Aus dem Institut für Anatomie ΙΙ -...

Aus dem Institut für Anatomie ΙΙ:

Experimentelle Morphologie

(Direktor: Prof. Dr. med. Udo Schumacher)

des Zentrums für Experimentelle Medizin

des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf

Die Wirkung des Proteasomeninhibitors Bortezomib auf

humane Neuroblastomzellen in vitro und in vivo in einem Xenograftmodell

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg vorgelegt von

Christina Haane

aus Dorsten

Hamburg 2007

Angenommen von der Medizinischen Fakultät

der Universität Hamburg am: 01.12.2008

Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen

Fakultät der Universität Hamburg

Prüfungsausschuss, der Vorsitzende: Prof. Dr. U. Schumacher

Prüfungsausschuss: 2. Gutachter: Prof. Dr. H.-E. Laack

Prüfungsausschuss: 3. Gutachterin: PD Dr. S. Klutmann

Meinen Eltern

Abkürzungsverzeichnis

I


Abb. Abbildung

Alu Arthrobacter luteus

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CASY Cellcounter Analyser System

CLL Chronisch lymphatische Leukämie

CT Computertomographie

°C Grad Celsius

ddH2O double distilled H2O

evtl. eventuell

[18 F]FDG Fluordeoxyglukose

[18F]FLT Fluorothymidin

g Gramm

GPOH Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie und Hämatologie

h Stunde

HE Hämatoxylin-Eosin

HPLC High Performance Liquid Chromatography

INSS International Neuroblastoma Staging System

i.v. intravenous

kg Kilogramm

KG Körpergewicht

KV Kilo Volt

nm nanometer

nM nano Mol

Nr. Nummer

n.s. nicht signifikant

min Minuten

MHz Megahertz

MRT Magnetresonanztomographie

µm micrometer

* p < 0,05

** p < 0,01

*** p < 0,001


II

PCR Polymerasekettenreaktion

PET Positronenemissionstomographie

s Sekunden

s.c. subcutan

scid Severe combined immune deficiency

SD Standard deviation

SEM Standard error of the mean

Tab. Tabelle

UKE Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

Voxel Volumenenlement (dreidimensionales Pixel)

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

Inhaltsverzeichnis

1

Inhaltsverzeichnis 1

1 Arbeitshypothese und Fragestellung 3

2 Einleitung 4

2.1 Das humane Neuroblastom 4

2.2 Bortezomib 8

3 Material und Methoden 10

3.1 Neuroblastomzelllinien 10

3.2 Bortezomib 10

3.3 Charakterisierung von Bortezomib in vitro 10

3.3.1 Zellproliferationsassay 10

3.3.1.1 Zellkultur 10

3.3.1.2 Detektion von Mykoplasmen in der Zellkultur 11

3.3.1.3 Zellzählung 12

3.3.1.4 Erstellen von Eichkurven 12

3.3.1.5 Zellproliferationsassay mit Zusatz von Bortezomib 13

3.4 Charakterisierung von Bortezomib in vivo 14

3.4.1 Versuchstiere 14

3.4.2 Behandlung der Tiere 15

3.4.3 Histologie 16

3.4.3.1 Primärtumoren 16

3.4.3.1.1 Lichtmikroskopie 16

3.4.3.1.2 Elektronenmikroskopie 17

3.4.3.2 Lungenmetastasierung 17

3.4.4 Disseminierte Tumorzellen im Blut 18

3.4.5 Imaging 19

3.4.5.1 Magnetresonanztomographie 19

Inhaltsverzeichnis

2

3.4.5.2 Positronen-Emissions-Tomographie /

Computer Tomographie 20

3.5 Statistische Auswertung 22

4 Ergebnisse 23

4.1 Wirkung von Bortezomib in vitro 23

4.2 Wirkung von Bortezomib in vivo 28

4.2.1 Primärtumor 28

4.2.1.1 Lichtmikroskopie 29

4.2.1.2 Elektronenmikroskopie 33

4.2.2 Lungenmetastasierung 35

4.2.3 Disseminierte Tumorzellen im Blut 36

4.2.4 Imaging 39

4.2.4.1 MRT 39

4.2.4.2 PET-CT 43

5 Diskussion 47

6 Zusammenfassung 59

7 Literaturverzeichnis 60

Danksagung 67

Lebenslauf 68

Selbstständigkeitserklärung 69

Arbeitshypothese und Fragestellung

3

1 Arbeitshypothese und Fragestellung

Bei Kindern mit der Diagnose Neuroblastom ist die Prognose häufig infaust, so dass ein

großes Interesse für neue Therapieansätze besteht. Besonders bei dem großen Anteil der

Patienten, die sich im Stadium IV befinden, ist die Aussicht auf Heilung äußerst gering. Bei

Einsatz des Proteasomeninhibitors Bortezomib wurden bereits antiproliferative Wirkungen bei

verschiedenen Tumorentitäten nachgewiesen. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit

folgende Fragen zu klären:

• Hat der Proteasomeninhibitor Bortezomib eine wachstumshemmende

Wirkung auf die humanen Neuroblastomzelllinien in vitro?

• Hat das Medikament Bortezomib auch eine antiproliferative Wirkung in vivo,

wenn humane Neuroblastomzellen in scid – Mäuse transplantiert werden?

• Gibt es Unterschiede zwischen der behandelten Bortezomibgruppe und der

Kontrollgruppe in Hinblick auf Apoptosen und Mitosen der Primärtumoren,

sowie der Anzahl der Spontanmetastasen in den Lungen und der Anzahl der

freien Tumorzellen im Blut?

• Können die Imagingverfahren MRT und PET-CT die humanen

Neuroblastome im scid -Mausmodell charakterisieren?

Einleitung

4

2 Einleitung

2.1 Das Neuroblastom

Das Neuroblastom ist mit 7 - 14% aller kindlichen Tumoren der häufigste extrakranielle solide

Tumor des Kindesalters (Morgenstern et al., 2004). In Deutschland liegt die Zahl der

Neuerkrankungen bei 120 - 130 Fällen pro Jahr. Die Inzidenz liegt bei circa 1,3 Erkrankungen

auf 100.000 Kinder, die sich in einem Alter unter 15 Jahren befinden (Hero und Berthold,

2002; Schwab et al., 2003; Simon, 2005). Das Neuroblastom gehört zu den embryonalen

Tumoren, die charakteristischerweise in 90% der Fälle in einem Alter von unter 5 Jahren

diagnostiziert werden (Schwab et al., 2003). Das mittlere Lebensalter der Patienten liegt bei

unter zwei Jahren und 35% der Kinder erkranken bereits in einem Alter von unter einem Jahr

(Morgenstern et al., 2004).

Es handelt sich um eine maligne Erkrankung, die von primitiven sympathischen neuralen

Vorläufern des Nervengewebes ausgeht (Brodeur, 2003). Histologisch findet man zwei

verschiedene Zelltypen, die Neuroblast / Ganglienzelle und die Schwann-Zellen. Letztere sind

vermutlich nicht neoplastisch, werden aber wahrscheinlich als Stromazelle von den

Tumorzellen rekrutiert (Koletzko, 2003).

Aufgrund seiner Histogenese, kann das Neuroblastom überall dort auftreten, wo

sympathisches Nervengewebe zu finden ist. In erster Linie entstehen Neuroblastome deshalb

im Nebennierenmark. Die übrigen Lokalisationen verteilen sich, vom Retroperitonealraum

ausgehend, in den paraspinalen Ganglien von Thorax, Abdomen oder Pelvis (Brodeur, 2003).

Die Ausbreitung des Neuroblastoms erfolgt durch infiltratives Wachstum und durch

lymphogene und hämatogene Metastasierung. Diese erfolgt zumeist in das Knochenmark, in

Fernlymphknoten und in die Leber, seltener in die Haut, ins Gehirn und in die Lunge (Hero

und Berthold, 2002; Simon, 2005). Das Stadium IV-S nimmt eine Sonderstellung ein. Hierbei

ist das Erkrankungsalter auf das erste Lebensjahr begrenzt, es findet sich ein lokalisierter

Primärtumor mit Metastasen, die sich definitionsgemäß allerdings nur im Knochenmark, in der

Haut oder in der Leber befinden dürfen (Hero und Berthold, 2002).

Die betroffenen Kinder leiden sowohl unter Krankheitszeichen, die direkt auf den Tumor

zurückzuführen sind, als auch unter so genannten Allgemeinsymptomen. Entsprechend der

verschiedenen Ursprungsorte kann ein Neuroblastom durch unterschiedliche Symptome

auffallen wie z. B. ein tastbarer Knoten im Bauchraum, Atembeschwerden, Husten und

verdickte Halslymphknoten oder auch Anzeichen einer Querschnittslähmung durch

Einleitung

5

Vorwachsen des Tumors in Richtung Rückenmark. Als Allgemeinsymptome können Blässe,

Gewichtsverlust, Fieber und Durchfall auftreten (Simon et al., 2004; Simon, 2005).

Der Verdacht auf das Vorliegen eines Neuroblastoms ergibt sich aus den typischen

Beschwerden und dem Befund der körperlichen Untersuchung. Häufig wird ein Neuroblastom

aber auch zufällig im Rahmen einer Routineuntersuchung entdeckt. Die Diagnosesicherung

erfolgt durch weiterführende Untersuchungen: Blut- und Urinuntersuchung auf

Katecholaminmetabolite, feingewebliche Beurteilung eines Biopsats, Röntgenuntersuchung

des Brustkorbs, Ultraschalluntersuchung des Bauchraums, Computer- und

Kernspintomographie und Szintigraphie.

Ein System zum Staging des Neuroblastoms stellt das INSS (=International Neuroblastoma

Staging System) dar. Zusätzlich können verschiedene Parameter wie z.B. der Ferritin-Spiegel

bestimmt werden, um die Staging Analyse zu vervollständigen.

Stadium Kriterien I Lokalisierter Tumor mit makroskopisch kompletter Entfernung, repräsentative

ipsi- und contralaterale Lymphknoten histologisch ohne Tumorbefall. Lediglich unmittelbar am Tumor adhärente, chirurgisch entfernte Lymphknoten dürfen positiv sein. Auch bilaterale Tumoren, die makroskopisch komplett exstirpiert werden können und keinen regionalen Lymphknotenbefall aufweisen

IIa Unilateraler Tumor mit makroskopisch inkompletter Resektion, ipsi- und contralaterale Lymphknoten histologisch negativ

IIb Tumor wie bei IIa, jedoch positive regionale ipsilaterale Lymphknoten III Nichtresektabler unilateraler Tumor infiltriert über die Mittellinie mit oder ohne

Lymphknotenbefall oder Nichtresektabler Mittellinientumor mit bilateraler Ausdehnung durch Infiltration oder Lymphknotenbefall (Das Überschreiten der Mittellinie ist definiert durch infiltratives Erreichen / Überschreiten der Wirbelkante der Gegenseite)

IV Tumoraussaat in Lymphknoten, Knochen, Knochenmark, Leber und andere Organe

IV-S Sonderform, nur bei Säuglingen im 1. Lebensjahr, lokalisierter Primärtumor wie bei Stadium I, IIa oder IIb, Tumoraussaat nur in Leber, Haut und/oder Knochenmark

Tab. 1: Internationale Stadieneinteilung des Neuroblastoms nach INSS (Simon, 2005).

Einleitung

6

Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Kriterien, wobei das Alter ein ganz

entscheidender prognostischer Faktor darstellt. Die angefügte Tabelle 2. verdeutlicht die

vergleichsweise guten Heilungschancen bei Kindern unter 1 Jahr im Gegensatz zu Kindern,

die bei Diagnosestellung älter als 1 Jahr sind.

Alter

Stadium

Anteil Neuroblastome in der Altersgruppe

(%)

5-Jahresüberlebensrate

(%)

< 1 Jahr I-III 61 95 +/-1 IV 13 53 +/-6 IV-S 26 79 +/-4

> 1 Jahr I-III 45 76 +/-2 IV 55 20 +/-2

Tab. 2: Überlebenswahrscheinlichkeit beim Neuroblastom in Abhängigkeit von Alter und Stadium (GPOH- Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie und Hämatologie, Koletzko, 2003). Dabei waren 615 Kinder < 1 Jahr und 1028 Kinder > 1 Jahr.

Das Tumorstadium, das vor allem auch durch das Ausmaß der Metastasierung bestimmt wird,

ist ebenfalls für die prognostische Einschätzung wichtig. Weitere klinische Marker, die mit der

Prognose des Neuroblastoms korrelieren, sind die Serummarker LDH und Ferritin.

Zunehmende Bedeutung als Risikofaktoren erlangen die bereits oben beschriebenen

molekulargenetischen Veränderungen. Der wichtigste relevante Marker ist die Amplifikation

des MYC-N, die mit einer deutlich schlechteren Überlebensrate einhergeht (Hero und

Berthold, 2002). Daneben gibt es weitere zahlreiche molekulare Marker (Status Chromosom

1p, 11q, 3p, Expression des Adhäsionsmolekül CD44, Telomeraseaktivität, Caspase 8 als

mögliches Tumorsuppressorgen, etc.), die in der Zukunft zunehmend an Bedeutung erlangen

könnten, deren klinische Wertigkeit zum Teil aber noch nicht endgültig geklärt werden konnte

(Hero und Berthold, 2002; Schwab et al., 2003; Simon et al., 2004; Simon, 2005).

Die Behandlung des Tumors richtet sich nach den prognostischen Faktoren wie z. B. Stadium,

Alter, molekulargenetische Marker (Interdisziplinäre Leitlinien 2004, Deutsche

Krebsgesellschaft e.V., Frankfurt). Erst nach einem kompletten Staging kann die Operation als

erste therapeutische Maßnahme empfohlen werden. In einem Ersteingriff geht es um

Diagnosesicherung und Resektion des Tumors. Wenn histologisch und molekulargenetisch

die Diagnose gesichert wurde, erfolgt die Einteilung in der Regel in 3 Behandlungsgruppen:

Beobachtungs-, Standardrisiko- und Hochrisikogruppe. In Abhängigkeit von der Risikogruppe

reichen die therapeutischen Interventionen von alleiniger Operation bis hin zur

Einleitung

7

Maximaltherapie (Interdisziplinäre Leitlinien: Deutsche Krebsgesellschaft e.V. Frankfurt,

2004).

Das Therapiekonzept Beobachtungsgruppe besteht nach der Operation aus regelmäßigen

Kontrollen und eventuell einer leichten Chemotherapie. Die Patienten mit einem

Standardrisiko bekommen nach der Operation eine Chemotherapie. Je nach Ansprechen im

Therapieverlauf kann eine sekundäre Tumoroperation oder eine Strahlentherapie notwendig

sein. Hingegen werden Patienten mit einem Hochrisiko - Neuroblastom sowohl primär operiert

als auch adjuvant / palliativ mit Chemotherapie und Strahlentherapie behandelt. Je nach

Ansprechen kann eine Second-Look-Operation erfolgen (Simon, 2005; Hero und Berthold,

2002).

Im Rahmen von Tumorstudien erhalten alle Patienten anschließend eine

Hochdosischemotherapie mit autologer Stammzelltransplantation (Simon, 2005). In der Regel

wird die Behandlung der Hochrisikogruppe durch weitere konsolidierende Therapieverfahren

ergänzt, z. B. Immuntherapie mit Antikörpern. Morgenstern et al., (2004) und Brodeur et al.,

(2003) berichteten von einer biologischen Therapie mit cis-Retinsäure, welche gute Resultate

nach autologer Stammzelltransplantation zeigte. Fang et al., (2006) berichteten von H+linked

monocarboxylate transporter (MCT1 / SLC 16A1), die einen Erfolg versprechenden Einfluss

auf das Tumorwachstum von Hochrisikopatienten haben sollen. Simon (2005) wies weiterhin

auf neue Ansätze der Tumorvakzinierung mit dendritischen Zellen hin. All diese

verschiedenen Therapieansätze sind Gegenstand aktueller klinischer Studien.

