Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - … · 2015. 7. 29. · Comparação da...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)

TATIANE MALDONADO COELHO

Comparação da atividade biológica e glicosilação da Gonadotrofia Coriônica equina recombinante

(reCGββββαααα) expressa em duas linhagens celulares de mamíferos visando à geração de um biofármaco.

Versão da Tese Corrigida

São Paulo

Data de Depósito na SPG:

23/06/2014

TATIANE MALDONADO COELHO

Comparação da atividade biológica e glicosilação da Gonadotrofia Coriônica equina recombinante

(reCGββββαααα) expressa em duas linhagens de celulares de mamíferos visando à geração de um biofármaco.

Tese apresentada ao Instituto de Química da

Universidade de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)

Orientadora: Profa. Dr

a. Mari Cleide Sogayar

São Paulo

2014

Dedico este trabalho:

aos meus pais, Ivanir e Elaine, pelo amor incondicional;

à minha irmã, Cíntia e ao meu cunhado, Joseph, pela amizade de uma vida inteira

ao meu marido, Carlos, por ser meu companheiro nesta jornada

ao meu filho, Arthur, por ser minha alegria, minha sabedoria e minha motivação

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Mari Cleide Sogayar, por me receber em seu grupo de braços abertos há nove anos e ter me proporcionado um ambiente tão enriquecedor e acolhedor. Agradeço pela amizade, pela preocupação, pelos conselhos e pela postura ética e firme que sempre manteve ao longo de sua vida acadêmica. Por ser um exemplo de dedicação, perseverança, alegria e sensibilidade. Por ter um amor tão grande à ciência e às pessoas. Por conseguir concatenar pessoas com o mesmo brilho nos olhos e dedicação em um grupo fantástico, que tornaram o ambiente do meu doutorado inesquecível.

À Dra. Ana Claudia Carreira pela paciência, dedicação, amizade e companheirismo. Por ter me ensinado a fazer ciência de qualidade na bancada, por estar sempre disponível e por participar de tudo. Por ser co-autora deste projeto e ter somado tanto a todos os experimentos. Obrigada pela companhia diária e pelas infindáveis ajudas.

Aos meus alunos de Iniciação Científica – Nathali Guimarães Nóbrega e Gabriel Levin, a quem eu tive o prazer de orientar. À Nathali eu agradeço por ter me ajudado a ser mais organizada, por ser sempre tão alegre e companheira, por trabalhar tão bem e ter se tornado uma amiga querida. Ao Gabriel eu agradeço pela excelência e perseverança nos experimentos, por me ajudar tanto agora no final do doutorado, pelas conversas no fluxo laminar, pelos café na copinhae pela confiança depositada. Agradeço por terem me tornado um ser humano muito melhor.

Ao Professor Mike Butler, da Univerdidade de Manitoba, por ter me recebido em seu grupo para ralizar o Doutorado Sanduíche. Agradeço por ter me mostrado que é possível ser um grande cientista e ao mesmo tempo uma pessoa gentil e acolhedora. Por ter agrupado em seu laboratório pessoas com bagagens culturais e científicas tão diferentes e tão complementares. Agradeço as inúmeras sugestões e aos “Tim’s coffe n doughnuts” que sempre trazia nas reuniões semanais.

Aos nossos Postdocs: Fernando Lojudice, Marcos Demasi, Marina Trombetta Lima, Renato Astorino, Patrícia Kossugue e Thalita Souza Carmo, pela amizade gostosa, pelas discussões científicas e outras nem tanto. Agradeço desde as figurinhas do álbum da copa às inúmeras dicas de carreira e de vida. Agradeço a convivência agradável de todos os dias, as risadas e o companheirismo.

À Mariele, Camila e Ingrid, Déborah e Zizi nossas técnicas queridas, pela amizade, pela excelência, pelo altruísmo, dedicação e boa-vontade sempre! E, como não mencionar, pelo café sempre fresquinho e pelo material do lab sempre estéril e pronto para uso. Pela imensa ajuda, principalmente com os experimentos de Western blot e com o ensaio In Vivo

A todos os colegas do NUCEL, principalmente nos tempos de LBCM e UIPH no IQ-USP.

Aos colegas de pós-graduação:

À Aline, por conseguir são tão doce e tão rabugenta ao mesmo tempo. Pelas conversas de mãe, de doutorado sanduíche ede dona de casa, por me dar várias dicas de livros, filmes, séries, comidas e restaurantes, enfim, por dividir comigo muitos momentos e muitos sentimentos.

À Ana Lúcia, por ser tão descompensada e engraçada, por ter sempre uma opinião sincera, por fazer dancinhas engraçadas e falar com o melhor sotaque do mundo.

À Érika por ser a pessoa mais entusiasta da ciência e tecnologia que eu conheço. Pela viagem à SBBiotec no Guarujá, pelo Melisso, pelas risadas e ideias.

Ao Gustavo, por ser tão inteligente, por compartilhar comigo várias etapas do doutorado e por nos convidar para passar uns dias com sua família em Cruzeiro. Pela coragem, dedicação e pela ética que marcam sua personalidade.

À Ilana, por dividir os alunos da Vet comigo e com a Aline, e me fazer dar muiras risadas. Pela confiança e pela amizade muito especial que construímos.

À Letícia, por ser onipresente em todos os eventos. Por ser sempre bem informada a respeito de coisas burocráticas et al. Por todas as risadas. Por me ajudar a passar em Bioquímica Avançada.

À LuGomes, por ser uma das melhores amigas que fiz no lab e com a qual espero manter contato para toda a vida. Sempre foi a minha referência de IC espetááááculo, depois doutoranda espetááááculo e agora PostDoc espetáááculo. Você sempre foi minha idola acadêmica.

À Marina, por ser minha companheira nos tempos finais, por toda ajuda, todos os café e almoços, pelos perrengues, por toda gentileza e alegria que transbordam de sua pessoa.

À Marluce, por compartilhar tanto de sua vida comigo e ser uma amiga para todos os momentos. Por ser uma profissional tão admirável e inspirar a todos ao seu redor.

À Nanda, por ser uma cientista tão focada e tão determinada, por ser um exemplo de profissionalismo e por ser uma amiga sincera para todos os momentos/

À Roberta por sempre me fazer rir. Por ser mundana e desbocada. Por ser autênctica e divertida.

À Patty por todas as inúmeras conversas de cachorro, academia, bebês, células, tese, futebol, viagens et al Pela alegria e bom-humor diários que distribui a todos.

A todos os colegas do Mike’s Lab: Ben, Bo, Carina, Katrin, Natalie, Sarah, Venkata,Vince e Viridiana pelo auxílio e pela amizade. À Dra. Maureen Spearmann por ter me adotado cientificamente e me ajudado tanto com as análises de N-glicanos. Por ser tão competente e tão comprometida com a qualidade dos resultados. Por ser tão mãezona de todos do lab. À Bo. Carina e Nathalie pela amizade e por me fazerem sentir em casa mesmo longe dela.

À Universidade de São Paulo, ao Instituto de Química, ao Departamento de Bioquímica e ao Instituto de Biociências por proporcionarem um riquíssimo universo de possibilidades.

Aos funcionários do Departamento de Pós pelo apoio emocional e logístico na estrega da tese.

A todas as agências financiadoras que de alguma forma contribuíram para este projeto, especialmente a FAPESP, pela bolsa de doutorado no país e Bolsa Sanduíche.

Aos meus amigos da Vet 69 pela amizade de mais de 11 anos! Por compartilhare sempre os bons momentos e as vitórias de cada um.

E, principalmente,

ao meu marido, Carlos, meu maior incentivador e companheiro. Por me amar tanto, me compreender e me fazer tão feliz. Obrigada por cuidar tão bem de mim e do nosso filho. Por sempre acreditar que tudo dá certo no final – e dá mesmo!

à minha irmã Cíntia e o seu marido Joseph, “irmão” que foi agregado à minha vida, pela amizade de toda uma vida. Por me entenderem melhor do que ninguém. Por serem padrinhos maravilhosos para o Arthur. Pelas viagens, almoços, jantares e tantos outros momentos!

aos meus pais, Elaine e Ivanir (em memória) por sempre me proporcionarem condições e cuidados para que eu chegasse até aqui. Pelo amor incondicional. Pela educação. Pela minha formação como ser humano. Por abrirem mão de tantas coisas (que eu só percebi agora que sou mãe) para me fazerem feliz.

E, por fim,

ao meu filho Arthur, por ser a minha alegria de viver e meu maior estímulo para percorrer esta jornada até o fim.

“Tente outra vez”

Raul Seixas

RESUMO

Coelho, T.M. Comparação da atividade biológica e glicosilação da Gonadotrofia Coriônica equina

recombinante (reCGββββαααα) expressa em duas linhagens celulares de mamíferos visando à geração de

um biofármaco. 2014. 143 páginas. Tese de Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas (Bioquímica). Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

Atualmente, o Brasil encontra-se na privilegiada posição de maior produtor e exportador mundial de carne

bovina, tornando a pecuária uma das atividades nacionais mais importantes e rentáveis. Este dado enfatiza a

importância de pesquisa e desenvolvimento em reprodução bovina, especialmente em hormônios

estimuladores da ovulação, tais como a gonadotrofina coriônica equina (eCG). Os produtos comerciais à base

de eCG comercialmente disponíveis são purificados a partir do sangue de éguas gestantes, apresentando

variabilidade de lote para lote e presença de contaminantes. Estes fatos, juntamente com a limitação do

material de partida (sangue equino), enfatizam a necessidade de haver um sistema de expressão de eCG

recombinante passível de ser explorado comercialmente. Neste quesito, as células de mamíferos se mostram

um sistema robusto para tal finalidade, visto que são capazes de adicionar modificações pós-traducionais às

cadeias polipeptídicas, tais como a glicosilação, o que é essencial para o correto dobramento, maturação e

montagem das duas subunidades, além de interferir diretamente com a meia-vida, o reconhecimento do

receptor, a solubilidade e a atividade biológica das proteínas. No entanto, mesmo entre os sistemas de

expressão heteróloga em células de mamífero, encontra-se muita variabilidade nos padrões de glicosilação

adicionado. No presente trabalho, foi realizado um estudo comparativo através da clonagem e expressão de

uma forma fusionada de eCG (reCGβα) em duas linhagens celulares diferentes: (1) CHO-DG44, um dos

sistemas de expressão mais utilizados pelas indústrias farmacêuticas, capaz de adicionar N-glicanos

complexos; e (2) 293T, uma linhagem humana capaz de produzir glicoproteínas carreando oligossacarídeos

complexos e sialilados. Os resultados de atividade biológica (in vitro e in vivo) apontam uma maior atividade

de reCG produzido por células CHO-DG44. O perfil de N-glicosilação de reCG produzido pelas células CHO-

DG44 assemelhou-se mais à eCG selvagem, quando comparado a reCG produzido por células 293T. Por fim,

estudos clínicos foram realizados com reCG produzido em meio livre de soro fetal bovino e parcialmente

purificado, onde atividade específica de reCG produzido por células CHO-DG44 mostrou-se similar ao

produto comercial selvagem.

Palavras-Chave: 1. Biotecnologia Molecular; 2. Expressão de proteínas recombinantes em células de mamífero; 3. Hormônios reprodutivos veterinários; 4. Produção de gonadotrofina coriônica equina recombinante; 5. Análise de glicosilação.

ABSTRACT

Coelho, T.M. Comparision of the biological activity and glicosilation of recombinant Chorionic

Gonadotropin (reCGββββαααα) expressed in two mammalian cell lines, aiming at generating a

biopharmaceutical.

Brazil is currently the major beef producer and exporter, rendering to livestock one of the country´s most

economically relevant activities. This emphasizes the importance of research and development in bovine

reproduction, especially at ovulation-stimulatory hormones, such as equine gonadotropin (eCG). The

commercially available eCG-based products are purified from blood of pregnant heifers, presenting batch-to-

batch variability and the presence of contaminants. These facts, together with the limitation of the bulk

material (equine blood), emphasize the need of an eCG expression system able to be commercially explored.

In this aspect, mammalian cells are a robust system, capable of add post-translational modifications to

polypeptide chains, such as glycosylation, which is essential for the correct folding, maturation and assembly

of both eCG subunits. In addition, glycosylation directly interferes with the protein half-life, receptor

recognition, solubility and biological activity. In the present work, a comparative study was carried out by

cloning and expressing a fusion form of eCG (reCGβα) in two different mammalian cell lines: (1) CHO-

DG44, one of the most used by pharmaceutical companies expression systems, capable of add complex-type

N-glycans; and (2) 293T, a human cell line capable of produce glycoproteins carrying complex and

sialylated oligosaccharides. The in vitro and in vivo biological activity results show a higher potency of

reCG produced by CHO-DG44 cells. The N-glycosylation pattern produced by CHO-DG44 cells was more

similar to native eCG in comparison to the N-glycosylation produced by 293T cells. Finally, clinical studies

were performed with serum absent media produced and partially purified reCG, showing that the specific

activity of reCG produced by CHO cells was similar to the commercial wild type product.

Key Words: 1. Molecular Biotechnology; 2. Expression of recombinant proteins in mammalian cells; 3. Glycosylation analysis.

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1. Protocolos de superovulação convencionais em bovinos........................................................................24

Figura 4.1: Construção do cDNA fusionado eCGβα...................................................................................................60

Figura 4.2: Expressão de reCGreCGreCGβα por populações de células CHO-DG44 transfectadas com o plasmídeo

pNUØ-eCGβα ao longo do processo de amplificação gênica deste plasmídeo pelo tratamento com doses crescentes do quimioterápico MTX................................................................................................................................................65

Figura 4.3: Dinâmica de expressão de reCGβα pelas populações de células resistentes às doses de 1µM e 2,5µM do quimioterápico MTX.....................................................................................................................................................66

Figura 4.4: Cinética de expressão de reCGβα pelos clones superprodutores de células 293T, ao longo de três dias, na presença ou ausência de soro fetal bovino...............................................................................................................68

Figura 4.5: Cinética de expressão de reCGβα pela população CHO 2.5µM após adaptação ao crescimento na ausência de MTX, ao longo de três dias, na presença ou ausência de soro fetal bovino..............................................70

Figura 4.6: Ensaio de Atividade Biológica In Vitro de eCG ......................................................................................73

Figura 4.7: Ensaio de Atividade Biológica In Vivo.....................................................................................................76

Figura 4.8: Painel representativo contendo fotografias do ensaio de Atividade Biológica In Vivo do reCG produzido por células 293T ou CHO-DG44..................................................................................................................................79

Figura4.9: Cromatograma resultante do processo de purificação de reCGβα com a coluna HiTrapTM Mono Q....................................................................................................................................................................................81

Figura 4.10: Cromatograma resultante do processo de purificação de proteínas secretadas no meio de cultura condicionado pelo controle negativo............................................................................................................................83

Figura 4.11: Porcentagens relativas de reCGβα, dosadas por ELISA quantitativo, presente nas diferentes etapas do processo cromatográfico realizado com a coluna HiTrapTM-Mono Q..........................................................................84

Figura 4.12. Análise da purificação de reCGβα por cromatografia de troca iônica realizada com a coluna HiTrapTM Mono Q.........................................................................................................................................................................86

Figura4.13: Cromatograma resultante do processo de purificação de reCGβα com a coluna HiTrapTMConA..............................................................................................................................................................89

Figura 4.14: Porcentagens relativas de reCGβα, dosadas por ELISA quantitativo, presente nas diferentes etapas do processo cromatográfico realizado com a coluna HiTrapTM-ConA..............................................................................90

Figura 4.15: Análise da purificação de reCGβα por cromatografia de troca iônica realizada com a coluna HiTrapTM Con A............................................................................................................................................................................91

Figura 4.16: Ensaio de Atividade Biológica In Vivo do reCG parcialmente purificado pela coluna HiTrapTM Con A....................................................................................................................................................................................93

Figura 4.17: Imagens do ensaio de Atividade Biológica In Vivo do reCG parcialmente purificado pela coluna HiTrapTM Con A...........................................................................................................................................................96

Figura 4.18: Fracionamento de eCG comercial (Folligon e WHO) em gel de poliacrilamida a 12% corado com Coomassie blue.............................................................................................................................................................97

Figura 4.19: Análise de N-glicosilação do eCG comercial Folligon e do padrão internacional de eCG NIBSC-WHO.............................................................................................................................................................................99

Figura 4.20: Principais picos obtidos de N-glicanos marcados com 2-AB e seus respectivos valores em GU..........101

Figura 4.21: Perfil de HPLC de amostras de N-glicanos extraídos do eCG comercial Folligon marcados com 2-AB presentes na preparação original e após digestão com diferentes combinações de exoglicosidases............................................................................................................................................................103

Figura 4.22: Análise de N-glicosilação do reCGβα produzido por células 293T ou CHO-DG44...........................105

Figura 4.23: Perfil de N-glicosilação obtido de reCGβα produzida por células 293T ou CHO-DG44....................107

Figura 4.24: Principais picos de N-glicanos marcados com 2-AB obtidos para βα produzido por células 293T ou CHO-DG44, e seus respectivos valores em unidades de glicose(GU).......................................................................108

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 3.1. Sequências dos primers para amplificação das sequências codificadoras de reCGα

e reCGβ e engenharia genética para geração da sequência fusionada eCGβα.............................................................33

Tabela 3.2. Sequências dos primers que pareiam no vetor pGEM®-T Easy................................................................36

Tabela 3.3 – Programa de NP-HPLC utilizado para analisar glicanos de eCGβα recombinante e eCG comercial.......................................................................................................................................................................55

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BLAST®: Basic Local Alignment Search Tool®

cDNA: DNA complementar

CHO: Chinese Hamster Ovary (ovário de hamster chinês)

DHFR: diidrofolato redutase

DNA: Deoxyribonucleic Acid (ácido desoxirribonucleico – ADN)

dNTPs: 2-deoxyriboNucleotide TriPhosphate (2-desoxirribonucleotídeos trifosfatados)

ddNTPs: 2,3-dideoxyriboNucleotide TriPhosphate (2,3-didesoxirribonucleotídeos trifosfatados)

DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium (meio Dulbecco’s Modiefied Eagle)

eCG: equine Corionic Gonadotrophin (gonadotropina coriônica equina)

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic Acid (ácido etilenodiaminotriacético)

ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ensaio imunoenzimático)

FBS: Fetal Bovine Serum – Soro Fetal Bovino

FSH: Follicule-Stimulating Hormone (hormônio folículo estimulante)

HEK: Human Embryonic Kidney (rim embrionário humano)

HPLC: High Performance Liquid Chromatography (cromatografia líquida de alta performance)

IRES: Internal Ribosome Entry Site (sítio de entrada interna do ribossomo)

kDa: quilodalton

L: litro

LB: Luria-Bertani; Lysogeny Broth (meio lisogênico)

MCS: Multiple Cloning Site (sítio múltiplo de clonagem)

mRNA: messenger RNA (RNA mensageiro)

m: metro

MTX: metrotexato

M: molar

NCBI: National Center for Biotechnology Information

ORF: Open Reading Frame (quadro/janela aberto/a de leitura)

pb: pares de base

PBS(A): Phosphate Buffered Saline (Absent) (solução salina tamponada com fosfato (sem cálcio ou

magnésio)

PCR: Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase)

RNA: Rybonucleic Acid (ácido ribonucleico – ARN)

rpm: rotações por minuto

SDS: Sodium Dodecyl Sulfate (dodecil sulfato de sódio)

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (eletroforese em gel de

poliacrilamida contendo SDS)

VC: volumes de coluna

v/v: volume em volume

SUMÁRIO

1. Introdução .................................................................................................................................... 21

1.1. A Família de hormônios glicoprotéicos equinos .................................................................. 21

1.2. A Gonadotrofina Coriônica/Hormônio Luteinizante equino (eCG/LH) ............................ 22

1.2.2 A estrutura de eCG/LH ................................................................................................ 22

1.2.2 A Função de eCG/LH ................................................................................................... 23

1.2.3 Aplicações de eCG ........................................................................................................ 24

2. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 30

2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................ 30

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 30

3. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 32

3.1 Extração de RNA e síntese de cDNA a partir de uma hipófise equina ...................................... 32

3.2 Desenho dos primers (oligonucleotídeos iniciadores) ............................................................. 33

3.3 Clonagem das sequências codificadoras de eCGα e eCGβ ....................................................... 34

3.4 Engenharia Genética para a união destas duas cadeias de eCG em uma sequência única

(eCGβα)............................................................................................................................................. 38

3.5 Sequenciamento da sequência fusionada eCGβα e subclonagem no Vetor pNUØ .................. 40

3.6 Linhagens celulares ................................................................................................................ 43

3.7 Meios de cultura, soluções e condições de cultivo de células transfectadas............................ 44

3.8 Meio de cultura: ..................................................................................................................... 44

3.9 Soluções:................................................................................................................................ 45

3.10 Condições de cultivo .............................................................................................................. 45

3.11 Produção de reCGβα em Batelada : ....................................................................................... 46

3.12 Cotransfecção de células 293T ou CHO-DG44 com a construção pNUØ-eCGβα e o vetor de

seleção pX343 para geração de clones e populações celulares superexpressando eCGβα e resistentes

à higromicina (higror) ......................................................................................................................... 46

3.13 Seleção de clones de células 293T superprodutoras de reCGβα ............................................. 47

3.14 Amplificação gênica de populações de células CHO-DG44 superprodutoras de reCGβα ......... 47

3.15 Determinação da expressão de reCGαβ em meios condicionados pelos clones de 293T e por

populações celulares de CHO-DG44 superexpressoras de reCGβα através de ELISA .......................... 48

3.16 Cinética de expressão de reCGβα em células 293T e CHO-DG44, na presença e na ausência de

soro fetal bovino ............................................................................................................................... 49

3.17 Ensaio de atividade biológica in vitro ...................................................................................... 49

3.18 Ensaio de atividade biológica in vivo ....................................................................................... 50

3.19 Purificação de reCGβα por HPLC ............................................................................................ 51

3.20 Western Blot .......................................................................................................................... 53

3.21 Análise de glicosilação de reCGβα e comparação com os padrões comerciais purificados de

eCG Folligon e NISRC-WHO ................................................................................................................ 55

4. RESULTADOS ............................................................................................................................ 59

4.1 Construção de gene de fusão eCGββββα ................................................................................... 60

4.2 Cotransfecção de células 293T e CHO-DG44 com a construção pNUØeCGββββαααα juntamente com o vetor de seleção pX343 e seleção de células resistentes à higromicina................................. 64

4.3 ELISA para detectar a expressão de eCGββββαααα em meios condicionados pelos clones de 293T e populações celulares de CHO-DG44 superexpressando estas duas subunidades de reCG......... 65

4.4 Cinética de expressão de reCGββββαααα expresso na presença ou na ausência de soro fetal bovino. .............................................................................................................................................. 70

4.5 Ensaio de Atividade Biológica In Vitro de reCGββββαααα ............................................................ 74

4.6 Ensaio de Atividade Biológica In Vivo de reCGββββαααα ............................................................. 77

4.7 Purificação Parcial de reCGββββαααα secretada em meio de cultura condicionado através de cromatografia de alta perfomenaca (HPLC) .................................................................................. 85

4.7.1 Cromatografia de Troca Inônica – HiTrap Mono Q (GE lifesciences) ............................. 86

4.7.2 Concanavalina A ............................................................................................................. 93

4.8 Análise de Perfil de N-glicosilação de reCGββββαααα produzido pelas células produtoras 293T e CHO-DG44 e comparação com padrões comerciais de eCG purificados de sangue de água ..... 102

4. 8.1. Análise de N-glicosilação dos padrões comerciais de eCG purificados a partir do sangue de

éguas prenhes (Folligon e NISRC-WHO) ........................................................................................... 102

4. 8.2. Análise de N-glicosilação de reCGβα produzido por células 293T e por células CHO-

DG44 111

5. DISCUSSÃO ...................................................................................... Erro! Indicador não definido.

5.1 Obtenção do inserto reCGβα ........................................................... Erro! Indicador não definido.

5.2 Expressão de reCGβα .................................................................. Erro! Indicador não definido.

5.2 Atividade Biológica In Vitro de reCGβα ........................................ Erro! Indicador não definido.

5.3 Atividade Biológica In Vivo de reCGβα ......................................... Erro! Indicador não definido.

5.4 Purificação Parcial de reCGβα por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) ........ Erro!

Indicador não definido.

6. CONCLUSÕES .......................................................................................................................... 143

7. PRÓXIMOS PASSOS ............................................................................................................... 144

8. PERSPECTIVAS ....................................................................................................................... 145

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 146

LISTA DE ANEXOS ................................................................................................................................ 152

ARTIGOS PUBLICADOS E/OU ACEITOS PARA PUBLICAÇÃO ......................................... 161

1. Introdução

O Brasil é um país de base agropecuária, sendo a criação e reprodução de bovinos

essencial para a movimentação da economia de nosso país. Muitos investimentos são realizados

por companhias farmacêuticas em pesquisa e desenvolvimento de novas drogas e protocolos

reprodutivos para reprodução de bovinos, visando melhorar os índices de prenhez de vacas e,

com isso, melhorar a produtividade das fazendas. Neste cenário, a gonadotrofina coriônica

equina, eCG, desponta como um hormônio indutor de ovulação peça-chave nesta cadeia

produtiva. Sua estrutura complexa e altamente glicosilada garantem uma meia-vida circulatória

longa, permitindo que uma única dose deste hormônio injetada por animal seja suficiente para

estimular o recrutamento folicular ovariano e induzir a maturação do folículo capacitado até o

estágio de ovulação. No entanto, estas peculiaridades estruturais tornam sua expressão na forma

recombinante um grande desafio.

1.1. A Família de hormônios glicoprotéicos equinos

A família de hormônios glicoprotéicos equinos, a mais estruturalmente complexa do

Reino Animal, é composta pelos hormônios folículo-estimulante (FSH), tireóide-estimulante

(TSH), luteinizante (LH) e gonadotrofina coriônica (CG), sendo os três primeiros secretados pela

adenohipófise e o último, exclusivo de primatas e equídeos, pelos cálices endometriais

placentários (Dirnberger et al., 2001; Gartner e Hiatt, 2002). Estas proteínas são heterodímeros

compostos pela associação não-covalente de uma subunidade α comum a todos e uma

subunidade β específica para cada hormônio (Pierce e Parsons, 1981). A gonadotrofina coriônica

equina (eCG) constitui uma exceção, visto que a sequência nucleotídica de sua subunidade β é

idêntica à mesma da subunidade β do hormônio luteinizante (LH), sendo, por esta razão,

chamada de Gonadotrofina Coriônica/Hormônio Luteinizante equino (eCG/LH) (Sherman et al.,

1992).

1.2. A Gonadotrofina Coriônica/Hormônio Luteinizante equino (eCG/LH)

1.2.2 A estrutura de eCG/LH

Uma exceção na família dos hormônios glicoprotéicos equinos, a subunidade β de eCG e

eLH, em contraste com as mesmas subunidades de primatas, é codificada por um único gene em

comum, compartilhando o mesmo promotor com elementos randômicos do tipo TATAA e uma

sequência de aminoácidos idêntica (Sherman et al., 1992). No entanto, o seu conteúdo de

carboidratos é diferente entre as duas sequências: o eCG é o hormônio glicoprotéico mais

pesadamente glicosilado, com 45% de seu peso molecular correspondendo a carboidratos

(Gospodarowicz, 1972) versus 30% do peso do eLH (Butnev et al., 1996).

A subunidade α, composta de 96 aminoácidos, exibe duas complexas cadeias

oligossacarídicas N-ligadas, localizadas nos resíduos de asparaginas 56 e 82. Entretanto, as

cadeias de carboidratos dos dois hormônios exibem diferenças em suas estruturas: a subunidade

α de eLH possui dois N-glicanos biantenários finalizados em N-acetilgalactosaminas sulfatadas

(SO4-4-GalNAc), enquanto que os N-glicanos anexados à subunidade α de eCG são finalizados

em ácido siálico nas ligações α2,3 e α2,6 (Damm et al., 1990), possivelmente estendido com

repetições de lactosamina (Bousfield et al., 2004).

A subunidade β, composta de 149 resíduos de aminoácidos (Sugino et al., 1987), possui

uma única cadeia de N-glicano localizada na Asn13, terminando com GalNAc sulfatada em eLH

e α2,3Gal sialilada em eCG (Smith et al., 1993; Matsui et al., 1994). Ambas subunidades β

possuem até doze O-glicanos estendidos com poli N-acetil-lactosamina sialilada (α2,3)

localizados nas serinas ou treoninas do carboxi-peptídeo terminal (CTP) de 28 resíduos de

aminoácidos (Hokke et al., 1994; Bousfield et al., 2001). O CTP possui ação fundamental na

atividade biológica in vivo da gonadotrofina coriônica e manutenção deste hormônio na corrente

sanguínea do animal (Stoebel e Moberg, 1982; Bousfield et al., 2001).

Como o eLH e a eCG possuem cadeias polipeptídicas idênticas, a diferença entre a

estrutura dos N- e O-glicanos explica a diferença entre os pesos moleculares e a atividade

biológica destes dois hormônios: eCG apresenta uma excepcional meia-vida circulatória em

comparação ao eLH (Bousfield et al., 2001). A remoção dos resíduos terminais de ácido siálico

das cadeias de glicanos da eCG diminui dramaticamente a atividade in vivo desta glicoproteína,

visto que sua meia-vida é reduzida de 48 horas para aproximadamente 1-2 horas (Martinuk et al.,

1991).

