TRABAJO PRÁCTICO Nº 4: DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE … · Valores Normales: HbA > 97% HbA2 hasta...

Química Biológica Patológica 2016 Licenciatura en Bioquímica

Área de Química Biológica 50

TRABAJO PRÁCTICO Nº 4: DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE β-TALASEMIAS

Dra. Silvia Mabel Varas

Objetivos:

- Análisis de los distintos índices hematimétricos: su aporte en el diagnóstico diferencial de anemias microcitarias (anemias ferropénicas y β-talasemicas).

- Diagnóstico Bioquímico de β-talasemias. - Separación electroforética de hemoglobinas usando papel como soporte. - Importancia de la cuantificación de Hemoglobina Fetal. - Observación de frotis sanguíneos normales y patológicos. - Discusión de la aplicación de técnicas moleculares para la detección de las

mutaciones más frecuentes.

DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE β-TALASEMIAS 1) DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE HB EN SANGR E

TOTAL La determinación de la concentración de Hb es el criterio fundamental para el

diagnóstico de una anemia. Para ello la metodología a emplear debe ser precisa y fiable. Desde el año 1967 el ICSH (International Commitee for Standardization in Haematology), recomienda el método de la cianometahemoglobina como el más fiable para dosificar la Hb. Posee la ventaja, junto a su precisión y exactitud, que puede ser verificado mediante el empleo de un patrón de Referencia Internacional. Existen otros métodos más económicos que ocasionalmente pueden sustituir el recomendado por el ICSH y la OMS. Entre otros tenemos los métodos de la Oxihemoglobina y el de Sahli, los que poseen margen de error mayor al método de la cianometaHb.

Método de la Cianometahemoglobina Fundamento: La oxidación de la Hb (Fe2+) en metahemoglobina (Fe3+) por acción del ferricianuro

y posterior combinación con iones cianuro a pH=7.2 da lugar a la formación de cianometa-Hb; la cual se cuantifica espectrofotométricamente a 540 nm.

Reactivos: 1- Solución Diluyente o de Drabkin: NaHCO3 ............................. 1 g. KCN ................................... 50 mg. K3[Fe(CN)6]...................... 200 mg. H2O destilada c.s.p........... 1000 ml. Para lograr la hemólisis completa se agrega una gota de Tritón cada 5 ml de solución.

Debe guardarse en frascos color caramelo a temperatura ambiente y renovarse mensualmente.

2- Sangre extraída con anticoagulante (EDTA). Técnica: 1- En un tubo de ensayo colocar 5 ml de la solución diluyente, exactamente



medidos. 2- Agregar 20 µl de sangre homogenizada (o del hemolizado). Es muy importante

eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del tips de la micropipeta antes de introducirla en el reactivo diluyente. Asimismo una vez descargada la sangre enjuagar 2 ó 3 veces con el líquido diluyente para eliminar toda la sangre que hubiera quedado adherida a las paredes internas del tip.

3- Agitar en vórtex, para una correcta homogeneización. 4- Esperar 10’ y leer en espectrofotómetro a 540 nm. Usar como blanco la solución

diluyente. 5- La concentración de Hb se expresara en g / dl (g%), y se calculará mediante una

curva de calibración o mediante un testigo de concentración conocida. De esta forma el sistema será.

B T M Solución Diluyente 5 ml 5 ml 5 ml

Testigo de Hb. --- 20 µl --- Muestra --- --- 20 µl

Cálculos: Hb ( g/ dl ) = AM . [T] / AT En donde la [T] , es la concentración del testigo expresado en g/dl. AM : es la absorbancia de la Muestra. AT : es la absorbancia del Testigo. 2) ELECTROFORESIS DE Hb SOBRE CELLOGEL. Fundamento: Separación electroforética de las hemo-proteínas, utilizando como soporte de corrida

acetato de celulosa y trabajando a pH=8,6. Reactivos: 1- Buffer Tris-Glicina, pH=8,6:

Tris .....................................14.1 g Glicina ................................22.6 g H2O dest. csp.....................2000 ml

2- Solucion Colorante Amidoschwarz: Amidoschwarz ......... 0.5 g Metanol ................... 45 ml Ac.Acetico................ 10 ml H2O dest................... 45 ml

3- Solucion Decolorante : Metanol ...................45 ml Ac. Acetico .............10 ml H2O dest. ................45 ml

4- Solución de Hb: Preparada a partir del hemolizado a una concentración final de 5g%.

Técnica: 1- Extraer 2,5 ml de sangre en un tubo con heparina.



2- Tomar 1ml de la sangre bien homogeneizada y colocarla en un tubo de 1,5 ml. Centrifugar 10’ a 2000 r.p.m. y eliminar el plasma y glóbulos blancos. Lavar 4 veces con 1 volumen de solución fisiológica.

3- Agregar al concentrado de eritrocitos 1 volumen de agua y 0.4 volúmenes de tolueno. Agitar bien durante algunos segundos.

4- Centrifugar a 3500 rpm durante 20 ’. 5- Observar a trasluz: la capa roja brillante corresponde a la hemoglobina libre. 6- Dosar Hb libre mediante el método de la cianometahemoglobina

anteriormente descripto. En caso de obtenerse altos valores de Hb (18-20 %), se deben colocar 10 ml del reactivo diluyente y luego multiplicar los valores obtenidos por 2 (inversa de la dilución).

7- Preparar una solución de Hb al 5%, en un volumen final de 100 μl. Esta solución se usara para sembrar sobre las tiras de acetato de celulosa.

