser explicado se outras enzimas fossem capazes
de fosforilar a TcK2, e apoiariam a ideia de que mesmo fosforilada, a TcK2
mutada não seria capaz de fosforilar eIF2 transduzindo a resposta de
estresse. Adicionalmente, estes resultados poderiam indicar que a banda
superior da quinase corresponde também a outro tipo de modificação como
glicosilação ou palmitoilação. Para averiguar esta possibilidade, tratamos
extratos de parasitas com endonuclease H, e não verificamos alteração de
bandas. Mais importante, contudo, foi o fato de que a reinserção da proteína
selvagem nos parasitas nocautes reverteu os diferentes fenótipos, enquanto
que o mesmo não foi observado para a enzima mutada, comprovando que a
atividade da TcK2 é relevante para o controle do heme citosol/reservossomo, e
consequentemente para o controle do equilíbrio do estado oxidativo do
parasita.
Na figura 59 está esquematizado como a TcK2 atuaria dentro do parasita.
Os níveis de heme adquirido pelas células causariam a manutenção dos
parasitas no estado proliferativo através do controle da síntese proteica. O
115
excesso de heme seria estocado nos reservossomos e utilizado de forma
regulada. Em baixos níveis de heme, a TcK2 estaria atividade e possibilitando
a expressão seletiva de genes envolvidos na invasão celular e na capacidade
do parasita de lidar com agentes oxidantes. Na falta da quinase, este balanço
seria perdido, com um acúmulo de heme no citosol.
Em conclusão, os dados obtidos nesta tese evidenciam um papel
importante da quinase TcK2 no equilíbrio do heme desencadeando um papel
também no controle dos níveis de ROS. O que chama mais atenção que isso
acontece em formas epimastigotas, formas replicativas presentes no inseto. Já
formas replicativas presentes no hospedeiro mamífero a TcK2 desempenha
uma papel no desenvolvimento da infecção intracelular, como mostrado
parasitas nocautes apresentam a capacidade de invasão, porém perder a
capacidade de multiplicação intracelular. Sugerindo que o acúmulo de heme ou
a presença, é importante para o desenvolvimento da infecção, como acontece
em Leishmania sp. A incorporação de heme por formas amastigotas seria
necessária para a infecção e a formação de formas tripomastigotas
sanguíneas. Trabalhos recentes sugerem que o estresse oxidativo sofrido
pelos parasitas durante a invasão auxiliaria na infecção, provavelmente a TcK2
pode estar relacionada com este controle e sua ausência nas formas
amastigotas desequilibraria o ambiente tornando inviável a progressão da
doença. Sugerindo que a TcK2 teria uma função importante no controle da
homeostase celular, sendo um possível alvo de drogas para o tratamento da
doença de Chagas.
116
Figura 59. Esquema da função da TcK2 no T.cruzi.
117
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Zhang, M., B.R. Joyce, W.J. Sullivan, Jr., e V. Nussenzweig. 2013. Translational control in Plasmodium and Toxoplasma parasites. Eukariot Cell. 12:161-167.
Zhang, M., S. Mishra, R. Sakthivel, M. Rojas, R. Ranjan, W.J. Sullivan, Jr., B.M. Fontoura, R. Menard, T.E. Dever, e V. Nussenzweig. 2012. PK4, a eukaryotic initiation factor 2alpha(eIF2alpha) kinase, is essential for the development of the erythrocytic cycle of Plasmodium. Proc Natl Acad Sci USA. 109:3956-3961.
125
Anexo I
A membrane bound eIF2 alpha kinase located in
endosomes is regulated by heme and controls
differentiation and ROS levels in Trypanosoma cruzi
Leonardo da Silva Augusto1, Nilmar Silvio Moretti1, Thiago
Cesar Prata Ramos1, Teresa Cristina Leandro de Jesus1#a,
Min Zhang2, Beatriz A. Castilho1, Sergio Schenkman1*
1Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Escola Paulista de
Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazil,
2Department of Pathology, New York University School of Medicine, New York,
New York, United States of America.
#aCurrent address: Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de
São Paulo. São Carlos, SP, Brazil
* Corresponding author
Email: [email protected]
126
ABSTRACT
Regulation of translation initiation has been described as a critical step in the
control of growth and differentiation of several protozoan parasites in response
to environmental changes. This occurs by activation of protein kinases that are
similar to the ones found in higher eukaryotes, which phosphorylate the alpha
subunit of translation initiation factor 2 (eIF2α), decreasing general translation
and favoring the expression of stress remedial response genes. However, very
little is known about the signals that activate eIF2 kinases in protozoan
parasites. Here, we have characterized an eIF2 kinase of Trypanosoma cruzi
(TcK2), the agent of Chagas’ disease, as a transmembrane protein located in
organelles that accumulate nutrients in proliferating parasite forms. We found
that the absence of heme causes TcK2 changes that results in the
differentiation of proliferative epimastigote forms to infective metacyclic-
trypomastigotes. Heme binds specifically to the catalytic domain of the kinase
and inhibits its activity. Parasite lines lacking TcK2 lose the differentiation
capacity and display growth deficiency by the accumulation of hydrogen
peroxide that drive the generation of reactive oxygen species. We provided
evidence that the augmented level of hydrogen peroxide occurs because of
heme accumulation in the cell, not in the reserve organelles. This apparently
causes an increase of superoxide dismutase activity and decrease of peroxide
activity in the parasite. These alterations could be restored by the re-expression
of the wild type but not by a TcK2 dead mutant. These findings indicate that
heme is a key factor for growth control and differentiation through regulation of
an unusual type of eIF2 kinase in T. cruzi.