1.2.2 A Função de eCG/LH

O eLH, secretada pela adeno-hipófise, atua em conjunto com o FSH na indução da

secreção de estrógenos pelo folículo em desenvolvimento e pela ruptura da parede folicular

quando o mesmo atinge a maturidade. O LH estimula as células intersticiais tanto nos ovários

quanto nos testículos. Nos machos, as células intersticiais (células de Leydig) produzem

andrógenos sob estímulo de LH (Hafez e Hafez, 2004).

A eCG é secretada pelo útero equino, mais especificamente pelos cálices endometriais

que são formados ao redor do quadragésimo dia de gestação, permanecendo até ao redor do

octagésimo quinto dia. A secreção deste hormônio, que possui ação biológica semelhante tanto

ao FSH quanto ao LH, estimula o desenvolvimento de folículos ovarianos na égua gestante.

Alguns destes folículos ovulam, mas a maioria transforma-se em folículos luteinizados devido à

ação semelhante ao LH. Tais corpos lúteos acessórios produzem a progesterona necessária para

manter a prenhez na égua (Hafez e Hafez, 2004).

Esta gonadotrofina única possui a capacidade de, em espécies heterólogas, ligar-se aos

receptores tanto de FSH quanto de LH e provocar o estímulo da foliculogênese (Stewart et al.,

1976; Combarnous, 1981). Sua prolongada meia-vida plasmática, decorrente de sua alta

quantidade de açúcares (Mcintosh et al., 1975), permite que uma única aplicação deste hormônio

seja eficiente para induzir ovulação, poupando, deste modo, o tempo gasto com manejo e

diminuindo possíveis estresses dos animais submetidos a tratamento superovulatório (Kimura et

al., 2007).

1.2.3 Aplicações de eCG

Nos últimos anos, a gonadotrofina coriônica equina desponta como primeira opção na

indução da ovulação em vacas em anestro gestacional, nos protocolos de Inseminação Artificial

em Tempo Fixo (IATF), visando melhorar os índices de fertilidade de fêmeas bovinas criadas em

regime extensivo (Sá Filho et al., 2010; Ferreira et al., 2013; Carvalho et al. 2013; Barreiros et

al. 2014). Atualmente, estas aplicações da eCG correspondem à maior parte do mercado do

hormônio.

A eCG também vem sido utilizada em tratamentos superovulatórios de vacas e novilhas

como uma opção eficaz de tratamento em animais irascíveis (Mapletoft et al., 2002), visto que os

tratamentos hormonais convencionais em bovinocultura empregam a utilização de oito doses de

preparações comerciais purificadas de FSH porcino - Folltropin-V©, Bioniche© (dados obtidos

na bula do produto). A eCG é especialmente utilizado em vacas de corte criadas em manejo

extensivo.

Figura 1.1 – Protocolos de superovulação convencionais em bovinos. A) eCG (gonadotrofina coriônica

equina) é aplicado 10 dias após a observação do cio, em dose única. B) pFSH (hormônio folículo-estimulante

porcino) é aplicado a partir do 10° dia após o cio, em oito doses decrescentes, durante quatro dias. Em ambos os

casos, PGF (prostaglandina F2α) é utilizada para a indução da ovulação e a IADE (inseminação artificial com

detecção de estro) é realizada nos dias 14-15, com posterior coleta de embriões nos dias 21-22. (Adaptado de Hafez

& Hafez, 2004).

Os tratamentos superovulatórios com hormônios gonadotróficos são utilizados

previamente à transferência de embriões, uma biotécnica que permite recolher diversos

embriões, obtidos através de indução da superovulação e posterior fertilização in vitro ou in vivo,

de uma mesma fêmea de qualidade genética superior (doadora), transferindo-os para fêmeas com

potencial genético inferior (receptoras) que, por sua vez, levarão a gestação a termo (Pfeifer et

al., em http://www.ufpel.tche.br/hcv; Hafez e Hafez, 2004). A importância básica da TE para a

produção animal consiste na possibilidade de uma fêmea produzir um número de descendentes

muito superior ao que seria possível obter fisiologicamente durante sua vida reprodutiva. Além

disso, trata-se de uma importante ferramenta para pois acelera e confere maior precisão no

processo de melhoramento animal (Pfeifer et al., em http://www.ufpel.tche.br/hcv).

1.3. O eCG/LH recombinante

Em bovinocultura, muitos dos tratamentos ovulatórios atuais empregam a utilização de

gonadotrofina coriônica equina purificada a partir de soro de éguas gestantes (Christakos e Bahl,

1979; Mapletoft et al., 2002). Porém, além de a extração de gonadotrofinas ser uma tarefa

laboriosa e dispendiosa, a falta de biossegurança do material resultante é bastante preocupante,

visto que qualquer tentativa de purificação que preserve os hormônios glicoprotéicos demonstra

uma limitada capacidade de destruição de vírus resistentes (Tharasanit et al., 2006). Além disso,

pelo fato de ser um extrato biológico, existe uma grande variabilidade na atividade da

glicoproteína entre os lotes de eCG, contribuindo, desta maneira, para as variabilidades na

resposta e na qualidade dos embriões obtidos (Wilson et al., 1993). Além disso, tomando-se em

consideração o fato de que a fonte de origem do material é limitada (sangue de éguas prenhes), e

que existem fatores bioéticos relacionados à obtenção deste material, procura-se uma fonte

ilimitada e ética de eCG, que assegure o fornecimento ininterrupto ao mercado consumidor

crescente deste hormônio.

De modo a solucionar estes problemas, a gonadotrofina coriônica equina recombinante

foi clonada e, então, expressa em células de inseto (Legardinier et al., 2005), secretada em leite

de coelhas transgênicas (Galet et al., 2001), expressa em células de camundongos (Galet et al.,

2000), modificada e expressa como formas deglicosiladas em células CHO (Shiota et al., 1997;

Min et al., 2004), sendo que somente para os dois primeiros sistemas foram realizados ensaios de

atividade biológica in vivo, resultando em nenhuma atividade, fato este decorrente da diferença

nas cadeias ne glicanos adicionados por estes sistemas.

As proteínas recombinantes apresentam máxima biossegurança, melhor performance nos

resultados, nenhuma interferência de outros hormônios e poucos contaminantes, sendo, desta

maneira, usadas largamente na medicina reprodutiva humana e representando grande interesse

para produção assistida veterinária. A tecnologia recombinante provou ser possível a produção

de proteínas complexas de modo reprodutível. No entanto, a estrutura das gonadotrofinas é de

difícil reprodução, pois, além da presença das já comentadas modificações pós-traducionais, as

gonadotrofinas são compostas por duas cadeias transcritas e traduzidas de maneira independente,

as quais são combinadas subseqüentemente (Loumagel et al., 1995).

1.4. A expressão de proteínas recombinantes no sistema de células de mamíferos

O sistema de expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos possui a

grande vantagem de possuir o aparato para a adição de N- e O-glicanos nas cadeias recém-

sintetizadas, o que é absolutamente essencial para a correta apresentação da estrutura terciária de

cada subunidade, que, por sua vez, representa um pré-requisito para sua montagem com a contra-

subunidade (Strickland e Pierce, 1983; Strickland et al., 1985). Este processo facilita a formação

das pontes dissulfídicas, que é um evento crítico para o dobramento e a maturação da subunidade

funcional do hormônio (Beebe et al., 1990; Bedows et al., 1993; Feng et al., 1995). Além disso,

a glicosilação interfere diretamente na meia-vida da molécula na circulação, no reconhecimento

da molécula por seus receptores, exposição do hormônio a mecanismos regulatórios in vivo

(Lunenfeld, 2004), além de interferir na solubilidade, proteger contra proteases e inativação

térmica (Goochee, 1992); portanto, a adição de glicanos causa grande impacto nas propriedades

biológicas dos hormônios glicoprotéicos (Baenziger, 1996; Dirnberger et al., 2001).

A tarefa de elucidar padrões de glicosilação adiconados às proteínas é desafiadora, pois

esta modificação pós-traducional apresenta variabilidade tanto na ocupação dos sítios de

glicosilação (macroheterogeneidade) quanto nas glicoformas presentes em cada sítio

(microheterogeneidade) (Walsh e Jefferi 2006; Walsh, 2010; Werner et al. 2007). A glicosilação

das proteínas ocorre e uma série de processos enzimáticos que iniciam-se no retículo

endoplasmático e progridem ao longo do complexo de Golgi (Kornfeld e Kornfeld, 1985; Wurm,

2004; Ohtsubo e Marth et al., 2006), onde o processo é finalizado e a proteína é encaminhada a

seu destino final, que pode ser tanto permanecer intracelular, quanto ser transportada até a

membrana, quanto ser secretada. Sendo assim, o perfil de glicosilação presente em uma

glicoproteína reside na atividade das enzimas ativas presentes no complexo de Golgi

(glicosiltransferases, glicosidades e enzimas transportadoras), enzimas estas que variam de

acordo com o organismo, órgão e condição metabólica (Kornfeld e Kornfeld, 1985; Brooks,

2006).

Uma das formas mais efetivas de produção de glicoproteínas farmaceuticamente ativas é

utilizar o sistema de expressão CHO (Chinese Hamster Ovary), que possui uma variada gama de

glicosiltransferases, sendo capaz de adicionar N-glicanos bi e tri-antenários do tipo complexo e

sialilados a cadeias polipeptídicas sintetizadas, apresentando deficiências, no entanto, em

adicionar sulfatação e não realizando sialilação do tipo α2,6 terminais (Szkudlinski et al.,1993 ;

Paulson et al., 1989; Devasahayam, 2007). Comparativamente, a linhagem celular HEK293

(Human Embryonic Kidney) e as linhagens derivadas desta, como a 293T, são capazes de

produzir glicoproteínas carreando oligossacarídeos complexos e completos, com a presença de

sialilações do tipo α2,6, que podem ser importantes na manutenção da meia-vida de eCG

(Chitlaru et al., 1998).

Por estes motivos, propõe-se, neste trabalho, a clonagem da gonadotrofina coriônica

equina e sua expressão nos diferentes sistemas de células de mamíferos citadas acima: uma

linhagem murina, CHO-DG44-dhfr-/-, e uma linhagem humana, 293T, de modo a comparar

níveis de expressão, estruturas dos N-glicanos e atividade biológica da reCGβα expressa por

cada uma destas linhagens com o eCG comerialmente disponível no mercado. Assim, pretende-

se determinar o sistema de expressão de reCG mais eficiente e, por conseguinte, transferir o

processo de produção para uma indústria farmacêutica veterinária, de modo a preencher esta

lacuna na cadeia agropecuária nacional, que é a falta de um hormônio indutor da ovulação de

performance consistente, advindo de uma fonte ética, controlada e ilimitada.

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Obter uma construção contendo ambas as cadeias da gonadotrofina coriônica equina

(eCG) fusionadas e expressar a proteína reCGβα biologicamente ativa em duas linhagens

diferentes de células de mamíferos: CHO-DG44 e 293T e correlacionar esta atividade com o

perfil de glicosilação obtido desta proteína expressa entre as duas linhagem e também em relação

ao tipo selvagem, disponível comercialmente.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Amplificar os fragmentos de cDNAs referentes às cadeias α e β de eCG a partir de

cDNA de hipófise equina;

- Unir os fragmentos gênicos das duas cadeias em uma única sequência codificadora por

técnicas de engenharia genética e clonar esta sequência no vetor de expressão pNU-Ø;

- Obter clones celulares da linhagem 293T e populações celulares da linhagem CHO-

DG44 expressando reCGβα;

- Comparar a dinâmica de expressão de reCGβα entre as duas linhagens ao longo do

tempo;

- Comparar a expressão de reCGβα pelas células superprodutoras cultivadas na presença

ou na ausência de soro fetal bovino;

- Comparar a atividade biológica in vitro de reCGβα expressa pelas duas linhagens

celulares com a eCG selvagem, utilizando uma linhagem celular responsiva;

- Comparar a atividade biológica in vivo de reCGβα expressa pelas duas linhagens

celulares com a eCG selvagem, utilizando ratas pré-púberes;

- Purificar parcialmente a reCGβα expressa pelas duas linhagens celulares

- Comparar o perfil de glicosilação presente na reCGβα expressa pelas duas linhagens

celulares com a eCG selvagem;

- Correlacionar a atividade biológica desempenhada por reCGβα expresso por cada uma

das linhagens com o respectivo perfil de glicosilação obtido;

- Transferir o sistema de expressão considerado mais eficiente para uma indústria

farmacêutica veterinária, visando à produção comercial de reCG.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Extração de RNA e síntese de cDNA a partir de uma hipófise equina

Uma glândula hipófise foi obtida através da necrópsia de um cavalo (Equus caballus),

macho, raça meio-sangue árabe, de 19 anos. Esta hipófise foi imediatamente acondicionada em

RNAholder (Bioagency© Biotecnologia), a 4 °C, até ser macerada em nitrogênio líquido,

utilizando-se cadinho e pistilo.

O RNA total foi extraído deste macerado de hipófise utilizando-se o Illustra RNAspin

Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare®, Buckinghamshire, England), seguindo as

recomendações do fabricante. A concentração de RNA em cada preparação foi determinada

através de quantificação em nanoespectrofotômetro (ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop

Technologies Inc., Wilmington, EUA) e leitura de absorbância a 260 ηm. O grau de pureza do

RNA total foi estimado pela relação Abs260/Abs280 (contaminação por proteínas) e Abs260/Abs230

(contaminação por compostos orgânicos), admitindo-se, respectivamente, os valores de

aproximadamente 2,0 e entre 1,8 e 2,2, respectivamente, como ideais.

Uma vez consideradas satisfatoriamente puras, as amostras de RNA foram submetidas a

reações de transcrição reversa. Para tal, uma alíquota de 1,0 µg de cada RNA total foi incubada

por 10 min a 37 °C com 2,0 U de DNase I (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), em

solução contendo 1,25 mM de MgCl2 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA) e 20 U de

RNase OUTTM (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA). Posteriormente, esta enzima foi

inativada por aquecimento a 75 °C por 5 min. A cada amostra de RNA previamente tratado,

foram adicionados 250 ng de Oligo dT (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 50 ng de

Random Primer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 1,3 mM de dNTPs (Thermo

Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA) e 1,0 µL de água deionizada (Milli-Q®, Millipore,

Billerica, MA, EUA), que foram incubados a 65 °C por 10 min e imediatamente colocadas no

gelo. Em seguida, foi adicionado 1X tampão de síntese de primeira fita para a enzima ImPromTM

-II RT (Promega Corporation, Madison, EUA), 5,0 mM de ditiotreitol (DTT, Thermo Fisher

Scientific Inc., Waltham, EUA), 20 U de RNase OUTTM, 1,0 µL da enzima ImPromTM -II RT

(Promega Corporation, Madison, EUA) e 0,5 µL de água deionizada, para um volume final de

reação de 20,0 µL. As amostras foram incubadas a 25 °C por 10 min para pareamento dos

oligonucleotídeos e, posteriormente, a 42 °C por 2 h, para síntese dos cDNAs. Em seguida, a

enzima transcriptase reversa foi inativada por meio da incubação das amostras a 75 °C por 15

min. Para a degradação das moléculas de RNA molde, adicionou-se 1,0 µL de RNase H (5 U/µL,

Thermo Fisher Scientific Inc.). As amostras foram incubadas a 37° C por 30 min e,

posteriormente, a 72 °C por 10 min para inativação da enzima. Em seguida as amostras foram

diluídas 3 vezes em água deionizada, obtendo-se um volume final de 60 µL e estocadas a – 80

ºC.

3.2 Desenho dos primers (oligonucleotídeos iniciadores)

Os primers utilizados para amplificação das sequências de cDNA foram desenhados

baseando-se nas sequências codificadoras completas de cada uma das duas subunidades de eCG

contidas na base de dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov; National Center for

Biotechnology Information, U. S. NLM - U. S. National Library of Medicine, Bethesda, EUA

(NM_access number α: 001099763.1, β: 001490342.2). Não se fez uso de um programa

computacional para o desenho dos oligonucleotídeos. Todos os primers foram sintetizados pela

empresa Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM /Thermo Fisher Scientific Inc.. Os

primers liofilizados foram reconstituídos em solução tampão 10 mM Tris-Cl (pH 8,0) para gerar

uma solução estoque a 100 µM e soluções de uso a 10 µM.

As sequências dos primers utilizados na amplificação dessas cadeias e seus

intermediários obtidos nos passos de Engenharia Genética estão discriminadas na Tabela 3.1

abaixo:

Tabela 3.1. Sequências dos primers para amplificação das sequências codificadoras de reCGαααα e reCGββββ e engenharia genética para geração da sequência fusionada eCGββββαααα

Oligonucleotídeos Sequências (5’- 3’)

1 – eCGb F 5’-ATGGAGACGCTCCAGGGGCT- 3’

2 – eCGb R 5’-AGAAGTCTTTATTGGGAGGGGATGAGAG- 3’

3 – eCGa F 5’-TTTCCTGATGGAGAGTTTACAACGCAG- 3’

4 – eCGa R 5’-TTAAATCTTGTGGTGATAGCACGTGCTG-3’.

5 – Mut eCGa R NotI 5’-GCGCGGCCGCTTAAATCTTGTTGTGGTG-3’

6 – Mut eCGb F EcoRI 5’-CGGAATTCGCCACCATGGAGACGCTC-3’

7 – union F

8 – union R

5´-CCCAATAAAGACTTCTTTTCCTGATGGAGAG-3’

5’- CTCTCCATCAGGAAAAGAAGTCTTTATTGGG-3’.

Negrito: sítios de restrição para as enzimas EcoRI (primer forward) e NotI (primer reverse); Sublinhado: sequência consenso de Kozak

3.3 Clonagem das sequências codificadoras de eCGα e eCGββββ

O cDNA total de tecido hipofisário equino foi utilizado para a amplificação das

sequências codificadoras de ambas as subunidades de eCG. Utilizamos a estratégia descrita por

Jablonka-Shariff e colaboradores (Jablonka-Shariff et al., 2007) de gerar uma cadeia única

codificadora para ambas as subunidades de eCG, que serão, desta maneira, expressas de forma

covalente. Como a sequência codificadora para eCGβ precede a sequência codificadora para

eCGα nesta construção, os primers (1) e (2) foram utilizados para amplificar a sequência

codificadora de eCGβ sem o códon de parada. Já a sequência codificadora de eCGα foi

amplificada sem o peptídeo sinal, visto que este já estava presente no início da cadeia beta,

utilizando-se os primers (3) e (4). Para a amplificação, as reações de polimerase em cadeia

(PCR) foram realizadas utilizando-se a enzima High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase

(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM), seguindo o seguinte protocolo: a 100 ng de

amostras de cDNA de hipófise equina foram adicionados 1X tampão High Fidelity PCR Buffer

(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 0,2 mM de dNTPs (Thermo Fisher Scientific

Inc., Waltham, EUA), 2mM de MgSO4 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 400 nM

de primer Forward (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 400nM de primer Reverse

(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 1,0 U da enzima DNA polimerase descrita

acima e água deionizada para completar 50,0 µL de volume de reação. As seguintes condições

foram utilizadas: 94 ºC por 1 min; 35 ciclos de: 94 ºC por 30 seg, 55 ºC (eCGα) ou 58 ºC (eCGβ)

por 30 seg e 68 ºC por 1 min; extensão final a 68 ºC por 2 min.

Os amplicons foram detectados através de geis de agarose a 2,0% corado com 0,5µg/mL

de brometo de etídeo. Foram aplicados 30uL de cada reação de PCR e 10µL do marcador de

tamanho molecular GeneRulerTM 100bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,

EUA). Após aplicação das amostras, os geis foram submetidos a uma diferença de potencial de

100 V em tampão de corrida 1x TAE em cuba eletroforética horizontal Midigel 2 (APELEX,

Massy, França), por 90min. Para verificar a presença de bandas nos geis, estes foram expostos à

luz ultravioleta em um aparelho fotodocumentador MiniBIS Pro (DNR Bio-Imaging Systems,

Jerusalém, Israel). Bandas de tamanho correto foram removidas dos geis com bisturis

descartáveis e o DNA nelas presente foi isolado utilizando-se o GFX DNA and Band

Purification Kit (GE Healtcare, Carlsbad, CA, EUA), seguindo-se as orientações do fabricante. A

concentração de DNA em cada amostra foi determinada por leitura em nanoespectrofotômetro a

260 ηm. A partir deste momento, os produtos foram trabalhados separadamente.

Os amplicons purificados foram então clonados no vetor pGEM®-T, utilizando-se os

reagentes fornecidos pelo Promega pGEM®-T Easy System (Promega Corporation, Madison,

EUA). Para cada 50ng deste vetor, adicionou-se 25ng de cada fragmento purificado ou 2µL do

Control DNA Insert, 1X Rapid Ligation Buffer, 3U de T4 DNA ligase e água deionizada para

completar 12,0 µL de reação. As reações foram incubadas a 4 ºC por 16 h.

Bactérias Escherichia coli, cepa XL-1 Blue (genótipo: recA1 endA1 gyrA96 thi-1

hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)], Agilent Technologies, Santa

Clara, EUA) foram escolhidas para o procedimento de transformação bacteriana. Para tal, 10,0

µL de cada amplicon previamente dialisado foi adicionado a 40,0 µL de suspensão bacteriana em

solução de glicerol 10% de baixa força iônica. O método de transformação escolhido foi

eletroporação por pulso elétrico curto de alto voltagem. A mistura foi, então, adicionada à cubeta

para eletroporação de bactérias com espaço de 0,1 cm (Gene Pulser® Cuvetter E. coli Pulser®

Cuvette, Bio-Rad Laboratories, Hercules, EUA) e submetida a 2,8 kV de diferença de potencial,

utilizando-se um eletroporador Gene Pulser XcellTM (Bio-Rad). Imediatamente após o

eletrochoque, as bactérias foram incubadas em meio de cultura S.O.C. (Thermo Fisher Scientific

Inc., Waltham, EUATM) a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, a suspensão de bactérias transformadas

foi plaqueada sobre solução gelatinosa de meio lisogênico LB (Luria-Bertani/Lysogeny Broth;

Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EUA) e ágar (Select Agar®, Thermo Fisher

Scientific Inc., Waltham, EUATM) previamente tratada com isopropil β-D-1-

tiogalactopiranosídeo (IPTG, 0,5 mM Thermo Fisher Scientific, Inc.) e 5-bromo-4-cloro-indolil-

β-D-galactopiranosídeo (X-gal, 80 µg/mL, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM),

permitindo visualizar colônias de bactérias contendo as construções pGEM®-eCGα, pGEM®-

eCGβ ou pGEM®-inserto controle (colônias brancas) ou somente o vetor pGEM®-T Easy

(colônias azuis). Depois de plaqueadas, as bactérias foram incubadas em estufa a 37ºC por 16 h.

As colônias de bactérias de coloração branca referentes às construções pGEM®-eCGβα foram

isoladas com o auxílio de um palito de madeira estéril, inoculadas em meio LB (Becton,

Dickinson and Company) e incubadas a 37 º por 16 h.

Para verificar as construções que de fato possuíam os insertos de tamanho predito, as

suspensões bacterianas referentes a cada colônia isolada foram submetidas à PCR de colônias

com primers que pareiam no vetor pGEM®-T Easy (sequências e temperaturas estimadas de

desnaturação na Tabela 3.2).

Tabela 3.2. Sequências dos primers que pareiam no vetor pGEM®-T Easy.

Oligonucleotídeo Sequência (5'-3') Tm (ºC)

pGEM®-F CCAGGGTTTTCCCAGTCAGGAC 65,14

pGEM®-R TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC 59,50

Para esta reação, foram aliquotados 800 nM de dNTPs (Thermo Fisher Scientific Inc.),

2,0 mM de MgCl2 (Themor Fisher Scientific Inc.), 1X de tampão de reação com NH4 (Thermo

Fisher Scientific Inc.), 170 nM do primer pGEM®-F (Thermo Fisher Scientific Inc.), 170 nM do

primer pGEM®-R Thermo Fisher Scientific Inc.), 3,75 U de enzima Taq DNA polimerase

(Thermo Fisher Scientific Inc.), 0,3 µL de suspensões bacterianas e volume de água deionizada

para completar 15,0 µL de volume de reação. As seguintes condições foram utilizadas na reação:

95 ºC por 4 min; 40 ciclos de 95 ºC por 45 seg, 55 ºC por 45 seg e 72 ºC por 30 seg; 72 ºC por 5

min. Os amplicons foram detectados através de geis de agarose a 1,5%, análogo ao que já foi

descrito anteriormente neste ítem. Pela análise do tamanho predito das bandas, foi possível

selecionar clones bacterianos contendo as sequências corretas, que foram então expandidos em

meio lisogênico LB e estocados a – 80 ºC em meio de congelamento composto de ½ volume de

solução de glicerol 30% em água (v/v) e ½ volume de meio lisogênico LB (Becton, Dickinson

and Company).

3.4 Engenharia Genética para a união destas duas cadeias de eCG em uma

sequência única (eCGββββαααα)

Os clones bacterianos positivos contendo os insertos eCGα ou eCGβ foram inoculados

em meio lisogênico LB (Becton, Dickinson and Company) a 37 º C por 16 h sob agitação orbital

a 300 rotações por minuto (rpm). Para isolamento de DNA plasmidial, utilizou-se o GeneJET

Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, EUA.), seguindo-se as

orientações do fabricante. A concentração das amostras foi determinada por quantificação em

nanoespectrofotômetro (ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies Inc.) e leitura a

260 ηm. Os produtos purificados foram utilizados como templates para a obtenção da sequência

eCGβα, através de três rounds de PCRs mutagênicas subsequentes.

O primeiro round de PCRs visou a adição de sítios de restrição ao final da sequência

eCGα (NotI), utilizando os primers (3) e (5), e ao início da sequência eCGβ (EcoRI), utilizando

os primers (2) e (6). Para a adição destes sítios, as PCRs foram realizadas utilizando-se a enzima

Long Range (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), através do seguinte protocolo: a

100 ng das preparações plasmideais, contendo as sequências eCGβ ou eCGα, foram adicionados

1X tampão High Fidelity PCR Buffer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 0,2 mM

de dNTPs (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 2mM de MgSO4 (Thermo Fisher

Scientific Inc., Waltham, EUA),400 nM de primer Forward (Thermo Fisher Scientific Inc.,

Waltham, EUA), 400nM de primer Reverse (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 1,0

U da enzima DNA polimerase descrita acima e água deionizada para completar 50,0 µL de

volume de reação. As seguintes condições foram utilizadas: 94 ºC por 1 min; 35 ciclos de: 94 ºC

por 30 seg, 55 ºC (eCGα) ou 58 ºC (eCGβ) por 30 seg e 68 ºC por 1 min; extensão final a 68 ºC

por 2 min. Os produtos obtidos foram fracionados em gel de agarose e então, em procedimento

similar ao descrito no parágrafo acima, purificados do gel de agarose para servirem de template

no próximo round de reações mutagênicas.

No segundo round de PCRs, foram adicionados, a ambos amplicons, fragmentos gênicos

complementares à sequência da contra-subunidade, de maneira que ambas subunidades

pudessem ser unidas através destes fragmentos. O fragmento complementar inicial da cadeia

eCGα foi adicionado ao final da cadeia eCGβ modificada em uma reação que utilizou os primers

(6) e (7), enquanto que o fragmento complementar final da cadeia eCGβ foi adicionado ao início

da cadeia eCGα e ao início da sequência eCGβ (EcoRI), utilizando-se os primers (5) e (8). Para

este segundo round de PCRs mutagênicos, os mesmos reagentes e concentrações do primeiro

round foram utilizadas, nas seguintes condições de ciclagem: 94 ºC por 1 min; 35 ciclos de 94

ºC por 30 seg, 62ºC por 30 seg e 68 ºC por 1 min; extensão final a 68 ºC por 2 min. Novamente,

os produtos destas reações foram purificados do gel de agarose e usados como template para o

ultimo round de mutações.

O terceiro round de PCRs mutagênicos teve, como objetivo, unir as duas cadeias

previamente mutadas em uma cadeia única, que será chamada daqui para frente de eCGβα. Para

este fim, os templates purificados do round anterior foram adicionados em uma reação de PCR

realizada com os primers (5) e (6) e os mesmos reagentes e concentrações descritos, sob as

seguintes condições: 94 ºC por 1 min; 35 ciclos de 94 ºC por 30 seg, 65 ºC por 30 seg e 68 ºC for

1 min; extensão final a 68 ºC por 2 min.

Os amplicons foram detectados através de geis de agarose a 2,0%. corado com 0,5µg/mL

de brometo de etídeo, e o produto de tamanho esperado foi isolado com bisturi e purificado

através do GFX DNA and Band Purification Kit (GE Healtcare, Carlsbad, CA, EUA), como

descrito anteriormente.