8- Siembra en tiras de acetato de celulosa: a- Lavar las tiras de cellogel en buffer durante 30’. Eliminar el exceso de buffer con

papel de filtro. b- Colocar las tiras en la cuba de electroforesis, con la superficie opaca hacia arriba. c- Usar un microaplicador para sembrar las muestras a 3 cm del borde catódico d- Aplicar una tensión de 200 V ó 5 mA por tira durante 60-80 ’. e- Sacar las tiras y sumergirlas en colorante durante 5 ’. f- Decolorar en solución decolorante con tres o cuatro baños agitando suavemente,

hasta que solamente quede colorante en las bandas correspondientes. 9- Cuantificación. a- Cortar las bandas correspondientes a la Hb A y A2 y colocarlos en los tubos de

ensayo correspondientes, conteniendo ácido acético al 80%. La banda de Hb A se coloca en un tubo que tiene 9 ml de dicho reactivo, mientras

que la banda de HbA2 se coloca en un tubo que contiene 3 ml del mismo. c- Agitar en vortex hasta disolución completa del acetato de celulosa. d- Leer a 415 nm en una cubeta de cuarzo (UV). e- Cálculos de Valores Relativos: A: lectura de Hb A (de 9 ml), Tubo A. B: lectura de Hb A2 (de 3 ml), Tubo B C: es A x 3 (porque esta diluido 3 veces) C+B ------------------------- 100 % C ------------------------- x = % HbA C+B ------------------------- 100 % B -------------------------- y = %HbA2 Valores Normales: HbA > 97% HbA2 hasta 3%. Valores mayores de HbA2 indican β- talasemia heterocigota.



Representación esquemática de la posición relativa de todas las Hbs descriptas, la presencia de cada una de ellas dependerá de cada patología.

3) CUANTIFICACION DE LA HEMOGLOBINA FETAL. Método d e la

desnaturalización alcalina Fundamento La Hb F es más resistente a la desnaturalización alcalina que las otras Hbs,

apareciendo en el filtrado después de neutralizar el pH con una solución saturada de sulfato de amonio.

Muestra: 1- Lavar los eritrocitos 3 veces con SF. Lisar el paquete de eritrocitos con 2V de

H2O y 1V de Tolueno. 2- Vortexear y centrifugar 3000 rpm por 30 minutos y pipetear la solución de

hemoglobina Reactivos: 1- Solución de Drabkin. 2- Solución saturada de (NH4)2SO4 [706 g en 1000 ml H2O destilada. Calentar



hasta disolver. Guardar a t° ambiente] 3- Solución de NaOH, 1,2 N. [4,8 g en 100 ml de H2O destilada] 4- Hemolizado con una concentración de Hb aproximada de 8 g/dl Técnica: La técnica debe realizarse siempre a temperatura ambiente ( 20-25 °C). 1- Preparar la solución de cianometaHb de la siguiente manera: 600 µl del

hemolizado se le añade 10 ml de la solución de Drabkin. 2- En un tubo medir 2,8 ml de solución de cianometaHb, agregar 0,2 ml de NaOH.

Agitar. 3- Exactamente después de 2’ agregar 2 ml de sulfato de amonio. Agitar

vigorasamente. El material desnaturalizado es precipitado en 5-10 minutos. 4- Remover el precipitado por filtración con papel Whatman n° 6 o 42. Leer la

densidad óptica a 415nm. (AM). 5- Una solución CONTROL se prepara mezclando: 1,4 ml de solución de

cianometaHb + 1,6 ml de H2O + 2 ml de sulfato de amonio. Diluir esta solución 1:10 con agua destilada (0,5 ml+ 4,5 ml H2O) y leer a 415nm (ACo)

Cálculos:

Hb F % = AM x 100 ACo x 20

Factor 20: 2x10 Valores Normales:

Ninos: . Al nacer 50 % 5 meses : 5 % 2 años : 2%

Adultos : 0,2 - 1 %.

Bibliografía:

1. ITHAnet. Electronic Infrastructure for Thalassaemia Research Network: Protocol:Hb Fquantitation by alkali denaturation



DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE β-TALASEMIA Para diagnosticar el tipo de mutación se utilizan técnicas de biología molecular.

Existen cientos de mutaciones descriptas en el gen de globina. Pero existen estudios en donde se han informado que el 80 % de los alelos mutados en población de origen mediterráneo corresponden a cuatro mutaciones puntuales denominadas IVS 1-1, IVS 1-6 e IVS 1-110, en el intrón 1 y la mutación en el codón 39, en el segundo exón. El análisis consiste en amplificar ADN obtenido de leucocitos por PCR y luego hibridizar los productos de la reacción con sondas alelo- especificas (sondas ASO) que identifican mutaciones en los nucleótidos 1, 6 y 110 como así también la mutación en el codón 39. El análisis de estas mutaciones en la población talasémica de nuestro país nos permite realizar el diagnóstico con una certeza del 90 %.

Ejemplo de un Dot Blot:

El tratamiento depende del grado de severidad del cuadro, así en los pacientes β-

talasémicos homocigotas requieren: transfusiones permanentes, agentes quelantes (deferoxamina) y en algunos casos esplecnotomía.Se considera como otra posibilidad el transplante de médula ósea en estos pacientes.



GLOSARIO: Sitios de splice crípticos son motivos o secuencias presentes a lo largo pre-mRNAs.

Ellos no son reconocidos en condiciones normales y así normalmente no causan splicing. Mutaciones o deleciones en los elementos naturales pueden causar su activación de sitios de splice cercanos.

Anisocitosis: Este término se utiliza para denotar variaciones del tamaño de los eritrocitos.