Die Behandlung von Patienten mit Neuroblastom im Stadium IV-S nimmt eine Sonderstellung

ein, da Tumor und Metastasen oft spontan regredieren. Beim Auftreten von Lebermetastasen

oder Bedrohung durch Tumormassen kann auch hier eine milde Chemotherapie erforderlich

sein (Interdisziplinäre Leitlinien 2004, Deutsche Krebsgesellschaft, e.V. Frankfurt).

Diese Therapieansätze führen aber noch immer nicht zu einem durchschlagenden Erfolg in

der Behandlung des Neuroblastoms. Insbesondere Hochrisikopatienten im Stadium IV haben

eine Fünfjahresüblerlebensrate von 20 ± 2%. Die hohe Mortalität (je nach Stadium bis zu

80%) dieses kindlichen Tumors (Koletzko 2003, Berthold et al., 2005) macht die Dringlichkeit

der Suche nach weiteren Therapieoptionen deutlich. Ein solcher neuer Ansatzpunkt besteht

möglicherweise in der Beeinflussung der Tumorzellen durch den Proteasomeninhibitor

Bortezomib (Velcade ®).

Einleitung

8

2.2 Bortezomib

Bortezomib ist das erste zugelassene Medikament aus der neuen Wirkstoffklasse der

Proteasomeninhibitoren. Bortezomib hemmt spezifisch die Aktivität des ubiquitär

vorkommenden 26S-Proteasoms in Säugetierzellen. Das Proteasom ist ein essentieller

Enzymkomplex, welches Apoptose, Transkription, Zelladhäsion, Angiogenese,

Antigenpräsentation und den Zellzyklus reguliert (Le Blanc, 2002). In vielfachen Studien

wurde gezeigt, dass durch die Inhibition des Proteasoms die Tumorgröße verringert werden

kann. Beispiele hierfür sind das maligne Myelom (Hidshima et al., 2001; Katayoun et al.,

2004), das Mantelzelllymphom (Pham et al., 2003), das nichtkleinzellige Lungenkarzinom

(Ling et al., 2003), das Ovarialkarzinom (Frankel et al., 2000), das Pankreaskarzinom (Shah

et al., 2001; Bold et al., 2001), das Prostatakarzinom (Adams et al., 1999; Frankel et al.,

2000) und bösartige Tumoren im Kopf – Halsbereich (Sunwoo et al. 2001, van Waes et al.,

2005). Neueste Studien von Michaelis et al. (2006), Brignole et al. (2006) und Hamner et al.

(2007) zeigten erstmals antiproliferative Wirkungen auf humane Neuroblastomzelllinien in

vitro und in vivo. Zudem konnte in einer Phase Ι Studie bei pädiatrischen Patienten mit

refraktären soliden Tumoren (inklusive 2 Patienten mit Neuroblastom) gezeigt werden, dass

Bortezomib ein gut tolerables Medikament ist, welches nur eine geringe Toxizität aufweist

(Blaney et al., 2004).

Der molekulare Mechanismus, mit dem Bortezomib die Apoptose der Tumorzellen induziert, ist

weitestgehend unklar. Vermutet wird eine Veränderung der Balance zwischen pro- und

antiapoptotischen Signalen (Adams, 2003). Ein Molekül, das eine zentrale Rolle in der

Vermittlung vieler Effekte des Bortezomibs darstellt, ist der Transkriptionsfaktor NF-κB (Karin et

al., 2002). NF-κB liegt normalerweise im Zytosol im Komplex mit dem Inhibitormolekül IκB vor.

Durch zellulären Stress wird IκB durch die Proteasomen abgebaut, so dass es zur Aktivierung

von NF-κB kommt. Durch Bortezomib kann die Elimination des IκB reduziert werden und

folglich die Aktivität von NF-κB gehemmt werden. Beim Multiplen Myelom konnte weiter

beobachtet werden, dass Bortezomib die IL-6 induzierten Wachstumsstimulationen durch

Verminderung von gp 130 induziert. Dies wiederum führt zu einer vermehrten Aktivität von

Caspase 3 und somit zu einer verstärkten Apoptoseaktivität (Ludwig, 2004).

Weitere Studien haben gezeigt, dass Tumorzellen empfindlicher gegenüber den Effekten des

Bortezomibs sind als normale Zellen. Durch die Reversibilität der Proteasomeninhibition mit

Bortezomib erholten sich periphere mononukleare Blutzellen sehr schnell. Tumorzellen

hingegen waren dazu nicht in der Lage und gingen in Apoptose (Richardson, 2003). Testungen

Einleitung

9

des Medikamentes an normalen diploiden Zellen, wie z.B. humane Fibroblasten zeigten

wiederholt keine Effekte (Brignole et al., 2006).

Abb. 1: Intrazelluläre Signalkaskade des Transkriptionsfaktor NF-κκκκB (modifiziert nach Adams, 2003). Die Abbildung stellt den Zusammenhang zwischen NF-κB und seinem Inhibitor IκB dar. Weiterhin wird gezeigt, dass bei Einfluss von zellulärem Stress IκB durch Proteasomen abgebaut wird und NF-κB somit aktiv wird. Bortezomib greift in diesen Mechanismus ein und verhindert die Elimination von IκB.

Material und Methoden

10

3 Material und Methoden

3.1 Neuroblastomzelllinien

Es wurden sieben verschiedene humane Neuroblastomzelllinien (Kelly, LS, SH-SY5Y, SK-N-

SH, IMR-32, LAN-1 und LAN-5) untersucht. Die Zelllinien Kelly, LAN-1, LAN-5, SK-N-SH und

IMR-32 wurden uns freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Erttmann (Abteilung Pädiatrische

Onkologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die

Zelllinien LS und SH-SY5Y wurden uns freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Hildebrandt

(Abteilung Zelluläre Chemie, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland) zur

Verfügung gestellt.

3.2 Bortezomib (Velcade®)

Das Medikament Bortezomib wurde von der Firma Janssen Pharmaceutica N.V. (Beerse,

Belgien) über die Apotheke des Universitätsklinikums bezogen und als steriles Pulver in einer

Packungsgröße von 3,5 mg geliefert. Aus diesem Pulver wurde dann durch Zugabe von 3,5

ml PBS eine Stammlösung hergestellt, deren Konzentration 1 mg / ml betrug. Gelagert wurde

die Stammlösung dann bei – 20° C im Gefrierschrank.

Bei jedem Versuch wurde diese Stammlösung erneut aufgetaut und in einer

Verdünnungsreihe wurden die zu untersuchenden Konzentrationen hergestellt (siehe 3.3.1.5).

3.3. Charakterisierung von Bortezomib in vitro

3.3.1 Zellproliferationsassays

3.3.1.1 Zellkultur

Die Arbeiten mit den Zelllinien erfolgten unter einer Hera Safe Sicherheitswerkbank (Heraeus

Instruments, Hanau, Deutschland) unter sterilen Bedingungen. In 50 ml Zellkulturfalschen

(Nunclon®, Nunc, Roskilde, Dänemark) erfolgte die Kultivierung der Zelllinien unter

Standardbedingungen (37° C, 100% Luftfeuchtigkeit, 5% CO2 / 95% Luft) in einem Hera Cell

Brutschrank (Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland). Als Nährmedium wurde RPMI

Medium (Gibco/Life Technologies, Paisley, Scotland) verwendet, welches zusätzlich mit 10%

hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FCS, Gibco®), 2 mM L-Glutamin (Gibco®), sowie 100


11

U / ml Penicillin und 100 µg / ml Streptomycin (Gibco®) versetzt wurde. Dieses Medium wird

im Weiteren als Kulturmedium bezeichnet und wurde 2 – 3 mal pro Woche gewechselt. Wenn

die Zellen konfluent gewachsen waren, wurden sie passagiert. Hierzu wurde das alte

Kulturmedium abgesaugt, die Zellen wurden mit 5 ml PBS (Gibco® Dulbecco´s Phosphate-

Buffered Saline, Invitrogen, Carlsbad, USA) gespült, anschließend für fünf Minuten mit je 5 ml

Trypsin-EDTA (Gibco®) versetzt und darauf folgend bei 37° C und 5% CO2 5 Minuten

inkubiert. Nach dem Ablösen der Zellen vom Flaschenboden, erfolgte die Zugabe von 5 ml

Kulturmedium, um das Trypsin zu inaktivieren und so eine Schädigung der Zellen durch das

Trypsin-EDTA zu verhindern. Abschließend wurden die abgelösten Zellen auf neue

Zellkulturflaschen verteilt, die zuvor mit 15 ml Kulturmedium aufgefüllt waren, oder die Zellen

wurden für die Zellproliferationsexperimente eingesetzt. Da für die Standardisierung und

Reproduktion der Experimente eine hohe Zellzahl erforderlich war, wurden vor Beginn aller

Experimente alle sieben Zelllinien über mehrere Wochen in Zellkulturflaschen vermehrt und

ein Suspensionspool von jeder der sieben Zelllinien erstellt. Die Suspensionen wurden fünf

Minuten bei 1500 U / min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die entstandenen

Zellpellets wurden mit Gefriermedium (Cryo-safe Ir, c.c. pro GmbH, Neustadt, Deutschland)

resuspendiert und in Einfrierröhrchen (Nunc Cryo Tube Vials, Nalge Nunc International

Naperville, Roskilde, Dänemark) auf identische Aliquots von 1,5 ml verteilt. Über Nacht

wurden die Aliquots auf - 80° C gekühlt und abschließend in flüssigem Stickstoff

kryokonserviert. Für die weiteren beschriebenen Zellproliferationsexperimente wurden jeweils

ein bis zwei Aliquots pro Zelllinie aufgetaut, auf Zellkulturflaschen verteilt und ca. drei bis vier

Wochen kultiviert, bis eine ausreichende Zellzahl herangewachsen war, um die Versuche

durchführen zu können.

3.3.1.2 Detektion von Mykoplasmen-Kontamination in der Zellkultur

Zur Überprüfung der Zellkultur auf Kontamination durch Mykoplasmen wurde das VenorGeM®

Mykoplasmen-Detektionskit (Minerva Biolabs GmbH, Berlin, Deutschland) auf der Basis der

Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. Der Test ist zum Nachweis der typischerweise als

Kontamination in Zellkulturen auftretenden Mykoplasmenspezies geeignet und wurde

entsprechend der Angaben des Herstellers durchgeführt. Bei keiner der Zelllinien konnte eine

Kontamination durch Mykoplasmen nachgewiesen werden.


12

3.3.1.3 Zellzählung

Die Bestimmung der Zellzahl wurde mittels des CASY®-Cell Counter Analyser System

(CASY®-Technology, Schärfe System GmbH, Reutlingen, Deutschland) durchgeführt. Dabei

wurden vitale Zellen gezählt. Für die Messung wurden die Zellen in einer speziellen

Elektrolytlösung (CASY®ton) suspendiert und anschließend durch eine Präzisionsmesspore

gesaugt.

3.3.1.4 Erstellen von Eichkurven

In den folgenden Zellproliferationsassays wurde der Einfluss des Proteasomeninhibitors

Bortezomib der Firma Janssen Pharmaceutica N.V., (Beerse, Belgien) mit Hilfe des XTT-

Zellproliferationskit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) untersucht. Zur

Erstellung der Eichreihen wurde für jede Zelllinie eine Verdünnungsreihe mit sieben (Kelly,

LAN-1, LAN-5, SH-SY5Y, IMR-32, LS) bzw. zehn (SK-N-SH) verschiedenen

Zellkonzentrationen erstellt. Jeweils 80 µl der Zellsuspensionen wurden in die Vertiefungen

einer 96er Mikrotiterplatte (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert. Als Leerwert für

den ELISA-Reader wurden 80 µl Kulturmedium verwendet. Jeder Ansatz wurde fünffach

getestet. Die Platten wurden im Brutschrank für 24 Stunden unter Standardbedingungen

präinkubiert. Dann wurden 20 µl PBS zu den Testansätzen gegeben, was der Menge der in

den endgültigen Versuchen zugefügten Substanz Bortezomib gelöst in PBS entsprach.

Anschließend wurden die Zellen für 48 Stunden im Brutschrank unter Standardbedingungen

inkubiert. Zur Ermittlung der Zelldichte wurde 72 Stunden nach dem Aussäen der Cell

Proliferation Kit II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) benutzt. Dafür wurde

XTT labeling reagent und electron coupling reagent in einer Konzentration von 50 : 1

gemischt, was einer XTT Endkonzentration von 0,3 mg / ml entspricht. Von dieser

Konzentration wurden jeweils 50 µl in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben und die

Platten wurden zur weiteren Inkubation in den Brutschrank gestellt. Die Extinktion wurde nach

4, 6 und 24 Stunden bei 450 nm im ELISA Reader Dynatch MR3.13 (Dynex Technologies,

Ashford, UK) gemessen. Für die Zelllinien Kelly, LAN-1, LAN- 5, IMR-32, LS und SK-N-SH

stellten sich 6 Stunden und für SH-SY5Y 24 Stunden als eine optimale Inkubationszeit mit

XTT heraus. Die Zellkonzentrationen, die nach 72 Stunden Wachstum im exponentiellen

Bereich der Eichkurve lagen, wurden zum Aussäen der einzelnen Neuroblastomzellreihen

angewandt. Die jeweiligen Zellzahlen / ml sind in der Tabelle 3 zusammengefasst.


13

Zelllinie Kelly LAN-1 LAN-5 LS SK-N-SH SH-SY5Y IMR-32

Zellzahl / ml 150.000 150.000 200.000 70.000 60.000 420.000 700.000

Tab. 3: Zellzahlen / ml der Neuroblastomzelllinien, die ein geeignetes Wachstum über die Versuchsdauer von 72 Stunden gezeigt haben.

Exemplarisch ist in Abbildung 2 der Eichkurvenverlauf der Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y

dargestellt. Hierbei ist die unterschiedliche Absorption des XTTs nach 4, 6 und 24 Stunden zu

sehen.

SH-SY5Y

104 105 106

0

1

24h

6h

24h

Zellen / ml

Ab

so

rpti

on

Abb. 2: Eichkurve der Zelllinie SH-SY5Y. Dargestellt ist die unterschiedliche Absorption nach 4, 6 und 24 Stunden. Die optimale Absorption fand nach 24 Stunden statt, aus diesem Grund wurden alle weiteren Ergebnisse der anschließend durchgeführten Versuche der Zelllinie SH-SY5Y nach 24 h abgelesen.

3.3.1.5 Zellproliferationsassay mit Zusatz von Bortezomib (Velcade ®)

Auf den einzelnen Mikrotiterplatten wurde jeder Versuch in einem Fünffachansatz

durchgeführt. Jeder Versuch wurde in mindestens vier unabhängigen Versuchen wiederholt,

dieses Vorgehen galt für alle sieben Zelllinien, die mit Bortezomib getestet wurden. Zu Beginn

wurden 80 µl Medium in die Vertiefungen als Leerwert für den Zellproliferationsassay

pipettiert. Die restlichen Vertiefungen wurden jeweils mit 80 µl der erstellten optimalen

Zellkonzentration gefüllt. Anschließend wurden die pipettierten Mikrotiterplatten für 24

Stunden im Brutschrank (unter Standardbedingungen) inkubiert, um ein ideales Anwachsen


14

der Zellen zu gewährleisten. Die Testlösungen wurden hergestellt, indem die Stammlösung

von Bortezomib (1 mg / ml) mit PBS in einer Verdünnungsreihe (1:10) versetzt wurde.

Insgesamt wurden sechs verschiedene Konzentrationen in einer Verdünnungsreihe von 100

µg / ml bis 0,001 µg / ml des Bortezomib hergestellt. 20 µl dieser Verdünnungen wurden

dann jeweils zu den 80 µl Medium in die Vertiefungen gegeben. Dies entsprach dann einer

Endkonzentration von 20 µg / ml bis 0,0002 µg / ml des Medikamentes. Die Mikrotiterplatte

wurde nach Medikamentengabe für weitere 48 Stunden im Brutschrank (unter

Standardbedingungen) inkubiert.