3.5 Sequenciamento da sequência fusionada eCGββββαααα e subclonagem no Vetor

pNUØ

O fragmento eCGβα purificado foi então clonado no vetor pGEM®-T Easy, clones

bacterianos foram obtidos com esta construção e examinados quanto à presença do inserto. Dez

clones positivos foram submetidos a sequenciamento de DNA pelo método de Sanger. Assim,

em uma microplaca para PCR de 96 poços (PCR® Microplate, Axygen Scientific Inc., Union

City, EUA), 3,0 µL de reação de PCR de colônias foram adicionados a 4,0 µL de tampão 5x de

sequenciamento (BigDye Terminator v3.1 Sequencing Buffer, Thermo Fisher Scientific Inc.,

Waltham, EUA), 0,5 µL do primer pGEM®-F ou pGEM®-R (10 µM, Thermo Fisher Scientific

Inc., Waltham, EUA), 2,0 µL de Big Dye Mix (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM)

e volume de água deionizada para completar 20,0 µL de volume de reação. As seguintes

condições foram utilizadas: 40 ciclos de 96 ºC por 10 seg (desnaturação), 53 ºC por 20 seg

(pareamento) e 60 ºC por 4 min (extensão). Para cada amostra, as reações foram feitas em

duplicata com cada primer independentemente. Depois da termociclagem, todas as amostras

foram submetidas à precipitação. A cada poço foram adicionados: 20,0 µL de água deionizada e,

em seguida, 60,0 µL de isopropanol (Merck KGAa). As amostras foram homogeneizadas por

vortexing e centrifugadas a 700 × g. A placa foi então protegida da luz, incubada a temperatura

ambiente por 15 min e centrifugada a 3.000 × g a 20 ºC por 30 min. O sobrenadante foi

descartado por inversão da placa e a placa foi centrifugada até 700 × g. 150 µL de solução 70%

isopropanol foram adicionados por poço, seguido de centrifugação a 3.000 × g a 20 ºC por 30

min e novamente inversão e centrifugação até 700 × g. A placa foi então incubada a 37 ºC por 10

min para que todo o isopropanol evaporasse. Uma vez precipitadas, as amostras foram

submetidas à eletroforese capilar em um aparelho Abi Prism 3700 DNA Analyzer (Thermo

Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM). Através dos cromatogramas originados, foram gerados

segmentos de DNA sobrepostos (contigs) pela ferramenta Phrap, seguido da análise de qualidade

pelo programa Phred.

Uma vez geradas, as sequências foram alinhadas contra sequências previamente

depositadas em bancos de dados através da ferramenta BLAST®

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; Basic Local Alignment Search Tool®, NCBI, U. S.

NLM). Primeiramente, se fez uso do programa nucleotide blast (ou blastn), para nucleotídeos, e

somente as sequências que apresentaram 100% de identidade e 0% de lacunas quando

comparadas com as sequências codificadoras depositadas para eCGα e eCGβ foram

consideradas. Os clones bacterianos contendo as sequências corretas foram expandidos em meio

lisogênico LB e estocados a – 80 ºC em meio de congelamento composto de ½ volume de

solução de glicerol 30% em água (v/v) e ½ volume de meio lisogênico LB (Becton, Dickinson

and Company).

Os clones bacterianos contendo a construção pGEM®-eCGβα dotados de sequências

corretas foram inoculados em meio lisogênico LB (Becton, Dickinson and Company) a 37 º C

por 16 h sob agitação orbital a 300 rpm. Para isolamento de DNA plasmideal, utilizou-se o

GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.), seguindo-se as orientações do

fabricante. A concentração das amostras foi determinada por quantificação em

nanoespectrofotômetro (ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies Inc.) e leitura a

260 ηm.

O produto final eCGβα foi purificado do gel de agarose, conforme descrito

anteriormente, e digerido com as enzimas de restrição EcoRI e NotI (Thermo Fisher Scientific

Inc.) a 37 ºC por 2 h, e inativação da enzima a 65 ºC por 20 min e então subclonado em um vetor

plasmideal especialmente construído por nosso grupo denominado pNUØ. Este vetor plasmideal

de expressão em células de mamífero é derivado do pUC18 (Messing e Vieira, 1982)e possui

um cassete de clonagem MCS contendo diversos sítios para enzimas de.restrição sob o controle

de um promotor híbrido contendo elemento enhancer de citomegalovírus e promotor de beta-

actina de galinha, bem como o cDNA codificador da enzima dihidrofolato redutase (dhfr) à

jusante de um sítio interno para entrada de ribossomos (IRES – internal ribosomal entry site).

Esta estrutura permite a expressão concomitante do inserto clonado no MCS, no caso o eCGβα,

e do dhfr, em uma estratégia que visa a complementação gênica de células CHO duplo negativo

para o gene dhfr , que, por sua vez, permite a seleção de células expressando altas quantidades

do produto de interesse após amplificação gênica, realizada através de tratamento com doses

crescentes do inibidor de dhfr, Metotrexato (MTX).

Para a subclonagem, o vetor foi previamente linearizado por ação das enzimas EcoRI e

NotI, gerando extremidades 5’ e 3’ coesivas e complementares ao inserto eCGβα. Utilizou-se a

razão molar inserto:vetor de 3:1 (MI = 3 x MV x TI/TV, onde MI = massa inserto, MV = massa

vetor, TI = tamanho inserto e TV = tamanho vetor). À mistura inserto-vetor, foram adicionados

tampão 10x T4 DNA Ligase Buffer (New England Biolabs® Inc., Ipswish, MA, EUA), 4,00 U

T4 DNA Ligase (New England Biolabs® Inc.) e água deionizada suficiente para completar 20

µL. A reação se deu a 16 ºC por 18 h. A partir daqui, esse vetor será denominado pNUØ-eCGβα.

A obtenção de clones bacterianos positivos de Escherichia coli, cepa XL-1 Blue, contendo este

vetor, foram mantidos em soluções glicerinadas a -80 °C, conforme descrito anteriormente.

Preparações plasmideais em média escala de um clone positivo foram obtidas , através do

QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN), seguindo-se as orientações do fabricante, sendo a

concentração das amostras determinada por quantificação em nanoespectrofotômetro (ND-1000

Spectrophotometer, NanoDrop Technologies Inc.) e leitura a 260 ηm.

3.6 Linhagens celulares

Células da linhagem 293T, de rim embrionário humano, foram adquiridas da American

Type Culture Colection (ATCCTM – Número ATCC®: CRL-3216TM) e cultivadas em meio

DMEM (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM) suplementado com 10 % (v/v) SFB

(Vitrocell Embriolife) em cultura aderente.

Células da linhagem CHO-DG44-dhfr-/-, de ovário de Hamster Chinês, foram adquiridas

da American Type Culture Colection (ATCCTM – Número ATCC®: PTA-3356TM) e cultivadas

em meio α-MEM (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM) suplementado com 7 %

(v/v) SFB (Vitrocell Embriolife) em cultura aderente.

Células da linhagem MLTC-1, de células de Leydig de camundongo superexpressando o

receptor para gonadotrofinas, foram adquiridas da American Type Culture Colection (ATCCTM –

Número ATCC®: CRL-2065TM) e cultivadas em meio RPMI (Thermo Fisher Scientific Inc.,

Waltham, EUATM) suplementado com 10% (v/v) SFB (Vitrocell Embriolife) em cultura

aderente.

As células foram sempre incubadas em atmosfera úmida a 37 ºC e 2% CO2 / 98% ar. O

estoque de células foi mantido através do congelamento em meio de cultura suplementado com

10% DMSO (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA) e armazenamento em nitrogênio líquido.

3.7 Meios de cultura, soluções e condições de cultivo de células transfectadas

3.8 Meio de cultura:

293T: DMEM (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM) suplementado com 10

% (v/v) SFB (Thermo Fisher Scientific Inc.).

CHO-DG44: α-MEM sem nucleosídeos (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,

EUATM) suplementado com 7 % (v/v) SFB (Thermo Fisher Scientific Inc.) dialisado.

MLTC-1: RPMI (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM) suplementado com 10

% (v/v) SFB (Thermo Fisher Scientific Inc.).

Antibióticos adicionados a todos os meios de cultura: 25 mg/mL ampicilina (Sigma-

Aldrich Co.) e 100 mg/mL estreptomicina (Sigma-Aldrich Co.)

3.9 Soluções:

Solução salina: PBSA (Phosphate Buffered Saline Absent – sem cálcio ou magnésio),

solução salina tamponada (pH 7,2), composta por NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM

e KH2PO4 1,5 mM.

Tripsina: solução 0,1% de tripsina (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM) em

PBSA contendo 1 mM EDTA (pH 8,0).

3.10 Condições de cultivo

As células foram mantidas em frascos T ou placas de cultivo tratadas, próprias para o

cultivo de células em aderência (Thermo Fisher Scientific Inc.; Becton, Dickinson and

Company; Corning Inc., Corning, EUA; ou TPP Techno Plastic Products, Trasadingen, Suíça),

incubadas em atmosfera úmida a 37 ºC e 2% CO2 / 98% ar. O meio de cultura foi trocado a cada

dois ou três dias. Ao atingirem confluência maior ou igual a 80%, as células foram

subcultivadas, sendo lavadas com solução salina PBSA, seguida de adição de solução de 0,1%

tripsina e inativação da mesma com meio de cultivo contendo SFB.

3.11 Produção de reCGββββαααα em Batelada :

As células superprodutoras de reCGβα foram cultivadas em monocamadas, conforme

descrito no item anterior, até que atingissem 95% de confluência, quando então foram lavadas

2X com solução de PBSA e tiveram seu meio de cultivo trocado para o mesmo meio (DMEM ou

α-MEM sem nucleosídeos), porém sem SFB. As garrafas ou placas carenciadas foram incubadas

nas mesmas condições já descritas durante 48h, quando então o meio de cultura, agora

denominado Meio Condicionado, contendo reCGβα, foi coletado, centrifugado a 1.200g por

5min para remover células soltas e debris, filtrados em membranas de 0,22µm (Millipore®),

transferido para frascos estéreis e mantido congelado a -20 °C por não mais do que 1 mês. Estes

meios condicionados foram utilizados em diversos experimentos ao longo do trabalho.

3.12 Cotransfecção de células 293T ou CHO-DG44 com a construção pNUØ-

eCGββββαααα e o vetor de seleção pX343 para geração de clones e populações

celulares superexpressando eCGββββαααα e resistentes à higromicina (higror)

Para a geração de clones celulares expressando estavelmente a proteína fusionada

eCGβα, células 293T e CHO-DG44 cultivadas em placas de 60 mm de diâmetro (P60), foram

independentemente cotransfectadas com a construção pNUØ-eCGβα e com o vetor de seleção

pX343, que confere resistência ao antibiótico higromicina B, usando uma razão de massa de

DNA de 40:1 (8ug do plasmídeo de interesse para 200ng do plasmídeo de resistência à

higromicina), como previamente descrito (Armelin et al., 1984). Os plasmídeos foram

primeiramente misturados com 16 µL do reagente de transfecção FuGENE HD Transfection

Reagent (Hoffmann-La Roche Ltd.) em meio de cultura na ausência de SFB para formação dos

complexos DNA-lipossomo. As células 293T ou CHO-DG44 foram incubadas com os

complexos e o meio de cultura foi trocado depois de 24 h.

3.13 Seleção de clones de células 293T superprodutoras de reCGββββαααα

48h após a transfecção, as células 293T foram diluídas nas proporções 1:10, 1:25, 1:50 e

1:100 e passaram a ser tratadas com 200 µg/mL higromicina B (Life TehnologiesTM) para

seleção de colônias celulares higror. O meio de cultura foi trocado a cada 48 h e a seleção foi

conduzida por duas semanas até que a maioria das células morressem e pequenas colônias

fossem visualizadas. Essas colônias foram isoladas com uma ponteira estéril para cada uma e

transferidas para poços de bandejas de 48 poços para estabelecimento dos clones celulares. O

tratamento com higromicina B foi mantido por duas semanas e os clones obtidos foram

congelados em nitrogênio líquido.

3.14 Amplificação gênica de populações de células CHO-DG44 superprodutoras

de reCGββββαααα

48h após a transfecção, as células CHO-DG44, diferentemente das células 293T, não

foram diluídas e passaram a ser tratadas com 200 µg/mL higromicina B (Life TehnologiesTM)

para seleção de células resistentes em meio à população transfectada, por duas semanas, até que

a seleção de uma sub-população resistente, quando, então, passaram a ser tratadas com

concentrações crescentes do quimioterápico MTX em meio de cultura sem nucleosídeos. O

tratamento foi iniciado com 30nM de MTX adicionado ao meio de cultivo. As células foram

cultivadas por aproximadamente duas semanas, com troca de meio a cada 48h para remoção de

células mortas, até que a cultura atingisse 90% de confluência, quando, então, aumentava-se a

concentração de MTX. O tratamento seguiu por aproximadamente seis meses, com aumento

gradual da concentração de MTX a cada vez que a cultura atingia 90% de confluência, sendo que

cada fase do tratamento durou de duas a três semanas.

3.15 Determinação da expressão de reCGααααββββ em meios condicionados pelos clones

de 293T e por populações celulares de CHO-DG44 superexpressoras de

reCGββββαααα através de ELISA

106 células de cada um dos clones de células 293T e das populações de CHO-DG44

superprodutores de reCGβα foram plaqueadas em 1mL de meio de cultura específico para cada

linhagem, na presença de FCS, em bandejas de seis poços (B6). O plaqueamento foi realizado

em duplicata, e as bandejas foram mantidas nas condições de cultivo descritas no item 35. 24h

após o plaqueamento, o meio de cultura foi descartado, as culturas aderentes foram lavadas com

PBSA e receberam meio de cultura fresco. O meio de cada clone/população foi coletado após

48h de condicionamento e utilizado para dosagem de reCGβα através de um ELISA específico

(PMSG ELISA – ALPCO Diagnostics), seguindo o manual provido pelo fabricante. Foram

realizadas algumas diluições de cada meio condicionado coletado (1:10, 1:25, 1:50 e 1:100), de

modo a obter valores de reCGβα dentro da curva de calibração do kit. Após o procedimento, os

valores de absorbância foram determinados a 460nm por leitura em um espectrofotômetro de

placa (SpectraMax M2 - Molecular Devices). Uma curva padrão, fornecida pelo kit, foi utlizada

como referência para uma análise logística de 4-parâmetros, realizada pelo software GraphPad

Prisma 5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego California USA,

www.graphpad.com). Os valores obtidos para cada clone/população foram considerados na

seleção de um candidato de cada um dos dois tipos celulares para a continuação dos

experimentos referentes a este projeto.

3.16 Cinética de expressão de reCGββββαααα em células 293T e CHO-DG44, na presença

e na ausência de soro fetal bovino

Os clones de células 293T e a população de CHO-DG44 com maior expressão de

reCGβα, selecionados no item anterior, foram submetidos a uma dinâmica de expressão de

reCGβα determinada por ELISA quantitativo. Para isso, 106 células destas células foram

plaqueadas em bandejas B6, da mesma maneira descrita no item anterior, porém adionou-se

meio de cultura contendo ou não SFB. Os meios condicionados foram coletados 24, 48 e 72h

após a troca, diluídos (1:10, 1:25 e 1:50) e submetidos ao ELISA para PMSG, exatamente da

mesma forma realizada no item anterior. O nível de expressão de reCGβα ao longo do tempo foi

determinado novamente por uma análise logística de 4-parâmetros, realizada pelo software

GraphPad Prism 5.00.

3.17 Ensaio de atividade biológica in vitro

Para determinar a atividade biológica in vitro do reCGβα produzido pelas células

superprodutoras, utilizou-se a linhagem celular MLTC-1 (Mouse Leydig Tumoral Cell – ATCC-

CRL2065), obtida da ATCC, que superexpressa receptores de gonadotrofinas (hCG e hFSH), e

um protocolo adaptado de Legardinier et al. 2005. Esta célula responde ao tratamento com eCG

produzindo e secretando progesterona de maneira dose-dependente. Resumidamente, 105 células

MLTC-1 foram plaqueadas em bandejas de 24 poços, utilizando-se 500µL de meio de cultura

RPMI (Gibco®) suplementado com 10% SFB.Ao alcançarem 80% de confluência, estas culturas

foram lavadas 2X com PBSA e carenciadas de SFB por 2h, para, então, serem tratadas por mais

2h com diversas diluições de meios de cultura condicionados contendo doses crescentes de

reCGβα e de eCG comercial (Folligon – Intervet®). Após os tratamentos, estes meios de cultura

condicionados pelas células MLTC-1 foram coletados e estocados a -20° C até serem

encaminhados para dosagem de progesterona. A atividade biológica in vitro foi determinada pela

quantidade de progesterona contida nas amostras, a que foi mensurada pela técnica de

cromatografia de alta performance, realizada pela empresa Nanocore Biotecnologia S/A. Dois

experimentos independentes foram realizados para cada amostra.

3.18 Ensaio de atividade biológica in vivo

A atividade fisiológica da proteína eCGβα obtida das células 293T e CHO-DG44- foi

determinada através do aumento de peso dos ovários e úteros de ratas pré-púberes tratadas com

preparações contendo doses cresccentes de reCGβα, através do ensaio recomendado pela

Farmacopeia Britânica, descrito por Cole & Erway (Cole and Erway, 1941). Todos os

experimentos envolvendo animais, bem como métodos adotados para criação e formas de

manutenção e experimentação, seguiram as normas do Comitê de Ética em Experimentação

Animal (CEUA) do Instituto de Química da USP Ratas Sprague-Dawley de 25 dias de idade,

obtidas no Biotério de Experimentação Animal do Instituto de Química-Faculdade de Ciências

Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, foram organizadas em grupos de 5 a 10 animais

por caixa, recebendo água e ração at libitum e mantidas em períodos de 12h de luz e 12h de

escuridão, a 22 °C constantes. Cem animais foram divididos entre grupos controle negativo (que

receberam PBSA ou meio de cultura condicionado por células não-produtoras de reCGβα),

grupo controle positivo (que receberam Folligon®) e grupos experimentais, estes últimos

contendo as condições FCS (meios de cultura condicionados por células superprodutoras de

reCGβα contendo 10% FCS) ou SFM (meios de cultura condicionados por células

superprodutoras de reCGβα na ausência de FCS). Cada grupo experimental, bem como o

controle positivo, compreende cinco pontos (2,5UIs; 5,0UIS; 10UIs; 20UIs e 40UIs). O N

experimental praticado foi de cinco animais por grupo.

Cada animal recebeu uma única dose de 200uL, via injeção subcutânea, de uma

preparação filtrada, através de filtros com poros de 0,22µm, contendo algum dos tratamentos

descritos acima. Três dias após a injeção, os animais foram eutanasiados, utilizando-se câmara

de CO2, e os ovários e úteros de cada animal foram removidos, dissecados e pesados. O aumento

no peso destes órgãos, comparativamente aos controles negativos, corresponde à resposta

biológica do animal ao estímulo com eCG. A resposta final para cada dose foi obtida através da

média aritmética do peso dos órgãos (ovários ou úteros) dos cinco animais de cada ponto. A

comparação da resposta entre as doses do controle positivo (Folligon®) e do reCGβα nos

permitiu traçar um paralelo entre as potências do primeiro e do último.

3.19 Purificação de reCGββββαααα por HPLC

Devido à sua natureza altamente glicosilada e ao seu PI baixo, duas estratégias foram

utilizadas para a purificação do reCGβα contido nos meios de cultura condicionados de células

superprodutoras, a saber: a) utilizando-se uma coluna cromatográfica na qual a fase estacionária

possui a leptina de feijão Concanavalina A aderida (HiTrapTM ConA 4B, GE Healthcare) de 1

mL; b) uma coluna de troca iônica contendo o forte trocador aniônico amônia quartenária

(HiTrapTM Capto Q, GE Healthcare) de 1 mL.

O sistema Äkta Purifier UPC-100 (GE Healthcare), de cromatografia líquida de alta

performance (HPLC, High Performance Liquid Chromatography), associado a cada uma das

colunas de cada vez, foi utilizado na otimização da purificação de reCGβα, em procedimentos

independentes. O fluxo constante de 2 mL/min foi utilizado durante todo o processo, para ambas

as colunas.

Para as purificações realizadas com a coluna HiTrapTM ConA 4B, equilibrou-se a coluna

com 3VC do tampão A (500 mM NaCl, 20 mM tris-HCl, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2, pH 7,4). Em

seguida, 50 mL de meio condicionado contendo reCGβα obtido através do processo de

fermentação, ou meio de cultura condicionado controle negativo, foram independentemente

diluídos 2X em tampão de diluição (890mM NaCl, 40mM Tris-HCl, 2mM MgCl2, 0,2mM

CaCl2, pH 7,4), filtrados através de filtros com poros de 0,45µm e aplicados à coluna, seguido de

lavagem da coluna (2 VC) com o tampão A. Para a eluição, um gradiente linear de concentração

de metil-α-D-glucopiranosídeo (Sigma-Aldrich®) foi aplicado, iniciando-se em 20 mM e

finalizando-se em 300 mM (diluído em tampão A), em um intervalo de 8 VC. As frações de

permeado e lavado foram coletadas, bem como as frações dos eluatos, e mantidas a 4 ºC para

futuras análises.

Para as purificações realizadas com a coluna HiTrapTM Mono Q, equilibrou-se a coluna

com 3VC do tampão A (10 mM NaCl, 100 mM Acetato de Sódio, pH 4,5). Em seguida, 20 mL

de meio condicionado contendo reCGβα ou meio condicionado controle negativo foram

independentemente diluídos 10X em tampão A, filtrados em em filtros de 0,45µm e aplicados à

coluna, seguido de lavagem da coluna (2 VC) com o tampão A. Para a eluição, gradientes

isocráticos de tampão B (1M NaCl, 100mM Acetato de Sódio, pH 4,5) foram aplicados: 0-11mM

NaCl; 11-19mM NaCl; 19-40mM NaCl e finalizado em 1M NaCl, em um intervalo de 12 VC.

As frações de permeado e lavado foram coletadas, bem como as frações dos eluatos, tiveram o

pH ajustado para 7,4 com uso de solução NaOH 100mM e foram mantidas a 4 ºC para futuras

análises.

Para os dois tipos de cromatografia realizadas, as frações, permeado, lavagens e eluatos

foram diluídos e submetidos à detecção de reCGβα por ELISA (PMSG ELISA Kit, ALPCO),

seguindo-se o protocolo do fabricante. As frações ativas foram concentradas, utilizando-se filtros

com corte de 10kDa (CentriconTM – Millipore®) e utilizadas para análises em geis de

poliacrilamida, utilizando-se o corante Coomassie Brilliant Blue e também análises de Western

blot.

3.20 Western Blot

As células superprodutoras de reCGβα foram mantidas em cultura aderente e submetidas

ao processo de fermentação descrito no item 3.10. Os meios condicionados obtidos foram ou

purificados como descrito no item anterior ou concentrados 10X utilizando-se filtros Centricon

com corte de 10kDa (Millipore®). Às amostras foi adicionado tampão de amostras redutor para

proteínas de Laemmli (Laemmli, 1970) (50mM Tris-Cl pH 6,8; 2,0 % SDS; 10 % glicerol; 0,1 %

azul de bromofenol; 700 mM β-mercaptoetanol), estas foram então fervidas por 7 min a 95 ºC e

transferidas imediatamente para o gelo. Estas amostras foram então aplicadas em minigeis de

poliacrilamida (SDS-PAGE) a 12% submergidos em tampão de corrida (0,3% de Tris; 1,44% de

glicina; 0,1% de SDS (Sigma-Aldrich Co.) e fracionados por eletroforese a corrente elétrica de

100 V, 100 W e 350 mA por aproximadamente 4h, utilizando o sistema MiniProtean III

electrophoresis system (BioRad®). O marcador de massa molecular BenchMarkTM Pre-Stained

Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA) foi usado como referência na

determinação do tamanho das bandas encontradas. As proteínas foram então transferidas para

membranas de nitrocelulose Hybond ECL Nitrocellulose (HybondTM-C Extra, GE Healthcare®)

usando o Mini-Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (BioRad®) por eletroblotting, aplicando-

se uma corrente elétrica 100 V, 100 W e 350 mA por 1,5h em cubas contendo tampão de

transferência (0,3% de Tris; 1,44% de glicina; 0,1% de SDS e 20% metanol). Todas as

incubações e lavagens a seguir foram feitas sob agitação. As membranas foram bloqueadas com

solução 7,5% leite desnatado em TBS 0,1% Tween® 20 (Sigma-Aldrich Co.) por 16h a

temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram lavadas 5X por 5min com solução TBS

0,1% e a seguir incubadas por 4h a temperatura ambiente com anticorpo primário policlonal de

coelho anti-eCG (gentilmente cedido pelo Professor Yves Combarnous, do Departamento de

Fisiologia da Reprodução e do Comportamento, INRA UMR, Nousille, França), diluído

1:20.000 na mesma solução de bloqueio. Em seguida, foram novamente lavadas 5X por 5 min

com solução TBS 0,1% e, a seguir, incubadas por 4h a temperatura ambiente com o anticorpo

secundário anti-IgG de coelho 1:1.000 (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, EUA) também

diluído na mesma solução de bloqueio. As membranas foram novamente lavadas 5X por 5 min

com solução TBS 0,1%, seguido de uma lavagem de 5 min somente com TBS. Em seguida,

aplicou-se o reagente Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (EMD Millipore

Corporation, Billerica, EUA). Para que fossem reveladas por quimiluminescência, as membranas

foram expostas a filmes Amersham Hyperfilm ECL Films (GE Healthcare) usados para

autoradiografia por intervalos de tempo que variaram de 1 a 10 minutos. Para todos os

experimentos de Western blot, Folligon® foi utilizado como controle positivo, ao passo que o

meio condicionado por células 293T ou CHO-DG44 que não expressam eCGβα foi utilizado

como controle negativo.

3.21 Análise de glicosilação de reCGββββαααα e comparação com os padrões comerciais

purificados de eCG Folligon e NISRC-WHO

Para traçar um paralelo entre a atividade biológica observada pela reCGβα produzida

tanto pelas células 293T quanto pelas células CHO-DG44 e as modificações pós-traducionais

adicionadas por cada tipo celular à esta proteína, procedeu-se à análise comparativa do perfil de

glicosilação de preparações parcialmente purificadas de reCGβα e de eCG purificado comercial

Folligon® (intervet®) e padrão internacional de eCG (NIBSC/WHO).

As frações enriquecidas para reCGβα obtidas no item 3.18 foram concentradas em torno

de 100X utilizando-se o dispositivo Centricon com corte de 10kDa (Millipore®) e aplicadas em

geis de SDS-PAGE, conforme descrito no item 3.19. Amostras de 20UIs de Folligon e 20UIs do

padrão internacional de eCG também foram aplicados em geis de SDS-PAGE de modo a realizar

a comparação proposta. Os geis contendo as amostras a serem analisadas foram todos realizados

em paralelo (dois geis idênticos por conjunto de amostras), sendo que um gel de cada par foi

destinado à Western blot (item 3.19) e o outro gel de cada par foi destinado à coloração por

Comassie Blue (1,25g de Coomassie R-250 Brilliant Blue diluído em 250mL de metanol, 50mL

de ácido acético glacial e 200mL de água destilada) por 16h. Estes geis foram lavados e

descorados, sob agitação, por 3X de 2h com solução de contendo 7,5% ácido acético e 15%

metanol em água destilada. Após a descoloração, as bandas presentes na faixa de tamanho do

eCG que apresentaram correspondência no Western blot, realizado paralelamente, foram

excisadas do gel, cortadas individualmente com um bisturi, secadas por 8h em centrífuga à vácuo

a 30 °C (SpeedVac) e enviadas ao laboratório do Professor Michael Butler, da University of

Manitoba, onde foram processadas através de um protocolo adaptado de Royle et al, 2006.

Resumidamente, este protocolo consiste na liberação dos glicanos do SDS-PAGE com

uma digestão in gel realizada com PNGaseF e marcação destes com 2-aminobenzeno (Glyko

Signal 2-AB labeling kit, Prozyme®). Estas amostras de glicanos marcados foram então

aplicadas em uma coluna de amida (Waters X-Bridge 3.5um amide column of 4.6 X 250mm),

acoplada à uma bomba (Waters Binary pump 1525u) e submetidas à cromatografia de fase

normal utilizando-se o sistema Waters 2475, sendo detectadas através de um detector de

fluorescência (Waters multi wavelength fluorescent detector, excitação a 330nm e emissão a

420nm). Todas as amostras marcadas a serem analizadas, bem como o padrão de unidades de

glicose (2-AB glucose ladder - Prozyme®) e o branco (Água Ultrafiltrada, Milli-Q – Millipore®)

foram diluídos 5X em Acetonitrila antes da aplicação na coluna de amida. O programa utilizado

encontra-se sumarizado na tabela abaixo:

Tempo (minutos) Fluxo (mL/min) Tampão A Tampão B

0 0,86 20 80

48 0,86 50 50

49 0,86 100 0

53 0,86 100 0

55 0,86 20 80

63 0,86 20 80

64 0 20 80

Tabela 3.3 – Programa de NP-HPLC utilizado para analisar glicanos de eCGββββαααα recombinante e eCG

comercial. Tampão A: Formato de Amônio 50mM, pH 4.4. Tampão B: Acetonitrila. Volume da coluna: 1mL.

O cálculo de unidades de glicose (GU) correspondentes a cada pico obtido foi realizado

comparando-se o tempo de retenção destes contra a curva do padrão de glicose (nove pontos),

em uma distribuição de quinta ordem polinomial. Desta forma, foi possível determinar GUs para

cada tempo de retenção obtido correspondente a cada pico de cada amostra.