Hipocromía: Se refiere a la reducción de la intensidad de la tinción, que puede variar desde un ligero incremento de la zona de palidez central hasta un área de gran tamaño rodeada por un pequeño borde de citoplasma hemoglobinizado.

Microcitosis: Son más pequeños y más pálidos que los eritrocitos normales. V.C.M. (Volumen Corpuscular Medio):es el valor medio del volumen de cada

hematíe .Se calcula a partir del hematocrito y del número de hematíes. VCM= Ht (l/l) / N° de hematies ( x 1012/ l ) [=] femtolitros (fl) Anasarca: edema intenso generalizado. Hidropesía Fetal: acumulo excesivo de líquido acuoso y claro en un tejido o cavidad.

En las talasemias la hidropesía fetal afecta a todo el cuerpo del neonato o recién nacido.



Algoritmo para el diagnóstico diferencial de anemias microciticas



TP N°5: PORFIRIAS Y PORFIRINAS: DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE PORFIRIAS

Dra. Silvia Mabel Varas

Objetivos: - Presentar conocimientos básicos del metabolismo de las porfirinas - Establecer las bases bioquímicas y moleculares de la patogenia y orientar en el

diagnóstico y tratamiento de las porfirias. - Conocer y realizar los test diagnósticos básicos para porfirias.

Introducción Las porfirinas son tetrapirroles clásicos que contiene 4 anillos pirrólicos designados

según la nomenclatura de Hans Fischer, como A, B, C y D. Los mismos se hallan unidos a través de 4 puentes metilenos denominados como α, β, γ y δ. Poseen una estructura planar rígida, con cadenas laterales sustituyentes en las posiciones β- de los carbonos de cada núcleo pirrólico, estas posiciones se enumeran de 1 a 8, comenzando por el anillo A. Ver figura:

De esa forma, según el tipo y posición de los sustituyentes, tendremos los distintos

tipos de porfirinas:

En donde: M= -CH3 (grupos metilos)

A= -CH2-COOH (grupos acetilos) P= -CH2-CH2-COOH (grupos propionicos) V= -CH-CH2 (grupos vinilos)

El tipo y número de cadenas laterales determina las propiedades resultantes. Así las

uroporfirinas (Uro) poseen 8 grupos ácidos carboxílicos mientras que las coproporfirinas (Copro) tienen 4 y las protoporfirinas (Proto) tan solo 2. De esta forma las Uro se



excretan principalmente por orina, las Copro por orina y bilis y las Proto solamente por bilis.

Las porfirinas participan en procesos fundamentales de los seres vivos como grupos prostéticos de una gran variedad de hemoproteínas. Estas hemoproteínas tienen diferentes funciones entre las que podemos destacar:

• Unión reversible con el oxígeno: hemoglobina, mioglobina. • Reacciones con el oxígeno molecular: Citocromo P450 (monoxigenasa),

Triptófano oxigenasa (dioxigenasa), Citocromo oxidasa (oxidasa). • Reacciones con peróxidos: Peroxidasa, Catalasa. • Reacciones de transferencia de electrones: Citocromos. Las porfirinas, debido a su estructura altamente conjugada de dobles enlaces

alternados, presentan propiedades foto-ópticas especiales: son fácilmente excitadas por luz de alrededor de los 400 nm y emiten una intensa fluorescencia roja. En solución ácida, los espectros de emisión de las porfirinas presentan dos importantes bandas de emisión, una a los 600-610 nm y la otra a 640-660 nm. Esta técnica de cuantificación de las porfirinas es muy sensible, nos permite detectar las porfirinas en una concentración de alrededor de los 5 ng. Es además muy específica ya que diferencia una Proto de una Copro de una Uroporfirina.

Las porfirinas libres en solución alcalina y sus ésteres metílicos en solventes

orgánicos (cloroformo) presentan un espectro de absorción típico de 4 bandas en el visible, entre 480 y 650 nm, y una banda ancha en la región de los 400 nm llamada Banda de Soret.

En solución ácida (HCl) se aprecian en cambio la Banda de Soret más acentuada y dos bandas a aproximadamente 550 y 600 nm llamadas α y β; por tal motivo la medida en el máximo de Soret en medio ácido es la más utilizada para la cuantificación de porfirinas libres espectrofotométricamente.

Ver espectros de absorción.



Porfirinógenos Los porfirinógenos son los intermediarios normales de la célula; los cuales a

diferencia de las porfirinas poseen los 4 puentes metilénicos reducidos. Así mientras las porfirinas exhiben una estructura altamente conjugada de dobles enlaces y por lo tanto presentan una notable coloración y emiten una intensa fluorescencia roja a la luz UV; los porfirinógenos son incoloros y no fluorescen. Estos compuestos cuando se excretan se oxidan espontáneamente a las correspondientes porfirinas, la oxidación puede acelerase por medio del agregado de oxidantes suaves, como soluciones diluidas de yodo; sin embargo el manipuleo mismo de las muestras asegura esta conversión.



Vía Biosintética del Hem Las moléculas relativamente complejas de las porfirinas son sintetizadas en las

células a partir de precursores muy simples, teniendo como intermediarios en la secuencia de reacciones enzimáticas a los porfirinógenos.

En animales y bacterias los precursores son el succinilCoA procedente del ciclo de Krebs y la glicocola, que procede del “pool de aminoácidos. La secuencia de reacciones catalizadas por ocho enzimas fue establecida por los grupos de Shemin, Rimington, Neuberger y Granick. La compartimentación de las enzimas en la célula es esencial para el control de la biosíntesis del hemo. En la mitocondria se localizan la primera y las tres últimas enzimas de la ruta, mientras que las enzimas Intermedias se localizan en el citoplasma.

