Anti MPO (p-ANCA) pour analyses de routine Détermination quantitative des anticorps IgG contre la myéloperoxydase dans le sérum ou le plasma humain.

Voir l’étiquette externe Σ= 96 tests RÉF DKO092

USAGE PRÉVU L'anti-MPO (p-ANCA) est un test immunoenzymatique indirect en phase solide (ELISA) pour la détermination quantitative des auto-anticorps de classe IgG dirigés contre la myéloperoxydase (MPO) dans le sérum ou le plasma humain. Le test est conçu pour usage diagnostique in vitro en soutien au diagnostic dans le cas de certaines vasculites auto-immunes comme la granulomatose de Wegener. Le kit Anti MPO (p-ANCA) est destiné exclusivement à un usage en laboratoire. 1. SIGNIFICATION CLINIQUE Les anticorps anti-cytoplasme neutrophile (ANCA) représentent un groupe d'autoanticorps dont l'action est dirigée contre les composants cytoplasmiques des granulocytes neutrophiles et des monocytes. Les méthodes classiques de détermination des ANCA sont les tests d'immunofluorescence (IF). Ces techniques d'immunofluorescence indirecte permettent de reconnaître 2 modèles : le type cytoplasmique (c-ANCA) et le type périnucléaire (p-ANCA). L’antigène principal pour le c-ANCA est la protéinase 3 (PR3) présente dans les granules primaires. L'action des anticorps anti p-ANCA présents dans les sérums positifs est principalement dirigée contre la myéloperoxydase (MPO). L'action des anticorps contre d'autres antigènes comme, par exemple, la lactoferrine, l'élastase, la cathepsine-G ainsi que le lysozyme provoquent souvent une réaction positive pour le p-ANCA. Cela complique l'interprétation et la classification exactes des profils d'immunofluorescence. C'est pourquoi toute réponse positive à l'IF pour l'ANCA devrait faire l'objet d'une différenciation par la technique ELISA en utilisant des antigènes purifiés. PR3-ANCA et MPO-ANCA sont des marqueurs sérologiques fiables pour le diagnostic des vasculites. PR3-ANCA est l'auto-antigène classique dans la granulomatose de Wegener avec une spécificité clinique supérieure à 95 % La présence de c-ANCA a été démontrée dans diverses maladies. Les anticorps anti-MPO sont hautement spécifiques pour les glomérulonéphrites idiopathiques et associées à des vasculites et pour la polyartérite noueuse, le syndrome de Churg-Strauss et la polyangéite sans implication rénale. Les méthodes ELISA spécifiques pour PR3 et MPO peuvent apporter une confirmation importante, outre l'interprétation des résultats de lecture difficile par immunofluorescence, par exemple dans les cas de réponse positive simultanément pour plusieurs anticorps ou un arrière-plan élevé de fluorescence. 2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Le test anti-MPO-IgG repose sur le lien entre les anticorps présents dans l'échantillon et la myéloperoxydase des neutrophiles humains liés sur les microplaques. Les

anticorps présents dans les calibrateurs, dans les contrôles et dans les échantillons prédilués des patients se lient sur la surface interne des puits. Au bout de 30 minutes d'incubation, la microplaque est lavée avec un tampon de lavage afin de supprimer les composants du sérum qui n'ont pas réagi. Une solution d'immunoglobuline anti-humain IgG conjugué avec de la peroxydase reconnaît les anticorps de classe IgG liés aux antigènes immobilisés. Au bout de 30 minutes d'incubation, l’excès de conjugué enzymatique qui ne s'est pas spécifiquement lié est supprimé par un lavage avec tampon. Verser une solution de substrat chromogène contenant du TMB dans les puits. Au bout de 15 minutes d'incubation, bloquer le développement de la couleur en ajoutant de la solution d'arrêt. La coloration de la solution devient jaune. La quantité de couleur se développant est directement proportionnelle à la concentration d'anticorps IgA dans l'échantillon original. 3. REACTIFS, MATERIAUX ET INSTRUMENTS 3.1. Réactifs et matériaux fournis dans le coffret 1. Étalons anti-MPO (5 flacons, 1,2 mL chaque) Tampon phosphaté 0,1M, NaN3 < 0,1%, sérum humain