Alíquotas do pool de glicanos obtidos para cada amostra foram secos por centrifugação à

vácuo e ressuspendidos em 2µL do tampão 5X de glicosidases (Prozyme®), adicionados de 1µL

de um array de glicosidases e água q.s.p. 10µL. A seguinte combinação de glicosidases, em uma

incubação a 37 °C por 16h, foi utilizada para digerir as amostras de glicanos até suas estruturas

basais:

1) Sialidase (Glyko Sialidase A TM – A. Urefaciens – Prozyme);

2) Sialidase + Fucosidase (Glyko β-FucosidaseTM – Bovine Testis – Prozyme);

3) Sialidase + Fucosidase + Galactosidase (Glyko β-GalactosidaseTM – Bovine Testis –

Prozyme) e

4) Sialidase + Fucosidase + Galactosidase + Hexosaminidase (Glyko HexosaminidaseTM

– Jack Bean – Prozyme).

Após a digestão, estas amostras foram purificadas em cartucho de purificação de glicanos

(Glyko clean S - Prozyme) e submetidas novamente à HPLC, nas mesmas condições descritas

acima.

Comparações entre estruturas putativas de glicanos presentes em eCG descritas na

literatura, estruturas pré-caracterizadas disponíveis em um banco on line (Glycobase 3.2) e as

GUs obtidas por HPLC permitiram uma análise quantitativa e qualitativa dos glicanos liberados

pelas sucessivas digestões realizadas.

4. RESULTADOS

4.1 Construção de gene de fusão eCGββββαTrês estapas de PCR mutagênicos foram

necessárias para alcançar a contrução final eCGβα. A primeira etapa de reações de PCR

mutagênicas, representadas na figura 4.1A, consistiu na clonagem da sequência de eCGβ sem o

stop codon e na clonagem da sequência de eCGα sem a sequência do peptídeo sinal, gerando

produtos de 510pb e 288pb, respectivamente. Na segunda etapa, representada na figura 4.1B,

adicionou-se o sítio para a enzima NotI na extremidade 3’ da sequência codificadora de eCGα,

gerando um produto de 298pb (figura 4.1B, banda a), enquanto que em uma reação, realizada em

paralelo, adicionou-se o sítio da enzima de restrição EcoRI e o fragmento de Kozac na

extremidade 5’ da sequência codificadora de eCGβ em uma reação de PCR, gerando um produto

de 524pb (figura 4.1B, banda b). O terceiro e último passo, representado na figura 4.1B e C,

consistiu na adição de um fragmento da contrasubunidade a cada sequência codificadora mutada,

de modo que estas pudessem ser unidas por complementariedade destes fragmentos, em um PCR

final. A adição do fragmento 3’ da cadeia β à extremidade 5’ da cadeia α gerou um fragmento de

317pb (figura 4.1B, banda c), enquanto que a adição do fragmento 5’da cadeia α à extremidade

3’da cadeia β gerou um fragmento de 536pb (figura 4.1B, banda d). O produto final,

correspondente ao gene fusionado eCGβα, de tamanho 822pb, foi sequenciado e sub-clonado no

vetor pNUØ de expressão em células de mamífero, como mostra a figura 4.1D.

Figura 4.1: Construção do cDNA fusionado eCGβα. (A) Amplificação da sequência codificadora de

eCGα sem o peptídeo sinal (α: 288 pb) e da sequência codificadora de eCGβ sem o stop codon (β: 510 pb).

(B) Construções intermediárias obtidas. (a) e (b): produtos do primeiro round de PCRs mutagênicos. (c) e

(d): produtos do segundo round de PCRs mutagênicos. (C) Diagrama esquemático representando os passos

de Engenharia Genética realizados para a obtenção do inserto final eCGβα. (1): representação da figura

(1A); (2): representação da figura (1B, a e b); (3): representação da figura (1B, c e d); (4): representação do

produto final eCGβα. (D) Digestão do plasmídeo pNUØ-eCGβα com as enzimas de restrição EcoRI e NotI,

onde é possível visualizar o vetor pNUØ (7.6 Kbp) e o inserto (822 pb), presente em clones bacterianos

distintos. SP: Peptídeo sinal. TAA: stop codon. EcoRI e NotI: sítio para as enzimas de restição EcoRI

eNotI.

Um esquema representando os quatro passos de PCRs mutagênicos para obter o produto

final eCGβα encontra-se na figura 4.1C, onde os itens 1, 2, 3 e 4 referem-se aos passos 1, 2, 3 e

final de PCRs mutagênicos, descritos no item 3.4, da metodologia. Estes passos de PCR

mutagênicos podem ser analisados nas imagens A, B e D da figura 4, onde os fracionamentos de

- 800

D

eCGβα

pNUØ

pb

C

α β

eCG

500 - 400 -

300 - 250 -

bp

A

500 - 400 - 300 -

pb

B

a b c d

eCGβ SP eCGα TAAA

eCGβ SP EcoRI NotI eCGα TAA

eCGβ SP EcoRI

NotI eCGα TAAA eCGα eCGβ

eCGβ SP EcoRI NotI

eCGα TAA

1 -

2 -

3 -

4 -

geis de agarose permitem confirmar o tamanho de cada amplicon gerado nos passos

intermediários e no passo final, como foi detalhado no parágrafo acima.

Os cromatogramas gerados foram compilados e transformados em contigs utilizando-se a

ferramenta Phrap, tendo, em seguida, a qualidade analisada com o programa Phred. A sequência

codificadora completa referente ao gene de fusão eCGβα encontra-se abaixo, detalhando-se na

legenda os fragmentos pertencentes a cada cDNA, bem como os sítios para enzimas de restrição

e a sequência consenso de Kozac:

>Contig eCGβα CGGAATTCGCCACCATGGAGACGCTCCAGGGGCTGCTGCTGTGGATGCTGCTGAGTGTTGGCGGGGTCTGGGCATCCAGGGGGCCA

CTGCGGCCACTGTGCCGGCCCATCAACGCCACTCTGGCTGCTGAGAAGGAGGCCTGCCCCATCTGCATCACCTTCACCACCAGCAT

CTGTGCCGGCTACTGCCCCAGCATGGTGCGGGTGATGCCAGCTGCCCTGCCGGCCATTCCCCAGCCAGTGTGCACCTACCGTGAGC

TGCGCTTTGCTTCCATCCGGCTCCCCGGCTGCCCGCCTGGTGTGGACCCCATGGTCTCCTTCCCCGTGGCCCTCAGTTGTCACTGC

GGGCCCTGCCAGATCAAGACCACTGACTGCGGGGTTTTCAGAGACCAGCCCTTGGCCTGTGCCCCCCAGGCCTCCTCTTCCTCTAA

GGATCCCCCATCCCAACCTCTCACATCCACATCCACCCCAACTCCTGGGGCCAGCAGACGTTCCTCTCATCCCCTCCCAATAAAGA

CTTCTTTTCCTGATGGAGAGTTTACAACGCAGGATTGCCCAGAATGCAAGCTAAGGGAAAACAAGTACTTCTTCAAACTGGGCGTC

CCGATTTACCAGTGTAAGGGCTGCTGCTTCTCCAGAGCGTACCCCACTCCAGCAAGGTCCAGGAAGACAATGTTGGTCCCAAAGAA

CATCACCTCAGAATCCACATGCTGTGTGGCCAAAGCATTTATCAGGGTCACAGTGATGGGAAACATCAAGTTGGAGAACCACACCC

AGTGCTATTGCAGCACTTGCTATCACCACAAGATTTAAGCGGCCGCGC

Figura 4.2: Sequência contig (formato FASTA) obtida após submeter os cromatogramas do

sequenciamento de um dos clones bacterianos contendo a construção pNUØeCGβα ao sequenciamento

automatizado, utilizando-se o método de Sanger. Em verde: sítio para a enzima de restrição EcoRI; em fúccia

fragmento de kozac; em azul: cadeia β sem o stop codon; em amarelo: cadeia α sem o peptídeo sinal; em roxo:sítio

para a enzima de restrição NotI. Total da construção: 822pb.

O alinhamento desta sequência contra as sequências das subunidades independentes de

eCG obtidas na base de dados do NCBI através da ferramenta BLAST® segue abaixo, em

formato FASTA, com todas as informações obtidas deste pareamento resumidas no cabeçalho,

podendo-se verificar a ocorrência de 100% de identidade entre a sequência eCGβα clonada e as

sequências codificadoras de eCGα e eCGβ:

NM_001099763.1| Equus caballus gonadotropin alpha 1subunit (CG), mRNA Length: 387 Score: 532 bits (288), Expect: 5e-148 Identities: 288/288 (100%), Gaps: 0/288 (0%)

Query 1 CCTGATGGAGAGTTTACAACGCAGGATTGCCCAGAATGCAAGCTAAGGGAAAACAAGTAC 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 85 CCTGATGGAGAGTTTACAACGCAGGATTGCCCAGAATGCAAGCTAAGGGAAAACAAGTAC 144

Query 61 TTCTTCAAACTGGGCGTCCCGATTTACCAGTGTAAGGGCTGCTGCTTCTCCAGAGCGTAC 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 145 TTCTTCAAACTGGGCGTCCCGATTTACCAGTGTAAGGGCTGCTGCTTCTCCAGAGCGTAC 204

Query 121 CCCACTCCAGCAAGGTCCAGGAAGACAATGTTGGTCCCAAAGAACATCACCTCAGAATCC 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 205 CCCACTCCAGCAAGGTCCAGGAAGACAATGTTGGTCCCAAAGAACATCACCTCAGAATCC 264

Query 181 ACATGCTGTGTGGCCAAAGCATTTATCAGGGTCACAGTGATGGGAAACATCAAGTTGGAG 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 265 ACATGCTGTGTGGCCAAAGCATTTATCAGGGTCACAGTGATGGGAAACATCAAGTTGGAG 324

Query 241 AACCACACCCAGTGCTATTGCAGCACTTGCTATCACCACAAGATTTAA 288

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 325 AACCACACCCAGTGCTATTGCAGCACTTGCTATCACCACAAGATTTAA 372

XM_001490342.2| PREDICTED: Equus caballus luteinizing hormone beta polypeptide (LHB),

mRNA. Length=520

Score = 939 bits (508), Expect = 0.0

Identities = 508/508 (100%), Gaps = 0/508 (0%)

Query 15 ATGGAGACGCTCCAGGGGCTGCTGCTGTGGATGCTGCTGAGTGTTGGCGGGGTCTGGGCA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1 ATGGAGACGCTCCAGGGGCTGCTGCTGTGGATGCTGCTGAGTGTTGGCGGGGTCTGGGCA

Query 75 TCCAGGGGGCCACTGCGGCCACTGTGCCGGCCCATCAACGCCACTCTGGCTGCTGAGAAG

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 61 TCCAGGGGGCCACTGCGGCCACTGTGCCGGCCCATCAACGCCACTCTGGCTGCTGAGAAG

Query 135 GAGGCCTGCCCCATCTGCATCACCTTCACCACCAGCATCTGTGCCGGCTACTGCCCCAGC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 121 GAGGCCTGCCCCATCTGCATCACCTTCACCACCAGCATCTGTGCCGGCTACTGCCCCAGC

Query 195 ATGGTGCGGGTGATGCCAGCTGCCCTGCCGGCCATTCCCCAGCCAGTGTGCACCTACCGT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 181 ATGGTGCGGGTGATGCCAGCTGCCCTGCCGGCCATTCCCCAGCCAGTGTGCACCTACCGT

Query 255 GAGCTGCGCTTTGCTTCCATCCGGCTCCCCGGCTGCCCGCCTGGTGTGGACCCCATGGTC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 241 GAGCTGCGCTTTGCTTCCATCCGGCTCCCCGGCTGCCCGCCTGGTGTGGACCCCATGGTC

Query 315 TCCTTCCCCGTGGCCCTCAGTTGTCACTGCGGGCCCTGCCAGATCAAGACCACTGACTGC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 301 TCCTTCCCCGTGGCCCTCAGTTGTCACTGCGGGCCCTGCCAGATCAAGACCACTGACTGC

Query 375 GGGGTTTTCAGAGACCAGCCCTTGGCCTGTGCCCCCCAGGCCTCCTCTTCCTCTAAGGAT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 361 GGGGTTTTCAGAGACCAGCCCTTGGCCTGTGCCCCCCAGGCCTCCTCTTCCTCTAAGGAT

Query 435 CCCCCATCCCAACCTCTCACATCCACATCCACCCCAACTCCTGGGGCCAGCAGACGTTCC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 421 CCCCCATCCCAACCTCTCACATCCACATCCACCCCAACTCCTGGGGCCAGCAGACGTTCC

Query 495 TCTCATCCCCTCCCAATAAAGACTTCTT 522

||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 481 TCTCATCCCCTCCCAATAAAGACTTCTT 508

4.2 Cotransfecção de células 293T e CHO-DG44 com a construção pNUØeCGββββαααα

juntamente com o vetor de seleção pX343 e seleção de células resistentes à

higromicina Uma vez que um clone bacteriano contendo a construção

pNUØeCGβα correta foi identificado, pôde-se realizar preparações plasmideais desta construção

para a transfecção de células 293T e CHO-DG44, visando à produção da proteína eCGβα.

Optou-se pela estratégia de cotransfecção para seleção de clones e populações celulares

expressando maior quantidade de eCGβα, como descrito no item 3.11, onde uma parte (8µg) da

construção pNUØeCGβα foi cotransfectada com massa 40 vezes menor do vetor plasmidial

pX343 (200ng), que confere resistência ao antibiótico higromicina B. Dessa forma, as células

selecionadas por serem resistentes à higromicina, devido à presença de pelo menos uma cópia do

vetor pX343, teriam probabilidade de conter uma quantidade muito maior da construção de

interesse e, consequentemente, uma alta expressão da proteína eCGβα.

Após a transfecção, procedeu-se com a diluição da população celular 293T e o tratamento

com 200µg/mL de higromicina B, por duas semanas, quando houve uma diminuição acentuada

do número de células viáveis, até que somente umas poucas número células permaneceram

vivas. Estas células vivas proliferaram e formaram pequenas colônias isoladas, o que possibilitou

o isolamento, nas diluições celulares 1:50 e 1:100, de 12 clones celulares de células 293T, que

foram expandidos individualmente em garrafas T25 e congelados a -80 °C de modo a formar

uma banco de células-mãe.

A população de células CHO-DG44 resistentes à higromicina não foi diluída, tendo sido

tratada primeiramente com este antibiótico para, num segundo momento, iniciar-se o processo de

amplificação gênica desta subpopulação através do tratamento com doses crescentes do

quimioterápico metotrexato (MTX) adicionado ao meio de cultura ausente de nucleosídeos,

como descrito no item 3.13. O tratamento desta população celular transfectante seguiu por

aproximadamente seis meses, com a morte de muitas células em cada etapa do tratamento,

células estas que devem ter menor resistência ao quimioterápico provavelmente devido a uma

menor quantidade de moléculas da enzima dihidrofolato redutase (DHFR), cuja sequência

codificadora encontra-se no plasmídeo pNUØeCGβα. Assim, a cada etapa de seleção, exercia-se

uma pressão seletiva nas células de modo a aumentar o número de cópias do plasmídeo de

interesse, permitindo, assim, a sobrevivência e proliferação da cultura celular. Cada vez que a

cultura atingia 90% de confluência, aumentava-se a concentração de MTX adicionado ao meio

de cultivo. Cada fase do tratamento durou de duas a três semanas, sendo que, após

aproximadamente seis meses, uma população resistente a 2,5µM de MTX foi obtida, expandida e

congelada em Nitrogênio líquido. A partir deste momento, foram realizadas fermentações desta

população para expansão das mesmas e realização de ensaios de atividade biológica.

4.3 ELISA para detectar a expressão de eCGββββαααα em meios condicionados pelos

clones de 293T e populações celulares de CHO-DG44 superexpressando estas

duas subunidades de reCGOs níveis de reCGrβα expressos por cada clone

celular de 293T e pela população celular de CHO-DG44 obtidos, foram determinados através de

um ELISA específico (PMSG ELISA – ALPCO Diagnostics), como descrito no item 3.14. Esta

proteína recombinante possui peptídeo sinal, portanto, é esperado que seja secretada para o meio

de cultura das células que a produzem.

Desta forma, 106 células de cada um dos clones de 293T, na passagem sete após seu

isolamento, foram plaqueadas, e os meios de cultura condicionados durante 48h foram coletados

e utilizados para dosagem de -reCGβα. Para isso, diluições seriadas foram realizadas (1:5; 1:10;

1:25; 1:50 e 1:100) e as amostras foram dosadas utilizando-se o kit PMSG ELISA (ALPCO

Diagnostics). Para estes clones, os valores de reCGβα expressos no meio de cultura variaram

entre 3,5 e 12UIs/mL (dado não mostrado). A partir deste resultado, selecionamos três dos clones

que apresentavam maior expressão de reCGβα para realizar uma cinética de expressão desta

proteína ao longo do tempo.

As populações de células CHO-DG44 foram ensaiadas ao longo do processo de

amplificação gênica por MTX (descrito no item 3.13), sendo plaqueadas as populações

resistentes à 100ng, 250ng, 1µM e 2.5µM, nas condições mencionadas no item 3.14, e os meios

de cultura condicionados por estas populações celulares foram diluídos e submetidos à dosagem

pelo PMSG ELISA (ALPCO Diagnostics). O aumento da expressão de reCGβα no meio de

cultura ao longo do tratamento com doses crescentes de MTX pode ser observado na figura 4.2,

abaixo:

CHO pop 1

00nM

CHO pop 2

50nM

CHO pop 5

00nM

CHO pop 1

uM

CHO pop 2

.5uM

0

10

20

30

40

50

***

***

Populações CHODG44 expressando r-eCGba tratadas com MTX

r-eC

Gb

a (U

Is/m

L)

Figura 4.2: Expressão de reCGreCGreCGββββαααα por populações de células CHO-DG44 transfectadas com o plasmídeo pNUØ-eCGββββαααα ao longo do processo de amplificação gênica deste plasmídeo pelo tratamento com doses crescentes do quimioterápico MTX. Abscissa: Populações de células CHO-DG44 superexpressando

reCGβα as quais são resistentes a doses crescentes de MTX; Ordenada: concentração de reCGβα (UIs/mL) presente no meio de cultura condicionado durante 48h por cada população celular. Pode-se verificar um aumento

significativo no nível de expressão de reCGβα a partir de 1µM de MTX. (P<0.001). Número de replicatas experimentais: 4.

Neste gráfico, é possível verificar que a expressão de reCGβα mantem-se em níveis

similares àqueles observados para alguns clones celulares de 293T até o tratamento com 500nM

de MTX, aumentando dramaticamente para 23,1UIs e 41,3UIs de reCGβα sendo expressos nas

populações de células CHO-DG44 transfectantes submetidas ao crescimento na presença de 1µM

e 2.5µM de MTX, respectivamente. Os dados foram analizados por One-Way ANOVA

(GraphPad Prism), seguido de teste pós-Hoc Tukey, verificando-se significância estatística no

aumento da expressão de reCG pelas populações 1µM e 2,5µM MTX, em relação à população

100nM (r2= 0,9875). A partir deste momento, estas duas últimas populações foram selecionadas

para realizar uma dinâmica comparativa da expressão de reCGβα ao longo do tempo (48 e 72h).

Para isso, plaqueamentos foram realizados da mesma maneira descrita acima, e os meios de

cultura condicionados foram coletados após 48 e 72h e ensaiados quanto à concentração de

reCGβα pelo kit PMSG-ELISa (ALPCO Diagnostics). A dinâmica de expressão de reCGβα

pode ser verificada na figura 4.3:

CHO 1uM 48

h

CHO 1uM 72

h

CHO 2.5u

M 48h

CHO 2.5u

M 72h

0

20

40

60

Curva de expressão de r-eCG produzido por populações de células CHO na presença de MTX

r-eC

Gb

a (U

Is/m

L)

Figura 4.3: Dinâmica de expressão de reCGββββαααα pelas populações de células resistentes às doses de 1µµµµM e 2,5µµµµM do quimioterápico MTX. Abscissa: Populações de células CHO-DG44 resistentes à 1µM e 2.5µM de MTX, em dois momentos distintos de condicionamento do meio de cultura: 48 e 72h; Ordenada: concentração de

reCGβα (UIs/mL) presente no meio de cultura condicionado durante 48h por cada população. Não é possível

verificar diferenças estatisticamente significantivas no nível de expressão de reCGβα entre as duas populações. Número de replicatas experimentais: 2.

Neste gráfico, pode-se verificar que a expressão de reCGβα mostrou-se similar entre as

populações de células CHO-DG44 transfectantes resistentes à 1µM e 2.5µM de MTX, não sendo

possível observar aumento na expressão entre 48h e 72h, para ambas as células. Os dados foram

analizados por Two-Way ANOVA (GraphPad Prism), seguido de teste pós-Hoc Bonferroni, os

quais mostraram que não há significância estatística entre os dados. A partir deste momento,

selecionamos a população de células CHO-DG44 resistente a 2,5µM para experimentos futuros.

4.4 Cinética de expressão de reCGββββαααα expresso na presença ou na ausência de

soro fetal bovino.O experimento acima nos permitiu selecionar três clones

celulares de 293T que mais expressavam reCGβα (em torno de 10UIs) na passagem 7.

Decidimos avaliar tanto a estabilidade da expressão de reCGβα após 10 passagens quanto o nível

da expressão desta proteína quando as células superprodutoras foram cultivadas tanto na

presença (condição FBS) quanto na ausência de soro fetal bovino (condição serum free media –

SFM). Para tanto, os clones celulares de 293T foram cultivados como descrito no item 3.9 por 10

passagens adicionais, quando foram plaqueados conforme os itens 3.14 e 3.15 e submetidos a

ELISA para determinar o nível de expressão de reCGβα ao longo do tempo. A curva de

expressão de reCGβα dos três clones na presença de SFB pode ser vizualizada na figura 4.4

abaixo:

293T Clone 1

24h

48h

72h

24h

48h

72h

0

5

10

15

20

25FBS

SFM

**

*

A

Curva de expressão (horas)

r-eC

Gb

a (U

I/m

L)

293T Clone 3

24h

48h

72h

24h

48h

0

5

10

15FBS

SFM

***

B


r-eC

Gb

a (U

I/m

L)

293T Clone 5

24h

48h

72h

24h

48h

0

5

10

15

20FBS

SFM

***

*

C


r-eC

Gb

a (U

I/m

L)

Figura 4.4: Cinética de expressão de reCGββββαααα pelos clones superprodutores de células 293T, ao longo de três dias, na presença ou ausência de soro fetal bovino. Abscissa: Pontos (24h, 48h ou 72h) de determinação da

concentração de reCGβα presente no meio condicionado, com ou sem soro fetal bovino (FBS). Ordenada:

concentração de reCGβα (UIs/mL) presente no meio de cultura condicionado 48h por cada população. FBS: meio de cultura condicionado na presença de SFB. SFM: meio de cultura condicionado em ausência de FBS (serum free

media). Resultados referentes aos clones celulares denominados 1 (painel A), 3 (painel B) e 5 (painel C) obtidos de células 293T transfectantes. Podemos verificar significância estatística entre as duas condições (FBS e SFM) de cultivo de um mesmo clone celular na maioria dos pontos (horas). *: p<0,05. **: p<0,01. ***: p<0,001. Número de replicatas biológicas: 2. Número de replicatas experimentais: 2.

Nesta figura, podemos verificar que a expressão de reCGβα pelos clones 293T

selecionados mostrou-se crescente ao longo dos três pontos (24, 48 e 72h) escolhidos para o

ensaio, o que se mostrou verdadeiro para ambas as condições (FBS, representado por barras

pretas e SFM, barras brancas) aplicadas para todos os clones (1, 3 e 5), com exceção dos pontos

72h dos clones 3 e 5 (painéis 4.4 B e C) devido ao fato da concentração destes estar acima do

ponto mais diluído da curva de ELISA, não permitindo, portanto, determinar a expressão de

reCGβα nestas duas condições. Comparando o nível de expressão da proteína de interesse entre

as condições FBS e SFM, é possível afirmar que a condição SFM apresentou maior expressão de

reCGβα passível de ser determninada por ELISA. Uma análise estatística dos dados, realizada

por Two-Way ANOVA (GraphPad Prism), seguido de teste pós-Hoc Bonferroni, mostrou

significância estatística (p<0,05) para este fenômeno nos pontos 24h de todos os clones (paineis

4.4 A, B e C) e também no ponto 48h do clone 1 (painel 4.4 A). Uma diferença com

significância mais estringente (p<0,01) entre as condições FBS e SFM foi observada no ponto

48h do clone 3 (painel 4.4 B), e a diferença maior (p<0,001) foi observada no ponto 48h do clone

5 (painel 4.4 C). Estes resultados nos permitem ainda afirmar que os níveis de expressão de

reCGβα para os três clones se mantiveram no mesmo nível de grandeza que observados

anteriormente, mesmoa após 10 passagens, o que denota estabilidade da expressão proteica do

produto recombinante. A partir deste momento, tomando como base os dados acima,

selecionamos o clone 293T 5 para prosseguir nas próximas etapas do trabalho por demonstrar

maior expressão de reCGβα na condição 48h SFM.

A população de CHO-DG44 superprodutora resistente à dose de 2.5µM de MTX foi

depletada do quimioterápico MTX e mantida na ausência deste, nas condições de cultivo

mencionadas anteriormente (item 3.14) por 10 passagens adicionais, quando foi submetida à

curva de expressão na presença (SFB) e ausência (SFM) de soro fetal bovino por 24, 48 e 72h,

nas mesmas condições descritas para os clones de 293T. Abaixo, na figura 4.5, podemos

verificar a concentração de reCGβα encontrada para cara condição:

24h

48h

72h

24h

48h

72h

0

10

20

30FBS

SFM

***

**

r-eC

Gb

a (U

Is/m

L)

Figura 4.5: Cinética de expressão de reCGββββαααα pela população CHO 2.5µµµµM após adaptação ao crescimento na ausência de MTX, ao longo de três dias, na presença ou ausência de soro fetal bovino. Abscissa: Pontos (24h,

48h ou 72h) de determinação da concentração de reCGβα presente no meio condicionado, com ou sem soro fetal

bovino (FBS). Ordenada: concentração de reCGβα (UIs/mL) presente no meio de cultura condicionado 48h por cada condição. FBS: meio de cultura condicionado na presença de SFB. SFM: meio de cultura condicionado em

ausência de FBS (serum free media). Resultados referentes à população CHO-DG44 resistente à dose de 2.5µM de MTX adaptada ao crescimento na ausência desta droga por 10 passagens. Podemos verificar significância estatística entre as duas condições (FBS e SFM) de cultivo de um mesmo clone celular em todos os pontos (horas). *: p<0,05. **: p<0,01. Número de replicatas biológicas: 1. Número de replicatas experimentais: 2.

Nesta figura, podemos verificar que a expressão de reCGβα pela população resistente a

2,5µM de MTX diminuiu após 10 passagens da remoção da pressão seletiva exercida pelo MTX.

Tomando o ponto 48 como parâmetro de comparação, esta diminuição foi na ordem de 2X (de

~40UIs/mL com MTX para ~20UIs sem MTX) quando as células foram cultivadas na condição

FBS, e na ordem de 4X (de ~40UIs com MTX para ~10UIs sem MTX) quando as células foram

cultivadas na condição SFM. No entanto, esta expressão é equiparável àquela dos clones

celulares 293T. Comparando o nível de expressão da proteína de interesse entre as condições

FBS e SFM, é possível afirmar que a condição FBS apresentou maior expressão de reCGβα

passível de ser determninada por ELISA. Uma análise estatística dos dados, realizada por Two-

Way ANOVA (GraphPad Prism), seguido de teste pós-Hoc Bonferroni, mostrou significância

estatística (p<0,05) para este fenômeno no ponto 24h e uma diferença com significância mais

estringente (p<0,01) entre as condições FBS e SFM foi observada nos pontos 48h e 72h desta

população.

A partir deste momento, ensaios de atividade biológica foram realizados para determinar

a atividade específica da proteína reCGβα produzida por ambas as células.

4.5 Ensaio de Atividade Biológica In Vitro de reCGββββααααForam realizados dois

ensaios independentes, em duplicata experimental, para determinar a atividade biológica in vitro

de reCGβα produzido pelas células superprodutoras. Para tal finalidade, utilizamos a linhagem

celular MLTC-1 (Mouse Leydig Tumoral Cell – ATCC-CRL2065) que superexpressa receptores

de gonadotrofinas (hCG e hFSH), em um protocolo adaptado de Legardinier et al. 2005 e

descrito no item 3.16. Utilizamos preparações contendo doses crescentes de reCGβα advindo de

células 293T ou CHO-DG44 cultivadas nas condições FBS ou SFM como condições

experimentais. Como controle negativo, utilizamos meio de cultura condicionado por células

CHO-DG44 ou 293T não produtoras de reCGβα, e como controle positivo utilizamos o eCG

comercial Folligon (Intervet). Esta célula responde ao tratamento com eCG produzindo e

secretando progesterona de maneira dose-dependente, e os meios de cultura condicionados por

estas após os tratamentos foram encaminhados para dosagem de progesterona, realizado pela

técnica de HPLC pela empresa Nanocore Biotecnologia S/A. A atividade biológica in vitro

obtida para cada condição ensaiada pode ser verificada na figura 4.6 abaixo:

FBS

Controle

Neg

ativ

o

0.25

UI

0.5

UI

1.0

UI

2.0

UI

4.0

UI

Controle

Neg

ativ

o

0.25

UI

0.5

UI

1.0

UI

2.0

UI

4.0

UI

Controle

Neg

ativ

o

0.25

UI

0.5

UI

1.0

UI

2.0

UI

4.0

UI0

100

200

300

400

CHO FBS

293T FBS

Folligon

******

***

A

Tratamentos (doses de eCG)

Pro

ges

tero

na

(ng

/mL

)

SFM

Controle

Neg

ativ

o

0.25

UI

0.5

UI

1.0

UI

2.0

UI

4.0

UI

Controle

Neg

ativ

o

0.25

UI

0.5

UI

1.0

UI

2.0

UI

4.0

UI

Controle

Neg

ativ

o

0.25

UI

0.5

UI

1.0

UI

2.0

UI

4.0

UI0

50

100

150

200

250

CHO SFM

293T SFM

Folligon

****** ***

***B

Tratamentos (doses de eCG)

Pro

ges

tero

na

(ng

/mL

)

Figura 4.6: Ensaio de Atividade Biológica In Vitro de eCG Resposta de progesterona secretada pelas células

MLTC-1 após tratamento com doses crescentes de Folligon ou reCGβα produzido na presença (A) ou ausência de soro fetal bovino (B). Abscissa: Tratamentos realizados, que consistiram em doses crescentes (0,25UI; 0,5UI; 1UI;

2UI e 4UI) de reCGβα ou Folligon. Ordenada: concentração de Progesterona (ng/mL) secretada no meio de cultura

condicionado pelas células MLTC-1. Resultados obtidos de reCGβα produzido a partir de 106 células, cultivadas nas condições FBS ou SFM por 48h. Podemos verificar significância estatística (***: p<0,001) quando comparamos os resultados do tratamento com o controle negativo e dos tratamentos com as preparações hormonais de interesse, em todas as condições. Não houve diferenças estatisticamente relevantes entre os tratamentos realizados com

reCGβα FBS, reCGβα SFM e Folligon, para uma mesma dose. Número de replicatas biológicas: 2. Número de replicatas experimentais: 2.