Elder ha demostrado una vía alternativa a partir del pentaporfirínógeno, que teniendo como intermediario el deshidroisocoproporfirinógeno, se transforma en harderoporfirinógeno que conduce a la formación del protoporfirinógeno y consecuentemente del hemo. Este intermediario es el precursor u origen de las denominadas isocoproporfirinas o porfirinas de la serie P de Elder aisladas en pacientes con porfiria cutánea tarda y en ratas intoxicadas con hexaclorobenceno, situaciones ambas en las que ésta ruta alternativa es importante.

Las porfirinas pueden seguir diferentes vías para su eliminación del organismo; la ruta de excreción que van a seguir depende de su hidrosolubilidad y ésta es función del número de grupos carboxílicos libres presentes en las cadenas laterales de sus moléculas. La uroporfirina, octocarboxílica, es muy hidrosoluble, por lo que se excreta casi exclusivamente por orina, al igual que su porfirinógeno mientras que la protoporfirina y otras porfirinas dicarboxílicas, poco hidrosolubles, son eliminadas únicamente por bilis, de forma parecida a la bilirrubina y bromosulfoftaleína, utilizando mecanismos transportadores comunes.

La coproporfirina tetracarboxílica se excreta preferentemente por vía bilio-fecal, mientras que su porfirinógeno puede seguir ambas rutas excretorias.

El ácido delta-aminolevulinico (ALA) y el porfobilinógeno (PBG) infundidos en vena son eliminados exclusivamente por orina al igual que la uroporfirina y el uroporfirinógeno.

El comportamiento excretorio de las porfirinas tetracarboxílicas es flexible ya que pueden seguir ambas rutas dependiendo de la integridad funcional de los órganos que las rigen, hígado y riñón.

En condiciones normales la coproporfirina es eliminada exclusivamente por bilis, mientras que su porfirinógeno, captado menos ávidamente por el hepatocito, puede transformarse en protoporfirina y eliminarse como tal en bilis, o bien ser excretado por orina constituyendo, tras su oxidación, la fracción normal urinaria de coproporfirina. La lesión del hepatocito (por medio de tetracloruro de carbono) que disminuye la capacidad de aclarar la coproporfirina del plasma o la alteración de los mecanismos de excreción biliar (ligadura del conducto biliar común) que imposibilita su eliminación biliar, darían lugar a que dicha porfirina y su porfirinógeno alcanzasen altas concentraciones plasmáticas siendo excretados pasivamente por el riñón.

Las porfirinas, sobre todo las menos hidrosolubles requieren un sistema de transporte plasmático, así concretamente la coproporfirina presente en plasma circula unida a proteínas, fundamentalmente hemopexina. La hemopexina es una glicoproteína de unos 57000 daltons de peso molecular sintetizada fundamentalmente en el hígado que es el órgano donde el complejo copro-hemopexina interacciona con un receptor especifico, liberándose la coproporfirina hacia el citoplasma. En el citoplasma la coproporfirina se



une a diversas proteínas semejantes a la ligandina. La afinidad de la unión con estas proteínas transportadoras es función inversa de la hidrofobicidad de las cadenas laterales de las moléculas porfirínicas; así la coproporfirina se une más fuertemente a la ligandina que la uroporfirina hidrosoluble, lo cual explica su exclusiva eliminación renal, al no ser transportada a través del hígado hacia la bilis.

La hipercoproporfirinuria de los enfermos hepáticos fue ya descrita por Garrod hace

más de 90 años; Hymans Van den Bergh y col. interpretaron el aumento de la coproporfirinuria en las ictericias obstructivas como debida a defecto de la excreción de la porfirina que normalmente debía eliminarse por bilis, sin embargo no siempre debe interpretarse la hipercoproporfirinuria de los enfermos hepáticos como secundaria al defecto excretorio o regurgitación biliar. En las colestasis, lo característico es un aumento en orina del isómero I de la coproporfirina que es el que normalmente se excreta por bilis, mientras que en hepatopatías no colestásicas y etílicas se incrementa en orina el isómero III.



Porfirias Se las define como un grupo de enfermedades, ya sean congénitas o adquiridas, que

se originan como consecuencia del desorden en el metabolismo de las porfirinas.

Pueden clasificarse en agudas y no agudas, dependiendo si sufren o no de

ataques agudos. Son porfirias agudas: PIA, CH y PV. Se caracterizan por sufrir ataques a lo largo de toda su vida. Estos ataques involucran disfunción del SNC, SNP Y SNA. Los síntomas pueden deberse a una deficiencia de heme en el SN y/o a acumulación de intermediarios neurotóxicos tales como ALA y PBG.

PORFIRIAS CONGENITAS 1. Porfiria Congénita Eritropoyetica o Enfermedad de Gunther Se hereda en forma AR. Se encuentra deficiente la actividad de la enzima

Uroporfirinógeno III Cosintetasa. Hay acumulación de Uro y Copro de la serie I en tejidos y eritrocitos. Acompañado por una elevada excreción de Uro y Copro de tipo I en orina y de Copro en heces.

2. Protoporfiria Eritropoyetica Se hereda en forma AD. Hay un déficit de la enzima ferroquelatasa que conduce a

una acumulación de Protoporfirina IX que aumenta de 100-150 su valor en eritrocitos. Esta aumentada en plasma y también su excreción en heces. Clínicamente se caracteriza por una moderada fotosensibilidad y disfunción hepato-biliar con colelitiasis y cirrosis de variada intensidad.