72 Stunden nach dem Aussäen der Zelllinien, wurde zur Auswertung der Cell Proliferation Kit

II (XTT) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) verwendet. Von dieser XTT-Lösung wurden

anschließend 50 µl in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben. Bei den Zelllinien Kelly,

LAN-1, LAN-5, SK-N-SH, LS und IMR-32 wurden nach 6 Stunden und bei der Zelllinie SH-

SY5Y nach 24 Stunden bei einer Testfilter-Wellenlänge von 490 nm und einer Referenzfilter-

Wellenlänge von 630 nm die Messungen durchgeführt. Die Ergebnisse der Kontrolle dienten

dann bei der Auswertung des Proliferationsassays als 100% Zellwachstum, zu denen die

übrigen Werte in Relation gesetzt wurden.

3.4 Charakterisierung von Bortezomib in vivo

3.4.1 Severe combined immuno deficiency Mausmodell

3.4.1.1 Versuchstiere

Die Versuche wurden an männlichen und weiblichen severe combined immuno deficiency

(scid) Mäusen der Firma Charles River durchgeführt. Die Tiere sind in der 48. Kalenderwoche

2005 geboren und waren zu Versuchsbeginn 15 Wochen alt. Die Tiere hatten im Mittel ein

Gewicht von 25 g mit einer Standardabweichung von 3,2 g. Die Haltung erfolgte in Filter-Top

Käfigen in Gruppen zu jeweils 5 Tieren bei einer Raumtemperatur von 19 – 21° C und unter

Beibehaltung des normalen Tag-Nacht-Rhythmus (Dunkelphase von 19 – 7 Uhr). Die Tiere

erhielten steriles Wasser und steriles Standard-Einstreufutter (sniff M-Z Alleindiät extrudiert,

sniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland) ad libitum und wurden mindestens 6 – 8 Tage

vor Versuchsbeginn zur Akklimatisierung und Eingewöhnung im Tierstall des

Universitätsklinikums Hamburg–Eppendorf (Haus Süderfeldstraße) gehalten. Der im Rahmen

dieser Arbeit durchgeführte Tierversuch wurde nach § 8 des Tierschutzgesetzes von 1998 der

Bundesrepublik Deutschland unter der Versuchsnummer: 64 / 05 von der Behörde für Umwelt

und Gesundheit in Hamburg genehmigt.


15

Während der Studie ist die scid-Maus Nr. 8.3 (Bortezomibgruppe) aus unbekannter Ursache

verstorben. Es gab keine Anzeichen dafür, dass der Tumor oder die Behandlung mit

Bortezomib Einfluss auf den Gesundheitszustand des Tieres genommen hatten.

3.4.2 Behandlung der Tiere

Für den Tierversuch wurde die Zelllinie SK-N-SH ausgewählt, da diese Zelllinie in bereits

durchgeführten Tierversuchen unseres Institutes ein gutes Tumorwachstum und eine hohe

Metastasierungsrate aufwies (Ursula Valentiner, unveröffentlicht).

Aus den in flüssigem Stickstoff gelagerten Zellpoolen wurden je zwei Aliquots der SK-N-SH

Zellen aufgetaut, mindestens zwei Wochen lang kultiviert und anschließend hinsichtlich ihrer

Vitalität geprüft. Nach Absaugen des Kulturmediums und zweifacher Spülung im eisgekühlten

PBS wurden die Zellen mittels Trypsinierung gelöst und bei 1500 U / min fünf Minuten

zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt. Die Zellpellets wurden mit jeweils 1 ml

Kulturmedium resuspendiert und alle Zellen der jeweiligen Zelllinie wurden erneut gepoolt.

Nach Herstellung einer 1 : 10 Verdünnung wurde die Zellzahl der Suspension durch das

CASY®-Cell Counter Analyser System (CASY®-Technology, Schärfe System GmbH,

Reutlingen, Deutschland) bestimmt. Die Suspension wurde dann wieder zentrifugiert und die

Zellpellets wurden nach Absaugen des Überstandes mit Kulturmedium ohne FCS

resuspendiert und die Zellzahl wurde auf 5 x 106 Zellen / ml eingestellt. Die Tiere wurden mit

einem Narkosegemisch aus 20% O2 und 80% CO2 anästhesiert und danach wurden jedem

Tier 1 x 106 Zellen gelöst in 200 µl Kulturmedium subkutan zwischen die Schulterblätter

injiziert. Drei Tage nach der Tumorzellinjektion wurden die vorher in Kontrollgruppe und

Bortezomibgruppe eingeteilten Tiere, zwei mal pro Woche mit dem gleichen Verhältnis an

Narkosegemisch betäubt. Danach wurden den 20 Tieren der Behandlungsgruppe 0,2 ml der

Medikamentenlösung (Bortezomib: 1 mg / ml) in die Schwanzvene gespritzt. Dies entspricht

einer Menge von 1 mg / kg KG (Körpergewicht). Die 20 Mäuse der Kontrollgruppe erhielten

0,2 ml PBS intravenös verabreicht. Der Gesundheitszustand der Tiere wurde regelmäßig

kontrolliert. Es konnte keine Veränderung der scid-Mäuse im Verlauf der Behandlung mit dem

Medikament Bortezomib festgestellt werden. Nach 31 Tagen Behandlung (insgesamt 9

Injektionen) wurde bei den Tieren ein Imaging mittels MRT und PET-CT durchgeführt.

Abschließend erfolgte eine Betäubung der scid-Mäuse mit einem Narkosegemisch (0,1 ml / 10

g Körpergewicht) bestehend aus Rompun-Ketanest (0,8 ml Rompun 2% (Bayer Leverkusen,

Deutschland) und 1,2 ml Ketamin Gräub (100 mg / ml; Albrecht, Aulendorf, Deutschland) in 8


16

ml 0,9% NaCl). Die Tiere wurden nach Blutentnahme aus dem Augenplexus durch cervicale

Dislokation getötet. Danach wurden die Primärtumoren und die Lungen herauspräpariert. Die

Primärtumoren wurden gewogen und in beschriftete Gitterkörbchen überführt. Zur späteren

Einbettung in Paraffin nach einem automatisierten Standardverfahren wurden sie vorerst für

zwei Tage in 4% gepuffertem Formalin für 48 Stunden fixiert. Die Lungen wurden en bloc in

gepuffertem, mit 0,1 mol Phosphatpuffer (zusammengesetzt aus Natriumdihydrogenphosphat

und Dinatriumphosphat) angesetztem Formalin für 48 Stunden fixiert. Anschließend wurden

sie unter einem Stereo-Mikroskop in 1 mm dicke Scheiben geschnitten. Die Schnittdicke

wurde durch unter der Glasplatte liegendes Millimeterpapier kontrolliert. Die Lungenschnitte

wurden zufällig über einen Objektträger verteilt, in 4% igem Ager eingelegt und mit einem

Deckgläschen zusammengedrückt. Dieser Block wurde dann, wie zuvor beschrieben, in

Paraffin eingebettet. Die verdichteten Agarblöcke waren somit für die Histologie vorbereitet.

3.4.3 Histologie

3.4.3.1 Primärtumor

3.4.3.1.1 Lichtmikroskopie

Von den in Paraffin eingebetteten Primärtumoren wurden mit einem Mikrotom (Mircrom,

Techno Med GmbH, Bielefeld) 5 µm dicke Paraffinschnitte angefertigt. Diese wurden

anschließend in ein Wärmebad überführt und auf einen beschichteten Objektträger (Histo

Bond, Marienfeld, Deutschland) aufgenommen. Danach wurden die Schnitte für 24 Stunden

im Wärmeschrank bei 37° C getrocknet und anschließend mit Hämatoxylin – Eosin (HE)

gefärbt. Dieses wurde nach einem Standardprotokoll in einem Färbeautomaten (Varistain,

Shandon, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt. Daraufhin wurden die Objektträger

eingedeckelt (Deckgläser: Engelbrecht, Edermüde, Deutschland; Eukitt Kleber: Kindler

Freiburg, Deutschland). Von den Primärtumorblöcken wurden zusätzlich Schnitte für die

Immunhistologie gewonnen.

Die HE gefärbten Schnitte der Primärtumoren wurden anschließend mittels Lichtmikroskopie

auf die Anzahl ihrer Apoptosen und Mitosen untersucht. Hierzu wurde ein Okular mit

Gitternetz benutzt, welches aus 10 mal 10 Kästchen bestand. Es wurden die vitalen Areale

des Primärtumors bestimmt und anschließend eine Zählung von 100 Zellen vorgenommen,

die in apoptotische Zellen, mitotische Zellen und normale Zellen eingeteilt wurden. Dieses

wurde an vier weiteren Bereichen des vitalen Primärtumorgewebes durchgeführt, so dass


17

insgesamt 500 Zellen ausgewertet wurden. Insgesamt wurde diese Zellzählung drei Mal

durchgeführt.

Zusätzlich wurde eine Bestimmung des Nekroseanteils mittels Lichtmikroskopie durchgeführt.

Dieses wurde durch eine prozentuale Einschätzung des vitalen und nekrotischen

Primärtumorgewebes durchgeführt.

3.4.3.1.2 Elektronenmikroskopie

Für die Elektronenmikroskopie wurden etwa 1 x 1 x 1 mm3 Gewebestücke von den Tumoren

der scid-Mäuse in 3,5% Glutaraldehyd und in 0,1 Phosphatpuffer fixiert. Anschließend erfolgte

eine Nachfixierung mit Osmiumtetroxid (1% Osmiumtetroxidin 0,1 M Phosphat-Saccarose-

Puffer) für zwei Stunden und anschließend wurde das Gewebe in einer aufsteigenden

Ethanolreihe (35% - 100%) dehydriert. Nach Spülung in Propylenoxid wurden die

Gewebestücke in Glycidether (Serva, Heidelberg, Deutschland) eingebettet. Der Primärtumor

wurde unter der Stereolupe aufgeblockt. Jetzt konnten 80 - 100 nm ultradünne Schnitte mit

dem Sorvall Porter-Blum MT2-B ULTRA-MICROTOME (Norwalk, Connecticut, USA) von den

Neuroblastomen angefertigt werden. Nach Kontrastierung mit 1% Uranylacetet und Bleicitrat

wurden die Schnitte mit einem Philips CM100 Transmissions-Elektronenmikroskop untersucht.

3.4.3.2 Lungenmetastasierung

Die vorher eingebetteten Lungen wurden ebenfalls in 5 µm dicke Paraffinschnitte geschnitten.

Die Lungen wurden komplett in Serie aufgeschnitten, wobei jeder zehnte Schnitt in ein

Wärmebad überführt und auf einen beschichteten Objektträger (Histo Bond, Marienfeld,

Deutschland) aufgenommen wurde. Von den Lungenblöcken wurden zusätzlich aus der Mitte

heraus jeweils 2 mal 20 Schnitte für die Immunhistologie gewonnen. Nach 24 Stunden im

Wärmeschrank bei 37° C waren die Schnitte getrocknet, so dass sie dann weiter HE gefärbt

wurden. Dieses wurde nach einem Standardprotokoll in einem Färbeautomaten (Varistain,

Shandon, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt.

Die HE gefärbten Schnitte der Lungen wurden lichtmikroskopisch bei 100 facher

Vergrößerung betrachtet und die Anzahl der Metastasen gezählt. Dabei wurde mäanderförmig

über den Objektträger gefahren, um alle Flächen des Schnittes zu erfassen und gleichzeitig

eine fehlerhafte Doppelzählung von Lungenmetastasen auszuschließen. Die

Lungenmetastasen stellen sich in der HE-Färbung unter dem Lichtmikroskop deutlich


18

abgegrenzt zum umgebenden Lungengewebe (Parenchym und Stroma) dar. Die Schnitte

wurden jeweils zweimal durchgemustert. Die Metastasen der 10 mittleren HE-gefärbten

Serienschnitte wurden unter dem Lichtmikroskop ausgezählt. Die Anzahl der

Lungenmetastasen der mittleren 10 Schnitte einer Lunge wurden addiert und ein Mittelwert für

die Anzahl an Lungenmetastasen pro Schnitt gebildet. Dieser wurde mit der Gesamtzahl der

Schnitte einer Lunge multipliziert. Anschließend wurden von dem so errechneten Wert 20%

subtrahiert. Das so erhaltene Ergebnis gibt die Anzahl an Lungenmetastasen in der gesamten

Lunge wieder (Jojovic und Schumacher, 2000).

3.4.4 Disseminierte Tumorzellen im Blut

Für die Untersuchung der Anzahl der freien Tumorzellen im Blut der scid-Mäuse wurde eine

Real-time Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Dazu wurde das LightCycler-

System. LightCycler 2.0 der Firma Roche (Mannheim, Deutschland) benutzt.

Zur DNA Extraktion aus dem Blut wurde das QIAampDNA Blood Mini Kit 250 (Qiagen,

Hilden, Deutschland) verwendet. Die Herstellung des LightCycler Master Mixes (LightCycler

Fast Start DNA Master Plus SYBR Green Ι Cat No. 03515885001, Roche, Mannheim,

Deutschland) wurde nach Angaben des Herstellers zubereitet. Dieses QIAampDNA Blood

Mini Kit 250 besteht aus dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green Ι, einer Taq DNA

Polymerase, einem Taq PCR Puffer, einer Nukleotidmixtur und 1 mmol MgCl2. Für eine

Blutprobe wurde ein 8 µl Arbeitsmastermix hergestellt. Dieser beinhaltete 100 pmol des ALU-

Primers forward (TGGCTCACGC CTGTAATCCC A) und 100 pmol des ALU-Primers reverse

(GCCACTACGC CCGGCTAATT T) (freundlicherweise von Frau Dr. Nehmann zur Verfügung

gestellt). Dazu wurde der LightCycler Master Mix und ddH2O gegeben.

Nachdem die Proben für 10 min bei 95° C erhitzt wurden, erfolgte die Denaturierung für 5 s.

Anschließend erfolgte das Annealing für 5 s bei 67° C und danach die Elongation bei 72° C

für 20 s. Nach diesem Zyklus wurde dann die Messung durchgeführt. Es wurden für jede

Probe 45 Zyklen durchgeführt. Durch die mitlaufenden Eichkurvenproben bestehend aus

sieben Proben von 106 Tumorzellen bis zu 100 Tumorzellen, konnte anschließend der

Rückschluss auf die Anzahl der freien Tumorzellen der scid-Mäuse im Blut hergestellt werden.

Zusätzlich liefen immer zwei Negativproben bestehend aus H2O und scid-Kontroll-DNA mit,

um sicherzustellen, dass die Messungen ordnungsgemäß abgelaufen waren.


19

Nach der PCR wurde eine Schmelzkurvenanlayse durchgeführt, anhand derer die Spezifität

der Produkte bestimmt wurde. Jede DNA-Probe wurde mindestens drei Mal analysiert. Die

Datenverarbeitung erfolgte mit der gerätespezifischen LightCycler™ Software 3.5 (Roche,

Mannheim, Deutschland).

3.4.5 Imaging

3.4.5.1 Magnetresonanztomographie

Vier Wochen nach der Inokulation der humanen Neuroblastomzellen wurde bei acht scid-

Mäusen ein Imaging mittels der Magnetresonanztomografie (MRT) durchgeführt. Dabei

stammten jeweils vier scid-Mäuse aus der Kontrollgruppe und vier Tiere aus der

Bortezomibgruppe. Für die Untersuchungen wurden die scid-Mäuse gewogen und mit einem

Gemisch aus Rompun-Ketanest anästhesiert (0,8 ml Rompun 2% (Bayer Leverkusen,


ml 0,9% NaCl). Es wurden 0,1 ml / 10 g Mauskörpergewicht verabreicht. Nach Erreichen der

Narkosetiefe, wurden die scid-Mäuse auf einer speziellen Kunststofftrage fixiert und diese

dann in der MRT-Kleintierspule gelagert.