STD0 RÉF DCE002/09206-0 STD1 RÉF DCE002/09207-0 STD2 RÉF DCE002/09208-0 STD3 RÉF DCE002/09209-0

STD4 RÉF DCE002/09210-0 2. Contrôles (2 flacons, 1,2 mL chaque, prêt à l'emploi) Tampon phosphaté 0,1M, NaN3 < 0,1%, sérum humain Contrôle négatif RÉF DCE045/09201-0 Contrôle positif RÉF DCE045/09202-0 3. Diluant échantillon (1 flacon, 100 mL) Tampon phosphaté 0,1M, NaN3 < 0,1%, sérum humain RÉF DCE053-0 4. Conjugué (1 flacon, 15 mL) Anti-humain IgG conjugué avec de la peroxydase de raifort (HRP), BSA 0,1%, Proclin < 0,0015% RÉF DCE002/09202-0 5. Microplaque coatée (1 microplaque sécable, myéloperoxydase adsorbée sur la surface) RÉF DCE002/09203-0 6. Substrat TMB (1 flacon,15 mL) 3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine 0,26 g/L, peroxyde d'hydrogène à 0,05% RÉF DCE004-0 7. Solution de lavage conc. 10X (1 flacon, 50 mL) Tampon phosphaté 0,2M, proclin < 0,0015% RÉF DCE054-0 8. Solution d'arrêt (1 flacon, 15 mL) 0.15M d'acide sulfurique RÉF DCE005-0

IVD LOT

3.2. Réactifs nécessaires non fournis dans le coffret Eau distillée. 3.3. Matériaux et instruments auxiliaires Distributeurs automatiques. Lecteur pour microplaques (450 nm). 4. AVERTISSEMENTS • Ce coffret est exclusivement pour usage in vitro et

l'essai doit être exécuté par un personnel expert. • Utilisez les dispositifs de protection individuelle prévus

pendant toute opération avec les réactifs fournis. • Tous les réactifs d'origine humaine utilisés dans la

préparation des étalons et des contrôles ont été testés et ont donné un résultat négatif pour la présence des anticorps anti-VIH, de l'antigène Hbs et des anticorps anti-VHC. Cependant, aucun test n'offre la certitude complète de l'absence du VIH, du VHB, du VHC ou d'autres agents infectieux. Par conséquent, les Étalons et les Contrôles doivent être gérés comme matériaux potentiellement infectieux.

• Matériaux d'origine animale utilisées pour la préparation de cette trousse ont été obtenus à partir d'animaux sains et protéines bovines ont été obtenus à partir de pays non touchés par l'ESB, mais ces matériaux devraient être utilisées comme potentiellement infectieux.

• Certains réactifs contiennent de petites quantités d'azide de sodium (NaN3) ou Proclin 300R comme conservateur. Eviter tout contact avec peau et les muqueuses.

• L'azide de sodium peut être toxique s'il est ingéré ou absorbé à travers la peau ou les yeux ; de plus, il peut réagir avec les tubes de plomb ou de cuivre en formant des azotures métalliques potentiellement explosifs. Faire couler de grandes quantités d'eau si un évier est utilisé pour éliminer les réactifs et prévenir la formation d'azotures.

• Le Chromogène TMB contient un irritant qui peut être nocif si inhalé, ingéré ou absorbé à travers la peau. Pour empêcher des lésions, éviter toute inhalation ou ingestion par la peau ou les yeux et tout contact cutané ou oculaire.

• La solution d'arrêt est constituée d'une solution d'acide sulfurique dilué. L'acide sulfurique est poison et corrosif et peut être toxique s'il est ingéré. Pour prévenir toute brûlure chimique possible, éviter le contact avec la peau et les yeux.