3. Coproporfiria Eritropoyetica Congénita Se trasmite por un carácter AD, hay deficiencia de la enzima coproporfirinógeno

oxidasa. Hay un considerable aumento de coproporfirina en los glóbulos rojos. Presentan fenómenos de fotosensibilidad leve y su evolución es crónica y benigna.

4. Porfiria Aguda Intermitente (PIA) Se hereda en forma AD, con deficiencia de la PBG deaminasa. Presentan niveles



aumentados de PBG y ALA en plasma y por ende en orina. Como tanto el PBG como ALA atraviesan la barrera hemato-encefálica provocan disfunciones neurológicas; con convulsiones, estado confusional, parálisis de las extremidades, etc.

La manifestación clínica de esta enfermedad está asociada a factores adquiridos como por ejemplo, estado nutricional, nivel de hormonas o al consumo de determinado fármacos. Ver lista de drogas que pueden precipitar ataques agudos de porfirias.

Desde el punto de vista cardiovascular: taquicardia, que puede ser un parámetro en la progresión de la enfermedad e hipertensión arterial durante un episodio que debe controlarse con propanolol.

El tratamiento durante los ataques debe ser sintomatológico, para ello se han descrito numerosos fármacos cuyo uso en estos pacientes es seguro y no complica aún más el cuadro, ver Tabla N º2.



5. Porfiria Variegata o Mixta Se trasmite según un carácter AD, se produce por una deficiencia de

protoporfirinogeno oxidasa. Hay una excreción muy elevada de protoporfirinas en materia fecal; como así también de Copro. Durante las crisis existen elevados niveles de PBG. Clínicamente combina las manifestaciones dermatológicas de la PCT con las manifestaciones neurológicas de la PIA.

6. Coproporfiria Hereditaria Hay una deficiencia de la enzima coproporfirinogeno oxidasa, se hereda en forma

AD. Se observa un aumento de Coproporfirina III en heces y durante los accesos se encuentra elevado el PBG y ALA en orina. Por lo general las crisis se manifiestan por la ingesta de determinados fármacos, Tabla Nº1.

7. Porfirias Cutánea Tardía (PCT) Se hereda en forma AD y existe una deficiencia de la enzima uroporfirinógeno

decarboxilasa. Hay secreción aumentada de Uro de tipo I y II por orina. Es una afección



crónica que se manifiesta por lesiones cutáneas por fotosensibilidad en zonas expuestas a la luz solar; también con daño hepático con siderosis, cirrosis y hemacromatosis (acumulo de Fe).

PORFIRIAS ADQUIRIDAS 8. Intoxicación con Plomo La intoxicación con Pb causa síntomas similares a la PIA. El Pb actúa inhibiendo la

acción de la ALA dehidrasa provocando el desplazamiento del sitio activo de la enzima del Zn que se encuentra protegiendo los grupos sulfhídricos allí presentes. También inhibe a la ferroquelatasa. Se caracteriza por un aumento en orina de la excreción de δ-ALA y Copro. En los glóbulos rojos por niveles aumentados de Proto y Copro. La actividad de la enzima ALA dehidrasa se encuentra notablemente disminuida. Clínicamente se caracteriza por anemia con punteado basófilo, anorexia, ribete gingival, astenia., irritabilidad, somnolencia, dolores reumatoideos y abdominales, cefaleas, vómitos, nefritis crónica, parálisis radial periférica, impotencia y esterilidad. Como tratamiento se les suele administrar quelantes de Pb que lo eliminan de los tejidos blandos, excretando el complejo a través del riñón y el hígado. Se suele emplear EDTA para tales fines.

Parámetro de Exposición: Plombemia N:< 30µg/dl sangre Parámetro de Efecto Biológico: 1° Elección: δ-ALA en orina N: < 4,5 mg/g creatinina

Intoxicado: 10 mg/g creatinina 2° Elección: Protoporfirina Eritrocitarias < 75 µg/dl sangre 9. Símil PCT por consumo de alcohol El alcoholismo crónico puede generar una sintomatología semejante a la observada

en los enfermos con PCT.



BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA: 1. Tesis para obtener el grado de PhD de Gunnel Lunin: “Genetic investigation

and regulation of the porphobilinogen deaminase gene”. Departament of Molecular Medicine, Estocolmo, Suecia.

2. Alcira Batlle: “Porfirias y Porfirinas. Aspectos clínicos, bioquímicos y biología molecular”. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 1997. S3. ISSNN 0325-2957.

3. Piomelli S. A micromethod for free erythrocyte porphyrins: the FEP test.1973. J Lab Clin Med. 81(6):932-40.

4. With TK. 1980. Diagnostic Tests for Porphyria. Laboratory Medicine 11(7): 446-454



TP DE LABORATORIO: DETECCIÓN DE PORFIRINAS Objetivos: - Establecer las bases bioquímicas y moleculares de la patogenia y orientar en el

diagnóstico y tratamiento de las porfirias. TOMA DE LA MUESTRA Y RECOMENDACIONES Existen tres tipos de muestras de principal interés para el diagnóstico de las porfirias:

orina, sangre y heces. Una regla fundamental para todas las muestras es que deben mantenerse refrigeradas a 4ºC y protegidas de la luz.

Las recomendaciones generales para la recolección y transporte de las muestras son las siguientes:

Orina : se requiere orina de 24 horas, para ello deberá descartar la primera del día

anterior a la concurrencia al laboratorio y recoger incluso la primera del día en que tienen turno, recordando que se necesita la totalidad del volumen urinario.

Sangre: Se recogerán entre 10-15 ml de sangre utilizando como anticoagulante

heparina. Es fundamental que la muestra no coagule. Deberá también evitarse congelar y descongelar la muestra para evitar la hemólisis. En caso de sospecha de intoxicación por Pb no pueden usarse recipientes de vidrio para recoger la sangre.