Die MRT-Untersuchungen erfolgten mit einem 3-Tesla-Ganzkörpergraphen (Intera Philips,

Best, Niederlande). Es wurde eine splenoidförmige Kleintierspule mit einem

Innendurchmesser von 7 cm als Empfangsspule verwendet (Philips Forschungslabor,

Hamburg). Zur Übersicht wurden T1 gewichtete Gradientenechosequenzen in drei Ebenen

angefertigt (Survey). Anschließend erfolgte die Akquisition hochauflösender T1 gewichteter

Gradientenecho- und T2 gewichteter Turbo-Spinecho-Sequenzen in sagittaler, coronaler und

axialer Schichtführung. Es wurden die folgenden Sequenzparameter verwendet: (T1

Gewichtung) TR 424 ms, TE 4,9 ms, Flip 45°; FOV 90 mm, Matrix 400 x 400, Schichtdicke 1

mm, Schichtabstand 0,1 mm, Zeit 5:57,9 min; (T2 Gewichtung) TR 3438,4 ms; TE 90 ms; Flip

90°; FOV 90 mm; Matrix 400 x 400; Schichtdicke 0.6 mm; Schichtabstand 0,06 mm, Zeit

6:04,5 min. Die gesamte Untersuchungszeit pro Maus betrug circa 30 Minuten.


20

Abb. 3: MRT (Tesla-Ganzkörpergraphen) mit Kleintierspule und spezieller Auflage zur Mauslagerung. Das Foto wurde freundlicherweise von Herrn Dr. med. Kersten Peldschus zur Verfügung gestellt.

Die Auswertung der Bilddaten zur Bestimmung der Tumorgrößen erfolgte durch Mitarbeiter

der Forschungsgruppe VOXEL-MAN (Institut für Mathematik und Datenverarbeitung in der

Medizin, UKE, Hamburg). Es wurde ein halbautomatisches Segmentationsverfahren

basierend auf der interaktiven Festlegung von Schwellenwertbereichen (verschiedene

Grauabstufungen des Tumors) und der anschließenden, automatischen Erfassung

zusammenhängender Volumenelemente (Voxel) im Bereich der Tumore angewandt. Die

korrespondierenden Tumorvolumina wurden jeweils aus der Anzahl der segmentierten Voxel

und deren räumlichen Abmessungen berechnet.

3.4.5.2 Positronen-Emissions-Tomographie / Computer Tomographie

Weiterhin wurde ein Imaging mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) / Computer-

Tomographie (CT) bei 36 Versuchstieren durchgeführt. Die scid-Mäuse wurden in zwei

Gruppen eingeteilt. Jede Gruppe bestand aus scid-Mäusen der Behandlungsgruppe und der

Kontrollgruppe. Als Tracer wurden [18F]FDG und [18F]FLT (ABX Advanced Biochemical

Compounds, Radeberg, Deutschland) benutzt. Diese wurden dann in jeweils 18 Mäuse

appliziert. Je 13 MBq von [18F]FDG und [18F]FLT wurden über die Schwanzvene jeder scid-

Maus verabreicht. Nach 60 min wurden die Tiere durch intraperitoneale Injektion bestehend

aus einem Gemisch aus Rompun-Ketanest (0,8 ml Rompun 2% (Bayer Leverkusen,


21


ml 0,9% NaCl) betäubt. Wie auch schon bei vorherigen Betäubungen wurden 0,1 ml / 10 g

Mauskörpergewicht gespritzt. Nach Erreichen der Narkosetiefe wurden die Tiere auf einem

Gerüst platziert und in das PET-CT gefahren. Dynamische PET Aufnahmen wurden für 45 min

unter Verwendung eines konventionellen Vollringes, Ganzkörper PET durchgeführt (Gemini

GXL 10 PET/CT System, Philips Medical Systems, Deutschland).

Abb. 4: Untersuchung der scid-Mäuse im PET-CT mit Tierreck. Hierbei ist es möglich 18 Tiere zeitgleich zu untersuchen. Das Foto wurde freundlicherweise von Herrn Dr. med. Kersten Peldschus zur Verfügung gestellt.

Nach der Durchführung der Untersuchung wurde zunächst durch die CT - Aufnahmen die

anatomische Zuordnung der Strukturen im PET ermöglicht. Anschließend wurden die Bilder

visuell beurteilt und die Stärke der Anreicherung von den radioaktiven Substanzen [18F]FDG

und [18F]FLT beurteilt (freundlicherweise erfolgte dieses durch die Abteilung für

Nuklearmedizin des UKE). Die visuelle Interpretation wurde wie folgt festgelegt: War keine

Anreicherung erkennbar, wurde dieses mit 0 betitelt. Mit 1 wurde ein stärkeres Signal als das

Hintergrundrauschen angegeben. Mit 2 wurde eine Aufnahme der radioaktiven Substanz

betitelt, die stärker war als die des Referenzorgans Leber für [18F]FLT oder die des

Referenzorgans Gehirn für [18F]FDG.


22

3.5 Statistische Auswertung

Die Ergebnisse der XTT-Tests sind als Mittelwert ± SD von mindestens vier unabhängigen

Versuchen dargestellt. Die Absorption der unbehandelten Kontrollzellen wurde dabei einer

Zellzahl von 100 % gleichgesetzt, die Absorption der behandelten Zellen entsprach dem

prozentualen Anteil der Kontrolle. Mittels des t-Tests (ungepaart) konnte dann für alle oben

genannten Untersuchungen ermittelt werden, ab welcher Konzentration des Bortezomibs eine

signifikante Hemmung im Vergleich zum Kontrollwert vorhanden war.

Primärtumorgewicht, Anzahl an Apoptosen, Mitosen und nekrotischen Arealen in den

Primärtumoren, sowie die Anzahl an disseminierten Tumorzellen im Blut von Kontroll- und

Bortezomibgruppe wurden verglichen, um auch hier die Wirkung von Bortezomib auf das

Neuroblastomzellwachstum in vivo zu untersuchen.

Die Ergebnisse der in vivo Versuche wurden auf ganze Zahlen auf- bzw. abgerundet.

Für alle statistischen Berechnungen und Graphen wurde die Software Graph Pad Prism

(Graph Pad TM, San Diego, USA) verwendet, wobei p-Werte <0,05 als statistisch signifikant

bewertet wurden.

Ergebnisse

23

4 Ergebnisse

4.1 Wirkung von Bortezomib in vitro

Die Wirkung von Bortezomib wurde an humanen Neuroblastomzellen untersucht. Dafür wurde

der Effekt einzelner Konzentrationen von Bortezomib auf die Zelllinien Kelly, SK-N-SH, SH-

SY5Y, LAN-1, LAN-5, IMR-32 und LS getestet. Wenn eine bestimmte Konzentration von

Bortezomib nur bei drei oder weniger Zelllinien eine Wirkung zeigte, wurden statistisch

signifikante Effekte von weniger als 20% als biologisch nicht relevant eingestuft (Valentiner et

al., 2005). Bortezomib verursachte eine dosisabhängige Wachstumsinhibierung bei allen

untersuchten Neuroblastomzelllinien. Die IC50 Werte der sieben Zelllinien reichten von 1,9 ng /

ml (SH-SY5Y) zu 8,4 ng / ml (LAN-1).

Bei der Zelllinie LS kam es bei einer Konzentration des Bortzomibs von 0,0002 µg / ml und

0,002 µg / ml zu keinerlei Veränderung der Zellproliferation. Erst ab einer Konzentration von

0,02 µg / ml Bortezomiblösung kam es zu einem massiven Abfall der Zellzahl auf 6,9%

(p<0,001) der Kontrolle. Bei einer Konzentration von 2 µg / ml und 20 µg / ml wurde die

Proliferation auf 1,5% der Kontrolle gesenkt.

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102

0

25

50

75

100

125

Bortezomib [µg/ml]

Zell

zah

l [%

]

Abb. 5: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie LS. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweilige Konzentration.

Bei der Zelllinie Kelly setzte die inhibitorische Wirkung ebenfalls erst bei einer Konzentration

von 0,02 µg / ml Bortezomib ein. Die Zellzahl erreichte nur noch 7,8% (p<0,001) des

Ergebnisse

24

Kontrollwertes. Bei einer Konzentration von 20 µg / ml und 2 µg / ml wurde die Proliferation

auf 5% der Kontrolle gehemmt.

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102

0

25

50

75

100

125

Bortezomib [µg/ml]

Zell

zah

l [%

]

Abb. 6: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie Kelly. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweilige Konzentration.

Bei der Zelllinie SK-N-SH konnten ähnliche Werte wie bei den Zelllinien LS und Kelly erzielt

werden. Hier lag die Zellzahl bei den Konzentrationen von 0,02 µg / ml bis 20 µg / ml

Bortezomib bei ca. 9% (p<0,001). Bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml kam es lediglich

zu einem leichten Abfall auf 96% (p< 0,05) des Kontrollwachstums.

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102

0

25

50

75

100

125

Bortezomib [µg/ml]

Zell

zah

l [%

]

Abb. 7: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie SK-N-SH. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweiligen Konzentrationen.

Bei der Zelllinie SH-SY5Y zeigte sich bereits ab einer Konzentration des Bortezomibs von

0,002 µg / ml ein massiver Abfall auf 39% (p<0,001) des Kontrollwachstums. Hier lag die

Ergebnisse

25

stärkste Inhibition bei einer Konzentration von 0,02 µg / ml. Hierbei konnte die Proliferation

auf 2,5% der Kontrolle (p<0,001) gehemmt werden.

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102

0

50

100

150

Bortezomib [µg/ml]

Zell

zah

l [%

]

Abb. 8: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20)

Bei der Zelllinie IMR-32 zeigte sich eine statistisch signifikante Änderung der Zellzahl ab 0,02

µg / ml Bortezomib (p<0,001). Hierbei wurde die Proliferation auf 23% des Kontrollwertes

gehemmt. Wie bei der Zelllinie SH-SY5Y lag auch hier die stärkste Proliferationshemmung

(16,4% der Kontrolle, p<0,001) bei einer Bortezomibkonzentration von 0,2 µg / ml.

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102

0

25

50

75

100

125

Bortezomib [µg/ml]

Zell

zah

l [%

]

Abb. 9: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie IMR-32. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweiligen Konzentrationen.

Ergebnisse

26

Eine signifikante Hemmung konnte auch bei der Zelllinie LAN-1 erreicht werden. Wieder kam

es bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml Bortezomib nur zu einer leichten Hemmung auf

93% (p<0,05) des Kontrollwachstums. Jedoch konnte dann ein kontinuierlicher Abfall der

Proliferation auf 30% (p<0,001) bei einer Konzentration von 0,02 µg / ml bis hin zu einer

Hemmung auf 5% (p<0,001) des Kontrollwertes bei einer Konzentration von 2 µg / ml

Bortezomib beobachtet werden.

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102

0

25

50

75

100

125

Bortezomib [µg/ml]

Zell

zah

l [%

]

Abb. 10 Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie LAN-1. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweilige Konzentration.

Bei der Zelllinie LAN-5 konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden wie bei LAN-1. Hier wurde

ebenfalls bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml Bortezomib die Proliferation auf 87%

(p<0,01) nur leicht gesenkt. Eine deutliche Hemmung wurde bei einer Konzentration von 0,02

µg / ml auf 27% (p<0,001) des Kontrollwachstums erzielt. Durch die höheren Konzentrationen

konnte dann eine ausgeprägte Wachstumshemmung bei 20 µg / ml Bortezomib auf 3% der

Kontrolle (p<0,001) erzielt werden.

Ergebnisse

27

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102

0

25

50

75

100

125

Bortezomib [µg/ml]

Zell

zah

l [%

]

Abb. 11: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie LAN-5. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweiligen Konzentrationen.

Bei allen Zelllinien bis auf SK-N-SH traten deutliche Schwankungen der einzelnen Ergebnisse

innerhalb der Versuche, insbesondere bei einer Bortezomibkonzentration von 0,002 µg / ml,

auf.

Substanz Lebende Zellen (% von der Kontrolle) SH-SY5Y SK-N-SH IMR-32 LAN-5 LAN-1 LS Kelly Bortezomib

0.0002 µg / ml

0.002 µg / ml

0.02 µg / ml

0.2 µg / ml

2 µg / ml

20 µg / ml

IC50 (µg / ml)

112 ***

39 ***

2 ***

3 ***

8 ***

11 ***

0.0019

103 n.s.

97 n.s.

9 ***

9 ***

10 ***

9 ***

0.0034

102 n.s.

94 *

23 ***

16 ***

19 ***

20 ***

0.0056

104 *

87 **

28 ***

16 ***

7 ***

3 ***

0.0074

103 n.s.

93 *

31 ***

23 ***

10 ***

5 ***

0.0084

104 n.s.

101 n.s.

7 ***

3 ***

1 ***

2 ***

0.0078

102 n.s.

100 n.s.

8 ***

5 ***

5 ***

5 ***

0.0064

Tab. 4: Effekte von Bortezomib auf die sieben getesteten Neuroblastomzelllinien. Die Zahlen repräsentieren die Anzahl von lebenden Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Der IC50 gibt die Konzentration an, bei der die Hälfte der Gesamtwirkung erreicht wurde. Die statistische Analyse wurde mittels des Student´s t-test (ungepaart) durchgeführt. n.s.= nicht signifikant.* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

Ergebnisse

28

4.2. Wirkung von Bortezomib in vivo

Um die Wirkung von Bortezomib in vivo zu untersuchen, wurden 40 scid-Mäuse mit humanen

SK-N-SH Neuroblastomzellen beimpft. Diese Zelllinie wurde verwendet, da sie bereits bei

durchgeführten Tierversuchen unseres Institutes ein gutes Tumorwachstum und eine hohe

Metastasierungsrate aufwies (Ursula Valentiner, unveröffentlicht). Weiterhin wurde die

Zellproliferation dieser Zelllinie in vitro durch Bortezomib inhibiert.

Die Tiere wurden in 2 Gruppen eingeteilt, die eine Gruppe erhielt den Proteasomeninhibitor

Bortezomib (Konzentration 1 mg / kg KG) und die Kontrollgruppe erhielt PBS. Am Ende der

Versuchszeit von vier Wochen wurden acht Tiere (vier Tiere aus jeder Gruppe) mittels MRT

und 36 scid-Mäuse (jeweils 18 aus jeder Gruppe) mittels PET / CT untersucht. Zudem wurden

die entnommenen Primärtumore und Organe durch histologische Färbungen und das Blut der

Tiere mit Hilfe der Real-time PCR untersucht.

4.2.1 Primärtumor

Nach der Tötung der scid-Mäuse wurden die Primärtumoren entnommen und gewogen. Es

konnte kein signifikanter Unterschied des Primärtumorgewichtes (p<0,84) zwischen

Kontrollgruppe (0,29 g) und der mit Bortezomib behandelten Gruppe (0,26 g) festgestellt

werden (Abb. 12).

Abb. 12: Tumorgewicht der mit PBS behandelten Kontrollgruppe und der mit Bortezomib behandelten Gruppe. Gezeigt ist der Mittelwert ± SEM.

Kontrolle Bortezomib0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Tu

mo

rgew

ich

t [g

]

Ergebnisse

29

4.2.1.1 Lichtmikroskopie

Die Neuroblastomzellen des Primärtumores präsentierten sich als eher runde, undifferenzierte

Zellen und waren dicht gepackt. Einzig in der Zellperipherie waren die Zellen lockerer gepackt.

Die Primärtumoren enthielten wenig Stroma; in ihrem Zentrum waren ausgeprägte eosinophile

nekrotische Areale zu erkennen. Weiterhin wiesen die malignen Zellen eine zum Kern hin

verschobene Kern-Plasma-Relation auf und zeigten atypische polymorphe und polyzyklische

Zellkerne, prominente Nukleoli und Mitosen. In der HE Färbung wurden die apoptotischen

Zellen durch dunkel gefärbte und kondensierte Chromosomen dargestellt. Mitosen zeigten

sich durch mitotische Figuren von kondensierten Chromosomen.