O ensaio de atividade biológica in vitro foi realizado em duas condições principais:

reCGβα produzido por células 293T (em verde) ou CHO-DG44 (em azul) na presença de soro

fetal bovino (A) ou na ausência deste (B). Para ambos os gráficos, os resultados do controle

positivo Folligon (em cinza) foram adicionados como forma de comparação. O teste de variância

two-way ANOVA, com análise pós-Hoc Bonferroni foi empregado, sendo que a análise foi feita

no programa GraphPad Prism versão 5.0. Os resultados apresentados nesta figura evidenciam

não haver diferença na resposta a uma mesma dose de eCG advinda de diferentes preparações

(FBS ou SFM; CHO-DG44, 293T ou Folligon). Todos os pontos apresentaram diferença

estatística (p < 0,001) em relação ao controle negativo.

4.6 Ensaio de Atividade Biológica In Vivo de reCGββββααααForam realizados dois

ensaios independentes, em triplicata experimental, para determinar a atividade biológica in vivo

de reCGβα produzido pelas células superprodutoras. Cinco doses crescentes de reCGβα, bem

como do controle positivo Folligon (Intervet), foram injetadas, subcutaneamente, em ratas pré-

púberes com idades entre 23 e 25 dias, como descrito no item 3.17. Utilizamos como controle

negativo solução salina (PBSA) e também meio de cultura condicionado por células CHO-DG44

que não expressam βα. Como resultado, podemos observar nos gráficos abaixo (Figura 4.7) o

aumento no peso dos ovários (Figura 4.7 A) e dos úteros (Figura 4.7 B) dos animais tratados:

Ovários

PBSA

Mei

o CHO C

ontro

le N

egat

ivo

CHO SFM

2.5

UI

CHO SFM

5.0

UI

CHO SFM

10.

0UI

CHO SFM

20.

0UI

CHO SFM

40.

0UI

293T

SFM

2.5

UI

293T

SFM

5.0

UI

293T

SFM

10.

0UI

293T

SFM

20.

0UI

293T

SFM

40.

0UI

Folligon 2

.5UI

Folligo

n 5.0

UI

Folligon 1

0.0U

I

Folligo

n 20,

0UI

Follign 4

0,0U

I0

20

40

60

150

200

250

a

a

a

b

b

b

c

c

c

A

Grupos Experimentais (Curva)

pes

o (

mg

)

Útero

PBSA

Mei

o CHO C

ontrole

Neg

ativ

o

CHO SFM

2.5

UI

CHO SFM

5.0

UI

CHO SFM

10.

0UI

CHO SFM

20.

0UI

CHO SFM

40.

0UI

293T

SFM

2.5

UI

293T

SFM

5.0

UI

293T

SFM

10.

0UI

293T

SFM

20.

0UI

293T

SFM

40.

0UI

Folligon 2

.5UI

Folligon 5

.0UI

Folligon 1

0.0U

I

Folligon 2

0.0U

I

Follign 4

0.0U

I0

50

100

150

200

a

a,db

b,e

c

c,fd

ef

**

***

B

**

******

Grupos Experimentais (Curva)

pes

o (

mg

)

Figura 4.7: Ensaio de Atividade Biológica In Vivo. Resposta ovariana (A) e uterina (B) de ratas pré-púberes de 23

a 25 dias após tratamento com doses crescentes de Folligon ou reCGβα produzido na ausência de soro fetal bovino.

Abscissa: Tratamentos realizados, que consistiram em doses crescentes (2,5UI; 5UI; 10UI; 20UI e 40UI) de reCGβα

ou Folligon, bem como os controles negativos PBSA e CHO-DG44 não produtora de βα. Ordenada: peso (mg) dos

órgãos reprodutores dissecados no quarto dia após o tratamento. Resultados obtidos de reCGβα produzido no processo descrito em metodologia. A: Resposta dos ovários ao estímulo hormonal. Podemos verificar significância estatística (a: p<0,01; b e c: p<0,001) quando comparamos os resultados dos tratamentos com o eCG recombinante com os tratamentos com Folligon. Não houve diferenças estatisticamente relevantes entre os tratamentos realizados

com reCGβα e os grupos controle, apesar de haver uma tendência de resposta. B: Resposta dos úteros ao estímulo hormonal. Podemos verificar significância estatística (b: p<0,01 e c: p<0,001) quando comparamos os resultados dos tratamentos com o eCG recombinante produzido pela célula CHO-DG44 com aquele produzido pela célula

293T. Quando comparamos os resultados do reCGβα com os tratamentos realizados com Folligon, não encontramos diferenças estatísticas para as mesmas doses, com excessão da dose 10UI (a<0,05). Houve diferenças

estatisticamente relevantes entre os tratamentos realizados com reCGβα produzido pela célula 293T e por Folligon (d, e e f: p<0,001). Das condições de interesse, somente as doses de 20 e 40UIs apresentaram diferenças estatísticas dos grupos controle (**: p<0,01 e ***: P< 0,001). Folligon apresentou diferença estatística dos controles negativos nas doses 10UI, 20UI e 40UI (**: p<0,01 e ***: P< 0,001). Número de experimentos independentes: 2. Número de replicatas biológicas: 3.

O ensaio de atividade biológica in vivo foi realizado em duas condições principais:

reCGβα produzido por células 293T (em verde) ou CHO-DG44 (em azul) na ausência de soro

fetal bovino. Em cinza, encontram-se os resultados do controle positivo Folligon (Intervet), e em

branco os controles negativos (PBSA e meio de cultura condicionado por células CHO não

produtoras de reCGβα). Em (A) verificamos o aumento no peso dos ovários em resposta aos

tratamentos hormonais administrados, que consiste numa resposta direta dos animais ao

estímulo. O teste de variância One-way ANOVA, com análise pós-Hoc Tukey foi empregado,

evidenciando que neste órgão o tratamento com Folligon tornou os ovários significativamente

mais pesados do que aqueles tratados com reCGβα (a: p<0,01; b e c: p<0,001). Apesar de não

haver diferença estatística entre os tratamentos realizados com reCGβα e os grupos controle, o

hormônio produzido pelas células CHO-DG44 apresentou uma tendência de resposta, o que não

pode ser observado para a célula 293T. Em (B) verificou-se o aumento no peso dos úteros em

resposta aos tratamentos hormonais, sendo a resposta ao estímulo indireta neste órgão. O teste de

variância One-way ANOVA, com análise pós-Hoc Tukey foi novamente empregado,

evidenciando que neste órgão os tratamentos com o reCGβα produzido pelas células CHO

apresentou resultados significativamente melhores do que as mesmas doses do reCGβα

produzido pelas células 293T (b: p<0,01 e c: p<0,001) e semelhantes àqueles observados para

Folligon (d, e e f: p<0,001), com excessão da dose 10UI. Quando comparados aos controles

negativos, as três últimas doses de Folligon e as duas últimas doses de reCGβα apresentaram

aumentos de peso significativos (**: p<0,01 e ***: P< 0,001).

A Figura 4.8 apresenta as regressões lineares dos dados apresentados na figura anterior,

referentes às doses-respostas dos ovários (Figura 4.8 A) e dos úteros (Figura 4.8 B) dos animais

tratados:

Figura 4.8: Regressão linear referente aos dados obtidos do ensaio de Atividade Biológica In Vivo. Resposta ovariana (A) e uterina (B) de ratas pré-púberes de 23 a 25 dias após tratamento com doses crescentes de Folligon ou

reCGβα produzido na ausência de soro fetal bovino. Abscissa: Doses injetadas (2,5UI; 5UI; 10UI; 20UI e 40UI) de

Regressão Linear Ovários

0 10 20 30 40 500

50

100

150

200

250PBSA

Meio CHO Controle Negativo

CHO SFM

293T SFM

Folligon

Dose (UI/animal)

Pes

o (

mg

)

Regressão Linear Útero

0 10 20 30 40 500

50

100

150

200PBSA

Meio CHO Controle Negativo

CHO SFM

293T SFM

Folligon

Dose (UI/animal)

Pes

o (

mg

)A

B

reCGβα ou Folligon, ou controles negativos PBSA e CHO-DG44 não produtora de βα. Ordenada: peso (mg) dos

órgãos reprodutores dissecados no quarto dia após o tratamento. Resultados obtidos de reCGβα produzido no processo descrito em metodologia. A: Resposta dos ovários ao estímulo hormonal. Podemos verificar que s os os tratamentos com o eCG recombinante provocaram uma resposta mais discreta do que os tratamentos com Folligon. B: Resposta dos úteros ao estímulo hormonal. Podemos verificar que o tratamento com o eCG recombinante produzido pela célula CHO-DG44 apresentou uma curva de regressão linear bastante íngreme em relação à curva obtida do tratamento com Folligon, sendo que ambos os tratamentos alcançaram a mesma dose-resposta no último ponto (40UI).

Nesta figura encontram-se os dados de regressão linear para ovários (4.8 A) e úteros (4.8

B) referentes à resposta biológica in vivo a preparações à base de eCG: reCGβα produzido por

células 293T (em verde) ou CHO-DG44 (em azul); eCG selvagem controle positivo Folligon

(em vermelho). Os controles negativos (PBSA e meio de cultura condicionado por células CHO

não produtoras de reCGβα) encontram-se em preto. No painel (A) observa-se a regressão linear

referente à resposta ovariana aos tratamentos hormonais administrados. Nesta análise, o slope da

curva obtido para Folligon foi 4.160 ± 0.3949, enquanto que para reCGβα produzido por células

CHO-DG44 foi em torno de uma ordem de grandeza menor, 0.4539 ± 0.08040, e para reCGβα

produzido por células 293T foi 0.2585 ± 0.05656 ( p<0,001 para os três casos). Os controles não

apresentaram slopes significativos. Novamente, o hormônio produzido pelas células CHO-DG44

apresentou uma tendência de resposta, o que não pode ser observado para a célula 293T. No

painel (B) verificou-se a regressão linear referente à resposta uterina aos tratamentos hormonais

administrados. Nesta análise, o slope da curva obtido para Folligon, 0.7263 ± 0.3767 (p=0.0718)

não foi considerado significante, enquanto que o slope obtido para a resposta a reCGβα

produzido por células CHO-DG44 foi mais consistente, 2.415 ± 0.4049 1134 (p<0,0001) , e para

reCGβα produzido por células 293T foi o menor de todos, 0.3502 ± 0.1134 (p=0,0054). Os

controles não apresentaram slopes significativos. Nesta análise, o hormônio recombinante

produzido pelas células CHO-DG44 apresentou uma tendência de dose-resposta melhor do que o

produto comercial, Folligon, o que não pode ser observado para a célula 293T. A última dose

(40UI) de reCGβα apresentou uma resposta similar ao Folligon.

Na Figura 4.9, é possível analisar qualitativamente a resposta de úteros e ovários aos

tratamentos descritos:

Figura 4.9: Painel representativo contendo fotografias do ensaio de Atividade Biológica In Vivo do reCG produzido por células 293T ou CHO-DG44. Resposta ovariana e uterina de ratas pré-púberes de 23 a 25 dias após

tratamento com o reCGβα produzido na ausência de soro fetal bovino No Painel A é possível analisar

qualitativamente a resposta ao tratamento com 10 e 20UIs de Folligon (primeira coluna), 10, 20 e 40UIs de reCGβα

produzido pelas células 293T (segunda coluna) e 10, 20 e 40UIs de reCGβα produzido pelas células CHO-DG44 (terceira coluna) em comparação com o tratamento com PBSA. Observa-se que o tratamento com o hormônio recombinante produzido pelas células CHO-DG44 levou a um aumento no tamanho do útero e dos ovários, bem como um aumento na vascularização destes últimos, o que não foi obervado nem no tratamento com o controle negativo PBSA e nem com a condição 293T. No painel B encontram-se os ovários tratados com a condição CHO-DG44, onde é possível observar os folículos ovarianos e a vascularização induzidas por este tratamento.

Nesta figura estão exibidos um conjunto de órgãos (ovários e útero) referentes às

condições controle negativo (PBSA), duas doses (10UIs e 20UIS) de Folligon (primeira coluna)

e três doses (10UIS, 20UIS e 40UIS) do reCGβα produzido pelas células 293T (segunda coluna)

ou CHO-DG44 (terceira coluna). Estas imagens permitem uma análise qualitativa da resposta

dos animais aos tratamentos, onde é evidente a resposta ao Folligon e também ao hormônio

produzido pela célula CHO-DG44. Este último tratamento, especialmente na dose 40UIs, induziu

um aumento no tamanho destes órgãos (Painel A) e uma importante vascularização nos ovários e

a presença de folículos (Painel B).

4.7 Purificação Parcial de reCGββββαααα secretada em meio de cultura condicionado

através de cromatografia de alta perfomenaca (HPLC)Visando alcançar maior

massa e pureza da proteína de interesse, submeteu-se os meios de cultura condicionados

contendo reCGβα, coletados de acordo com a batelada de produção descrita no item 3.10, a dois

tipo distintos de cromatografia: troca iônica e cromatografia de afinidade. Nos itens a seguir

descrevemos detalhadamente os resultados obtidos para cada tipo de cromatografia praticada:

4.7.1 Cromatografia de Troca Inônica – HiTrap Mono Q (GE lifesciences)

Visando explorar a característica de baixo PI de eCG (ao redor de 1.8), utilizou-se a

coluna HiTrapTM Capto Q (GE Healthcare), que possui o trocador aniônico amônia quartenária

com habilidade para ligação de proteínas com domínios de carga negativa. Diluiu-se 10mL do

meio condicionado 10X em tampão A, como foi descrito em metodologia (item 3.18), de modo a

otimizar a ligação de reCGβα na coluna. Três gradientes de eluição contendo quantidades

crescentes de tampão B foram utilizados (1) 0-11mM NaCl para eluir proteínas contaminantes;

(2) 11-19mM NaCl e (3) 19-40mM NaCl para enriquecer eluato em reCGβα; e por fim 40-

1000mM NaCl para limpeza da coluna. Após 3VC de lavagem, os eluatos foram coletados em

11VC (A11-B10). O cromatograma resultante deste experimento encontra-se abaixo:

Figura4.10: Cromatograma resultante do processo de purificação de reCGββββαααα com a coluna HiTrapTM Mono Q. Neste gráfico podemos vizualizar, no eixo das abscissas, as frações eluídas na cromatografia realizada com o meio de cultura condicionado descrito, enquanto que no eixo das ordenadas (linha azul) é possível verificar a absorbância obtida, a 280nm, das frações eluídas (mAU). A condutividade de sal (NaCl) injetada a cada etapa é representada pela linha pontilhada marrom (mS/cm). O pico visualizado após o permeado corresponde às frações B2 a B10 (7,5 a 40mS de NaCl).

Como a cromatografia de troca inônica é um método inespecífico de purificação, decidiu-

se comparar o perfil cromatográfico das proteínas secretadas pela linhagem celular não produtora

de reCGβα com aquele advindo de preparações contendo a proteína de interesse. Para isso, 13

mL de meio de cultura condicionado por células não transfectadas com o vetor pNUØ-eCGβα

(controle negativo) foram diluídos 10X com tampão A e submetidos à cromatografia de troca

aniônica, exatamente nas mesmas condições descritas acima. No gráfico abaixo (Figura 4.11), é

perceptível a semelhança entre o padrão de eluição obtido para esta amostra (controle negativo) e

a amostra de interesse acima (Figura 4.10), sendo um pico marjoritário eluído entre 7,5 e 40mS

de NaCl:

Figura 4.11: Cromatograma resultante do processo de purificação de proteínas secretadas no meio de cultura condicionado pelo controle negativo. Neste gráfico podemos vizualizar, no eixo das abscissas, as frações eluídas na cromatografia realizada com o meio de cultura controle negativo, enquanto que no eixo das ordenadas (linha azul) é possível verificar a absorbância obtida, a 280nm, do eluato (mAU). A condutividade de sal (NaCl) injetada a cada etapa é representada pela linha pontilhada marrom (mS/cm). O pico visualizado após o permeado corresponde às frações B7 a C2 (7,5 a 40mS de NaCl).

Após o processo cromatográfico, as frações resultantes da cromatografia do meio

condicionado contendo reCGβα, bem como o permeado foram coletados, diluídos e dosados por

ELISA quantitativo. Um gráfico representativo foi gerado com as porcentagens de reCG

liberadas a cada fração, onde podemos observar que, embora aproximadamente 49% de reCG

tenha sido perdido no permeado, foi possível recuperar o reCG remanescente em algumas

frações bem definidas, correspondentes ao pico observado (em mAU) na Figura 4.10, sendo que

a maior porcentagem de reCG foi liberado entre as frações B1 e B5, correspondentes ao primeiro

e segundo gradientes de eluição (7,5-19mS NaCl). Para o controle negativo (Figura 4.11), o

eluato correspondente ao pico observado (7,5-40mS NaCl) não apresentou resposta no ELISA

quantitativo, como esperado (dado não mostrado). O resultado do ELISA realizado encontra-se

na Figura 4.12 abaixo:

Figura 4.12: Porcentagens relativas de reCGββββαααα, dosadas por ELISA quantitativo, presente nas diferentes

etapas do processo cromatográfico realizado com a coluna HiTrapTM-Mono Q. No eixo das ordenadas

encontram-se os valores, em %, de reCGβα presente em cada etapa, enquanto que no eixo das abscissas identifica-se

cada uma destas. Meio Original: meio de cultura condicionado diluído 10X em tampão A; FlowThrough: permeado;

Frações A9 e A10: lavagem; Frações A11 a B10: eluatos. Analisando este gráfico, podemos observar que 49% de

reCGβα foi liberado no permeado e o restante do reCGβα que ficou retido na coluna cromatográfica foi eluído entre

0

20

40

60

80

100

120

Me

io O

rig

ina

l

Flo

wT

hro

ug

h

Fra

ção

A9

Fra

ção

A1

0

Fra

ção

A1

1

Fra

ção

A1

2

Fra

ção

B1

Fra

ção

B2

Fra

ção

B3

Fra

ção

B4

Fra

ção

B5

Fra

ção

B6

Fra

ção

B7

Fra

ção

B8

Fra

ção

B9

Fra

ção

B1

0% de r-eCG

% de r-eCG

as frações B1 e B5, que correspondem ao primeiro e segundo gradientes de eluição, equivalentes à condutância entre

7,5 e 19mS de NaCl.

O meio de cultura condicionado pelas células superprodutoras e as frações resultantes

ativas para reCGβα (B1, B2 e B3 equivalentes à condutividade de 7,5 a 17mS de NaCl, Figura

4.10) foram concentrados 5X em centricon com corte de 10kDa (Millipore) seguido de

fracionamento eletroforético em dois geis idênticos de poliacrilamida a 12% , visando análise

qualitativa das proteínas eluídas. Nestes mesmos geis foram aplicados 40 UIs do controle

positivo Folligon (Intervet), e as frações eluídas à condutividade de 7,5 a 13mS de NaCl do

controle negativo (Figura 4.11), de modo a comparar as proteínas presentes no eluato de

interesse com (1) aquelas presentes no eluato do controle negativo e (2) o controle positivo. Estes

dois geis idênticos foram processados de maneira distinta, sendo que o primeiro foi corado com

Coomassie blue para visualização das bandas proteicas (Figura 4.13 Painel A) enquanto que o

segundo foi submetido à técnica de western blot para identificar a presença da proteína de

interesse (Figura 4.13 Painel B):

Figura 4.13. Análise da purificação de reCGββββαααα por cromatografia de troca iônica realizada com a coluna HiTrapTM Mono-Q. A: SDS-PAGE 12% (condição não redutora) corado com Coomassie blue contendo amostras de frações enriquecidas para reCGβα, controle positivo (Folligon) e controle negativo (frações similares obtidas da

cromatografia do meio de cultura controle negativo). As frações com atividade para reCGβα determinada por

ELISA (7,5-17mS/cm) foram concentradas 5X em filtros de celulose Centricon® com limite de massa molecular de

10 kDa. De modo a comparar a preparação enriquecida para reCGβα com proteínas contaminantes presentes no meio de cultura condicionado, utilizou-se como controle negativo frações similares (mesmas condições de eluição) advindas de cromatografia de meio de cultura de células não produtoras de reCGβα. Como controle positivo para referência, utilizou-se a preparação comercial de eCG purificada Folligon. B: Western blot referente às amostras do painel A, realizado com anticorpo específico para eCG. As bandas que apresentaram tamanhos correspondentes

àqueles preditos para a proteína de interesse estão indicadas com setas. Padrão de massa molecular: BenchMarkTM

Pre-Stained Protein Ladder. kDa: quilodaltons.

No painel A da Figura 4.13 é possível comparar o padrão de bandas resultante do

fracionamento protéico da condição de interesse (meio de cultura condicionado contendo

reCGβα (quarta amostra) e frações enriquecidas para reCGβα (quinta, sexte e sétima amostras)

com o padrão resultantes do controle negativo (frações eluídas de células não produtoras de

reCGβα) e do controle positivo (Folligon). Este experimento foi realizado em condições não-

desnaturantes. Para a primeira amostra (Folligon), é possível visualizar uma fraca banda de

60kDa referente ao dímero de eCG totalmente glicosilado, uma banda de 80 kDa referente a um

agregado desta proteína e um smear na região de 40kDa referente a glicoformas desta proteína.

Para o meio de cultura condicionado por células superprodutoras de reCGβα (quarta amostra), a

coloração por Coomassie blue indicou a presença de diversas bandas, não sendo possível detectar

reCGβα em meio às demais proteínas. Para as frações obtidas após a cromatografia de troca

iônica evidencia-se a presença de uma banda na altura de 64 kDa tanto na condição controle

negativo quanto na condição de interesse, não sendo possível a visualização de uma proteína no

tamanho de eCG por esta técnica.

No painel B desta figura, oWestern blot evidenciou que as bandas de tamanhos de

aproximadamente 50 e 60 kDa estavam presentes nos eluatos e no meio de cultura condicionado

da condição de interesse, enquanto que não foram observadas no controle negativo. Bandas de 80

kDa também foram identificadas pelo anticorpo, que correspondem provavelmente a agregados

de reCGβα. Na primeira coluna, bandas de 45 e 60 kDa correspondentes a glicoformas de eCG

comercial, bem como uma banda de 80 kDa correspondente a um agregado desta proteína

também se mostraram imunorreativas.

4.7.2 Concanavalina A

Visando explorar a característica de alta glicosilação de eCG (modificação pós-

traducional que pode alcançar até 45% de sua massa molecular), utilizou-se a a coluna HiTrapTM

ConA 4B, que possui a Lectina Concanavalina A como ligante de afinidade para proteínas

glicosiladas. Diluiu-se 50mL do meio condicionado 2X em tampão de diluição, de modo a

ajustar a concentração de NaCl, CaCl e MgCl, como foi descrito em metodologia (item 3.18),

para otimizar as condições de ligação de reCGβα nesta coluna. Um gradiente linear iniciando-se

em 30 e finalizando-se em 300 mM do competidor metil-�-D-glucopiranosídeo (Sigma-

Aldrich®) foi aplicado na eluição, em 10VC. O gráfico obtido para esta cromatografia encontra-

se na Figura 4.14 abaixo:

Figura4.14: Cromatograma resultante do processo de purificação de reCGββββαααα com a coluna HiTrapTMConA. Neste gráfico podemos vizualizar, no eixo das abscissas, as frações eluídas na cromatografia realizada com o meio de cultura condicionado descrito, enquanto que no eixo das ordenadas (linha azul) é possível verificar a absorbância obtida, a 280nm, das frações eluídas (mAU). A condutividade de sal (NaCl) injetada a cada etapa é representada pela linha pontilhada marrom (mS/cm). Não foi possível observar picos na eluição, apenas uma discreta elevação na abosrbância ao longo de todas as frações eluídas.

Observando este gráfico, é possível inferir que poucas proteínas ligaram-se à coluna

devido ao discreto aumento na absorbância observada na etapa de eluição e à alta quantidade de

proteínas saindo no permeado. O meio de cultura condicionado, as frações, o permeado e a

lavagem foram submetidos à detecção de reCGβα por ELISA (PMSG ELISA Kit, ALPCO), e os

resultados encontram-se organizados na Figura 4.15 abaixo:

Figura 4.15: Porcentagens relativas de reCGββββαααα, dosadas por ELISA quantitativo, presente nas diferentes

etapas do processo cromatográfico realizado com a coluna HiTrapTM-ConA. No eixo das ordenadas encontram-

se os valores, em %, de reCGβα presente em cada etapa da purificação, enquanto que no eixo das abscissas

identifica-se cada uma destas. Meio Original: meio de cultura condicionado diluído 2X em tampão A; FlowThrough:

permeado; 30-100mM, 100-200mM e 200-300mM: Frações agrupadas por faixa de concentração do competidor

metil-α-D-glucopiranosídeo (Sigma) presente no momento da eluição. Analisando este gráfico, podemos observar

que boa parte (57,7%) de reCGβα foi liberado no permeado e o restante do reCGβα que ficou retido na coluna

cromatográfica foi eluído de forma constante ao longo do gradiente de α-D-glucopuranosídeo (Sigma).

Todas as frações do eluato se mostraram ativas para reCGβα segundo o ensaio de ELISA.

As frações eluídas entre 20 e 200mM de metil-α-D-glucopiranosídeo foram unidas, concentradas

100X utilizando-se colunas com corte de 10kDa (CentriconTM – Millipore®) e utilizadas para

análises em geis de poliacrilamida, utilizando o corante Coomassie Brilliant Blue e também

análises de Western blot:

0

20

40

60

80

100

120

% de r-eCGba

% de r-eCGba

Figura 4.16: Análise da purificação de reCGββββαααα por cromatografia de troca iônica realizada com a coluna HiTrapTM Con A. A: SDS-PAGE 12% (condição redutora) corado com Coomassie blue contendo amostras de meio de cultura condicionado contendo controle positivo (Folligon – primeira coluna), meio de cultura condicionado de células controle negativo (segunda coluna), meio de cultura condicionado de células superprodutoras de reCGβα (terceira coluna), permeado (quarta coluna) e frações enriquecidas para reCGβα (última coluna), O permeado e as frações com atividade para reCGβα eluídas entre 20 e 200mM de metil-α-D-glucopiranosídeo foram concentradas

100X em filtros de celulose Centricon® com limite de massa molecular de 10 kDa antes de serem aplicadas no gel.

Os meios de cultura condicionados de interesse e controle negativo foram concentrados 5X. B: Western blot referente às amostras do painel A, realizado com anticorpo específico para eCG. As bandas que apresentaram tamanhos correspondentes àqueles preditos para a proteína de interesse estão indicadas com seta brancas. As setas pretas apontam para uma banda inespecífica imunoreativa que aparece tanto no controle negativo como no meio de cultura condicionado contendo reCGβα, porém deixa de aparecer nas frações eluídas. Padrão de massa molecular:

BenchMarkTM

Pre-Stained Protein Ladder. kDa: quilodaltons.

No painel A da Figura 4.16 é possível notar que o padrão de bandas resultante do

fracionamento protéico da condição de interesse (meio de cultura condicionado contendo

reCGβα (terceira coluna amostra) e das frações enriquecidas para reCGβα (quinta coluna) é

muito similar àquele resultante do controle negativo (meio de cultura condicionado por células

não produtoras de reCGβα, segunda coluna), não sendo possível, novamente, detectar

especificamente o. reCGβα em meio às demais proteínas. Para a primeira amostra (Folligon), é

possível visualizar uma fraca banda de 60kDa referente ao dímero de eCG totalmente glicosilado

e um smear na região de 40kDa referente a glicoformas desta proteína. Para os meios de cultura

condicionados, evidencia-se a presença de uma banda intensa na altura de 64 kDa tanto na

condição controle negativo quanto na condição de interesse, banda esta que também aparece no

permeado e diminui bastante de intensidade nas frações eluídas.