Heces: es necesaria una pequeña fracción, equivalente a una cuchara de té, recogida

en un recipiente limpio sin agregado alguno de conservantes. 1. DETERMINACION CUALITATIVA DE PORFIRINAS EN ORINA Fundamento: Las porfirinas son anfolitos con puntos isoeléctricos alrededor de pH = 3.5. A ese pH se pueden extraer fácilmente de soluciones acuosas por solventes orgánicos

polares como alcohol amílico, éter etílico o acetato de etilo. Materiales: - Tubos de centrífuga cónicos - Lámpara de Wood - Pipeta Pasteur - Tubos para centrifugar Reactivos: - Rvo de extracción: HAc: Alcohol Amílico: Eter Etílico (1:1:1) - HCl 1M Técnica: En un tubo de hemólisis colocar 1 ml del reactivo de extracción y adicionar sobre

éste 1 ml de orina, agitar en el vortex. Después de 2 min. de reposo o hasta cuando se separen las fases, observar en la lámpara de Wood.

En caso (+) se observará en la capa superior fluorescencia roja. En caso (-) se puede aumentar la sensibilidad haciendo una partición con HCl que

proporciona un método útil para su separación de otros pigmentos relacionados. Para ello



sobre un tubo de 1,5 ml que contenga 3 gotas de HCl (agregadas con la pipeta Pasteur) se le agregará TODO el extracto orgánico (capa superior) pero sin tocar la emulsión (interfase). Luego de vortexear el tubo se observa nuevamente en la lámpara de Wood, en caso (+) se observará fluorescencia roja en la capa inferior (clorhídrica).

Comentario: este test da (+) con concentraciones de porfirinas de alrededor de 70

µg/dl (≅1µmol/litro). En pacientes con ataque porfírico agudo, la prueba será positiva si la muestra se ha mantenido a temperatura ambiente unas pocas horas.

2. ESTERIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA E N CAPA DELGADA DE PORFIRINAS URINARIAS

Fundamento: Las porfirinas libres en solución acuosa, llevadas a su punto isoeléctrico, pueden

adsorberse sobre talco y esterificarse con mezcla esterificante de ácido sulfúrico y metanol. Las porfirinas esterificadas se extraen luego con cloroformo.

Posteriormente, se realiza una cromatografía utilizando dos solventes orgánicos, en donde todas las porfirinas son solubles. El grado de solubilidad (y por lo tanto la velocidad de migración) es inversamente proporcional al número de grupos carboxílicos que presenta cada porfirina.

Materiales y Reactivos:

- Talco sin perfume (tipo Venecia) - Ácido acético glacial - H2SO4 concentrado - Metanol - Cloroformo - Bicarbonato de sodio 6% - NaCl 7% - Cromatofolios de sílica gel sin indicador de fluorescencia para cromatografía en capa

fina, 20 cm x 20 cm, espesor de capa: 0,25 mm - Tolueno - Metiletilcetona - Acetato de etilo - Eter de petróleo

Técnica de esterificación: 1) Llevar 10 ml de orina a pH 3-3,5 con 0.5 ml de ácido acético glacial. 2) Agregar una cucharada de talco y agitar. 3) Dejar reposar 5 minutos y centrifugar por 10 minutos a 2000 rpm. 4) Descartar el sobrenadante y lavar el talco 15 de agua destilada. 5) Agregar al precipitado (talco con porfirinas) 10 ml de mezcla esterificante

H2SO4: CH3OH (10%, v/v) (4,5 ml de metanol y 0,5 ml de ácido sulfúrico). Dejar en oscuridad 16-24 h a temperatura ambiente.

6) Centrifugar y extraer el sobrenadante con porciones de 3 ml de cloroformo hasta fluorescencia negativa del talco. En caso de formarse emulsiones, agregar con piseta un chorro de agua destilada a fin de romper la misma.

7) Lavar la fase orgánica con 1 volumen de bicarbonato de sodio 6% (descartar la fase acuosa).

8) Lavar la fase orgánica con 1 volumen de NaCl 7% (descartar la fase acuosa).



9) Filtrar por papel S&S Nº 595 y recoger en tubo graduado. 10) Transferir la fase orgánica a un tubo de hemólisis y concentrar a 80-100° C en

baño de agua. Técnica de Cromatografía en capa delgada de porfirinas esterificadas (TLC):

- Se preparan los soportes (PO) sobre los que se realizará la corrida cromatográfica, para ello se disuelven la sílica del G60 (o el talco), en metanol y luego se sumergen los PO. Se dejan secar.

- Sembrar la fase orgánica concentrada y los testigos o muestra control en los cromatofolios, utilizando capilares, a 1 cm de su borde inferior.

- Colocar luego los PO en la cuba, la cual se ha saturado previamente con el solvente de corrida. 1ra corrida: 30 minutos en tolueno: metiletilcetona (20:1,5; v/v, 20 ml de tolueno y 1,5 ml de metiletilcetona). 2da corrida: 70 minutos en tolueno:acetato de etilo:metanol:éter de petróleo (25:0,5:1:3; v:v:v:v; 25 ml de tolueno, 0,5 ml de acetato de etilo, 1 ml de metanol, 3 ml de éter de petróleo).

- Dejar secar y observar bajo lámpara de Wood fluorescencia roja y comparar la muestra (M1) con los patrones sembrados (U: Uro, C: Copro; P: Proto).