In der vorliegenden Arbeit wurde bei den entnommenen Primärtumoren die Prozentzahl der

Apoptosen und der Mitosen bestimmt. Sowohl die Anzahl der Apoptosen als auch die Anzahl

der Mitosen wiesen einen hochsignifikanten Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der

mit Bortezomib behandelten Gruppe auf. In der Kontrollgruppe befanden sich 5% der Zellen in

Apoptose, während sich in der Behandlungsgruppe 10% der gezählten Zellen in Apoptose

befanden (p<0,001). Die Mitoserate der Kontrollgruppe betrug im Mittel 6,5% und die der

Bortezomibgruppe 5% (p<0,001). In den folgenden Abbildungen (Abb.13 – 16) sind die

histologischen Präparate und die dazugehörigen Ergebnisse der Anzahl an Apoptosen und

Mitosen graphisch dargestellt. Der Anteil an Nekrose im Primärtumor und das histologische

Präparat eines Kontrollgruppentieres sind in Abb. 17 und 18 dargestellt.

Ergebnisse

30

Abb. 13: Primärtumorareal einer behandelten scid-Maus mit hohem Apoptoseanteil (HE Färbung). Mit � sind einige Apoptosen gekennzeichnet.

Abb. 14: Anzahl der Apoptosen in den Primärtumoren der Kontrollgruppe und der Bortezomibgruppe. Gezeigt ist der Mittelwert ± SEM (n=15). Durch die Bortezomibbehandlung kam es zu einer statistisch signifikanten Steigerung der Apoptose in den Primärtumoren (p< 0,001).

Kontrolle Bortezomib

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

***

An

zah

l d

er

Ap

op

tosen

Ergebnisse

31

Abb. 15: Primärtumorareal mit Mitosen (HE Färbung). Mit � sind einige Mitosen gekennzeichnet.

Abb. 16: Anzahl der Mitosen in den Primärtumoren der Kontrollgruppe und der mit Bortezomib behandelten Gruppe. Gezeigt ist der Mittelwert ± SEM (n=15). Durch die Behandlung mit dem Medikament Bortezomib kam es zu einer Herabsetzung der Mitosenanzahl in den Tumoren (p< 0,001).


0

1

2

3

4

5

6

7

***

Mit

ose A

nza

hl

Ergebnisse

32

Darüber hinaus wurde der Nekroseanteil der entnommenen Primärtumore bestimmt. Hierbei

zeigte sich kein signifikanter Unterschied in den Nekrosebezirken zwischen der mit

Bortezomib behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe.

Abb. 17: Übersichtsaufnahme eines Primärtumores mit hohem Nekroseanteil (HE Färbung). Das Nekroseareal ist durch � gekennzeichnet.

Abb. 18: Prozentuale Abschätzung des Nekroseanteils der Primärtumoren der Kontrollgruppe versus Bortezomibgruppe. Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM (n=15). Es konnte kein signifikanter Unterschied des Nekroseanteiles zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden.

Kontrolle Bortezomib0

10

20

30

40

50

60

70

Nekro

sean

teil

[%

]

Ergebnisse

33

4.2.1.2 Elektronenmikroskopie

Die Neuroblastomzellen wuchsen im Randbereich des Tumors invasiv in Blutgefäße und

Muskulatur (Abb. 19). Dabei drängten sie sich zwischen die Skelettmuskelzellen und

proliferierten in diesen Zwischenräumen. Teilweise dellten die Tumorzellen die

Skelettmuskelfasern lokal ein.

Abb. 19: Infiltration des Neuroblastoms in die Skelettmuskulatur. Man erkennt, dass die Tumorzellen infiltrativ zwischen die Skelettmuskelfasern eingewachsen sind. Zwischen den Tumorzellen befinden sich deutlich sichtbare Interzellularräume (Pfeile), ihre Zellkerne enthalten meist einen deutlichen Nukleolus.

Ergebnisse

34

Abb. 20: Zentrale Nekrose des Neuroblastoms. Als Reste der abgestorbenen Tumorzellen findet man leere Plasmalemmvakuolen (mit � gekennzeichnet). In den zentralen Anteilen der Neuroblastome findet sich eine ausgeprägte Nekrose. Die Zellkerne der untergehenden Zellen zeigen randständig viel Heterochromatin (vergleiche mit der Kernstruktur vitaler Tumorzellen in Abb. 19). Einige der apoptotischen Zellen sind mit � gekennzeichnet.

Ergebnisse

35

4.2.2 Lungenmetastasierung

Um den Einfluss des Proteasomeninhibitors Bortezomib auf die Lungenmetastasierung zu

untersuchen, wurden HE gefärbte Schnitte angefertigt und die Anzahl der Metastasen mittels

Lichtmikroskopie bestimmt. Nach Berechnung mittels der Formel von Jojovic und Schumacher

(2000), wurde die Gesamtanzahl der Metastasen in den Lungen bestimmt.

Es wurden keine Metastasen in den Lungen der Bortezomibgruppe gefunden. Hingegen

konnten Lungenmetastasen in 5 Lungen von insgesamt 20 scid-Mäusen der Kontrollgruppe

nachgewiesen werden. Die Anzahl der Lungenmetastasen betrug 42, 168, 192, 24 und 48 in

den jeweiligen Kontrollmäusen.

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.00

50

100

150

200

Tumorgewicht [g]

An

zah

l d

er

Meta

sta

sen

Abb:21: Anzahl der Metastasen in den fünf Lungen der Kontrollgruppe der scid-Mäuse. Die Anzahl der Metastasen wurde nach der Formel von Jojovic und Schumacher (2000) berechnet (Mittelwert 95, SEM 35). Es bestand keine Korrelation zwischen Tumorgewicht und Anzahl der Metastasen.

Die Metastasen waren sowohl in den Lungenarterien als auch in den Alveolarsepten zu

finden. Die malignen Zellen wiesen eine zugunsten des Kernes verschobene Kern-Plasma-

Relation und ovale, z.T. eingedellte Zellkerne mit prominenten Nukleoli auf. Die Metastasen

grenzten sich gut gegen das restliche Lungengewebe ab (Abb. 22).

Ergebnisse

36

Abb. 22: Lunge eines Kontrolltieres mit Metastasen (HE Färbung). Die Pfeile � markieren Metastasen im Lungengewebe. Sie liegen in den Ästen der A. pulmonalis und im periarteriellen Raum. Die malignen Zellen weisen eine verschobene Kern-Plasma-Relation und atypische Zellkerne mit prominenten Nukleoli auf und grenzen sich gut gegen das Lungengewebe ab.

4.2.3 Disseminierte Tumorzellen im Blut

In Abbildung 23 ist ein typischer LightCycler Lauf dargestellt. Bei Zunahme der Anzahl der

Durchgänge kommt es zu einer Amplifikation der DNA. Es besteht eine Abhängigkeit

zwischen der Anzahl der freien Tumorzellen im Blut und der Anzahl der Zyklen die benötigt

werden, um einen Anstieg der Amplifikationskurve auszulösen. Bei wenigen DNA-Zyklen ist

ein Anstieg der Amplifikationskurve nur bei den ersten fünf Proben der Eichreihe zu erkennen

(Abb. 23). Probe 1 der Eichkurve (106Tumorzellen) zeigte eine erkennbare Amplifikation nach

sechs Zyklen, Probe 2 (105 Tumorzellen) nach acht Zyklen, Probe 3 (104 Tumorzellen) nach

zwölf Zyklen, Probe 4 (103 Tumorzellen) nach 15 Zyklen und Probe 5 (102 Tumorzellen) nach

18 Zyklen. Bei Probe 6 der Eichkurve (101 Tumorzellen) zeigte sich ein Anstieg der Kurve erst

nach ca. 21 Amplifikationszyklen. Hierbei gab es schon einzelne DNA-Proben der scid-Mäuse,

bei denen ein Anstieg vor der letzten Eichprobe zu beobachten war. Die danach folgenden

Kurven der DNA-Proben der scid-Mäuse der Kontrollgruppe wiesen demnach nur noch

geringe Anzahlen an freien Tumorzellen auf. Zur besseren Übersicht zeigt Abbildung 24 den

Kurvenverlauf von einigen Blutproben ohne die Eichkurve. Die erste DNA-Probe der scid-

Mäuse verzeichnete nach 22 Zyklen der Amplifikation einen Anstieg. Für die weiteren DNA-

Ergebnisse

37

Proben der Tiere waren weitere Zyklen erforderlich, um einen Nachweis von freien

Tumorzellen zu erzielen.

Mittels der Real-time PCR wurde festgestellt, dass es keine Differenz in der Anzahl der freien

Tumorzellen (15 freie Tumorzellen) zwischen der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe

gab (Abb. 25).

Abb. 23: LightCyclerlauf der Kontrollgruppe. Die vertikale Achse zeigt den Grad an Amplifikationen des SYBR-Green Ι Fluoreszenz und die horizontale Achse repräsentiert die Anzahl an Zyklen der Amplifikation.

Abb. 24: Blutproben der Kontrollgruppe in einem LightCyclerlauf. Nach 22 Zyklen konnte bei der ersten

Probe der scid-Maus aus der Kontrollgruppe ein Anstieg der Kurve verzeichnet werden. Für die anderen DNA-

Proben waren mehr Zyklen notwendig, um den Anstieg der Kurve und somit einen Nachweis von freien

Tumorzellen zu erzielen. Der Pfeil markiert die erste Probe.

Ergebnisse

38

Abb. 25: Anzahl der freien Tumorzellen im Blut. Die Menge der freien Tumorzellen wurde anhand der DNA – Konzentration bestimmt. Gezeigt ist der Vergleich von freien Tumorzellen zwischen der Kontrollgruppe und der Bortezomibgruppe. Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten der beiden Gruppen.

Kontrolle (n=20) Bortezomib (n=19)

Tumorgewicht (g) n.s. 0,29 (±0,05) 0,26 (±0,05)

Lungenmetastasen 5 von 18 (28%) Mäusen, Anzahl der Lungenmetastasen: 42; 168; 192; 24; 48.

0

Anzahl von apoptotischen

Zellen im Tumor (%) *** 5,04 (±0,18) 10,00 (±0,25)

Anzahl von mitotischen

Zellen im Tumor (%) *** 6,56 (±0,17) 5,08 (±0,12)

Anzahl von nekrotischen

Anteilen im Tumor (%)

n.s.

62,5 (±4,11) 56,6 (±5,30)

Disseminierte

Tumorzellen im Blut

(Zellen/ml) n.s.

1,36 (±0,12) 1,38 (±0,17) (n=18)

Tab. 5: Effekte von Bortezomib auf das Wachstum der humanen SK-N-SH Neuroblastom Zelllinie in einem scid-Mausmodel. Die Ergebnisse repräsentieren den Mittelwert (±SEM) ausgenommen Anzahl der Lungenmetastasen. Die statistische Analyse wurde mittels des Student´s t-test (ungepaart) durchgeführt. n.s. nicht signifikant; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Zell

en

/ m

l

Ergebnisse

39

4.2.4 Imaging

4.2.4.1 MRT

Zur Bestimmung der Tumorvolumina wurden MRT-Bilder angefertigt und diese mit dem Voxel

Programm (Voxel Man Gruppe, Hamburg) bearbeitet. Die Aufnahmen wurden im MRT sowohl

in T1 als auch in T2 Gewichtung angefertigt. Die anatomischen Strukturen waren mit der T1

Gewichtung sehr gut zu beurteilen, jedoch waren die Abgrenzung des Neuroblastoms, die

nekrotischen Anteile und die perifokalen Ödeme in den T2 gewichteten Aufnahmen deutlich

besser zu bestimmen. Für alle weiteren Beurteilungen und Berechnungen wurden deswegen

die sagittal oder coronal geschnittenen T2 Bilder benutzt.

Abb. 26: MRT-Aufnahme von scid-Maus Nr. 7.2. In der gezeigten MRT-Aufnahme ist die scid-Maus Nr. 7.2 in sagittaler Schnittrichtung und in T2 Gewichtung gezeigt. � zeigt den Primärtumor.

Danach wurden das Segmentationsverfahren und die automatische Erfassung

zusammenhängender Volumenelemente (Voxel) im Bereich der Tumore angewandt. Die

korrespondierenden Tumorvolumina wurden jeweils aus der Anzahl der segmentierten Voxel

und deren räumlichen Abmessungen berechnet. Gezeigt ist in Abb. 27 ein MRT Bild in

coronaler Schnittführung und die dazugehörigen durch die Voxel-Man Software bearbeiteten

Tumoranteile (rot dargestellt).

Ergebnisse

40

Abb. 27: MRT-Aufnahmen der scid-Maus nativ. Dargestellt ist die MRT-Aufnahme einer scid-Maus in coronaler Schnittführung und eine Bearbeitung des gleichen Bildes durch das Voxelprogramm. Der Tumor ist rot dargestellt.

Ergebnisse

41

Zudem wurde das berechnete Tumorvolumen mit dem tatsächlich am Tötungstag

gemessenen Tumorgewicht verglichen (Abb. 28). Mittels einer Produkt-Moment-Korrelation

(nach Pearson) wurde der Zusammenhang zwischen Tumorgewicht und Tumorvolumen

überprüft. Es ergab sich ein Korrelationskoeffizient von 0,6, der allerdings statistisch nicht

signifikant war.

Abb. 28: Graphische Darstellung der Korrelation zwischen Tumorvolumen und Tumorgewicht. Es besteht eine positive Korrelation zwischen dem durch die Voxel-Man Software bestimmten Tumorvolumen und dem tatsächlichen Tumorgewicht. Korrelationskoeffizient: 0,6.

Weiterhin konnte durch die VOXEL-MAN Arbeitsgruppe Hamburg eine dreidimensionale

Darstellung des Primärtumors der scid-Maus Nr. 7.2 hergestellt werden. Zum Vergleich

wurden Fotos am Tötungstag von dem Tumor der scid-Maus Nr. 7.2 angefertigt, so dass ein

direkter Vergleich möglich ist (Abb. 29).

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

100

200

300

400

500

Tumorgewicht [g]

Tu

mo

rvo

lum

en

[m

m3]

Ergebnisse

42

Abb. 29: Mittels Computerbearbeitung erstelltes 3D Bild eines Tumors sowie Foto desselben Tumors direkt nach Entnahme am Tötungstag. Die Abbildungen ermöglichen den direkten Vergleich zwischen der durch die Voxel-Man Software bearbeiteten MRT Tumordarstellung und dem Foto des resizierten nativen Tumors. Hierbei ist zu sehen, dass die Bearbeitung mittels des Voxel Programms eine gute Methode darstellt, um das Aussehen und die Form eines Tumors in situ nachzubilden.

Ergebnisse

43

4.2.4.2 PET-CT

Durch das PET-CT sollte die Sensitivität und Spezifizität der beiden Tracer [18F]FDG und

[18F]FLT zur Detektion eines Neuroblastoms ermittelt werden. Mit [18F]FDG konnten keine

Tumoren dargestellt werden, da sich dieser Tracer nicht ausreichend im Neuroblastom

anreicherte. Bei den [18F]FLT markierten Tumoren konnte dagegen eine visuelle Interpretation

vorgenommen werden. Die Tumorgewichte in beiden Gruppen unterschieden sich nicht

signifikant (Abb. 30). Es konnte festgestellt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen

Tumorgewicht und Anreicherung des [18F]FLT im Tumor gab, wobei Tumoren unter 0,1 g nicht

detektierbar waren (Abb. 31). Zwischen 0,1 g und 0,3 g strahlten die Tumoren ein Signal ab,

dass stärker als das Hintergrundrauschen war. Ab einem Tumorgewicht von 0,4 g, war das

Signal stärker als das Referenzorgan Leber.

Abb.30: Durchschnittliches Tumorgewichte der Neuroblastome in den zufällig eingeteilten Gruppen [18

FDG und [18 F]FLT. Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM. Es war kein signifikanter Unterschied in der Höhe des Tumorgewichtes festzustellen.