No painel B desta figura, o Western blot evidenciou que as bandas de tamanhos de

aproximadamente 55kDa estavam presentes nos eluatos e no meio de cultura condicionado da

condição de interesse, enquanto que não foram observadas no controle negativo. Uma banda

inespecífica de aproximadamente 35kDa foi identificadas pelo anticorpo nas amostras de meios

de cultura condicionados de interesse e controle negativo. Na primeira coluna, bandas de 40 a 65

kDa correspondentes a glicoformas de eCG comercial se mostraram imunorreativas.

Duas novas cromatografias foram realizadas, utilizando 50mL de meio de cultura

condicionado das células 293T ou das células CHO-DG44 superprodutoras de reCGβα, seguindo

os mesmos passos descritos e documentados acima. As frações eluídas entre 20 e 200mM de

metil-α-D-glucopiranosídeo contendo o equivalente a 80UIs de reCGβα foram unidas,

concentradas 100X utilizando-se colunas com corte de 10kDa (CentriconTM – Millipore®) e

utilizadas para um ensaio de atividade biológica in vivo, como descrito no item 3.17. Para isso,

um único experimento foi realizado utilizando-se 4 animais para cada condição de interesse

(20UIs de reCGβα produzido por células 293T ou por células CHO-DG44), 4 animais para cada

controle positivo (Folligon 10 ou 20UI) e 4 animais como controle negativo (PBSA). O resultado

deste ensaio pode ser visualizado na figura abaixo:

Ovários

PBSA

Folligon 1

0UI

Folligon 2

0UI

293T

20U

I

CHO 20U

I0

50

100

150

*

***

Tratamentos

Pes

o (

mg

)

Útero

PBSA

Folligon 1

0UI

Folligon 2

0UI

293T

20U

I

CHO 20U

I0

50

100

150

*** *** ***

Tratamentos

Pes

o (m

g)

Figura 4.17: Ensaio de Atividade Biológica In Vivo do reCG parcialmente purificado pela coluna HiTrapTM Con A. Resposta ovariana (A) e uterina (B) de ratas pré-púberes de 25 dias após tratamento com Folligon ou

reCGβα produzido na ausência de soro fetal bovino e parcialmente purificado pela coluna HiTrapTM Con A. Abscissa: Tratamentos realizados, que consistiram em duas doses (10UI e 20UI) do controle positivo Folligon,

controle negativo PBSA ou uma dose (10UIs) de reCGβα produzido pelas células CHO-DG44 ou 293T e

parcialmente purificado. Ordenada: peso (mg) dos órgãos reprodutores dissecados no quarto dia após o tratamento. A: Resposta dos ovários ao estímulo hormonal. Podemos verificar significância estatística (*: p<0,05 e ***: p<0,001) quando comparamos os resultados dos tratamentos com o eCG comercial Folligon (doses 10UI e 20UI, respsctivamente) com o controle negativo PBSA. Não houve diferenças estatisticamente relevantes entre os

tratamentos realizados com reCGβα e os grupos controle, apesar de haver uma tendência de resposta para a célula CHO-DG44. B: Resposta dos úteros ao estímulo hormonal. Podemos verificar significância estatística (***: p<0,001) quando comparamos os resultados dos tratamentos com as duas doses do controle positivo Folligon e com

o eCG recombinante produzido pela célula CHO-DG44 em relação ao controle negativo. O reCGβα produzido pela célula 293T não apresentou diferença estatística do controle negativo. Quando comparamos os resultados do

tratamento de 20UIs com o reCGβα produzido por CHO-DG44 com o tratamento de 20UIs realizado com Folligon, não encontramos diferenças estatísticas. Número de experimentos independentes: 1. Número de replicatas biológicas: 4.

Este ensaio de atividade biológica in vivo foi realizado em cinco condições: Controle

negativo PBSA (branco), 10 e 20UIs do controle positivo Folligon (Intervet) e 20UIs de reCGβα

parcialmente purificado por cromatografia de afinidade (HiTrapTM Con A) produzido por células

293T (em verde) ou CHO-DG44 (em azul) na ausência de soro fetal bovino. No painel A

verificou-se o aumento no peso dos ovários em resposta aos tratamentos hormonais

administrados (resposta direta). O teste de variância One-way ANOVA, com análise pós-Hoc

Tukey foi empregado, evidenciando que neste órgão os tratamentos com 10UIs e 20UIs Folligon

tornou os ovários significativamente mais pesados do que aqueles tratados com reCGβα (*:

p<0,01 e ***: p<0,001, respectivamente). Apesar de não haver diferença estatística entre os

tratamentos realizados com reCGβα parcialmente purificado e os grupos controle, o hormônio

parcialmente purificado produzido pelas células CHO-DG44 apresentou uma tendência de

resposta, o que não pode ser observado para a célula 293T. No painel B está representado o

aumento no peso dos úteros em resposta aos tratamentos hormonais (resposta indireta). O teste

de variância One-way ANOVA, com análise pós-Hoc Tukey foi novamente empregado,

evidenciando que neste órgão o tratamento com o reCGβα parcialmente purificado produzido

pelas células CHO-DG44 apresentou resultados significativamente semelhantes àqueles

observados para Folligon, enquanto que o reCGβα parcialmente purificado produzido pela célula

293T não apresentou diferença estatística do controle negativo PBSA. Na Figura 4.18 abaixo, é

possível analisar qualitativamente a resposta de úteros e ovários do controle negativo PBSA e

das condições de interesse (reCGβα produzido por células 293T ou CHO-DG44):

Figura 4.18: Imagens do ensaio de Atividade Biológica In Vivo do reCG parcialmente purificado pela coluna HiTrapTM Con A. Resposta ovariana e uterina de ratas pré-púberes de 25 dias após tratamento com o reCGβα produzido na ausência de soro fetal bovino e parcialmente purificado pela coluna HiTrapTM Con A. No Painel A é

possível analisar qualitativamente a resposta ao tratamento com reCGβα parcialmente purificado em comparação com o tratamento com PBSA, sendo que o tratamento com o hormônio recombinante produzido pelas células CHO-DG44 levou a um aumento no tamanho do útero e dos ovários, bem como um aumento na vascularização destes últimos, o que não foi obervado nem no tratamento com o controle negativo PBSA e nem com a condição 293T. No painel B encontram-se os ovários tratados com a proteína parcialmente purificada de células CHO-DG44 produtoras de reCG, onde é possível observar os folículos ovarianos e a vascularização induzidas por este tratamento.

Nesta figura estão exibidos um conjunto de órgãos (ovários e útero) referentes às

condições controle negativo (PBSA), reCGβα produzido pelas células 293T ou CHO-DG44 e

parcialmente purificado pela coluna Con A. Estas imagens permitem uma análise qualitativa da

resposta dos animais aos tratamentos, onde é evidente a resposta da proteína produzida pelas

células CHO-DG44, que apresentou aumento no tamanho destes órgãos (Figura 4.18, Painel A) e

uma importante vascularização nos ovários, além da presença de folículos ovarianos neste órgão

(Figura 4.18, Painel B).

4.8 Análise de Perfil de N-glicosilação de reCGββββαααα produzido pelas células

produtoras 293T e CHO-DG44 e comparação com padrões comerciais de eCG

purificados de sangue de águaPara comparar as estruturas de N-glicanos do reCGβα

produzido pelas células CHO-DG44 e 293T com aquelas presentes no eCG selvagem (purificado

de sangue de éguas) foi necessário extrair os N-glicanos destas amostras. A análise (item 3.20 da

metodologia) foi realizada em colaboração com o grupo do Professor Michael Butler, da

University of Manitoba no Canadá. As amostras são fracionadas em geis de poliacrilamida e as

bandas correspondentes à(s) proteína(s) de interesse passam por uma digestão in gel com a

exoglicosidase PNGaseF, de modo a remover os glicanos N-ligados à cadeia polipeptídica na

altura da base (Royle et al. 2007). Nos itens a seguir são apresentados os resultados obtidos para

cada uma das amostras analisadas.

4. 8.1. Análise de N-glicosilação dos padrões comerciais de eCG purificados a partir

do sangue de éguas prenhes (Folligon e NISRC-WHO)

Para obter o padrão de N-glicosilação presente nas amostras de eCG selvagem,

utilizamos duas preparações de eCG comercialmente disponíveis, sendo a primeira o Folligon

(Intervet), uma preparação 95% pura de eCG purificado do sangue de éguas prenhes, e a segunda

o padrão de eCG internacional obtido do “National Institute for Biological Standards and

Control” (NIBSC-WHO), uma preparação 99,9% pura obtida de amostras de sangue de éguas

prenhes advindas de diversas fontes. Estas amostras foram aplicadas em um gel de

poliacrilamida, o qual foi posteriormente corado com Coomassie blue (Figura 4.19 abaixo):

Figura 4.19: Fracionamento de eCG comercial (Folligon e WHO) em gel de poliacrilamida a 12% corado com Coomassie blue. Nesta figura observa-se as amostras referentes a uma curva com concentrações crescentes de Folligon (linhas 2 a 5) e amostras referentes a concentrações crescentes do padrão internacional de eCG NIBSC (linhas 7 a 9). Nas linhas 1 e 10 foi aplicado o padrão de massa molecular (MM) Prestained Precision Plus

TM (BioRad). As bandas referentes a eCG foram recortadas do gel e submetidas à extração e análise de N-glicanos.

Neste gel é possível identificar o padrão de bandas proteicas apresentado pelos padrões

comerciais de eCG. Nota-se que o padrão Folligon possui maior massa proteica quando

comparado com a mesma quantidade, em UIs, do padrão NIBSC-WHO. As bandas referentes ao

eCG cadeias separadas (22kDa para eCGα e 44kDa para eCGβ) e dímero (61kDa), destacadas

por retângulos vermelhos, foram recortadas e processadas para extração de N-glicanos. Estes

foram marcados com o fluoróforo 2-aminobenzeno e submetidos à cromatografia de fase normal

realizada em coluna de amida, sendo detectadas através de um detector de fluorescência. O

padrão de picos obtidos na eluição das amostras de eCG selvagem (uma mistura de diversos N-

glicanos presentes nas diversas glicoformas de cada proteína de interesse) bem como o tempo de

retenção referente a cada um destes picos pode ser observado na Figura 4.20:

6.9

34

12

.33

8

18

.86

1

24

.84

6

29

.89

1

34

.13

8

37

.75

2

40

.86

6

43

.58

8

45

.99

6

48

.13

8

50

.05

8

51

.83

7

EU

0.00

200.00

400.00

600.00

Minutes

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00

Dextran Ladder

GU Units Retention Time Area % Area

1 6.934 71097947 22.99

2 12.338 53115865 17.17

3 18.861 38780430 12.54

4 24.846 31553536 10.2

5 29.891 25907263 8.38

6 34.138 21283863 6.88

7 37.752 17362808 5.61

8 40.866 14081865 4.55

9 43.588 11251355 3.64

10 45.996 8847789 2.86

11 48.138 6852531 2.22

12 50.058 5288917 1.71

13 51.837 3885831 1.26

A

B

20

.68

221

.05

821

.66

42

2.0

61

22

.948

24

.02

82

4.5

97

25

.088

25.6

40

26

.16

426

.63

226

.81

4

28

.34

5

29

.39

32

9.7

78

30.4

73

30

.97

6

31

.665

32.5

88

33

.14

73

3.4

67

34.2

18

34

.72

1

35

.67

93

6.1

88

37

.25

43

7.6

09

37.9

74 38.4

89

39.1

18

39

.853

40

.332

41.0

64

41

.46

3

42

.516

43

.02

1

43

.739

44.2

82

44.8

51

45

.51

2

46

.216

46.5

80

47

.356

48

.06

6

EU

0.00

50.00

100.00

150.00

200.00

Minutes

20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00

Retention Time Area % Area GU value



1 20.682 334852 0.16 3.29784992 15 29.778 372748 0.18 4.9686559 30 39.118 33424635 16.44 7.4238939

2 21.058 2686352 1.32 3.358391288 16 30.473 61918 0.03 5.1201437 31 39.853 6837468 3.36 7.662698

3 21.664 198865 0.1 3.45701082 17 30.976 934761 0.46 5.2324514 32 40.332 7635100 3.75 7.8226202

4 22.061 69514 0.03 3.522379749 18 31.665 1371277 0.67 5.3900649 33 41.064 8369733 4.12 8.073791

5 22.948 265377 0.13 3.670847149 19 32.588 1165840 0.57 5.6083327 34 41.463 41330997 20.33 8.2142547

6 24.028 185160 0.09 3.856659567 20 33.147 561840 0.28 5.7446547 35 42.516 9970484 4.9 8.597493

7 24.597 336650 0.17 3.957025029 21 33.467 711228 0.35 5.8241423 36 43.021 8215726 4.04 8.7879801

8 25.088 60897 0.03 4.04511232 22 34.218 2796358 1.38 6.0149607 37 43.739 15831911 7.79 9.0666061

9 25.64 578558 0.28 4.145869954 23 34.721 3288418 1.62 6.1462114 38 44.282 4034359 1.98 9.2836067

10 26.164 76649 0.04 4.243291072 24 35.679 4429424 2.18 6.4041415 39 44.851 7733490 3.8 9.5170111

11 26.632 135812 0.07 4.331828366 25 36.188 3948916 1.94 6.5455781 40 45.512 3780719 1.86 9.7961482

12 26.814 125912 0.06 4.36666153 26 37.254 5266605 2.59 6.8521236 41 46.216 2528534 1.24 10.103253

13 28.345 61964 0.03 4.669109377 27 37.609 4660018 2.29 6.9574226 42 46.58 1912162 0.94 10.266143

14 29.393 679021 0.33 4.886522177 28 37.974 2145695 1.06 7.0674155 43 47.356 1221435 0.6 10.623083

29 38.4891258318

2 6.19 7.2256565 44 48.066 417557 0.21 10.961638

C

D

20.2

06

20.6

08

21.0

89

21.5

98

21.9

98

22.5

65

22.9

55

24.0

13

24.5

96

25.0

42 2

5.6

44

26.0

48

26.6

63

28.0

02

28.5

59

29.3

84

30.1

50

31.5

22

32.6

03

33.1

39

33.5

32

33.7

38

34.0

50

34.1

61

34.7

39

35.5

18

36.3

04

36.7

27

37.1

78

37.6

18

37.9

71

38.4

41

39.1

74

39.8

09

40.5

05

41.0

22

41.4

78

42.1

18

42.6

91 43.7

34

44.1

21

44.6

80

45.4

88

45.8

80

46.2

36

47.3

36

47.8

39

48.4

67

48.7

52

EU

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

Minutes

20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 48.00 50.00

E

F

WHO Standard

Retention

Time Area % Area GU values

Retention

Time Area % Area

GU

values

Retention

Time Area % Area

GU

values

1 20.206 38634 0.49 3.22 17 30.15 24502 0.31 5.05 33 39.174 248390 3.15 7.44

2 20.608 98958 1.25 3.29 18 31.522 102830 1.3 5.36 34 39.809 354277 4.49 7.65

3 21.089 1417794 17.97 3.36 19 32.603 196742 2.49 5.61 35 40.505 138266 1.75 7.88

4 21.598 134741 1.71 3.45 20 33.139 22512 0.29 5.74 36 41.022 549468 6.97 8.06

5 21.998 52902 0.67 3.51 21 33.532 17660 0.22 5.84 37 41.478 419868 5.32 8.22

6 22.565 45236 0.57 3.61 22 33.738 24714 0.31 5.89 38 42.118 368405 4.67 8.45

7 22.955 55355 0.7 3.67 23 34.05 2835 0.04 5.97 39 42.691 558841 7.08 8.66

8 24.013 173192 2.2 3.85 24 34.161 12174 0.15 6.00 40 43.734 614834 7.79 9.06

9 24.596 22991 0.29 3.96 25 34.739 54231 0.69 6.15 41 44.121 151663 1.92 9.22

10 25.042 8189 0.1 4.04 26 35.518 147602 1.87 6.36 42 44.68 418667 5.31 9.45

11 25.644 256193 3.25 4.15 27 36.304 55154 0.7 6.58 43 45.488 63096 0.8 9.79

12 26.048 41490 0.53 4.22 28 36.727 66409 0.84 6.70 44 45.88 17159 0.22 9.96

13 26.663 24600 0.31 4.34 29 37.178 54588 0.69 6.83 45 46.236 42707 0.54 10.11

14 28.002 20304 0.26 4.60 30 37.618 55799 0.71 6.96 46 47.336 6884 0.09 10.61

15 28.559 6353 0.08 4.71 31 37.971 204778 2.6 7.07 47 47.839 13794 0.17 10.85

16 29.384 236675 3 4.88 32 38.441 224055 2.84 7.21 48 48.467 3906 0.05 11.16

49 48.752 17651 0.22 11.30

Figura 4.20: Análise de N-glicosilação do eCG comercial Folligon e do padrão internacional de eCG NIBSC-WHO. Painéis (A) e (B) são referentes à curva de calibração (padrão de Unidades de Glicose marcadas com 2-AB) aplicada no início da corrida, contra a qual as amostras marcadas de interesse são comparadas. (A): Tempos de eluição de cada um dos picos obtidos pela curva de unidades de glicose; (B): Picos obtidos para a curva de calibração. Painéis (C) e (D) são referentes aos N-glicanos extraídos de Folligon, sendo que em (C) encontram-se os tempos de eluição obtidos para cada pico observado no gráfico (D). Painéis (E) e (F) são referentes aos N-glicanos extraídos do padrão internacional de eCG NIBSC-WHO, onde identificam-se os tempos de eluição obtidos para cada pico (E) observado no gráfico (F). Nos gráficos (Painéis B, D e F), o eixo das ordenadas corresponde às unidades de absorbância da fluorescência (EU) emitida pelas amostras marcadas com 2-AB e o eixo das abscissas corresponde ao tempo (minutos) no qual estas amostras foram eluídas. As tabelas (Painéis A, C e E) mostra os tempos de retenção de cada pico observado, a área ocupada por cada pico, a % da área ocupada por cada pico em relação à área total de todas as amostras de N-glicanos e, por fim, o valor, em GUs (Unidades de Glicose) obtido para cada amostra após comparação (regressão polinomial de cinco parâmetros) com a curva de calibração (Padrão de glicanos – GUs).

A Figura 4.20 mostra os dados obtidos após a eluição das amostras de interesse marcadas com

2-AB. As tabelas (Painéis A, C e E) geradas pelo software Empower GPC HPLC (Waters) detalham os

dados obtidos do cromatograma, como tempo de retenção de cada N-glicano contido na amostra

(picos), área ocupada (indicativo de abundância daquela estrutura encontrada) e % da área do pico em

relação à área total. Este software ainda calcula o valor de Unidades de Glicose (GU) obtido para cada

N-glicano (pico), baseado em uma regressão linear utilizando os dados da curva de calibração (dextran

ladder). Após substituir os valores de retenção por valores de GU para os principais picos, os gráficos

foram refeitos:

Figura 4.21: Principais picos obtidos de N-glicanos marcados com 2-AB e seus respectivos valores em GU. Ordenadas:

absorbância obtida para cada pico, indicando abundância de cada estrutura identificada. Abscissas: Valores de unidades de

glicose (GU values) obtidos ao longo da eluição.

Os picos obtidos indicam glicoformas putativas presentes nas preparações de interesse. É

possível observar que os valores de GU obtidos para os principais picos (aqueles com maior área) são

altos (>7 GUs), indicando a presença de glicanos altamente complexos anexados ao eCG comercial. A

maior parte das estruturas putativas com valores de GU acima de oito correspondem a estruturas bi-

antenárias de N-glicanos do tipo complexo, galactosilado e com a presença de um ou mais resíduos de

ácido siálico.

A partir deste momento, decidiu-se utilizar os dados obtidos para o eCG comercial Folligon.

Foi necessário realizar digestões com exoglicosidases para desconstruir as cadeias das estruturas

putativas e, assim, confirmar suas sequências. O perfil de N-glicanos obtidos após digestão com

diferentes combinações de exoglicosidades (descritas no item 3.20) encontra-se na Figura 4.22 abaixo:

Figura 4.22: Perfil de HPLC de amostras de N-glicanos extraídos do eCG comercial Folligon marcados com 2-AB

presentes na preparação original e após digestão com diferentes combinações de exoglicosidases. A: Perfil de HPLC

original obtido para os N-glicanos de Folligon; B-E: perfil de HPLC de N-glicanos após digestão com diferentes

combinações de exoglicosidases: Sialidase (B); Sialidase + Fucosidase (C); Sialidase + Fucosidase + Galactosidase (D);

Sialidase + Fucosidase + Galactosidase + Hexosaminidase (E).

Primeiramente, digeriu-se a preparação de N-glicanos obtidos do eCG comercial Folligon com

sialidase (Figura 4.22 B), visando eliminar os possíveis resíduos de ácido siálico presentes nas antenas

de N-glicanos de eCG. Verificou-se que os picos com valores de GU mais altos deram lugar a picos

com valores de GU mais baixo (estruturas que não mais apresentam ácido siálico). A digestão

combinada de Sialidase com Fucosidase (Figura 4.22 C) revelou um padrão de picos muito similar

àquele obtido após digestão somente com a Sialidase, indicando a ausência deste resíduo nas estruturas

isoladas de N-glicanos presentes em Folligon. A terceira combinação de enzimas (Sialidase +

Fucosidase + Galactosidase) mostrada na Figura 4.22 D mostrou um novo decréscimo nos valores de

GU dos picos obtidos, indicando a presença de resíduos de galactosidase nas estruturas (N-glicanos)

analisados. A digestão final (Figura 4.22 E), realizada com todas as enzimas utilizadas acima, com

adição da enzima Hexosaminidase, visou reduzir as antenas de N-glicanos obtidas para Folligon à

estrutura M3 (Manose 3), porém outros picos foram visualizados além do pico referente a M3,

indicando a presença de estruturas que não foram suceptíveis à digestão total com as combinações

enzimáticas utilizadas.

4. 8.2. Análise de N-glicosilação de reCGββββαααα produzido por células 293T e por

células CHO-DG44Para obter o padrão de N-glicosilação presente nas amostras de

reCGβα produzidas por células 293T ou CHO-DG44 na ausência de soro FBS, utilizamos

bandas de geis de poliacrilamida na faixa de 55kDa referentes à purificação desta proteína na

coluna HiTrapTM Mono Q, que foram imunorreativas no Western blot. Estas bandas foram

processadas e digeridas com PNGase F de modo a liberar os N-glicanos presentes nesta amostra.

Estes N-glicanos foram marcados com 2-AB e submetidos à cromatografia de fase normal

utilizando coluna de amida, como descrito acima para o eCG comercial Folligon. As tabelas

resultantes da cromatografia podem ser visualizados na Figura 4.23 abaixo, onde é possível

comparar os picos obtidos para as células 293T e CHO-DG44:

Figura 4.23: Análise de N-glicosilação do reCGββββαααα produzido por células 293T ou CHO-DG44. Estas tabelas mostram os tempos de retenção de cada pico observado, a área ocupada por cada pico, a % da área ocupada por cada pico em relação à área total de todas as amostras de N-glicaos e, por fim, o valor, em GUs (Unidades de Glicose) obtido para cada amostra após comparação (regressão polinomial de cinco parâmetros) com a curva de calibração (Padrão de glicanos – GUs – dado não mostrado). O Painel à esquerda contém N-glicanos obtidos das células 293T, enquanto que o Painel à direita mostra os N-glicanos obtidos para células CHO-DG44.

A Figura 4.23 mostra os dados obtidos após a eluição das amostras de interesse marcadas com

2-AB. As tabelas geradas pelo software Empower GPC HPLC (Waters) detalham os dados obtidos do

cromatograma, como: tempo de retenção de cada N-glicano contido na amostra (picos), área ocupada

(indicativo de abundância daquela estrutura encontrada) e % da área do pico em relação à área total.

Este Software ainda calcula o valor de Unidades de Glicose (GU) obtido para cada N-glicano (pico),

baseado em uma regressão linear utilizando os dados da curva de calibração (dextran ladder). Abaixo,

na Figura 4.24, encontram-se os cromatogramas obtidos para N-glicanos marcados com 2-AB que

foram extraídos de reCGβα produzido pelas células 293T (Painel A) ou CHO-DG44 (Painel B):

Figura 4.24: Perfil de N-glicosilação obtido de reCGββββαααα produzida por células 293T ou CHO-DG44. No Painel

A exibe-se o perfil de N-glicanos extraídos de reCGβα produzido pelas células 293T e no Painel B encontra-se o

perfil obtido para reCGβα produzido pelas células CHO-DG44. Nestes gráficos, o eixo das ordenadas corresponde às unidades de absorbância da fluorescência (EU) emitidas por cada amostra marcada com 2-AB enquanto o eixo das abscissas corresponde ao tempo (minutos) de eluição das amostras.

Após substituir os valores de retenção por valores de GU para os principais picos, os gráficos

foram refeitos, como pode ser observado na Figura 4.25 abaixo:

Figura 4.25: Principais picos de N-glicanos marcados com 2-AB obtidos para ββββαααα produzido por células 293T ou CHO-

DG44, e seus respectivos valores em unidades de glicose(GU). No painel A é possível indentificar os principais picos

obtidos para reCGβα produzido por células 293T, com seus respectivos valores de GU, enquanto que no painel B encontram-

se os picos obtidos para reCGβα produzido por células CHO-DG44, com seus respectivos GUs. Ordenadas: absorbância obtida

para cada pico, indicando abundância de cada estrutura identificada. Abscissas: Valores de unidades de glicose (GU values)

obtidos ao longo da eluição.

Os picos obtidos indicam glicoformas putativas presentes nas preparações de interesse. É

possível observar que a intensidade (EU) dos picos principais localizados nas regiões de GU mais altas

(>7 GUs) é relativamente mais baixa, quando comparado com Folligon, indicando a presença de

menor massa de glicanos altamente complexos extraídos das amostras de interesse. No entanto, nota-se

uma grande variedade de glicoformas complexas presentes para ambas as condições de interesse

(reCGβα expresso por células 293T ou CHODG-44), correspondentes a estruturas bi-antenárias de N-

glicanos do tipo complexo, galactosilado e com a presença de um ou mais resíduos de ácido siálico.

Comparando-se os picos obtidos para N-glicanos de reCGβα expresso por células 293T com

aqueles obtidos para o reCGβα expresso por células CHO-DG44, é possível notar que, no primeiro

caso, os N-glicanos concentram-se principalmente nas regiões acima de oito unidades de glicose,

enquanto que para o segundo caso, a distribuição dos N-glicanos concentra-se nas regiões equivalentes

a seis e 10 unidades de glicose. As estruturas putativas correspondentes a cada pico são sugeridas no

item Discussão deste trabalho.

5 Discussão

As preparações de eCG atualmente disponíveis no mercado são produzidas através da

purificação desta molécula a partir do sangue de éguas gestantes, as quais são criadas em outros países.

Assim, diversos fatores atuam conjuntamente como barreiras na expansão das técnicas reprodutivas

mencionadas acima. Dentre estes fatores, o custo com a importação e a disponibilidade da matéria

prima, questões éticas importantes relacionadas ao bem-estar animal, a variabilidade entre lotes e a

presença de contaminantes nas partidas purificadas são alguns dos principais pontos que levam à

necessidade urgente de uma preparação alternativa de eCG, como o eCG recombinante desenvolvido

neste trabalho.

Como o eCG é uma molécula complexa, apresentando em torno de 45% de sua massa

molecular consistindo de modificações pós-traducionais (glicosilação), faz-se necessário o uso de um

sistema de expressão robusto que permita a produção de um eCG recombinante o mais similar possível

em comparação com o selvagem. O sistema de expressão heterólogo em células de mamíferos foi

escolhido para a produção de reCG por permitir o processamento correto de cadeias polipeptídicas

recém-sintetizadas, o dobramento e a montagem de suas subunidades α e β, além da adição de cadeias

glicosiladas do tipo complexo, o que é fundamental para que o eCG recombinante produzido tenha

atividade biológica. No entanto, existe muita variabilidade nos padrões de glicosilação entre diferentes

células de mamíferos devido ao fato da maquinaria enzimática de adição de oligossacarídeos às

proteínas diferir entre as linhagens celulares, gerando glicoformas com diferentes graus e tipos de

glicosilação e atividades biológicas distintas. Um dos sistemas de expressão mais aceitos pelas

indústrias farmacêuticas é a linhagem celular CHO (Chinese Hamster Ovary), que possui uma variada

gama de glicosiltransferases, as quais são capazes de adicionar N-glicanos do tipo complexo. No

entanto, esta linhagem celular é deficiente em adicionar sialilações do tipo α2,6, que tem papel

importante na atividade biológica da proteína em questão. Comparativamente, a linhagem celular HEK

(Human Embryonic Kidney), da qual foi derivada a linhagem 293T, é capaz de produzir glicoproteínas

carreando oligossacarídeos complexos contendo resíduos de ácido siálico nesta conformação, sendo,

portanto, um modelo de estudo interessante. Sendo assim, o presente trabalho apresenta dados inéditos

de um estudo comparativo no qual correlaciou-se o perfil de glicosilação destas duas linhagens

celulares com a atividade biológica desempenhada pela gonadotrofina coriônica equina expressa pelas

mesmas.

5.1 Obtenção do inserto reCGββββαααα

A gonadotrofina coriônica equina é um dímero hormonal de estrutura complexa, com

aproximadamente 45% de sua massa molecular composta por cadeias glicosiladas, sendo considerada

o mais complexo de todos os hormônios glicoprotéicos (Gospodarowicz, 1972; Legardinier et al.