Comentario: En orinas con PCT predominan las Uroporfirinas. Cuando se hace la

cromatografía de muestras de materia fecal, los pacientes con CPH se distinguen de otras porfirias por la presencia de una fuerte mancha de Copro.

3. DETERMINACION CUALITATIVA DE PORFOBILINOGENO EN

ORINA Fundamento: El PBG reacciona con el reactivo de Erlich en medio ácido formando un compuesto

de condensación de color rojo que se puede cuantificar espectrofotométricamente leyendo a 555 nm.



Materiales: - Tubos de hemólisis - 1 pipeta de 5 ml - 1 pipeta Pasteur Reactivos: - Reactivo de Erlich: p-dimetilaminobenzaldehido ----------------- 2 g HCl concentrado ------------------------------- 50 ml H2O destilada ----------------------------------- 50 ml Es estable a tº ambiente y al abrigo de la luz. Técnica: En un tubo de hemólisis, colocar 2 ml del reactivo de Erlich y adicionar 1 ó 2 gotas

de orina. Se forman dos capas, en caso (+) se observa en la capa superior color rojo (en forma inmediata). El test (-) elimina la posibilidad de que los síntomas del paciente se deban a un ataque agudo de Porfiria.

El color amarillo indica la presencia de urea. Si la orina es oscura, se diluye con agua destilada (1:10), y así se observan mejor las reacciones.

Comentario: Esta determinación se debe hacer con orina fresca, si no es posible la orina debe ser llevada a pH 7-8 con NaHCO3 y así es estable a 4ºC al menos una semana.

4. DETERMINACION CUANTITATIVA DE PBG EN ORINA Fundamento: Ídem a 3 Materiales: - Tubos de Hemólisis Técnica: Diluir la orina 1:10 ó 1:100 con agua destilada según la intensidad del color rojo

obtenido en la determinación cualitativa. Colocar 2 ml de orina diluida en un tubo de hemólisis, adicionar 2 ml del Rvo de

Erlich y leer la reacción inmediatamente a 555 nm. Continuar leyendo hasta alcanzar la absorbancia máxima (≅ 2 min.).



Cálculos: PBG (mg/dl)= 1,25 . A555 . D PBG (µmol/L)= 5,54 . A555. D En donde:

A555: es la absorbancia de la muestra a 555 nm D: es la inversa de la dilución realizada 1,25 y 5,54: son factores

Valores Normales: Niños menores de 15 años: 0-11 mg/dl

Adultos: 0-0,2 mg/dl-Excreción máxima: 2 mg/24 hs.

5. DETERMINACION CUANTITATIVA DE PORFIRINAS URINARIAS TOTALES

Fundamento: Oxidación de los porfirinógenos a porfirinas en medio ácido y determinación de la

Banda de Soret de las mismas. Materiales: - Tubos de hemólisis: 1 - Pipetas de 1 ml: 3 Reactivos: - HCl 5M - Agua destilada Técnica: A 0,1 ml de orina del paciente, colocada en un tubo de hemólisis, adicionar 0,2 ml

de HCl 5M y 0,7 ml de agua destilada. Mezclar por inversión. Así la orina es diluida 1:10 con los reactivos.

Leer la muestra a 380 y 430 nm. Determinar el máximo de Soret, leyendo las absorbancias para coproporfirinas entre

400-410 nm y para uroporfirinas entre 400-405 nm. Las lecturas se hacen contra Blanco de agua. Cálculos: Uroporfirinas (µg/dl)= {2. Amax-(A380+A430)}.83,5 Coproporfirinas (µg/dl)= {2. Amax-(A380+A430)}.81,6 Porfirinas Totales (mg/dl)= {2. Amax-(A380+A430)}.4,74 Comentario: Todos los factores presentados en las formulas provienen de una

relación matemática que incluye el volumen de muestra inicial en ml, su correlación a dl, el PM del compuesto en cuestión, etc.

Este método es sensible para concentraciones de porfirinas patológicas. Se observan valores anormales de porfirinas excepto en la Protoporfirina Eritropoyética.



Valores Normales: Coproporfirinas: 34-200 µg/24 horas

52-358 mmol/24 hs Uroporfirinas: Escasa cantidad (15-30µg/24 hs)

6. ANALISIS DE ORINA PARA δ-AMINOLEVULINICO Fundamento: Transformación mediante la reacción de Knorr, del ALA en un compuesto pirrólico

análogo al PBG y cuantificación espectrofotométrica con el reactivo de Erlich. Materiales: - Tubos de ensayo - Tubos de hemolisis - Pipetas - Espectrofotómetro Reactivos: - Buffer acetato pH=4,6 Acetato de Sodio----------136 g Ac. acético glacial---------57 ml Agua destilada--------------hasta 1000 ml.

- Acetilacetona

- Estandar de ALA ALA (Sigma)----------------12 mg Buffer Acetato pH 4,6 ---- 50 ml Técnica:

TUBOS BT T BM M M E H2O (ml) 0,5 0,5 ----- ----- ----- Orina (ml) ----- ----- 0,5 0,5 0,5 Buffer (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Acetilacetona (µl) ----- 150 ----- 150 150 St ALA (µl) ----- 25 ----- ----- 25 H2O (ml) 5 5 5 5 5

Llevar a baño María a ebullición 10 min Enfriar con agua

Extraer 1 1 1 1 1 Colocar en un tubo de hemólisis y agregar

Rvo de Erlich (ml) 1 1 1 1 1 Reposar 15 min. Leer a 555 nm

En donde: BT: Blanco de testigo T: testigo BM: Blanco de muestra M: muestra ME: Muestra enriquecida



El tubo que contiene la muestra y que se encuentra enriquecido con ALA (estándar interno) provee una corrección de la supresión del rvo de Erlich por la orina del paciente. Este método detecta valores de hasta 1 mg/ dl (80 µmol/l).