0 1 2

[18F]FDG 18 0 0

[18F]FLT 4 8 5

Tab. 6: Darstellbarkeit der Neuroblastome im PET-CT mit zwei verschiedenen Tracern. Die visuelle Interpretation von 0 - 2 wurde nach den folgenden Kriterien vorgenommen: 0 = kein Signal, 1 = stärkeres Signal als das Hintergrundrauschen, 2 = stärkeres Signal, als das des Referenzorgan Leber.

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

[18F]FDG [18F]FLT

Tu

mo

rgew

ich

t [g

]

Ergebnisse

44

Abb. 31: Korrelation des Tumorgewichtes mit der Anreicherung des Tracers [18F]FLT. Bei Zunahme des Tumorgewichtes kam es zu einer stärkeren Anreicherung von [18F]FLT in den Neuroblastomen. Ab einem Schwellenwert von ca. 0,1 g Tumorgewicht war eine visuelle Interpretation der Neuroblastome möglich. Die Beurteilung wurde nach den oben genannten Kriterien durchgeführt (siehe Tab. 6).

Abb. 32: Axial geschnittene CT- Aufnahme der scid-Mäuse im Reck des PET-CT. Die CT- Aufnahmen wurden dann zur Zuordnung der anatomischen Strukturen in den PET Aufnahmen benutzt.

[18F]FLT

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

0

1

2

Tumorgewicht [g]

vis

uell

e I

nte

rpre

tati

on

Ergebnisse

45

A B

B

T

B

T

Abb. 33: scid-Maus Nr. 4.2 (Bortezomibgruppe) nach Fusion der CT und der PET Aufnahmen. A: Coronal geschnittene Aufnahme der scid-Maus. Die höchste Anreicherung des Tracers ergab sich in dem retrocervical gelegenen Tumor (T) und in der Harnblase (B), aufgrund der renalen Elimination des Tracers. B: Sagittal geschnittene Aufnahme des Tieres. Die Farbkodierung entspricht der unterschiedlichen Anreicherung des radioaktiven Tracers in der scid-Maus. Rot: Areale mit hoher Anreicherung (Tumor, Harnblase); gelb: Areale mit mittlerer Anreicherung; blau: Areal mit geringer Anreicherung.

Abb. 34: Axial geschnittene Aufnahmen der scid-Maus Nr. 4.2. Die Abbildung zeigt axial geschichtete CT- und PET-Aufnahmen des Thorax und des Hals- Kopfbereichs der scid-Maus. Die CT Aufnahmen des Tieres sind in Grauwerten dargestellt; die fusionierten PET-CT Aufnahmen sind farbig dargestellt. Die Farbgliederung zeigt wiederum die Stärke der Anreicherung der radioaktiven Substanz, wie in Abbildung 33 näher beschrieben. In cervicaler Höhe lässt sich der Tumor (T) besonders deutlich abgrenzen. In den dazugehörigen PET Aufnahmen sieht man wiederum die starke Anreicherung des Tumors mit [18 F]FLT. Weiterhin sind in der Abbildung Leber (LE), Lunge (L) und Schädelbasis (S) der scid Maus benannt.

L LE

T

S

Ergebnisse

46

Um eine noch bessere Zuordnung der Organstrukturen zu ermöglichen, wurden die PET-CT-

Bilder mit den vorher erstellten MRT-Bildern fusioniert (durch freundliche Unterstützung der

Nuklearmedizin des UKE). Dieses wird exemplarisch an Maus Nr. 3.3 in Abbildung 35

dargestellt.

Abb. 35: Fusion der MRT Aufnahmen mit den Bildern der PET–CT Untersuchung der Maus Nr. 3.3. in sagittaler Schnittführung (von rechts nach links). Der Tumor (T) ist retrocervical dargestellt. Weiterhin sind Herz (H), Lunge (L) und Harnblase (B) gekennzeichnet.

L

T

HB

rechtsrechts

links

L

T

HB

rechtsrechts

links

Diskussion

47

5 Diskussion

Das Neuroblastom ist bei Kindern der häufigste solide extrakranielle Tumor, dessen Prognose

vom Alter (> ein Jahr = schlechtere Prognose) und vom Ausbreitungsstadium dieses

embryonalen Tumors abhängt. Wird bei einem Kind, das älter als ein Jahr alt ist, ein

Neuroblastom des Stadium IV diagnostiziert, beträgt die mediane

Fünfjahresüberlebenswahrscheinlichkeit 20 % (Koletzko, 2003). Die bisherigen

Therapieansätze, bestehend aus Kombinationen von Operationen, Chemotherapeutika und

homologer Stammzelltherapie, zeigten bisher nicht den erhofften Erfolg (Morgenstern et al.,

2004). Daher ist es dringend erforderlich nach neuen Therapieansätzen zu suchen.

In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst in vitro überprüft, ob der Proteasomeninhibitor

Bortezomib auf die von uns getesteten humanen Neuroblastomzelllinien einen

antiproliferativen Effekt besitzt.

Es konnte gezeigt werden, dass das Medikament auf alle sieben getesteten Zelllinien eine

konzentrationsabhängige inhibitorische Wirkung bezüglich des Tumorzellwachstums hatte.

Alle Zelllinien zeigten einen massiven Abfall der Zellzahl bereits bei einer

Bortezomibkonzentration von 0,02 µg / ml. Bei der Zelllinie LS bewirkte dieses eine

Wachstumshemmung auf 6,9% der Kontrolle, bei der Zelllinie Kelly auf 7,8% der Kontrolle, bei

SK-N-SH auf 9% der Kontrolle. Bei den Zelllinien LAN-1 und LAN-5 zeigte sich eine

Hemmung auf 27% des Kontrollwertes. Bei der Zelllinie IMR-32 konnte das

Tumorzellwachstum auf 23% des Kontrollwertes gehemmt werden. Einzige Ausnahme war die

Zelllinie SH-SY5Y, die bereits bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml einen starken Abfall

der Zellproliferation (auf 39% der Kontrolle) bewirkt hatte, welches sich in dem niedrigen IC50

Wert von 1,9 ng / ml widerspiegelt. Im Allgemeinen lagen die IC50 Werte zwischen den sieben

Zelllinien zwischen 1,9 ng / ml (SH-SY5Y) und 8,4 ng / ml (LAN-1). Auffallend ist die hohe

Standardabweichung von SH-SY5Y bei der Konzentration von 0,002 µg / ml von 39,6. Bei

allen anderen Zelllinien lag die höchste Standardabweichung ebenfalls bei dieser

Konzentration.

In der Arbeit von Brignole et al., (2006) konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Bortezomib

eine statistisch signifikante Inhibierung des Zellwachstums bewirkt, welche zeit- und

dosisabhängig war. Der IC50 Wert lag nach 24-stündiger Behandlung (bei zehn getesteten

Neuroblastomzelllinien) im Mittel bei 9,6 nM, nach 48 Stunden bei 7,3 nM und nach 72

Stunden bei 6,1 nM. Bei uns lag der IC50 Wert im Mittel (bei sieben Zelllinien) nach 48

Stunden bei 15,1 nM. Die Forschungsgruppe von Brignole et al., (2006) benutzte in vitro

Diskussion

48

teilweise folgende andere Zelllinien (GIE-N, GI-LI-N, GI-CA-N, HTLA-230, SK-NBE2c und

CAN), wodurch die unterschiedlichen IC50 Werte erklärt werden könnten, wobei die Werte in

der gleichen Größenordnung liegen. Brignole et al., (2006) testeten zusätzlich SH-SY5Y

(Bortezomib sensible Zelllinie) und die Bortezomib resistente Zelllinie HTLA 230 mit kurzen

Behandlungszeiten von einer und vier bzw. acht Stunden mittels wash-out-Assay. Bei der

Zelllinie SH-SY5Y lag der IC50 Wert nach vierstündiger Behandlung bei 60 nM und nach einer

Stunde bei 150 nM. Bei den HTLA 230 Zellen zeigte sich nach einstündiger Behandlung ein

IC50 Wert von 200 nM. Weiterhin zeigte sich, dass es nach einer 72-stündigen Behandlung mit

20 nM Bortezomib zu einer fast 100% igen Inhibierung des Zellwachstums bei der Zelllinie

SH-SY5Y gekommen war. Bei den weiter getesteten Zelllinien (LAN-1, SK-NBE2c, IMR-32

und GI-LI-N) war es zu ähnlichen Resultaten gekommen (Brignole et al., 2007) In der

vorliegenden Studie lag die nahezu 100% ige Wachstumsinhibierung von SH-SY5Y nach 48

Stunden bei 52 nM.

Valentiner et al., (2005) konnten bei der Testung von PPAR-γ Agonisten ebenso bei SH-SY5Y

die stärkste Inhibierung des Neuroblastomzellwachstums in vitro nachweisen. Den

Ergebnissen von Valentiner et al., (2005) und Brignole et al., (2006) zufolge, weist die Zelllinie

SH-SY5Y anscheinend eine gute Chemosensibilität auf. Gründe für die hohe Sensitivität

dieser Neuroblastomzelllinie sind in der Literatur nicht beschrieben.

Hamner et al., (2007) untersuchten die Neuroblastomzelllinien NB-1691, CHLA-255 und SK-

N-AS mittels verschiedener Konzentrationen des Medikamentes Bortezomib und

unterschiedlichen Behandlungszeiten. Hierbei konnte ebenfalls eine zeit- und dosisabhängige

antiproliferierende Wirkung erzielt werden. Nach 24 stündiger Behandlungszeit (1 µmol / l)

konnte eine dosisabhängige Abnahme der Proliferation bei den 3 Zelllinien auf 13% (NB-

1691), 15% (CHLA-255) und 26% (SK-N-AS) bestimmt werden (p<0,1). Bei der geringsten

Dosis (10 nmol / l) wurde eine Zunahme der antiproliferativen Wirkung mit steigender

Behandlungsdauer (24, 48 und 72 Stunden) nachgewiesen (Hamner et al., 2007).

Weiterhin berichtete die Forschungsgruppe von Michaelis et al., (2006), dass Bortezomib bei

den von ihnen getesteten chemosensiblen Neuroblastomzelllinien (IMR-32 und Be(2)-C) und

medikamentenresistenten Zelllinien (UKF-NB-3rVCR10, UKF-NB-3 und UKF NB-3rDox20) bei

bereits niedrigsten Konzentrationen (Bsp. UKF-NB-3rVCR10 = 8,49 ± 2,07 nM; UKF NB-

3rDox20 = 4,0 ± 0,32 nM) eine Inhibierung des Zellzyklus bewirkte und zusätzlich Apoptose

induzierte. Ling et al., (2003) konnten eine Zunahme der Apoptose nach Behandlung mit

Bortezomib am nichtkleinzelligen Lungenkarzinom feststellen, wobei es zu einer Arretierung

Diskussion

49

des Zellzyklus in der G2 – M – Phase kam. Weitere Testungen mit Bortezomib wurden von

Sunwoo et al., (2001) an humanen Plattenepithelkarzinomen durchgeführt und wiederum kam

es zu einer Abnahme der Zellzahl und zudem zu einer Inaktivierung von NF-κB. Studien von

Ruiz et al., (2006) haben die Effekte von Bortezomib mit einem neuen irreversiblen

Proteasomeninhibitor (NPI-0052) an 20S Chymotryptic Proteasomen verglichen. Dazu wurden

isolierte chronisch lymphatische Leukämie (CLL) Zellen in vitro bezüglich ihrer Apoptose

getestet. Es konnte gezeigt werden, dass Bortezomib und NPI-0052 einen proapoptotischen

Effekt an isolierten CLL Zellen besaßen, wobei NPI-0052 sogar eine noch stärkere Wirkung

aufwies.

Nach den hervorragenden antiproliferativen Effekten in vitro wurde dann die Zelllinie SK-N-SH

für die in vivo Versuche ausgewählt. Diese Zelllinie wurde verwendet, da SK-N-SH in bereits

durchgeführten Tierversuchen ein schnelles Tumorwachstum und eine hohe

Metastasierungsrate aufwies (Ursula Valentiner, in Vorbereitung).

Die 40 scid-Mäuse wurden in zwei Gruppen eingeteilt und zwei Tage nach der s.c. Injektion

der Tumorzellen erhielt dann die eine Gruppe den Proteasomeninibitor Bortezomib in einer

Konzentration von 1 mg / kg KG (Michaelis et al., 2006; Brignole et al., 2006). Diese

Dosierung wurde ausgewählt, weil Sunwoo et al., (2001) berichteten, dass bei einer Gabe von

1 mg / kg KG eine signifikante Inhibierung des Tumorwachstums der humanen

Plattenzellkarzinomzelllinie UM-SCC-11B zu erzielen war. Eine höher dosierte

Medikamentengabe von 2 mg / kg KG hatte zum Tod (drei von sechs Mäusen) geführt. In der

von uns durchgeführten Studie erhielt die Kontrollgruppe PBS.

In dieser Studie erhielten die Tiere die Testsubstanz relativ direkt nach der Tumorzellinjektion.

Teicher (2006) berichtete zwar, dass Studien, bei denen ein Medikament erst nach erfolgtem

Tumorwachstum verabreicht wurde, eine viel höhere klinische Relevanz haben als Studien, in

denen das Medikament bereits vor Anwachsen des Tumors injiziert wurde. Dabei ist aber zu

bedenken, dass solide Tumoren fast nie primär mit einer Chemotherapie behandelt werden,

sondern der Primärtumor meist erst operativ entfernt oder verkleinert wird. Anschließend

erfolgt dann eine Chemotherapie, durch die okkulte Metastasen abgetötet werden sollen

(Koletzko, 2003).

Es hat sich gezeigt, dass eine Injektion von Bortezomib alle 72 Stunden für die Inhibierung der

Aktivität des 26S Proteasomen optimal ist (Adams et al., 1999). So wurde von uns in der

vorliegenden Arbeit das Medikament ebenfalls zweimal pro Woche verabreicht.

Diskussion

50

Es zeigte sich nach der Tötung der Tiere, dass das Medikament Bortezomib keinen

signifikanten Unterschied hinsichtlich des Primärtumorgewichtes zwischen den beiden

Gruppen bewirkt hatte. Im Mittel hatte die Kontrollgruppe ein Primärtumorgewicht von 0,29 g

und die Bortezomibgruppe von 0,26 g (Abb. 12). Dieses Tumorgewicht ist im Vergleich zu

bisherigen Tierversuchstudien eher gering. Thies et al., (2007) zeigten in den von ihnen

getesteten Melanomzelllinien (G361, MV3, FemX1, UISO-Mel 6,MeWo und Lox) auf, dass das

durchschnittliche Tumorgewicht eine Spannbreite zwischen 0,1 - 2,4 g bei unterschiedlichen

Anwachszeiten von 25 - 90 Tagen aufwies. Dieses zeigte, dass das Tumorgewicht unserer

Tiere (0,1 – 0,7 g) eher im unteren Drittel der Gewichtsskala anzusiedeln wäre. Im Gegensatz

zu vorhergehenden Versuchen, bei denen eine vierwöchige Anwachszeit ausreichend war,

wäre im vorliegenden Experiment eine längere Versuchsdauer vorteilhaft gewesen. Diese

Überlegungen werden durch die Arbeit von Teicher (2006) bestätigt, da das Tumorwachstum

logarithmisch mit der Versuchsdauer ansteigt. Durch die zeitliche Planung der bildgebenden

Untersuchungen war eine Terminänderung jedoch während des Tierversuches nicht mehr

möglich.