• Éviter l'exposition du réactif TMB/H2O2 à la lumière directe du soleil, aux métaux et aux substances oxydantes. Ne pas congeler la solution.

5. PRÉCAUTIONS D'USAGE • Observer rigoureusement l'ordre des passages indiqué

dans le présent protocole. • Tous les réactifs doivent être conservés à une

température contrôlée de 2-8°C dans leurs conteneurs originaux. Les exceptions sont clairement marqués.

• Avant usage, laisser reposer tous les éléments des coffrets et les échantillons à température ambiante (22-28°C) et mélanger avec soin.

• Ne pas échanger des éléments du coffret provenant de lots différents. Les dates d'échéance rapportées sur les étiquettes des récipients d'expédition et sur celles de tous les ampoules doivent être observées. Ne pas utiliser d'éléments au-delà de leur date d'échéance.

• ATTENTION : le réactif conjugué a été conçu pour garantir la plus grande sensibilité de dosage et, à moins d’être utilisé à bon escient, il risque d’être contaminé par des agents extérieurs : il est donc recommandé d’utiliser des consommables (embouts, flacons, cuvettes, etc.) à usage unique. Pour les dosages fractionnés, prélever la quantité exacte de

conjugué nécessaire et éviter de réintroduire les résidus dans le flacon d’origine. De plus, en ce qui concerne les dosages effectués avec des instruments automatiques et semi-automatiques, il est conseillé, avant d’utiliser le conjugué, d’effectuer le nettoyage de la partie fluidique en s’assurant que les procédures de lavage, de déprotéinisation et de décontamination sont suffisamment efficaces pour éviter la contamination du conjugué : cette procédure est vivement recommandée lorsque le kit est traité dans des analyseurs qui ne contiennent pas d’embouts à usage unique. Dans ce but, Diametra met séparément à disposition un réactif de décontamination pour le lavage des aiguilles.

• Si vous utilisez des équipements automatisés est de la responsabilité de l'utilisateur de s'assurer que le kit a été correctement validées.

• Un lavage incomplet ou peu soigné et une aspiration insuffisante du liquide dans les puits des tests ELISA peuvent provoquer un manque de précision et/ou un arrière-plan élevé.

• Il est important de maintenir constants les temps de réaction dans chaque puits afin d'obtenir les résultats susceptibles d'être répétés. Le pipetage des échantillons ne doit pas durer plus de 10 minutes afin d'éviter tout résultat incorrect. S'il se prolonge au-delà des 10 minutes, il est recommandé de suivre l'ordre de distribution. Si vous devez utiliser plus d'une microplaque, il est conseillé de répéter la courbe dose-réponse.

• L’ajout de la solution de substrat donne lieu à une réaction cinétique qui est interrompue par l'ajout de la solution de blocage. Par conséquent, il est nécessaire d'ajouter le substrat et la solution bloquante dans la séquence même afin d'éliminer toute variation temporelle pendant la réaction.

• Observer les instructions relatives à l'exécution du contrôle de qualité dans les laboratoires cliniques en testant les contrôles et/ou les groupes de sérum.

• Observer la plus grande précision dans la reconstitution et la distribution des réactifs.

• Ne pas utiliser des échantillons microbiologiquement contaminés ou des échantillons hautement lipémiques ou hémolysés.

• Les lecteurs de microplaques mesurent dans le sens vertical. Ne pas toucher le fond des puits.

6. CONDITIONS DE CONSERVATION • Conserver tous les réactifs du coffret à 2-8 °C. Ne pas

congeler. Les réactifs sont stables jusqu'à la date de péremption s'ils sont conservés et traités selon les instructions fournis.

• Les bandes de puits non utilisés doivent être immédiatement rangées dans le sachet refermable contenant le matériel dessicant et conservées dans le sachet bien fermé à 2-8 °C.