2005). O estabelecimento de pontes dissulfeto na aquisição da estrutura quaternária global relaciona-se

com a eficiência de glicosilação (Moriwaki et al., 1997) permitindo a formação de um dímero αXβ

com uma estrutura estável que proporciona sua secreção eficiente (Furuhashi et al., 1996; Moriwaki et

al., 1997). Alguns autores escolheram expressar gonadotrofinas como moléculas de cadeia única,

alegando que alguns hormônios (FSH e LH) encontraram dificuldades na dimerização quando

expressos em sistemas heterólogos (Corless et al.¸1987; Matzuk et al., 1988; Keene et al.¸1989;

Jablonka-Sheriff et al., 2007). Seguindo esta linha, Legardinier e colaboradores demonstraram a

expressão de um heterodimero de eCG ativo biologicamente in vitro (Legardinier et al. 2008). Estes

autores observaram que os níveis de reCGβα secretados, bem como sua atividade biológica, eram

inferiores ao eCG heterodimérico selvagem, porém o sistema escolhido para a expressão das cadeias

fusionadas de eCG foi a infecção de células de inseto SF9 com baculovírus recombinantes, mesmo

sabendo-se que estas células adicionam cadeias de N-glicanos muito diferentes daquelas encontradas

no eCG selvagem. Estes dados, no entanto, estão em desacordo com o observado por outros autores,

que demonstraram que cadeias fusionadas de gonadotrofinas humanas foram expressas em níveis

semelhantes a heterodímeros e apresentaram, ainda, maior atividade biológica tanto n vitro quanto in

vivo (Furuhashi et al. 1995; Narayan et al. 1995; Sugahara et al. 1995; Sugahara et al. 1996).

Considerando o sucesso obtido por estes autores em expressar altos níveis de gonadotrofinas

fusionadas em células de mamífero, com atividade biológica, e considerando que Legardinier e

colaboradores observaram atividade biológica in vitro na cadeia fusionada de reCG (um forte

indicativo de dobramento correto), escolhemos a estratégia de gerar uma construção gênica na qual as

duas cadeias de eCG se encontram fusionadas.

Para tanto, as sequências codificadoras das cadeias α e β foram clonadas a partir de cDNA de

hipófise equina, visto que tanto a sequência codificadora da cadeia α, comum à todas as

gonadotrofinas, quanto a sequência para a cadeia β de LH/CG são expressas neste órgão (Sherman

1992). Os primers utilizados na amplificação das sequências codificadoras para ambas as cadeias de

eCG por RT-PCR foram desenhados com base nas sequências depositadas na base de dados de

nucleotídeos do NCBI. Os amplicons de eCGβα gerados, conforme descrito na seção de Resultados,

foram subclonados no vetor plasmideal de expressão pNUØ, construído por nosso grupo para

expressão de produtos gênicos em células de mamíferos, através do sistema de complementação gênica

por DHFR, que funciona da seguinte maneira: células deficientes na produção da enzima DHFR, como

as células CHO-DG44 dhfr-/-, não conseguem sobreviver quando cultivadas na ausência de

nucleosídeos, visto que esta enzima catalisa a redução de ácido fólico a diidrofolato e, em níveis mais

significativos, de diidrofolato a tetraidrofolato. Estes subprodutos, vitais para as células, participam de

diferentes vias biossintéticas, incluindo a síntese de purinas (Cario et al., 2011). Assim, quando estas

células são transfectadas com construções obtidas a partir do vetor pNUØ, que possui a sequência

gênica correspondente à enzima DHFR, podendo, assim, crescer na ausência de nucleosídeos. Como o

cassete de expressão de DHFR e o MCS do vetor estão sob o controle transcricional do mesmo

promotor, o produto de interesse clonado no MCS deste vetor é expresso na mesma proporção quando

comparado com o dhfr. A amplificação gênica deste vetor pode ser obtida ao se tratar as células CHO-

DG44 com concentrações crescentes do inibidor químico da enzima (MTX, ou metotrexato), o que

potencializa a seleção de células com maior produção de DHFR e, consequentemente, do gene de

interesse (Lucas et al., 1996). Apesar deste vetor ser desenhado para altos níveis de expressão em

células deficientes em dhfr, ele pode ser utilizado, também, em outras linhagens celulares. Porém,

neste caso, outras estratégias de seleção, que não a complementação gênica, devem ser exploradas.

A estratégia de cotransfecção com um vetor de resistência ao antibiótico higromicina B foi

adotada para obter transfectantes de ambas as linhagens celulares escolhidas (293T e CHO-DG44). O

plasmídeo pX343 (que possui o cassete de resistência hygror) foi cotransfectado numa proporção de

1:40, ou seja, um número 40 vezes maior da construção pNUØ-eCGβα, visando à inserção de um alto

número de cópias do plasmídeo de interesse no genoma celular. Esta estratégia, adotada por nosso

grupo há 30 anos (Armelin et al., 1984), parte do pressuposto que, se a célula sobrevive ao tratamento

com higromicina, ela deve ter integrado pelo menos uma cópia do plasmídeo de resistência (no caso, o

pX343), portanto, deve possuir um número de cópias muito maior do plasmídeo de interesse (pNU)-

eCGβα. Esta estratégia foi adotada em diversos projetos biotecnológicos do nosso grupo (Bustos-

Valenzuela JC et al. 2011; Belchior et al., in prep.; Carreira et al.in prep; Coelho TM et al. in prep.),

tendo se mostrado bastante eficiente para diversas proteínas. Esta estratégia permitiu isolar clones

celulares de 293T resistentes à higromicina B e uma população de células CHO-DG44 resistente a este

antibiótico, a qual foi, então, submetida à dupla seleção através de diversas etapas de amplificação

gênica sob ação di quimioterápico MTX, gerando diversas subpopulações celulares.

5.2 Expressão de reCGββββαααα

O sistema de expressão escolhido para este trabalho foi o de células de mamíferos, devido à

alta complexidade estrutural das glicosilações presentes na proteína eCG, que interferem diretamente

na meia-vida circulatória e atividade biológica de eCG (Min et al., 2004; Legardinier et al., 2008).

Células de mamífero são capazes de processar corretamente e adicionar modificações pós-traducionais,

tais como glicosilação, as quais são essenciais para o correto dobramento, estabilidade e atividade

biológica das proteínas (Strickland e Pierce, 1983; Thomason et al., 1985; Beebe et al., 1990; Huth et

al., 1993; Feng et al., 1995; Devashayam, 2007). No entanto, grande variabilidade no perfil de

glicosilação adicionado é encontrada entre as diferentes espécies e tecidos das quais as linhagens de

mamífero advêm, o que se deve ao perfil diferenciado de glicosiltransferases ativas em cada linhagem

celular (Paulson et al.¸1989; Devashayam, 2007).

A escolha da linhagem celular é uma importante decisão quando se decide expressar um

biofármaco, pois pode definir se a proteína expressa apresentará (ou não) atividade biológica e

estabilidade (Jianwei Z 2012; Walsh G 2006). Um dos sistemas de expressão mais populares e mais

utilizados para a expressão de biofármacos é a célula de ovário de hamster chinês CHO (Kildegaard et

al., 2013), as quais contêm um vasto repertório de enzimas da via de glicosilação, permitindo a adição

de uma grande variedade de glicanos do tipo complexo, di ou tri-antenados (Davidson e Castellino,

1991; Hossler et al. 2009) Apesar de não adicionarem sialilações do tipo α2,6, presentes em eCG

(Paulson et al., 1989; Devasahayam, 2007), células CHO foram utilizadas por diversos grupos para

produzir esta e outras gonadotrofinas com atividade biológica (Min et al. 1996; keene et al., 1989;

Garcia-Campayo et al., 2004; Fares et al., 2007; Jablonka-Shariff et al., 2007; Takur et al., 2009; Kim

et al., 2010). Comparativamente, selecionamos a linhagem humana 293T de rim embrionário,

modificada com o antígeno Large T de SV40, para a expressão de reCGβα. Células HEK293 são

sabidamente um sistema robusto para expressão de glicoproteínas (Henry e Durocher 2011), sendo

capazes de produzir glicoproteínas contendo oligossacarídeos do tipo complexos, biantenários e

sialilados (Chitlaru et al., 1998). Huang e colaboradores descreveram que células HEK293T

transformadas com o antígeno Large T de SV40 apresentaram um aumento de sete vezes nos níveis de

expressão do receptor de glutamato GluR2 (Huang et al., 2005), em relação à linhagem parental

HEK293. Estes trabalhos reforçam a hipótese de que as células 293T escolhidas para o presente

trabalho são boas candidatas para a expressão de altos níveis da glicoproteína de interesse, mantendo

sua atividade biológica e um padrão glicosilação similar à proteína selvagem. Além disso, até o

presente momento, não existe relato na literatura de produção de eCG em células 293T, sendo os

resultados aqui obtidos inéditos.

Os clones superprodutores obtidos de 293T e as populações resistentes à doses crescentes do

quimioterápico MTX, obtidas a partir de células CHO-DG44, foram testados quanto aos seus níveis de

expressão de reCGβα por um ELISA específico para eCG. Para os clones celulares de 293T,

obtivemos valores de reCGβα expressos no meio de cultura variando entre 3,5 e 12UIs/mL, enquanto

para células CHO-DG44, os níveis de reCGβα expressos no meio de cultura aumentavam

proporcionalmente a cada etapa de tratamento com doses crescentes de MTX. Para populações tratadas

com até 500nM de MTX, a expressão de eCGβα encontrada estava no mesmo nível de grandeza

daquela observada para as células 293T. A expressão desta proteína elevou-se para ao redor de

40UIs/mL quando a dose de MTX subiu para 2.500nM. No entanto, vale a pena ressaltar que, após 10

passagens da remoção da pressão seletiva, a expressão de reCGβα caiu em aproximadamente 50%. A

literatura descreve, em diferentes sistemas, os níveis de expressão de reCG βα. Min e colaboradores

obtiveram aproximadamente 2µg/mL (equivalentes a 2UI/mL) de reCG selvagem e 1µg/mL

(equivalente a 1UI/mL) de reCGβα expressos em células CHO-K1 (Min et al., 2004). Legardinier e

colegas expressaram eCGβα em células COS-7, obtendo 0,094ng eCGβα/mL (94mUI/mL), e em

células de inseto SF9 e MimicTM , obtendo 4,1 e 5,3µg eCGβα/mL, respectivamente. Galet e colegas,

por sua vez, expressaram eCGβα em leite de coelhas transgênicas, obtendo 21,4µg eCGβα/mL. Estes

dados, gerados por outros pesquisadores, mostram que os nossos níveis de expressão, tanto para 293T

quanto para CHO-DG44, foram muito maiores do que aqueles obtidos para sistemas de expressão

similares (CHO-K1 e COS-7), se mostrando resultados maiores ou iguais àqueles obtidos em células

de inseto e, para as populações de células CHO-DG44 superexpressoras de reCGβα geradas neste

trabalho, os níveis de expressão desta proteína foi comparável àqueles obtidos para animais

transgênicos. Ainda, Crosset e colaboradores demonstraram que o nível de expressão de proteínas

recombinantes nestas duas linhagens celulares estudadas foi de 1,5 a 23µg/mL para células HEK

(precursora de 293T) e de 1,4 a 11 para CHO (precursora de CHO-DG44) (Crosset et al. 2012). Em

conjunto, esses dados enfatizam a eficiência do conjunto de técnicas aqui utilizadas (vetor de

expressão, estratégia de cotransfecção e amplificação gênica) na expressão de altos níveis de reCGβα

no meio de cultura condicionado pelas células superprodutoras geradas.

Dinâmicas de expressão de reCGβα expresso em meio de cultura condicionado na presença

ou na ausência de soro fetal bovino, após 24, 48 e 72h, mostraram que períodos mais longos

permitiram, de fato, maior acúmulo das proteínas secretadas para o meio de cultura. Os resultados

obtidos para células 293T mostram que a condição de ausência de soro fetal bovino (FBS) apresentou

melhores resultados, em termos de níveis de expressão, quando comparado com a produção da

proteína na presença de soro. Isso pode ser explicado por algumas hipóteses, como: a presença de

proteases no soro fetal bovino ou a agregação de reCG, que é uma proteína plasmática, a proteínas

presentes no soro, tais como a albumina. No entanto, para as células CHO-DG44, os resultados foram

invertidos, ou seja, a depleção de soro na cultura diminuiu o ritmo de secreção de eCGβα. De fato,

células superprodutoras de biofármacos encontram no cultivo em meio sem soro uma barreira

importante para maior produtividade (Rodrigues et al., 2013). Por outro lado, a falta de soro pode

acarretar perda ou diminuição da estabilidade da proteína.

O fato das células transfectantes manterem a capacidade de expressão da proteínas

reCGβα na ausência de soro merece destaque. Apesar de extensamente utilizado na manutenção

de células de mamíferos, o soro bovino passou a ser evitado na área de produção de biofármacos

devido ao perigo de contaminação dos produtos recombinantes com vírus e príons de origem

bovina. Hidrolisados peptídicos de plantas e microorganismos, utilizados amplamente na

indústria alimentícia, constituem, atualmente, fontes valiosas de componentes não animais para

promover o crescimento de células de mamíferos em cultura. Meios quimicamente definidos são

ainda mais interessantes por terem uma composição pré-determinada conhecida permitindo não

só evitar as possíveis contaminações, como, também, um maior controle da formulação do meio

de cultura, diminuindo a possível variação entre lotes (Butler & Meneses-Acosta, 2012), o que

pode comprometer a produção das proteínas em larga escala. Estes dados são indicativos de que

reCGβα poderia ser expresso em níveis semelhantes caso as células fossem cultivadas em meio

definido na ausência total de soro fetal bovino.

5.2 Atividade Biológica de reCGββββαααα In Vitro

Ensaios de atividade biológica in vitro são ferramentas potentes utilizadas para avaliar a

atividade biológica de proteínas de interesse, evitando o uso direto de animais de experimentação para

obter estas informações. No caso do eCG, por se tratar de um ensaio de estímulo-resposta envolvendo

receptores específicos, esta ferramenta é indicativa de algumas características da proteína

recombinante ensaiada, como seu dobramento correto e grau de estabilidade. Para avaliar a atividade

biológica in vitro do reCGβα, utilizamos a linhagem celular MLTC-1 (ATCC CRL-2061), obtida de

células de Leydig de camundongos, que superexpressa receptores de gonadotrofinas (hCG e hFSH)

que responde de maneira dose-dependente ao estímulo com eCG, produzindo e secretando

progesterona para o meio de cultura. Os resultados observados indicaram não haver diferenças

estatísticas na resposta a uma mesma dose de reCG advinda de diferentes preparações (CHODG-44 ou

293T, FCS ou SFM) e a uma mesma dose de Folligon. No entanto, ao observar-se cautelosamente os

gráficos, é possível notar uma tendência a uma resposta menos robusta nas condições de meio sem

soro (SFM), quando comparadas às mesmas doses na presença de soro. Este resultado é muito

positivo, pois indica que o reCGβα produzido por nossas células transfectantes possui atividade

biológica in vitro similar ao produto comercialmente disponível, Folligon, mesmo quando produzida

na ausência de soro fetal bovino. Legardinier e colaboradores (Legardinier et al., 2005) utilizaram o

mesmo ensaio para determinar a atividade biológica in vitro desempenhada por reCG heterodimérico e

por reCGβα produzido em células de inseto. Este autor verificou que, no caso do reCG heterodímero,

a resposta de produção de progesterona foi ligeiramente menor, quando comparada ao eCG selvagem,

enquanto que para a proteína fusionada (reCGβα), a resposta foi 50% menor. No entanto, estes

pesquisadores adotaram a estratégia de expressão em células de inseto, que adicionam N-glicanos

aberrantes à esta proteína, o que interferiu na estabilidade e na habilidade de reconhecimento do

receptor da proteína eCG. Min e colegas (Min et al., 2004) utilizaram culturas primárias de células da

granulosa para ensaiar a atividade biológica de FSH das proteínas reCGβα e reCG heterodimérico, e

culturas primárias de células de Leydig para ensaiar a atividade biológica de LH destas mesmas

proteínas recombinantes. Estes pesquisadores verificaram que a molécula fusionada apresentou

atividade biológica ligeiramente menor do que a molécula heterodimérica, para ambos os ensaios.

Os resultados obtidos por nosso grupo,discutidos até aqui, apresentam fortes indícios de que a

estratégia de expressão de uma molécula de eCG fusionada, adotada aqui, foi adequada nos quesitos

nível de expressão, dobramento e atividade biológica in vitro.

5.3 Atividade Biológica de reCGββββαααα In Vivo

A atividade biológica in vivo desempenhada por reCG βα secretado para o meio de cultura

das células superprodutoras foi investigada através do ensaio de gonadotrofinas de Cole & Erway

(Cole e Erway, 1941), recomendado pela Farmacopéia Britânica para gonadotrofinas, que permite a

determinação da atividade biológica de preparações contendo eCG (eCG comercial ou reCGβα)

através do estímulo da função ovariana e uterina em ratas pré-púberes, a qual se traduz em aumento do

peso destes órgãos após o estímulo hormonal.

Os resultados obtidos para a resposta ovariana evidenciaram pouca diferença entre os

tratamentos realizados com reCGβα, quando comparados com os controles negativos, em termos

de aumento no peso ovariano, apesar da curva dose-resposta do reCGβα produzido por células

CHO-DG44 ter apresentado tendência de aumento, o que não pode ser observado para as células

293T. Este dado é observado novamente na análise de regressão linear destes dados, que mostra

tendência de resposta positiva para o reCGβα neste órgão. No entanto, a figura 4.10, que permite

uma análise qualitativa da resposta aos tratamentos, evidencia a resposta ovariana ao hormônio

produzido pela célula CHO-DG44, notado pela presença de folículos ovarianos e vascularização

nestes órgãos, quando tratados com as maiores doses de reCGβα presentes na curva (20 e 40UI),

o que é corroborado por dados publicados por Witt e colaboradores, que relatam um aumento no

fluxo sanguíneo ovariano e uterino relacionado com a eficácia da resposta ao tratamento

estimulatório (Witt et al. 2012).

Recentemente, Lecompte e colaboradores publicaram um trabalho no qual demonstram

que a resposta uterina à eCG é indireta, atuando através do eixo hipotálamo-pituitário-gonadal,

num mecanismo que envolve um aumento no número de receptores de FSH presentes neste

órgão e a secreção de FSH pela hipófise. Esta resposta indireta ocorre em concentrações menores

de eCG do que a resposta ovariana (resposta direta do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal). A

resposta uterina observada quando do tratamento com reCGβα produzido por células CHO-

DG44 foi, de fato, bastante similar àquela observada para Folligon. Os dados de regressão linear

demonstram uma resposta mais consistente de reCGβα produzida pelas células CHO-DG44 em

comparação com o Folligon. Para o reCGβα produzido pelas células 293T, os resultados

indicam, novamente, baixa atividade desta preparação. No mesmo trabalho, Lecompte e

colaboradores correlacionaram tratamentos com hCG à uma alta resposta uterotrópica exibida

por este hormônio, a qual se apresentou mais discreta nos tratamentos com eCG. Os autores

concluem que o ensaio uterotrópico realizado em ratas sexualmente imaturas é um ensaio

sensível e conveniente para gonadotrofinas coriônicas humana e equina (Lecompte et al. 2010).

No entanto, ao analisar os dados da resposta uterotrópica obtida, em conjunto com os dados de

resposta ovariotrópica, observa-se que reCGβα possui menor potência do que o eCG

heterodimerico selvagem.

Vale ressaltar que este é o primeiro relato de um eCG recombinante com atividade

biológica comprovada in vivo, visto que os trabalhos de outros autores nos quais reCG é expresso

em sistema de células de mamífero (Min et al., 2004 e Choppineau et al. 2000), não mostram

avaliam a atividade hormonal in vivo, e os trabalhos nos quais eCG é expresso em outros

sistemas, tais como células de inseto (Legardinier et al. 2005), e em leite de coelhas transgênicas

(Galet et al., 2001), este hormônio não apresentou atividade biológica in vivo, mas somente in

vitro.

5.4 Purificação Parcial de reCGββββαααα por cromatografia líquida de alta

performance (HPLC)

A característica de baixo PI do eCG (em torno de 1,8) já foi explorada por outros autores em

processos de purificação desta proteína a partir do sangue de éguas prenhes, que utilizaram a

cromatografia de troca iônica como estratégia de purificação desta proteína (Moore e Ward, 1980;

González et al., 1997). A coluna HiTrapTM Capto Q (GE Healthcare), que possui o trocador aniônico

amônia quaternária, foi utilizada nos procedimentos de purificação de reCGβα a partir de meio de

cultura condicionado, na ausência de soro fetal bovino, de células CHO-DG44 e 293T

superprodutoras. Foi necessário diluir o meio de cultura condicionado dez vezes com tampão de

equilíbrio A (NaAc 100mM pH 4.5) de modo a diminuir a concentração de NaCl presente no meio de

cultura (a concentração de NaCl em meios de cultura como o DMEM e α-MEM é em torno de 110mM

de NaCl) e, desta forma, otimizar a ligação de reCGβα à coluna de troca iônica. Esta estratégia foi

adotada pois González e colaboradores observaram que, devido ao fato de poucas proteínas

apresentaram carga negativa em pH ácido, ocorre uma ligação preferencial de proteínas com PIs

baixos. No entanto, existe um limite para a seleção de pH, sendo eCG se mantém estável e

biologicamente ativa no intervalo de pH entre 4,0 e 8,0 (González et al., 1997). González e

colaboradores obtiveram maior atividade específica de eCG eluída com concentrações de NaCl entre

60 e 80mM. Nós adotamos esta estratégia, porém sem sucesso (dado não mostrado). Uma curva

utilizando concentrações de NaCl de 0 a 100mM foi realizada, verificando-se, por ELISA específico,

que a maior parte de reCGβα foi eluída entre 10 e 40mM de NaCl (dado não mostrado). Sendo assim,

três gradientes de eluição contendo quantidades crescentes de tampão B foram adotados, sendo o

primeiro de 0 a 11mM NaCl, objetivando eluir proteínas contaminantes, e segundo de 11 a 19mM

NaCl e o terceiro de 19 a 40mM NaCl, objetivando enriquecer o eluato em reCGβα. Um gradiente

final de 40 a 1.000mM NaCl foi adotado para limpeza da coluna. Uma recuperação de

aproximadamente 48% de reCGβα foi alcançada entre as concentrações de 11 a 40mM de NaCl.

González e colaboradores conseguiram recuperação de 90%, porém o material de partida utilizado por

este grupo era plasma equino e as condições cromatográficas utilizadas foram diferentes (adsorção de

eCG selvagem em bateladas contendo a resina). Moore e Ward apresentaram resultados de purificação

de eCG utilizando a coluna Mono-Q como estratégia de captura eficiente, seguida de uma

cromatografia de refinamento com Hidroxiapatita (Moore e Ward, 1980).

Os perfis cromatográficos obtidos para a purificação de reCGβα proveninente de meio de

cultura condicionado de células 293T ou de células CHO-DG44 e para a cromatografia realizada para

o controle negativo foram muito semelhantes, não sendo possível identificar o pico referente a eCG

nos cromatogramas obtidos. Análises de SDS-PAGE comparando as frações eluídas contendo reCGβα

e as frações eluídas nas mesmas condições utilisadas para o controle negativo não mostraram

diferenças no perfil de bandas observado, provavelmente porque reCGβα estava pouco abundante na

massa de proteína total eluída. No entanto, ensaios de Western blot revelam a presença de uma banda

de aproximadamente 55 kDa, eluída nas condições de interesse, a qual não apareceu no controle

negativo. Esta banda possui um tamanho ligeiramente inferior ao esperado para eCG, quando

comparada com o produto comercial Folligon (60 kDa). O meio condicionado não-purificado

apresentou um smear imunoreativo de 45 a 60 kDa, indicando que o processo de purificação parcial de

reCGβα, desenvolvido na coluna HiTrapTM Capto Q, selecionou uma glicoforma dentre aquelas

presentes no meio de cultura original.

Diversos grupos expressaram eCG na forma recombinante adicionando Tags de Histidina de

forma a possibilitar a cromatografia de afinidade para a sua purificação (Matsui et al., 1994;

Legardinier et al. 2008). Estes grupos obtiveram preparações puras e altamente concentradas de reCG,

o que facilitou as análises posteriores realizadas com esta proteína através de MS, SDS-PAGE e perfil

de glicosilação. O intuito de nosso grupo, no entanto, era expressar esta proteína na forma

recombinante sem a presença de Tags, visto que estes podem alterar a estrutura e a atividade biológica

da proteína em questão. No entanto, apesar de gerar dados novos de purificação de eCG recombinante,

a a purificação de reCGβα por esta metodologia se apresentou muito mais desafiadora, uma vez que,

apesar da obtenção de resultados razoáveis em termos de rendimento, ainda se detecta a presença de

muitas proteínas ínespecíficas nas análises de SDS-PAGE realizadas, destacando-se uma proteína

contaminante majoritária de 60kDa, portanto, a purificação obtida para reCGβα utilizando esta

metodologia foi considerada parcial.

Alternativamente, no presente trabalho, explorou-se a estrutura altamente glicosilada de eCG

para purificar esta molécula, utilizando-se cromatografia de afinidade por lectina. A coluna coluna

HiTrapTM Con A (GE Healthcare), que possui a lectina Concanavalina A, foi utilizada nos

procedimentos de purificação de reCGβα a partir de meio de cultura condicionado, na ausência de soro

fetal bovino, de células CHO-DG44 e 293T superprodutoras. Esta coluna foi selecionada por

apresentar afinidade a eCG (Murphy e Martinuck, 1991) e a hCG (Manjunath e Sairam, 1982). Foi

necessário ajustar a concentração de NaCl, MgCl2 e CaCl2 no meio de cultura condicionado para

otimizar a ligação de reCGβα à coluna de afinidade. A estratégia de eluição escolhida foi baseada na

tese de doutorado do Dr. Luis Augusto Ferreira Rossa (2009), na qual duas estratégias de

cromatografia de afinidade foram utilizadas em sequência (Blue-Sepharose seguida de Concanavalina

A), obtendo rendimento de aproximadamente 70% no processo.

Os resultados obtidos demonstram que a recuperação de reCGβα eluída por esta coluna foi

ligeiramente inferior (40% vs 50%) àquela obtida pela coluna HiTrap, para ambas as condições

ensaiadas (293T e CHO-DG44). No entanto, o reCGβα foi eluído da coluna ao longo de quase a

totalidade do gradiente de eluição com o competidor metil-α-D-glucopiranosídeo (20 a 200mM), o que

evidenciou a formação de um pico achatado de reCGβα. Ainda, observando o gráfico da eluição, é

possível inferir que poucas proteínas ligaram-se à coluna devido ao discreto aumento na absorbância

observada na etapa de eluição e à alta quantidade de proteínas saindo no permeado.

Quando as frações eluídas foram comparadas ao meio de cultura original, ao permeado e ao

controle negativo por meio de um gel de SDS-PAGE, notou-se a presença de um bandas

contaminantesna fração eluída, e uma ligeira diminuição na intensidade da proteína contaminante

majoritária, de 60 kDa. No entanto, assim como ocorreu para o reCGβα purificado por HiTrapTM

Capto Q, não foi possível observar a banda referente a reCGβα em meio às demais proteínas presentes

no fracionamento. No entanto, proteínas do tamanho de 55 kDa mostraram-se imunoreativas no

experimento de Western blot, evidenciando que foi possível enriquecer as frações eluídas na proteína

de inteeresse, obtendo-se uma purificação parcial.

As frações que apresentaram atividade por ELISA neste último experimento de purificação

por cromatografia de afinidade por concanavalina A foram concentradas utilizando-se filtros Centricon

com corte de 10 kDa e utilizadas em um ensaio de atividade biológica in vivo em ratas pré-púberes,

conforme descrito em Material e Métodos. Interessantemente, o reCGβα parcialmente purificado

obtido do meio de cultura de células CHO-DG44 apresentou atividade uterogênica estatisticamente

semelhante ao eCG comercial Folligon, tendo sido possível notar a presença de vascularização e de

folículos ovarianos desenvovidos e repletos de líquido folicular, indicando que o processo de

purificação desenvolvido, mesmo que parcial, preservou as propriedades biológicas de reCGβα. Este

resultado é inédito na literatura, pois nenhum autor publicou, até o momento, uma estratégia de

purificação de reCG (por cromatografias que não envolvam a presença de tags de afinidade), mantendo

a atividade biológica da proteína in vivo.

5.5 Comparação dos perfis de glicosilação obtidos para reCGββββαααα e eCGs comerciais.

Num primeiro momento, foi realizada a extração e análise do perfil de N-glicanos presentes

no eCG selvagem comercialmente disponível (Folligon) e no padrão internacional de eCG

(NIBSC/WHO). A maioria das estruturas presentes apresentou valores de GU acima de 7, indicando a

presença de estruturas do tipo complexa e multiantenárias e, possivelmente, sialiladas para ambos os

eCGs analisados.

De acordo com a base de dados de glicanos Glycobase, os valores de GU obtidos nos

forneceram diversas opções de estruturas para cada pico. Após comparar com dados da literatura e

realizar diversas digestões enzimáticas, foi possível inferir estruturas putativas de N-glicanos para cada

pico obtido. O padrão internacional de eCG (NIBSC/WHO) apresentou picos muito baixos, assim

portanto, optou-se por analisar somente o perfil de Folligon, que apresentou resultados mais robustos.