Michaelis et al., (2006) beschrieben, dass in Nacktmäusen die drei Neuroblastomzelllinien

(UKF-NB-3rVCR10, UKF-NB-3 and UKF NB-3rDox20) nach Behandlung mit Bortezomib eine

Verminderung des Tumorvolumens der Bortezomibgruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe

zeigten. Ein direkter Vergleich dieser Ergebnisse mit unseren Resultaten ist nicht möglich, da

diese Arbeitsgruppe das Tumorvolumen bestimmt hat und nicht das Tumorgewicht. Gründe

für eine unterschiedliche Wirksamkeit in vivo können sowohl in den unterschiedlich

verwendeten Zelllinien liegen, als auch in der Art des Versuchsaufbaus. So wurden von

Michaelis et al., (2006) nur die Nacktmäuse für die Testung mit Bortezomib benutzt, bei denen

der Tumor auch tastbar angewachsen war. Desgleichen zeigten Brignole et al., (2006) eine

statistisch signifikante Inhibierung des Tumorwachstums der Neuroblastome, welche sich

ebenfalls in einer Reduzierung des Tumorvolumens zeigte. Diese Arbeitsgruppe wendete

verschiedene Tiermodelle an, bei denen sowohl Nacktmäuse als auch scid-Mäuse benutzt

wurden. Die Nacktmäuse erhielten 2 x 106 HTLA-230 Tumorzellen, da diese Zelllinie eine der

resistentesten gegenüber Bortezomib ist, in die Schwanzvene. Die Behandlung mit

Bortezomib oder Kochsalzlösung setzte drei Tage nach Inokulation ein. Die scid-Mäuse

bekamen 1,5 x 106 Zellen der Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y in die Nebennierenrinde

gespritzt. Ihre Behandlung mit Bortezomib begann 10 Tage nach Inkorporation der

Tumorzellen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Behandlungszeitraum von 30 Tagen

gewählt. Durch die Experimente von Brignole et al., (2006) zeigte sich eine zunehmende

Diskussion

51

Differenz des Tumorvolumens zwischen behandelter und nichtbehandelter Gruppe mit

steigender Anzahl (30, 40, 50 Tage) der Behandlungstage. Die Unterschiede bezüglich der

Versuchsdurchführung können die differierenden Ergebnisse in Hinblick auf die Wirkung von

Bortezomib im Neuroblastom in vivo erklären.

Bei den Versuchsreihen von Amiri et al., (2004) bezüglich der Therapie vom malignen

Melanom mit Bortezomib, konnte eine signifikante Inhibierung (p<0,001) des Tumorvolumens

nach Gabe von 1,25 mg / kg KG und einer Behandlungsdauer von 36 Tagen im Vergleich zur

Kontrollgruppe erzielt werden. Das geringere Tumorvolumen wurde durch eine Inhibierung der

Angiogenese des Tumors erklärt. Nach Testungen mit Antikörpern gegen Endothelzellmarker

CD31 konnte gezeigt werden, dass mit Bortezomib behandelte Tumoren signifikant weniger

Vaskularisierung aufwiesen als Tumoren der Kontrollgruppen. Le Blanc et al., (2002) konnten

ebenfalls beim malignen Myelom eine signifikante Inhibition des Tumorwachstums

nachweisen, die auf eine Verminderung der Angiogenese und Induzierung der Apoptose

zurückzuführen war. Kahn et al., (2006) beschäftigten sich in ihrer Neuroblastomstudie mit

Kombinationstherapien. Es wurde beschrieben, dass scid-Mäuse, die eine Therapie

bestehend aus Bortezomib und IL-2 erhalten haben, eine Limitierung der Vaskularisation der

Tumorperipherie zeigten, die mit einer Abnahme der Tumorgröße einherging. In Hinsicht auf

Kombinationstherapien gab Teicher (2006) zu bedenken, dass sich immer die Frage stelle, ob

die kombinierten Medikamente einen sich addierenden Effekt hätten oder eine faktisch

unterschiedliche Wirkung aufweisen würden.

Es sollte ferner überprüft werden, ob Bortezomib trotz der Unwirksamkeit bezüglich des

Tumorgewichtes einen Einfluss auf die Anzahl der Apoptosen und Mitosen der Primärtumoren

hat. In der lichtmikroskopischen Untersuchung konnte ein statistisch signifikanter Unterschied

zwischen der Apoptosen- und Mitosenanzahl der beiden getesteten Gruppen eruiert werden.

Dabei hatte die Kontrollgruppe im Mittel einen Apoptoseanteil von 5 % der Gesamtzellzahl

und einen Mitoseanteil von 6,5%. Im Gegensatz dazu konnte bei den Primärtumoren der

Bortezomibgruppe ein Apoptoseanteil von 10 % und ein Mitoseanteil von 5 % ermittelt werden

(Abb. 14 und 16). Michaelis et al., (2006) haben ebenfalls gezeigt, dass Bortezomib einen

Anstieg der Apoptose in den Neuroblastomzelllinien UKF-NB-3 rVCR10, UKF-NB-3 und UKF

NB-3rDox20 im Xenograft bewirkt hatte. Es bestand allerdings ein deutlicher Unterschied

zwischen den verschiedenen Zelllinien bezüglich der Wirkung auf die Apoptoserate. Hierbei

scheint ein Zusammenhang zur Expression des Tumorsuppressorgens p53 zu bestehen. So

reagierten die Wildtyp p53 exprimierenden Zelllinien UKF-NB-3 rVCR10 und UKF-NB-3

sensitiver als die p53 mutierte Zelllinie UKF NB-3rDox20 auf die Behandlung mit Bortezomib.

Diskussion

52

Brignole et al., (2006) haben DNA Fragmente der behandelten Zellen mittels TUNEL und PI-

Färbungen gemessen. Auch diese Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die mit Bortezomib

behandelte Gruppe 62 % TUNEL positive Zellen aufwies und es konnte ein statistisch

signifikant höherer Anteil an apoptotischen Zellen mittels PI Färbung erzielt werden

(Bortezomib 29 % versus Kontrolle 5 %, p<0,001). Die Induktion von Apoptose erfolgte durch

die Aktivierung von Aspartat spezifischen Cystein Proteasen oder Caspasen (Thornberry et

al., 1998). Brignole et al., (2006) konnten diesbezüglich demonstrieren, dass es zu einer

zeitabhängigen signifikant erhöhten Caspaseaktivität der Bortezomibgruppe gegenüber der

Kontrollgruppe gekommen war. Es wurde daraus geschlossen, dass das Tumorsupressorgen

Caspase einen direkten Einfluss auf die Apoptose bei Neuroblastomen aufweist (Brignole et

al., 2006).

Durch vorausgegangene Studien wird deutlich, dass die Induktion der Apoptose nicht der

einzig wichtige Mechanismus zur Behandlung des Neuroblastoms zu sein scheint. Durch

Untersuchungen von Michaelis et al., (2006), Brignole et al., (2006) und Hamner et al., (2007)

wird ersichtlich, dass antiangiogenetische Effekte höchstwahrscheinlich eine sehr wichtige

Rolle in der Wachstumsinhibierung von Neuroblastomen in vivo spielen. Hamner et al., (2007)

gehen weiterhin von einer Herunterregulation der Expression von VEGF (vascular edothelial

growth factor) aus.

Wie auch schon die vorherige Studie von Michaelis et al., (2006) aufzeigte, konnte in der

vorliegenden Arbeit kein signifikanter Unterschied bezüglich des nekrotischen Anteiles des

Tumors zwischen der mit Bortezomib behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe festgestellt

werden.

Um den Unterschied der Metastasierung in die Lungen der scid-Mäuse zwischen der

Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe zu bestimmen, wurden die Lungen

lichtmikroskopisch untersucht. Es konnte dargestellt werden, dass es zu einem Unterschied

hinsichtlich der Metastasierung in die Lungen der scid-Mäuse gekommen war. In der

Kontrollgruppe konnten bei fünf von 20 scid-Mäusen Lungenmetastasen nachgewiesen

werden. Hingegen entwickelten die Tiere, die mit Bortezomib behandelt wurden, keine

Lungenmetastasen. Diese Ergebnisse zeigen erstmalig, dass es zu einer pharmakologischen

Beeinflussung der Metastasierungsrate der Neuroblastome in die Lunge der scid-Mäuse

kommen kann.

Insgesamt war die Anzahl der Metastasen in den Lungen der Kontrollgruppe gering. Dieses

könnte durch das geringe Primärtumorgewicht bei einer festgelegten Wachstumsdauer von

Diskussion

53

vier Wochen bedingt sein. In der Literatur wird dieser Zusammenhang zwischen

Primärtumorgewicht und Metastasierung kontrovers diskutiert. Man muss aber davon

ausgehen, dass der Zusammenhang zwischen Primärtumor und Metastasen

zelllinienspezifisch ist. So berichteten Thies et al., (2007), dass es bei den von ihnen

getesteten humanen Melanomzelllinien keine signifikante Beziehung zwischen Tumorgewicht

und Anzahl an Metastasen in der Lunge gab. Jojovic und Schumacher (2000) zeigten, dass

die von ihnen getesteten humanen HT29 Kolonkarzinomzellen einen Zusammenhang

zwischen Gewicht des Primärtumors und Anzahl der Lungenmetastasen aufwiesen. Falls ein

Zusammenhang zwischen Primärtumor und Anzahl an Metastasen existieren sollte, dann

könnte die Verringerung des Gewichts des Primärtumors schon per se eine Reduktion der

Metastasenanzahl bewirken. Nach unveröffentlichten Ergebnissen unseres Labors und den

Resultaten der vorliegenden Arbeit, besteht aber für die Zelllinie SK-N-SH kein

Zusammenhang zwischen Tumorgröße und Metastasen (Abb. 21); außerdem waren die

Tumorgewichte in unseren beiden Untersuchungsgruppen gleich (Abb.12). Daher kann in

dieser Studie von einer spezifisch antimetastatischen Wirkung ausgegangen werden. Eine

antimetastatische Wirkung von Bortezomib bei Neuroblastomen wird in den Untersuchungen

von Khan et al., (2006) bestätigt. Es wurden Unterschiede zwischen behandelten Gruppen

(Bortezomib, IL-2 oder Kombination von Bortezomib und IL-2) und der Kontrollgruppe

hinsichtlich der Metastasen von Neuroblastomen in die Leber beschrieben. Nach der i.v.

Injizierung von TBJ-RFP Zellen, waren die Lebermetastasen der Kontrollgruppe wesentlich

größer und besser vaskularisiert, als die der behandelten Gruppe. Die scid-Mäuse, welche

lediglich mit Bortezomib behandelt wurden, zeigten eine Abnahme der Lebermetastasengröße

sowie der Vaskularisierung. Eine Kombinationstherapie mit Bortezomib und IL-2 hat zu einer

Potenzierung dieser Effekte geführt. Hinzuzufügen ist aber, dass es sich hierbei nicht um eine

Spontanmetastasierung des Primärtumors handelt, sondern um eine i.v. Injektion der

Tumorzellen, sodass der erste Schritt der Metastasierungskaskade fehlt. Es handelt sich also

vielmehr um disseminierte Tumorzellen, die sich nach Durchtritt des Gefäßsinuswalls in der

Leber zu Metastasen formiert haben, welches auch als extravaskuläre Tumorzellproliferation

bezeichnet wird (Nischwitz, 2007). Damit zeigen unsere Versuche erstmalig, dass es zu einer

echten Hemmung von Metastasierung unter Bortezomib kommen kann.

Um weiterhin zu überprüfen, ob Bortezomib einen Einfluss auf die Disseminierung der freien

Tumorzellen im Blut besitzt, wurde eine Real-time PCR durchgeführt. In der vorliegenden

Arbeit konnte gezeigt werden, dass es keinen Unterschied (15 freie Tumorzellen) zwischen

Diskussion

54

der mit Bortezomib behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe bezüglich der freien

Tumorzellen im Blut der scid-Mäuse gab.

Schneider et al., (2002) haben beschrieben, dass die Real-time PCR eine gute Möglichkeit

darstellt, um ALU-Sequenzen diverser humaner Tumorentitäten im Xenograftmodell zu

detektieren. Für die gegenwärtige Studie wurde ebenfalls ALU-PCR benutzt, da im haploiden

Genom ungefähr 500.000 Kopien (entspricht 5% der menschlichen DNA) an ALU-Sequenzen

vorhanden sind (Alberts et al., 1999). Schneider (2002) beschrieb, dass ALU-PCR den

Nachweis und eine Quantifizierung der Metastasen zu einem Zeitpunkt ermöglichen, zu dem

eine exakte Auswertung mit der klassischen Histologie noch nicht möglich ist. Demnach bietet

sich diese Methode an, um eine Kontrolle der Metastasierungsrate während des

Tierversuches durchzuführen.

Vor der Tötung der Tiere wurden zur näheren Charakterisierung des Tumors und seiner

möglichen Metastasen bildgebende Untersuchungen durchgeführt. Es wurde ein

halbautomatisches Segmentationsverfahren basierend auf der interaktiven Festlegung von

Schwellenwertbereichen (verschiedene Grauabstufungen des Tumors) und der

anschließenden, automatischen Erfassung zusammenhängender Volumenelemente (Voxel)

im Bereich der Tumore angewandt. Die korrespondierenden Tumorvolumina wurden jeweils

aus der Anzahl der segmentierten Voxel und deren räumlichen Abmessungen berechnet.

Hinsichtlich des Tumorwachstumsverhaltens konnte allerdings kein deutlicher Unterschied

zwischen der Bortezomib- und der Kontrollgruppe eruiert werden. Ein Befund, der der

späteren ex vivo Untersuchung der Tumorgewichte entsprach.

Mit der Voxel-Man Software hatte man durch die Bestimmung der Gesamtmenge der Voxel

des Tumors die Möglichkeit, das tatsächliche Tumorvolumen zu ermitteln. In Abbildung 30

wird gezeigt, wie sich eine Rekonstruktion des Tumors einer scid-Maus darstellt.

Anschließend wurde das Tumorvolumen berechnet, welches mit dem am Tötungstag

tatsächlichen gemessenen Gewicht mit einer leichten Korrelation (r = 0,6; statistisch n.s.)

übereinstimmte. Diese Ergebnisse demonstrieren an sich zwar schon die guten Ansätze der

intravitalen Tumorvolumetrie mittels MRT-Bildgebung und Bildnachbearbeitung mit der

Software Voxel-Man, zeigen aber dennoch, dass es zu weiteren Verfeinerungen kommen

muss, um eine noch höhere Korrelation zwischen Tumorgewicht und Tumorvolumen zu

erzielen, die dann auch für die klinische Onkologie von großem Interesse sein dürfte.

Verschiedene Faktoren könnten die Qualität der Segmentationen beeinflusst haben, wodurch

sich kein höherer Korrelationskoeffizient erzielen ließ. Bei unseren Untersuchungen waren die

Diskussion

55

Formen der Tumoren sehr unterschiedlich (kugelig bzw. länglich auslaufend, kompakt oder

gelappt). Bei gelappten Tumoren war die Korrelation zwischen Tumorgewicht und

Tumorvolumen schlechter als bei kugelförmigen Tumoren.

Die Forschungsgruppe von Cornelissen et al., 2005 verglich zwei MRT - basierte Methoden

(die manuelle Messmethode und die halbautomatische Messmethode) mit zwei klassischen

Methoden zur Tumorvolumenbestimmung (Messschieber und Wasserprobe). Bei der

manuellen Messmethode wurde das Tumorvolumen durch Multiplikation von Schnittdicke und

Tumorareal bestimmt. Das Prinzip der halbautomatischen Methode bestand darin, dass aus

dem intensivsten farblich markierten Teil des Tumors erst einmal ein Punkt bestimmt wurde.

Alle Voxel in der Umgebung dieses Punktes, die eine höhere Signalintensität als ein

festgelegter Schwellenwert aufwiesen, wurden in das Tumorvolumen einbezogen. Die

Messschieberauswertung funktionierte nach dem Prinzip der Messung der kurzen und langen

Achse des Tumors mittels eines Messschiebers, woraus das Volumen dann berechnet wurde.