127
AUTHOR SUMMARY
Trypanosoma cruzi proliferates as epimastigotes in the midgut of the insect
vector filled with blood meal. There, it accumulates nutrients in specific
organelles called reservosomes. The parasite moves towards the hindgut and
when the blood is completely digested, reservosomes are consumed. At this
moment, the insect is ready for a new feeding cycle that promotes the release
of infective metacyclic-trypomastigote forms. We have previously found that
such differentiation involves protein synthesis arrest through the
phosphorylation of the eukaryotic translation initiation factor 2α (eIF2α). Now,
we show that one of the kinases that phosphorylate eIF2α is localized in the
reservosome. The kinase TcK2 binds and is specifically inhibited by heme
derived from blood hemoglobin. We also found that heme inhibits differentiation,
suggesting that it is an important signal for differentiation. By generating
knockouts of TcK2, we observed an increased accumulation of heme in the
cytosol, which induced cellular damage by affecting the reactive oxygen
metabolism in the parasite. We concluded that this eIF2 kinase TcK2 senses
cytosolic heme obtained from the blood meal, promoting its storage in the
reservosomes. When heme levels are decreased in the cytosol, the TcK2
activation causes protein synthesis arrest followed by the induction of the
differentiation of proliferative epimastigote forms to infective metacyclic-
trypomastigotes
128
Anexo II
129
Anexo III
130
Anexo IV
131
Anexo V
Characterization of Trypanosoma cruzi sirtuins as
possible drug targets for Chagas Disease
Nilmar Silvio Morettia, Leonardo da Silva Augustoa, Tatiana
Mordente Clementea, Raysa Paes Pinto Antunesa, Nobuko
Yoshidaa, Ana Claudia Torrecilhasb, Maria Isabel Nogueira
Canoc and Sergio Schenkmana*
aDepartamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,
Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São
Paulo, São Paulo, SP, Brazil
bDepartamento de Ciências Biológicas, Campus Diadema, Universidade
Federal de São Paulo, Diadema, SP, Brazil
cDepartamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade
Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brazil
Running title: Sirtuins as drug target for Chagas Disease
*Address correspondence to Sergio Schenkman,
132
Lysine acetylation has emerged as a major post-translational
modification involved in diverse cellular functions in higher eukaryotes. The
protein acetylation is regulated through the activities of lysine acetyltransferases
and lysine deacetylases. Amongst the deacetylases, the Sirtuins are NAD+-
dependent histone deacetylases involved in different cellular events, such as
gene silencing, DNA damage repair, and metabolic processes. Here we
investigated the protein acetylation of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas
disease, during parasite proliferation and differentiation and the involvement of
sirtuins in these phenomena. Several changes in the acetylation were observed
during parasite growth and metacyclogenesis, suggesting a role of this
modification in these processes. Using specific antibodies or cell lines
overexpressing tagged version of TcSir2rp1 and TcSir2rp3, the two putative T.
cruzi sirtuins, we found that TcSir2rp1 is localized in the cytosol and TcSir2rp3
in the mitochondrion. Both proteins were able to modify the acetylation levels of
specific proteins as measured by immunoblotting with antibodies against acetyl-
lysine, but generated antagonistic effects on parasite development. TcSir2rp1
overexpression acts impairing parasite growth and differentiation, whereas
TcSir2rp3 improves both. We further investigated the effect of salermide, a
specific sirtuin inhibitor that has been tested to treatment of some tumors in vitro
and in vivo. Treatment of parasites with salermide during in vitro infection
prevented the growth and the initial multiplication after mammalian cell invasion
by T. cruzi. Also, in vivo infection was partially controlled after salermide
treatment. Our findings prompted the use of sirtuins as drug targets for Chagas
disease treatment.
133
Anexo VI
Ikaros is a guardian of the ‘B-side’ of murine B-1 cells
Vivian Cristina de Oliveira 1, Nilmar Silvo Moretti 2, Leonardo da Silva Augusto 2,
José Daniel Lopes1, Sergio Schenkman 2, Mario Mariano1,3, Ana Flavia Popi 1 1 Disciplina de Imunologia, Departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia, Universidade Federal de São Paulo; 2 Disciplina de Biologia Celular, Departamento de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia, Universidade Federal de São Paulo 3 Universidade Paulista (UNIP)
Running title: Ikaros mantains B cell program in B-1 cells
Key words: Ikaros, B-1 cells, PU.1
ABSTRACT
Ikaros, Aiolos and Helios are zinc finger transcription factors that are
important regulators of the hematopoietic system. Several studies have
suggested the role of Ikaros in the development, maturation, activation and
differentiation of lymphocytes. To elucidate this mechanism, it is important to
understand how this transcription factor works in the dichotomy of the
hematopoietic system, a topic that remains uncertain. Herein, we investigated
the Ikaros role in the control of lymphomyeloid phenotype of B-1 lymphocytes.
We found that Ikaros is highly expressed in B-1 cells, as well as its target
genes. Moreover, Ikaros positively regulates the expression of Flt3, Gfi e Il7r,
while down-regulates PU.1. Furthermore, Ikaros silencing favors the
differentiation of B-1 cells into phagocytes. Taken together, these data pointed
to the relevance of Ikaros in the maintenance of promiscuous gene profile of B-
1 cells. It could be suggested that Ikaros function as a guardian of B-1 lymphoid
pattern, and that its absence directs the differentiation of B-1 cells into
phagocytes.