A Figura 5.1 abaixo contém as estruturas putativas selecionadas para cada pico, após se comparar o

padrão da digestão realizada com exoglicosidades:

Figura 5.1: Estruturas de N-glicanos obtidas para o eCG comercial Folligon após digestão realizada com com

combinações de exoglicosidades. No eixo das abscissas encontram-se os valores relativos de unidades de glicose (GU)

obtidos para cada cromatografia, enquanto que no eixo das ordenadas encontram-se a intensidade dos picos eluídos (EU). É

possível identificar as estruturas de N-glicanos atribuídas a cada pico e acompanhar a progressiva diminuição dos valores

de GUs dos picos após serem realizadas digestões com conjuntos de enzimas progressivos. No painel A, encontram-se as

estruturas não digeridas., e nos painéis B, C e D encontram-se as estruturas obtidas após digestão com sialidase, sialidase +

galactosidade + fucosidase e sialidase + galactosidase + fucosidase + hexosaminidase, respectivamente.

A análise do padrão de estruturas digeridas com diferentes enzimas nos permite correlacionar

as estruturas presentes na amostra antes e após cada etapa da digestão. Partindo-se de estruturas

completas, já descritas na literatura para eCG, e proteínas da mesma família (hCG, eLH), é possível

traçar um paralelo entre a estrutura obtida na amostra não-digerida (uma cadeia com duas antenas

finalizada em ácido siálico, por exemplo) com a mesma estrutura após a digestão com sialidase (uma

cadeia com duas antenas finalizadas com galactose).

Após digestão total, a glicoestrutura mais abundante esperada para eCG é M3 (referente a 3

resíduos de Manose), a estrutura de base de N-glicanos após a digestão de todos os resíduos presentes

na antena (Matsui et al., 1994). Por alguma razão que ainda não foi identificada, nós obtivemos alguns

picos resultantes da digestão incompleta com as quatro enzimas (Figura 5, Painel D), sendo uma destas

estruturas consistente com uma estrutura A3 (três resíduos de GlucNAc, presentes no início de

estruturas tri-antenárias). Considerando que o mesmo conjunto de enzimas foi utilizado em

experimentos paralelos nos quais todas as estruturas convergiram para M3 após tratamento com esta

combinação de exoglicosidases, foi possível inferir que algum radical está bloqueando a ação de

alguma das enzimas utilizadas (provavelmente a hexoxaminidase). De fato, a literatura mostra que

muitas moléculas de eCG possuem N-glicanos contendo GalNac sulfatadas e uma ou mais repetições

de LacNAc (Bousfield et al., 2004), o que pode bloquear a ação de hexoxaminidase. Outro pico foi

observado no valor de GU de 7,465, porém uma estrutura não pode ser sugerida baseando-se somente

em digestões enzimáticas. Esta estrutura, no entanto, provavelmente é resultante de uma digestão

incompleta de um N-glicano de duas ou três antenas.

Considerando o conjunto de digestões enzimátics realizadas com as enzimas Sialidase +

Fucosidase + Galactosidase (Figura 5.1 Painel C), e o perfil obtido pela digestão do Painel D, foi

possível identificar estruturas biantenárias (A2) ou biantenárias com a presença de um GlucNAc

bissetriz, ligado diretamente ao primeiro resíduo de manose (A2B), o que está de acordo com os dados

encontrados na literatura. Matsui e colaboradores descreveram que 46,6% dos N-glicanos presentes em

eCG são bi-antenários (A2) e 14% são biantenários bissetrizes (A2B). Neste painel foi possível

identificar, ainda, a presença de resíduos de N-glicanos tri-antenários (A3) e tri-antenários bissetrizes

(A3B), os quais Matsui e colaboradores descreveram como sendo 13% dos N-glicanos de eCG. Alguns

autores (Damm et al, 1989; Karmeling et al, 1989; Smith et al, 1992; Legardinier et al, 2005 and

2008) descreveram os N-glicanos de eCG como sendo principalmente bi-antenários, porém não

mencionaram porcentagens.

Dados da literatura sugerem a presença de resíduos de fucose ligados à estrutura de base dos N-

glicanos de eCG. No entanto, diferentes autores discordam sobre a proporção de resíduos de fucose,

que foram estimados entre 5% e 90% (Damm et al, 1989; Matsui et al 1994; Bousfield et al, 2004).

Nossos dados sugerem que a porcentagem de resíduos de fucose em eCG selvagem é bastante

reduzida, pois não foram encontradas diferenças nos perfis de digestão realizados após digestão com

Sialidase + Fucosidase e Sialidase apenas.

Na digestão realizada com sialidase + fucosidase (Painel B da Figura 5.1) é possível identificar

um decréscimo no valor de GU dos picos observados nas amostras não-digeridas (Painel A),

demonstrando a presença de ácido siálico na maioria das antenas. Os valores de GU obtidos indicam

que boa parte dos N-glicanos presentes em Folligon são do tipo completo por apresentaram resíduos de

GalNAc em todas as antenas, sendo a maioria das estruturas bi-antenárias bissetrizes ou não (A2G2 e

A2BG2) e uma menor proporção de N-glicanos tri-antenários bi-galactosilados (A3G2) e tri-antenários

bissetrizes tri-galactosilados (A3BG3). A literatura mostra que a maioria dos N-glicanos de eCG são

bi-antenários e bi-galactosilados, podendo ser bissetrizes ou não. Os N-glicanos tri-antenários, por sua

vez, podem ser tanto bi- quanto tri-galactosilados (Matsui et al 1994; Bousfield et al, 2004). Foi

encontrada uma estrutura, com GU de 7,093, que corresponde ao tamanho de uma N-

acetyllactosamina, presente numa estrutura bi-antenária, o que foi extensivamente descrito na literatura

por outros autores, embora nenhum deles tenha atribuído uma porcentagem assertiva sobre a

quantidade destas estruturas encontradas em eCG (Bousfield et al, 2004; Legardinier et al, 2005).

O Painel A da Figura 5.1 mostra as estruturas encontradas para o eCG não-digerido.

Considerando as estruturas digeridas citadas acima, é possível inferir estruturas putativas completas de

N-glicanos presentes no eCG selvagem, e compará-las com aquelas encontradas nas amostras de eCG

recombinante. A maioria dos N-glicanos obtidos são bi-antenários, bissetrizes ou não, e mono ou bi-

sialilados, o que está de acordo com o descrito na literatura até o momento (Matsui et al 1994;

Bousfield et al, 2004; Legardinier et al, 2005, Legardinier Legardinier et al, 2008). Alguns picos

possuem valores de GU correspondentes à uma única antena (GU 7,424 e GU 8,074), o que está em

desacordo com os resultados da digestão, nos quais estruturas bi- e tri- antenárias foram as mais

abundantes. Porém, estes resultados não são absolutos, visto que estas estruturas putativas são aquelas

que se alinharam com as estruturas depositadas no banco de dados Glycobase, que não possui as

estruturas lactosamina (Lac) e N-acetillactosamina (LacNAc), bem como de N-glicanos sulfatados.

Estas três últimas estruturas foram descritas, em diferentes porcentagens, tanto em eCG quanto em

eLH (Damm et al 1989; Matsui et al 1994; Bousfield et al, 2004). Portanto, se faz necessário um

tratamento destas amostras com sulfatase e outras enzimas para remover os possíveis resíduos de

LacNaAc e Lac possivelmente presentes nestas amostras (Sialidase + Hexoxaminidase, por exemplo),

para confirmar a identidade destas estruturas.

O reCGβα expresso por células 293T ou CHO-DG44 foi parcialmente purificado por HiTrapTM

Capto Q e submetido à análises de glicosilação. Os resultados encontrados mostram perfis de N-

glicanos distintos encontrados nas frações enriquecidas para reCGβα expressos pelas duas linhagens

celulares. A Figura 5.2 abaixo contém as estruturas putativas para os principais picos encontrados na

análise:

Figura 5.2: Estruturas Putativas de N-glicanos obtidas em frações enriquecidas em reCGββββαααα. No eixo das abscissas

encontram-se os valores relativos de unidades de glicose (GU) obtidos para cada cromatografia, enquanto que no eixo das

ordenadas encontram-se a intensidade dos picos eluídos (EU). As setas indicam possíveis estruturas de N-glicanos

atribuídas a cada pico. A: perfil obtido para reCGβα expresso na linhagem 293T; B: perfil obtido para reCGβα expresso na

linhagem CHO-DG44.

A intensidade dos picos obtidos foi baixa em comparação com Folligon, muito provavelmente

devida à baixa massa de proteína parcialmente purificada imunorreativa submetida à digestão com

PNGase. No entanto, foi possível realizar uma análise preliminar através do Software Glicobase 3.2

versão 3.2, que indicou a presença de glicoestruturas bastante ricas para ambas as linhagens estudadas.

Muitas estruturas com valores de GU baixo (4 a 6) foram encontradas. Este fenômeno pode ser

atribuído à degradação dos N-glicanos. Algumas hipóteses foram levantadas, tais como: degradação

por glicosidases presentes no meio de cultura condicionado das células, degradação durante o processo

de purificação ou de processamento das bandas de SDS-PAGE para extração os N-glicanos. Novas

amostras estão em preparo para se obter maior massa de N-glicanos e com maior qualidade para uma

amostra definitiva. Não foi possível, devido à baixa quantidade de N-glicanos disponível, realizar as

digestões por exoglicosidases. Portanto, a análise das estruturas encontradasé é, putativa, sendo

necessários novos experimentos para confirmar as estruturas aqui encontradas.

Os valores de GU encontrado indicam a presença de diversas glicoformas do tipo complexas e

multiantenárias, contendo um a dois resíduos de ácido siálico para ambas as linhagens celulares

superprodutoras de reCGβα. Após se comparar com dados da literatura e com o resultado obtido aqui

para Folligon, foi possível inferir as estruturas putativas que serão discutidas a seguir.

As estruturas de N-glicanos encontradas para as células 293T apresentaram menor intensidade

de picos (equivalente a menor massa de cada estrutura) e maior variabilidade em comparação com as

estruturas encontradas para as células CHO-DG44. Para 293T, foram encontrados três picos

importantes de base A1:A1, que é provavelmente produto de degradação, A1G1 e A1G1S1, indicando

a presença de N-glicanos mono-antenários. Apenas três estruturas de base A2 (A2G1 e A2G2S1 e

F(6)A2G2S1) com áreas totais somando 3,11% foram identificadas, mostrando que os N-glicanos bi-

antenários são pouco representativos neste modelo. Este dado destoa dos N-glicanos bi-antenários

obtidos para Folligon (correspondentes à maioria das estruturas) e para eCG descritos na literatura

(Matsui et al 1994; Bousfield et al, 2004; Legardinier et al, 2005, Legardinier Legardinier et al, 2008)

podendo explicar a baixa atividade biológica encontrada para o reCGβα expresso por esta linhagem.

Diversas glicoformas tri- e tetra-antenárias sialiladas, com pelo menos duas antenas ocupadas por

ácidos siálicos foram encontradas, totalizando 12% do total e boa parte das estruturas mais complexas

obtidas (GU>7), o que está de acordo com o perfil encontrado para glicoproteínas expressas por estas

células. Chitlaru e colaboradores observaram sialilações do tipo α2,6 incompletos em uma proteína

recombinante expressa em células HEK293, mas atribuiu este fenômeno à incapacidade das

sialiltransferases presentes no complexo de Golgi destas células em adicionar estes resíduos quando

taxas muito altas de proteínas são expressas, como é o caso de biofármacos e outras proteíinas

recombinantes (Chitlaru et al., 1998).

As estruturas encontradas nas frações enriquecidas para reCGβα expresso nas células CHO-

DG44 foram de maior intensidade EU (denotando maior massa de cada estrutura presente na

preparação) quando comparadas com aquela proveniente das células 293T. Estas células apresentaram

N-glicanos com menor grau de degradação e maior proporção de estruturas bi-antenárias: somando-se

a área dos picos de todas as estruturas de base A2, obtêm-se 28,17%. N-glicanos tri e tetra-antenários,

por sua vez, somaram 36,72% das estruturas totais. Estes dados corroboram os dados obtidos pelo

ensaio de atividade biológica realizado in vivo , visto que, dentre as duas linhagens utilizadas no

estudo, os N-glicanos adicionados pelas células CHO-DG44 são os que mais se assemelham àqueles

encontrados em Folligon. A literatura suporta este resultado, visto que Croset e colegas demonstraram

que proteínas expressas em células CHO possuem maior quantidade e variedade de glicanos sialilados,

quando comparadas com aquelas produzidas na linhagem CHO (Crosset et al., 2012).

Novos experimentos estão em andamento, a fim de adaptar as células superprodutoras em meio

quimicamente definido à cultura em suspensão utilizando-se biorreatores spinners, de modo a

aumentar a expressão de reCGβα e diminuir a presença de contaminantes. Esta estratégia permitirá

purificar maior quantidade de reCGβα e com maior facilidade, o que tornará viável uma análise mais

apurada de N-glicanos expressos por cada linhagem celular aqui estudada. Por fim, a digestão com

exoglicosidases será realizada num futuro próximo de modo a confirmar as estruturas preditas no

presente trabalho.

No presente momento, o sucesso na produção de uma molécula de eCG recombinante com

atividade biológica levou levou nosso grupo a elaborar um convênio visando a parceria entre o nosso

grupo de pesquisa e a indústria farmacêutica veterinária de grande porte Ourofino Agronegócio. Este

convênio, quando celebrado, permitirá a transferência da tecnologia aqui desenvolvida para a indústria,

uma das nossas maiores metas.

Um ensaio clínico utilizando trinta vacas foi realizado a campo em parceria com a empresa

Ourofino, utilizando meios de cultura condicionados obtidos por células superprodutoras de reCGβα

na ausência de soro fetal bovino (dados não mostrados). Os dados obtidos deste ensaio são sigilosos e

de porte da empresa, no entanto, foi possível constatar a plena atividade biológica de reCGβα na

espécie-alvo, em níveis semelhantes ao produto comercial purificado.

5. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos no presente trabalho permitem concluir que foi possível gerar

clones superprodutores de reCGβα tanto em células 293T quanto em células CHO-DG44.

A reCGβα produzida pelas células CHO-DG44 apresentou atividade biológica In Vivo,

sendo capaz de estimular a função ovariana e uterina em ratas pré-púberes.

Foi possível estabelecer um protocolo de purificação parcial de reCGβα por

cromatografia líquida de afinidade (Concanavalina A), onde as frações enriquecidas para

reCGβα apresentaram atividade biológica In Vivo.

Foi possível realizar análise do perfil de N-glicosilação de reCGβα produzido tanto por

CHO-DG44 quanto por 293T e comparar os resultados com o eCG comercial Folligon, sendo

que o perfil obtido pelas células CHO-DG44 ficou mais parecido com o obtido pelo Folligon, o

que corrobora os dados de atividade biológica.

O produto reCGβα possui atividade na espécie-alvo (fêmeas bovinas) similar àquela

desempenhada pelo produto purificado disponível no mercado.

.

6. PRÓXIMOS PASSOS

Os resultados gerados no presente projeto sugerem algumas abordagens futuras de

destaque para continuação do estudo:

a) Otimizar e padronizar a purificação de reCGβα, provavelmente utilizando duas

abordagens complementares;

b) Realizar análises de N-glicosilação de re-CGβα utilizando digestão por

exoglicosidases;

c) Realizar análise de expressão gênica de mRNA codificante para enzimas da via de

N-glicosilação presentes nas células CHO e 293T produtoras de eCG

recombinante versus não-produtoras, correlacionando estes dados com a atividade

específica destas enzimas (perfil de N-glicanos de reCG);

d) Subclonar o inserto contendo as cadeias fusionadas de eCG e os insertos

referentes às cadeias separadas no vetor patenteável pNU-1 e gerar novos clones

superprodutores de reCGβα produzidos por células em suspensão em meio

quimicamente definido.

7. PERSPECTIVAS

Considerando o sucesso do presente trabalho e a importância do hormônio eCG, nossa

intenção é patentear o processo de produção de eCG recombinante em células de mamífero

utilizando a estratégia de co-transfecção e otimização da expressão gênica descritos e transferir o

processo para uma Indústria Farmacêutica Veterinária.

Em termos de novos dados acadêmicos gerados, pretende-se publicar dois artigos

referentes a este trabalho:

- O primeiro comparando a atividade biológica de reCG expressa em CHO-DG44 e 293T;

- O segundo correlacionando o perfil de glicosilação adicionado por células humanas e

por células de hamster em eCG recombinante e a atividade biológica desempenhada por esta

molécula; incluindo os dados de perfil de expressão gênica de mRNAs codificantes para enzimas

da via de N-glicosilação.

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Thakur D, Rejtar T, Karger BL, Washburn N, Bosques CJ, Gunay NS, Shriver Z and Venkataraman G Profiling of the Glycoforms of the Intact α Subunit of Recombinant Human Chorionic Gonadotropin by High Resolution CE/MS Anal Chem. 2009 November 1; 81(21): 8900–8907.

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Thibier, M. e D. A. Stringfellow. Health and Safety Advisory Committee (HASAC) of the International Embryo Transfer Society (IETS) has managed critical challenges for two decades. Theriogenology, v.59, n.3-4, Feb, p.1067-78. 2003.

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Wilson, J. M., A. L. Jones, et al. Superovulation of cattle with a recombinant-DNA bovine follicle stimulating hormone. Animal Reproduction Science (Netherlands), v.v. 33(1-4) n.(1-4) p.p. 71-82. 1993.

Witt MC, Bollwein H, Probst J, Baackmann C, Squires EL, Sieme H. Doppler sonography of the uterine and ovarian arteries during a superovulatory program in horses. Theriogenology 2012 Apr 15 77(7): 1406-14

Wurm FM. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol 2004 Nov;22(11):1393-8. Review.

LISTA DE ANEXOS

A – COMITÊ DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO E USO DE ANIMAIS (CEUA)

B – SÚMULA CURRICULAR

C− ARTIGOS PUBLICADOS E/OU ACEITOS PARA PUBLICAÇÃO

SÚMULA CURRICULAR

Tatiane Maldonado Coelho

Brasileira, casada, 30 anos

[email protected]

Formação Acadêmica

� Doutorado Direto em Bioquímica – Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São

Paulo, SP, Brasil

Início: 03/2008 Conclusão prevista: 1º Semestre/2014

� Doutorado Sanduíche – Microbiology Department, University of Mnitoba, MB, CA

Início: 11/2011 Conclusão: 04/2012

� Iniciação Científica em Bioquímica – Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de

São Paulo, SP, Brasil


� Graduação em Medicina Veterinária – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São

Paulo, SP, Brasil


Qualificações/Expertise

� Técnicas de Biologia Celular, Biologia Molecular e Bioquímica

� PCR, RT-PCR, qRT-PCR, clonagem, eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida (DNA e proteína), sequenciamento de DNA, isolamento de ácidos nucleicos e proteínas, etc.

� Cultura de células � Expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos

� Purificação cromatográfica de proteínas

� Ensaios in vitro e in vivo (animais vertebrados)

� Ensaios de atividade biológica � Análise de N-glicosilação de proteínas

� Professora de Inglês na ONG - Centro Profissionalizante Chico Xavier por oito meses (2011)-

� Elaboração de um Plano de Trabalho para uma empresa Farmacêutica Veterinária Parceira referente a um ensaio clínico de eCG recombinante

� Ética, objetividade, audácia e criatividade para desenvolver projetos com aplicação comercial

Aspirações Profissionais

� Cargos relacionados a Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação

� Cargos relacionados a Especialista de Produtos e Insumos dedicados à pesquisa e inovação � MBA em gestão de projetos

Projetos de Pesquisa/Bolsas

� Avaliação da atividade biológica da Gonadotrofina Coriônica equina recombinante (reCG) expressa em três diferentes tipos de célula de mamífero (09/2008 – 11/2013). Bolsista de Doutorado Direto - Fundação de Apoioà Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Instituto de Química, Departamento de Bioquímica, USP. Orientador: Profa. Dra. Mari Cleide Sogayar

� � Produção de FSH bovino recombinante (rbFSH) em células de mamífero (07/2006 – 12/2007) – Bolsista de

Iniciação Científica –Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Instituto de Química, Departamento de Bioquímica, USP. Orientador: Profa. Dra. Mari Cleide Sogayar

Idiomas

� Português: Língua mãe

� Inglês: Avançado – fala, escrita, leitura, tradução (TOEFL ITP) � Francês: Nível Básico (2 semestres de curso na Wizard Idiomas. São Paulo, Brasil)

Experiência Profissional

� Estagiária no Hospital de Ruminantes – VCM -FMVZ-USP � Início: 04/2003 Conclusão: 05/2003

� -Estagiária na clínica veterinária PuppyBrazil (Santo André – SP) Início: 01/2004 Conclusão: 02/2004

� -Estagiária no Núcleo de Apoio à Pesquisa da Glândula Mamária (NAP-GAMA) VPS-FMVZ-USP Início: 07/2004 Conclusão: 11/2004

� Estagiária na de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento (LMMD) FZEA-USP Início: 12/2004 Conclusão: 02/2005

� Estagiária no Laboratório de Biologia Molecular empresa Nanocore Biotecnologia S/A – Setor de Biologia Celular e Biotecnologia Início: 08/2007 Conclusão: 12/2007

Experiência Acadêmica

Supervisões

� Gabriel Levin. Avaliação da modulação da expressão de MMPs e TIMPs por RECK e SPARC durante o desenvolvimento ovariano, foliculogênese e superovulação em ratas 2011-2014 (Concluída). Iniciação Científica (Graduando em Biologia) - Universidade de São Paulo

� Nathali Guimarães Nóbrega. Avaliação da modulação da expressão de MMPs e TIMPs por RECK e SPARC durante o desenvolvimento ovariano, foliculogênese e superovulação em ratas 2011-2014 (Concluída). Iniciação Científica (Graduando em Biologia) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Organização de Cursos, Cursos Ministrados e Monitoria

� A Caminho da Biotecnologia (2013). Curso teórico-prático/workshop ministrado a alunos do Ensino Fundamental II das escolas See-Saw/Panamby Bilingual School, Nossa Escola Perdizes e Escola de Aplicação da USP. Docente responsável: Profa. Dra. Mari Cleide Sogayar. Carga horária: 16 h. Vínculo: organizador e monitor pleno (voluntário)

� Biologia Molecular da Transformação Maligna - QBQ5717 (2011). Disciplina de Pós-Graduação ministrada junto ao Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP. Docente responsável: Profa. Dra. Mari Cleide Sogayar. Carga horária: 210 h. Vínculo: responsável por alguns experimentos e colóquios

� Biologia Molecular do Gene - QBQ0126 (2011). Disciplina de graduação ministrada a alunos de curso de Medicina Veterinária da USP junto ao Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP Docente responsável: Prof. Dr. Frederico Gueiros Filho. Carga horária: 60 h. Vínculo: organizador e monitor pleno (remunerado)

� Bioquímica: Estrutura de Biomoléculas e Metabolismo – QBQ0213 (2010). Disciplina de graduação ministrada a alunos do curso de Nutrição da USP junto ao Departamento de Bioquímica do Instituto de

Química da USP Docente responsável: Prof. Dr. Deborah Schetmann. Carga horária: 120 h. Vínculo: monitor pleno (remunerado)

� A Caminho da Biotecnologia (2010). Curso teórico-prático/workshop ministrado a alunos do Ensino Fundamental II das escolas See-Saw/Panamby Bilingual School, Nossa Escola Perdizes e Escola de Aplicação da USP. Docente responsável: Profa. Dra. Mari Cleide Sogayar. Carga horária: 16 h. Vínculo: responsável por algumas aulas. Monitor Suplente.

� XIV Semana da Bio. Participação da XIV Semana Temática do curso de Ciências Biológicas da UNESP

campus Botucatu, como palestrante do curso “Princípios e Aplicações da Engenharia Genética Moderna”, realizado entre os dias 20 e 21 de Agosto de 2010, em Botucatu, São Paulo. Vínculo – Organizador e Ministrante

� Biologia Molecular do Gene - QBQ0126 (2009). Disciplina de graduação ministrada a alunos de curso de

Medicina Veterinária da USP junto ao Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP Docente responsável: Prof. Dra. Mari Cleide Sogayar. Carga horária: 120 h. Vínculo: organizador e monitor pleno (remunerado)

� Biologia Molecular do Gene - QBQ0126 (2008). Disciplina de graduação ministrada a alunos de curso de Medicina Veterinária da USP junto ao Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP Docente responsável: Prof. Dra. Mari Cleide Sogayar. Carga horária: 120 h. Vínculo: organizador e monitor pleno (voluntário)

� Biologia Molecular da Transformação Maligna - QBQ5717 (2008). Disciplina de Pós-Graduação ministrada junto ao Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP. Docente responsável: Profa. Dra. Mari Cleide Sogayar. Carga horária: 210 h. Vínculo: Organizador e Monitor Pleno.

Produção Bibliográfica

Artigos Publicados em Periódicos

1. BELCHIOR, GG, SOGAYAR, MC, GRIKSCHEIT, TC. Stem cells and biopharmaceuticals: vital roles in

the growth of tissue-engineering small intestine. Seminars in Pediatric Surgery. Accepted for publication.

2. CARREIRA, ACO, LEVIN, G, COELHO, TM, BELCHIOR, GG, SOGAYAR, MC. Biofármacos: sua

importância e as técnicas utilizadas em sua produção. Genética na Escola, 2013. 8(2):168-177.

Resumos em Anais de Congresso

1. COELHO, TM; Carreira, ACO, Butler, M; SOGAYAR, MC. Comparative Study of recombinant equine

Chorionic Gonadotropin expressed in three different mammalian cells: correlation between glycosylation and

biological activity. Protein Expression in Animal Cells PEACe 2013. Kananaskis, BC, Canada



biological activity. 4°°°° Congresso Brasileiro de Biotecnologia. 2012. Guarujá, São Paulo – Brasil..



biological activity. Canadian Society for Chemical Engineering. 2011. London, ON, Canada.

4. CARREIRA, ACO; SODRE, FCM; BELCHIOR, GG; COELHO, TM; SOGAYAR, MC. Production of

Biopharmaceuticals and Cell Therapy for Tissue Repair and Wound Healing. In: XL Reunião Anual da

Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq), 2011, Foz do Iguaçu, Brasil

5. Carreira, ACO, Belchior, GG, Sodré, FMC, COELHO, TM; SOGAYAR MC. The use of Recombinant

Human Growth Factors expressed in mammalian cell systems as an Alternative Therapeutical Approach

to Wound Healing Process XV Congresso da Sociedade Brasileira de Biologia Celular. 2011. São Paulo – SP

6. CARREIRA, ACO; SODRE, FCM; BELCHIOR, GG; CRUZ, LO; COELHO, TM; SOGAYAR, MC .

Recombinant Human Growth Factors as an Alternative Therapeutical Approach to Wound Healing Process.

XXXIX Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq), 2010, Foz do

Iguaçu, Brasil

7. PEREIRA TM, Colin, C; Figueira, RCS; Corrêa, R. Production of Recombinant Bovine FSH (Follicle

Stimulating Hormone) in Mammalian Cells. XXXV Reunião Anual da SBBq, 2007, Águas de Lindoia.

Brasil.

8. PEREIRA, TM, Colin, C; Figueira RCS; SOGAYAR, MC. Production of Recombinant Bovine FSH (Follicle

Stimulating Hormone) in Mammalian Cells. XIV Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP

(SIICUSP), 2006, Ribeirão Preto, Brasil

9. PEREIRA, TM, Colin, C; Figueira RCS, SOGAYAR, MC. Cloning and expression of Recombinant Bovine

FSH (Follicle Stimulating Hormone). XIV Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP

(SIICUSP), 2006, Ribeirão Preto, Brasil

Apresentação Oral de Trabalhos



biological activity. Protein Expression in Animal Cells PEACe 2013. Kananaskis, BC, Canada



biological activity. Canadian Society for Chemical Engineering. 2011. London, ON, Canada.

Palestras anuais nos Ciclos de Seminários Temáticos de Controle da Proliferação Celular e Origem de

Neoplasias de 2012, 2012, São Paulo, Brasil

Prêmios

� 1º lugar por apresentação de trabalho (pôster). Vínculo: primeiro autor. 4º Congresso Brasileiro de

Biotecnologia, 2012. Guarujá, Brasil

Participação em Eventos

� XXXVIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq), 2009.

Ouvinte. Águas de Lindóia, Brasil

� XXXVII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq), 2008.

Ouvinte. Águas de Lindóia, Brasil

� XIV Congresso da Sociedade Brasileira de Biologia Celular (SBBC), 2008. Apresentação de trabalho.

São Paulo, Brasil

� Curso: Biologia do RNA. XIV Congresso da Sociedade Brasileira de Biologia Celular (SBBC), 2008.

Ouvinte. São Paulo, Brasil

� XV Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP (SIICUSP), 2007. Apresentação de trabalho.

São Paulo, Brasil

� XXXV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq), 2006.

Apresentação de Trabalho. Foz do Iguaçu, Brasil

� XIV Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP (SIICUSP), 2006. Apresentação de trabalho.

São Paulo, Brasil

ARTIGOS PUBLICADOS E/OU ACEITOS PARA PUBLICAÇÃO

1. Publicado: Genética na Escola. 8(2):168-177

2. Publicado: Molecular Biotechnology. 39(2):89-95. 2008.

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