Die weit verbreitete Tumorvolumenbestimmung durch die Wasserprobe erforderte eine

Resektion des Tumors. Das Tumorvolumen wurde danach in einem speziell dafür

hergestellten System gemessen. Dieses System bestand aus drei korrespondierenden

Pipetten, von denen alle drei mit Wasser gefüllt wurden. Durch die Zugabe des Tumors

änderte sich die Wasserstandshöhe, die dann abgelesen werden konnte. Nachteil dieser

Methode liegt darin, dass die Versuchstiere getötet werden müssen. Die Arbeitsgruppe konnte

bei dieser Versuchsreihe eine positive Korrelation von r2 = 0,95 bei p<0,0001 zwischen den

vier Methoden feststellen. Allerdings spielt der Nekroseanteil des Tumors bei dem

halbautomatischen Segmentationsverfahren eine Rolle (Cornelissen et al., 2005). Bei

Tumoren mit einen hohen Anteil an Nekrose (Tumoren > 1,5 cm3) unterschieden sich die

Ergebnisse der Tumorvolumenbestimmung mittels der halbautomatischen Methode deutlich

von der Messung mittels der Wasserprobe. Dies liegt darin begründet, dass die nekrotischen

Anteile bei der halbautomatischen Methode automatisch detektiert werden können und nicht

in die Messung mit einbezogen werden (Cornelissen et al., 2005). In der von uns

ausgeführten Tumorauswertung mittels der Voxel-Man Software könnten die Nekrosen

ebenfalls herausgerechnet werden. Mit halbautomatischen MRT - basierten Methoden zur

Tumorvolumenbestimmung ergäbe sich daher die Möglichkeit der genaueren Bestimmung der

Tumormasse. Dieses ist von Bedeutung, da einige Medikamente die apoptotischen Vorgänge

der Tumorzelle stimulieren. Daraus resultiert aber nicht zwangsläufig eine Abnahme des

Tumorvolumens.

Diskussion

56

Weiterhin haben halbautomatische Methoden den Vorteil, dass sie zur

Tumorwachstumskontrolle im Therapieverlauf eingesetzt werden können. Teicher (2006)

beschreibt in ihrer Arbeit die Wichtigkeit der Kontrolle des Tumorwachstums während des

Versuches, da das Tumorwachstum bis zum letztendlichen Tumorvolumen zwischen

Medikamenten- und Kontrollgruppe unterschiedlich ablaufen kann. Die MRT Kontrolle der

Tumormasse unter medikamentöser Therapie ist für die Beurteilung der Wirkung einer

Substanz von großem Interesse. Hierdurch wird nochmals deutlich, wie wichtig die

Weiterentwicklung der Methoden der nicht invasiven Tumorvolumenbestimmung ist.

Weiterhin könnte das Angrenzen an andere signalintensive Strukturen (z. B. Fett im

Nackenbereich) dafür verantwortlich sein, dass die Korrelation zwischen Tumorgewicht und

Tumorvolumen in dieser Untersuchung nicht noch höher ausgefallen ist. Hinzu kommen

Rundungsfehler bei der Angabe des tatsächlich gemessenen Tumorgewichtes, da nur eine

Kommastelle betrachtet wurde.

Mittels des PET-CTs sollte ein Vergleich der radioaktiven Tracer [18F]FDG und [18F]FLT

hinsichtlich ihrer Sensitivität beim Neuroblastom ermittelt werden. Meist wird zur

Diagnosestellung, Staging und Restaging von Tumoren der Tracer [18F]FDG benutzt

(Hazelton TR und Coppage L, 2005; Avril NE und Weber WA, 2005). Krieger-Hinck et al.,

(2006) zeigten, dass der normalerweise benutzte Tracer [18F]FDG sich im Neuroblastom

schlechter angereichert hatte als [18F]FLT. Dieses konnte durch die Untersuchungen in der

vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Es zeigte sich, dass bei den PET-CT Aufnahmen, die

mit [18F]FDG durchgeführt wurden, trotz vergleichbarer Tumorgewichte in beiden Gruppen

(Abb. 30) keine Anreicherung der radioaktiven Substanz in den Tumoren nachweisbar war. Im

Gegensatz dazu konnte bei den Tumoren, die mit [18F]FLT markierten wurden, eine visuelle

Interpretation vorgenommen werden. Abbildung 31 zeigt nochmals, dass es auch bei [18F]FLT

zu keiner Anreicherung bei einem Tumorgewicht < 0,1 g gekommen war. Zwischen 0,1 g und

0,3 g zeigten die Tumoren ein Signal, dass stärker als das Hintergrundrauschen war. Ab

einem Tumorgewicht von 0,4 g war das Signal stärker als das Referenzorgan Leber.

Die Resultate der Untersuchung ergaben eine positive Korrelation zwischen Tumorgewicht

und Anreicherung des [18F]FLT im Tumor. Pacak et al., (2004) berichteten bereits, dass

Tumoren mit einer Tumorgröße unter 0,7 mm nicht im konventionellen humanen PET zu

beurteilen wären. Die Auflösung, die mit diesen Geräten erreicht werden kann, ist niedriger als

die eines Kleintier- PETs und somit ist die Darstellung und Beurteilung sehr kleiner Tumoren

schwierig. Im Gegensatz dazu und vor allem scheinbar kontrovers zu Krieger-Hinck et al.,

(2006), konnte in der vorliegenden Studie eine Anreicherung von [18F]FLT auch bei einem

Diskussion

57

Tumorgewicht < 1,0 g erzielt werden. Der Grund der unterschiedlichen Sensitivitäten der

Detektion der Tumoren liegt in der Benutzung unterschiedlicher PET-CT Geräte. Das in

unserer Studie verwendete Gerät besaß eine höhere Auflösung als das benutzte Gerät von

Krieger-Hinck et al., (2006) und somit konnten auch Tumoren mit sehr niedrigen

Tumorgewichten dargestellt werden.

Vorherige Studien belegten bereits, dass keine Korrelation zwischen der Expression von Ki 67

und der Anreicherung von [18F]FDG und [18F]FLT bestand. Beispiele hierfür sind das

Ösophaguskarzinom (van Westreenen et. al., 2005), das Pankreaskarzinom (Buck et al.,

2001) sowie die Tumoren der Mamma (Smyczek-Gargya et al., 2004) und des Thorax

(Dittmann et al., 2003). Krieger-Hinck et al., (2006) konnten bezüglich der Immunreaktion mit

Ki 67 ebenfalls keine positive Korrelation zwischen der Zellproliferationsrate und dem

[18F]FDG und [18F]FLT uptake bei humanen Neuroblastomen im scid-Mausmodel ermitteln.

Aus diesen Gründen wurden von uns keine weiteren Untersuchungen bezüglich der

Expression von Ki 67 in Neuroblastomen durchgeführt.

Weiterhin wurde in dieser Arbeit im Rahmen einer Pilotstudie untersucht, ob eine Fusion der

Aufnahmen von PET-CT und MRT zu einer weiteren Verbesserung der anatomischen

Zuordnung führen würde. Nach der Fusion der beiden Bilddatensätze konnte gezeigt werden,

dass die anatomischen Strukturen wesentlich besser sichtbar waren, als in den PET Bildern

allein. Eine Anreicherung der radioaktiven Substanz im Tumor war klarer vom umliegenden

Gewebe abzugrenzen. Eine genauere Beurteilbarkeit von Tumoren mittels Fusion der

bildgebenden Verfahren könnte eine bessere Verlaufskontrolle während der Tumortherapie in

der onkologischen Medizin ermöglichen.

Zu bedenken ist aber, dass das MRT und das PET-CT zu unterschiedlichen Zeitpunkten

durchgeführt wurden und somit die Mäuse nicht exakt in der gleichen Position lagen. Es

wurde für diese Arbeit eine retrospektive Fusion durchgeführt. Für weitere Studien könnte

man eine Verbesserung der Untersuchungsergebnisse erzielen, indem das CT Protokoll für

die Mausuntersuchung z.B. durch weniger Kilovolt (kV) optimiert würde, denn dieses würde zu

mehr Weichteilkontrast führen. Durch ein Kleintier-PET würde man noch eine weitere

Optimierung der Auflösung erhalten.

Zusammengefasst haben diese Studien ergeben, dass der Proteasomeninhibitor Bortezomib

hervorragende Wirkungen auf die Proliferation humaner Neuroblastomzelllinien in vitro gezeigt

hatte, die in vivo nur teilweise zu erzielen waren. Es konnte keine Wirkung auf das

Primärtumorgewicht erzielt werden. Jedoch zeigte sich eine statistisch signifikante Zunahme

Diskussion

58

der Apoptoserate und Abnahme der Mitoserate in der Behandlungsgruppe im Vergleich zur

Kontrollgruppe. Erstmalig konnte eine antimetastatische Wirkung in Bezug auf die spontane

Lungenmetastasierung festgestellt werden. Diese Ergebnisse sind aber nur begrenzt zu

verallgemeinern, da nur eine Zellreihe in vivo untersucht wurde und eine längere

Versuchsdauer von Vorteil gewesen wäre. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit

und der aktuellen Ergebnisse anderer Forschungsgruppen sollten weitere Untersuchungen

zur Bedeutung von Proteasomeninhibitoren für die Therapie von Neuroblastomen

durchgeführt werden.

Zusammenfassung

59

6 Zusammenfassung

Insgesamt ist die Prognose von Kindern mit Neuroblastomen im fortgeschrittenen Stadium

schlecht, so dass ein dringender Bedarf an neuen Therapieansätzen besteht. Der

Proteasomeninhibitor Bortezomib (Velcade) zeigte bereits antiproliferative Wirkungen bei

verschiedenen Tumorentitäten sowie nach neuen Studien auch wachstumshemmende

Einflüsse auf das humane Neuroblastom in vitro und in vivo. Ziel dieser Arbeit war es, die

Wirkung des Medikament Bortezomib auf humane Neuroblastomzellen in vitro und in vivo zu

untersuchen. Das Medikament wurde in vitro an sieben humanen Neuroblastomzelllinien

(Kelly, LS, SH-SY5Y, SK-N-SH, IMR-32, LAN-1 und LAN-5) getestet. In vitro konnte bei allen

Zelllinien eine dosisabhängige Inhibierung des Zellwachstums erzielt werden. Für die in vivo

Versuche wurde die Zelllinie SK-N-SH in 40 scid-Mäuse injiziert und die Wirkung von

Bortezomib getestet. Diese Zelllinie wurde ausgewählt, weil sie in vorhergehenden scid

Mausversuchen eine gute Anwachsrate und eine hohe Metastasierungsrate aufwies; in den in

vitro Versuchen zeigte sie eine durchschnittliche Empfindlichkeit auf Bortezomib. Zusätzlich

wurde ein Imaging der Tumoren mittels MRT und PET-CT durchgeführt. Nach Tötung der

scid-Mäuse wurden die Primärtumore und Organe entnommen, histologisch aufgearbeitet und

die Apoptose- und Mitoserate in den Primärtumoren sowie die Lungenmetastasierung

bestimmt. Das Blut der Tiere wurde auf disseminierte Tumorzellen mittels der Real-time PCR

untersucht. In vivo reduzierte Bortezomib das Gewicht der Primärtumoren nicht. Es fand sich

jedoch ein statistisch signifikant höherer Apoptoseanteil und niedrigerer Mitoseanteil bei den

mit Bortezomib behandelten scid-Mäusen. Weiterhin konnte erstmalig gezeigt werden, das

Bortezomib die Lungenmetastasierungsrate von Neuroblastomen pharmakologisch

beeinflusst, da die Medikamentengruppe im Gegensatz zur Kontrollgruppe (5 von 20 Tieren)

keine Lungenmetastasen aufwies. Bei der Untersuchung des Blutes (n = 15 / Maus) gab es

keinen Unterschied bezüglich der disseminierten Tumorzellen zwischen den beiden Gruppen.

Durch MRT und anschließende Tumorrekonstruierung mit Hilfe des Voxel-Man Programms

konnte eine leichte Korrelation (r = 0,6; n.s.) zwischen dem Tumorvolumen und Tumorgewicht

erzielt werden. Mittels PET-CT konnte bestätigt werden, dass sich [18F]FLT zur Untersuchung

des Neuroblastoms besser eignet als [18F]FDG. Eine Fusion der Aufnahmen des MRT und

des PET-CT konnte eine deutliche Verbesserung der Zuordnung anatomischer Strukturen

erzielt werden. Aufgrund der Ergebnisse dieser vorliegenden Arbeit könnte man erwägen,

Bortezomib als adjuvante Therapie beim Neuroblastom in klinischen Studien zu testen.

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Danksagung

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Danksagung

Allen, die zum Gelingen an dieser Arbeit beigetragen haben, möchte ich an dieser Stelle

meinen Dank aussprechen:

Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Lehrer und Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. Udo

Schumacher für die Bereitstellung des interessanten Themas, die Möglichkeit dieses im

Anatomischen Institut ΙΙ durchführen zu können und für seine immer motivierenden

Anregungen und Ideen, die diese Arbeit erst wachsen ließen.

Bei meiner Betreuerin Frau Dr. med. Ursula Valentiner bedanke ich mich sehr für die

uneingeschränkte Betreuung während der gesamten Durchführung der Arbeit, den vielen

hervorragenden Tipps und Ratschlägen und ihrer immer unterstützenden Art.

Herrn Prof. Dr. Erttmann und Herrn Prof. Dr. Hildebrandt danke ich sehr herzlich für die zur

Verfügung gestellten Neuroblastomzelllinien.

Dem gesamten MTA-Laborteam möchte ich für die hervorragende Unterstützung und der

„umsorgenden“ Art während der ganzen Zeit recht herzlich danken. Dieses gilt vor allem Herrn

Klaus Siebert, Frau Renate Gehrke, Frau Maike Märker und ganz besonders Frau Kornelia

Babista.

Den wissenschaftlichen Assistenten, besonders Frau Dr. rer. nat. Heike Gustke und Frau Dr.

rer. nat. Nina Nehmann, möchte ich sowohl für die ausgezeichneten Hilfestellungen bei

praktischen Fragestellungen als auch beim Verfassen der Doktorarbeit danken.

Herrn Prof. Dr. med. Brenner, Herrn Florian Wilke und besonders Herrn Dr. med. Kersten

Peldschus danke ich sehr für ihre Unterstützung bezüglich des Imagings. Weiterhin möchte

ich mich bei Herrn Dr. Ulf Tiede und Herrn Dr. Michael Owsijewitsch für die Bearbeitung der

MRT – Bilder mittels der Voxel-Man Software recht herzlich bedanken.

Den Mitarbeitern des “Tierstalles“ danke ich sehr für die gute Versorgung der Versuchstiere.

Bei meinen Mitdoktoranden bedanke ich mich für eine tolle gemeinsame Zeit mit vielen

anregenden Gesprächen, gegenseitiger Unterstützung und Motivation.

Meiner Familie danke ich besonders für ihre stetige Begleitung und Unterstützung während

meines gesamten Studiums.

Zu guter Letzt möchte ich mich bei meinen Freunden bedanken, die durch Motivation und

Abwechslung ebenfalls sehr zum Gelingen beigetragen haben.

Lebenslauf

68

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Haane

Vorname Christina

Geburtsdatum-, ort 02/03/1979 in Dorsten

Schulbildung

08/1985 – 07/1989 Grundschule Don Bosco, Dorsten – Lembeck

08/1989 – 06/1995 St. Elisabeth Realschule, Reken

08/1995 – 06/1997 Fachoberschule für Sozial- und Gesundheitswesen, Dorsten, Erlangen der Fachhochschulreife

Berufsausbildung

10/1997 – 09/2000 Timmermeister Schule, Lehranstalt für Physiotherapie, Münster, Staatsexamen

Berufserfahrung

01/2001 – 03/2002 Berufsgenossenschaftliches Unfallkrankenhaus Hamburg-Boberg, Abteilung für Physiotherapie

Hochschulausbildung

12/2001 Studienberechtigung § 38 des Hamburgischen Hochschulgesetzes

04/2002 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf der Universität Hamburg

03/2004 Physikum

04/2004 – 08/2006 Klinische Ausbildung Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

09/2006 – 07/2007 Université Victor Segalen Bordeaux 2, ERASMUS Studienjahr in Frankreich

seit 08/2007 Praktisches Jahr

Selbstständigkeitserklärung

69

Selbstständigkeitserklärung

Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst,

andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den

benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe

(Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich

gemacht habe, und dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer

anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur

Promotion beworben habe.

Hamburg, den 24.10.2007

Christina Haane

Aus dem Institut für Anatomie ΙΙ -...

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