Cálculos: Restar los valores de BT y BM a los valores del T y M, ME respectivamente. Sin estandar interno:

δ-ALA (mg/dl)= 8,65.AM δ-ALA (µmol/l)= 660.AM

Con estándar interno:

δ-ALA (mg/dl)=4,1.AM AT…….. AME-AM

δ-ALA (µmol/l)= 375.AM AT…… AME-AM

Valores Normales: - Niños menores de 15 años: 0-0,49 mg/dl. - Adultos: 0,1-0,57 mg/dl-Excreción diaria se estima en 1,3 - 7,0 mg/24 hs. 7. ACTIVIDAD DE δ-AMINOLEVULINICO DEHIDRASA Fundamento: Medir la actividad de la enzima δ-ALA dehidrasa eritrocitaria determinando los

moles de PBG formados, los que se dosan espectrofotométricamente con el Rvo de Erlich. Materiales: - Tubos de centrifuga - Pipetas - Espectrofotómetro Reactivos: - Buffer Fosfato 0,5 M pH=6,8 - Buffer Fosfato 0,05 M pH=6,8 - TCA 50% p/ v - Rvo de Erlich - δ-ALA: 0,025 M - Reactivo Hemolizante I: Cod. 1 999 701- 1x500 ml. Wiener Lab. (Bromuro de

tetradeciltrimetilamonio al 0,9%) Técnica: Se extrae sangre de pacientes utilizando como anticoagulante heparina. Se centrifuga

y separan los eritrocitos utilizando como anticoagulante heparina. Se centrifuga y separan los eritrocitos, los que se hemolizan con reactivo hemolizante I. Diluir los glóbulos rojos 1:15 con buffer fosfato 0.05M. Preparar el siguiente sistema de incubación en tubos de centrifuga:

Reactivos B M



H2O (ml) 1,2 1,2 Buffer fosfato 0,5 M (ml) 0,2 0,2 Glóbulos rojos (dil.1:15) (ml) 0,5 0,5 ALA 0,025M (ml) ----- 0,1

Incubar 60´a 37 °C TCA (ml) 0,2 0,2

Centrifugar 5000 rpm durante 5’ Extraer (ml) 1 1 Rvo de Erlich (ml 1 1

Leer en espectrofotómetro a 555 nm a los Cálculos: Restar el valor del B a la M. moles de PBG formados/h/ml de GR= A555. 2,2 . 15 . 1000…

113,6 . 226 .0,5 = A555 . 2,57

En donde: 2,2: volumen final del tubo 15: dilución 113,6: coeficiente de extinción molar 226: PM del PBG 0,5: volumen glóbulos rojos

8. DETERMINACION RAPIDA PARA PORFIRINAS EN SANGRE Fundamento: Ídem a 1 Materiales: - Tubos de centrifuga - Lámpara de Wood - Pipetas de Pasteur Reactivos: - Reactivo I: HAc:AcEt (1:4) - HCl 3M Técnica: Mezclar 1 ml de sangre con 3 ml del reactivo I, colocando la mezcla en un tubo de

centrifuga y agitar enérgicamente, dejar en reposo 10’ para que se separen ambas fases. Centrifugar, para acelerar el proceso y trasvasar el sobrenadante a otro tubo de centrifuga conteniendo 0,5 ml HCl

3M. Agitar vigorosamente y dejar en reposo. Observar la fase inferior a la luz UV. Normalmente esta capa aparece casi negra, mientras que si se encuentra elevada la cantidad de porfirinas, mostrará una fluorescencia rojo-naranja.



9. DETERMINACION DE PROTOPORFIRINAS LIBRES ERITROCITARIAS (PLE). Método de S. Piomelli, (1973)*

Fundamento: Determinación de la fluorescencia de la protoporfirina, previa extracción con mezcla

de acetato de etilo-ácido acético. Reactivos: - Suspensión de celite (al 5% en NaCl 0,9%) - Rvo I: Mezcla de acetato de etilo : HAc (4:1) - HCl 1,5 N Técnica: Se mezclan 20µl de sangre entera con 0,1 ml de la suspensión de celite y se agita en

vórtex. Agregar 2 ml del reactivo I, agitar en vórtex, centrifugar 1 minuto a baja velocidad. Transferir el SN a un tubo de ensayo y agregar 2 ml de HCl 1,5 N, mezclar en el vórtex. Dejar decantar durante 10-15’; la fase superior se extrae con una trompa de agua, descartándose. La fase clorhídrica se trasvasa a una cuba para leer fluorescencia.

Condiciones de lectura en el fluorómetro: λ excitación= 397nm Ancho de ventana: 10nm λ emisión= 622 nm Ancho de ventana: 40nm Para calibrar el fluorómetro se utiliza un estándar de coproporfirinas 50µg/ml (para

la lectura del estándar se utiliza 0,05 µg/ml). Cálculos: µg PLE/100 ml de GR= Fx . [St] . VT . 100

Fs . Vsangre. 1,11 En donde:

Fx: Fluorescencia de la muestra Fs: Fluorescencia del estándar VT: volumen total (2,5 ml) [St]: Concentración del estándar (0,05µg) Volumen de sangre: (0,02 ml)

Conociendo los valores de Ht o Hb, los resultados se expresan como PLE% de glóbulos rojos o como PLE/Hb, respectivamente.



RESUMEN

TRABAJO PRÁCTICO Nº 4: DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE … · Valores Normales: HbA > 97% HbA2 hasta...

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