7. PROCÉDURE Porter tous les réactifs à température ambiante (22-28°C) et bien les mélanger. 7.1. Préparation des étalons (S0… .S4) Du moment que les préparations de référence internationale ne sont pas disponibles pour les anticorps anti-MPO, le système d'analyse est calibré dans des unités relatives arbitraires. Les étalons ont approximativement les concentrations suivantes :

S0 S1 S2 S3 S4 AU/mL 0 10 20 40 160

7.2. Préparation de l'échantillon Pour l'exécution du test, des échantillons de sérum ou de plasma humain peuvent être utilisés. Les échantillons à utiliser doivent être limpides. Il est conseillé d'éviter toute contamination due à l'hyperlipémie, même si une telle contamination n'interfère pas avec l'analyse. Les échantillons peuvent être conservés réfrigérés à 2-8°C pendant un maximum de 5 jours ou ils peuvent être conservés à -20°C pendant un maximum de 6 mois. Il est conseillé d'éviter les cycles répétés de congélation et décongélation des échantillons de sérum qui pourraient entraîner une perte variable de l'activité des autoanticorps. L'analyse des échantillons inactivés à la chaleur n'est pas recommandée. Tous les échantillons de sérum sont prédilués à 1:100 avec diluant d'échantillon. 10 µL de sérum peuvent donc être dilués avec 990 µL de diluant échantillon. Les Contrôles sont prêt à l'emploi. 7.3. Préparation de la solution de lavage Diluer le contenu de chaque flacon de solution de lavage concentrée (10x) dans de l'eau distillée jusqu'à obtenir un volume final de 500 mL. Maintenir la préparation réfrigérée : stable à 2-8°C pendant au moins 30 jours après la préparation ou jusqu'à la date de péremption rapportée sur l'étiquette. 7.4. Procédure Amener tous les réactifs à température ambiante (22-28°C) pendant au moins 30 minutes. Puisqu'il faut opérer en double, préparer deux puits pour chaque point de la courbe d'étalonnage (S0-S4), deux pour chaque échantillon et un pour l'échantillon blanc.

8. CONTRÔLE DE QUALITÉ • Le contrôle positif pour les IgG anti-MPO et le contrôle

négatif doivent être inclus chaque fois qu'un test est exécuté afin de s'assurer que tous les réactifs et le test fonctionnent correctement.

• Du fait que les contrôles sont prédilués, ils ne constituent pas un contrôle procédural pour les techniques de dilution utilisées pour les échantillons.

• D'autres sérums de contrôle peuvent être préparés en recueillant un pool de sérums humains, en les fractionnant en aliquotes et en le conservant à < -20 °C.

• Pour que les résultats du test soient considérés valides, tous les critères suivants doivent être satisfaits. Si un seul d'entre eux ne rentre pas dans les valeurs spécifiées, les résultats ne devraient pas être considérées valides et le test doit être répété : - L’absorbance du contrôle positif doit être supérieure à celle du contrôle négatif. - Le contrôle négatif et celui positif servent à contrôler un éventuel dysfonctionnement des réactifs et n'assurent pas la précision en correspondance de la valeur seuil du test. - Le test n'est valide que si la densité optique à 450 nm du contrôle négatif (1) et du contrôle positif (2) et ainsi que celle des calibrateurs (S0-S5) coïncide avec les intervalles correspondants indiqués dans le certificat de contrôle de qualité inclus dans le coffret.

9. CALCUL DES RÉSULTATS Pour les IgG anti-MPO, la méthode de sélection pour le traitement des résultats est une élaboration de 4 paramètres avec axes lin-log pour densité optique et concentration respectivement. De plus, il est possible d'utiliser une approximation du spline et les coordonnées log-log. Il est toutefois recommandé d'utiliser une courbe Lin-Log. Il faut avant tout calculer la moyenne des densités optiques relatives aux calibrateurs. Utiliser une feuille de papier lin-log et tracer les densités optiques moyennes de chaque calibrateur vers la concentration respective. Dessiner la courbe se rapprochant le mieux de tous les points d'étalonnage. Les points des calibrateurs peuvent également être raccordés entre eux par des segments de ligne droite. La concentration des échantillons inconnus peut être déterminée par interpolation à partir de la courbe d'étalonnage. Dans une étude sur les valeurs normales exécutée avec des échantillons de sérum provenant de donneurs sains, les intervalles de normalité suivants ont été calculés avec le test des IgG anti-MPO. IgG anti-MPO (p-ANCA) [AU/mL] Point de coupure : 20 Les valeurs rapportées ci-dessus ne sont que des valeurs suggérées. Chaque laboratoire devrait établir, en fonction de la procédure utilisée, sa propre fourchette de normalité sur les contrôles, les appareils et la population de patients, selon les méthodes standards propres à chacun d'eux. Les résultats positifs devraient être vérifiés en rapport à l'état clinique du patient. De plus, chaque décision relativement à la thérapie devrait être prise individuellement. Il est recommandé que chaque laboratoire établisse ses propres intervalles normaux et pathologiques des anti-MPO du sérum. 10. LIMITES DU TEST La présence dans l'échantillon de complexes immunes ou autres agrégats d'immunoglobuline peut entraîner des réactions aspécifiques avec faux positifs.

Réactifs Étalon Échantillon /Contrôles Blanc

Étalon S0-S4

100 µL

Contrôles 100 µL

Échantillon diluée 100 µL

Laisser incuber pendant 60 minutes à température ambiante (22-28°C). Éloigner le mélange de réaction, laver les puits trois fois avec 300 µL de solution de lavage diluée.

Conjugué 100 µL 100 µL

Laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante (22-28°C). Éloigner le mélange de réaction, laver les puits trois fois avec 300 µL de solution de lavage diluée.

Substrat TMB 100 µL 100 µL 100 µL

Laisser incuber pendant 15 minutes à température ambiante (22-28°C) à l'abri de la lumière.

Solution d'arrêt 100 µL 100 µL 100 µL

Agiter doucement la microplaque. Lire l'absorbance (E) à 450 nm en mettant à zéro avec le blanc.

11. PARAMÈTRES CARACTÉRISTIQUES

11.1. Spécificité Des tests de corrélation contre un coffret commercial analogue de référence effectués sur 32 sérums (dont 8 positifs et 24 négatifs) ont démontré une spécificité de 100%. 11.2. Sensibilité Des tests de corrélation contre un coffret commercial analogue de référence effectués sur 32 sérums (dont 8 positifs et 24 négatifs) ont démontré une sensibilité de 100%. 11.3. Limite de sensibilité La plus petite concentration d'anti-MPO qui pouvent être distinguées par l'étalon zéro est d'environ 0,73 AU/mL avec une limite de confiance de 98%. 11.4. Précision et reproductibilité

11.4.1. Intra-essai La variabilité à l'intérieur du même coffret a été déterminée en répliquant trois sérums différents avec des valeurs se situant dans la fourchette de travail de la courbe standard. La variabilité intra-essai est ≤ 6,1%

11.4.2. Inter-essai La variabilité entre différents coffrets a été déterminée en répliquant la détermination de deux sérums de contrôle différents avec des coffrets appartenant à des lots différents et/ou avec des combinaisons de lots de réactifs différents. La variabilité inter-essai est ≤ 12,3%. 12. DISPOSITIONS RELATIVES À L'ÉLIMINATION DES

DÉCHETS Les réactifs doivent être jetés conformément aux lois en vigueur.

BIBLIOGRAPHIE 1. Jennette, J.C. and Falk, R.J. Antineutrophil

Cytoplasmic Autoantibodies and Associated Diseases: a Review. Am. J. Kidney Dis. 1990,Vol. XV,No. 6: 517 - 529.

2. Gross, W.L. et al. Antineutrophil Cytoplasmic Autoantibody-Associated Diseases: A Rheumatologist`s Perspective. Am. J. Kidney Dis. 1991,Vol. XVIII, No. 2: 175 - 179.

3. Wieslander, J.How are Antineutrophil Cytoplasmic Autoantibodies Detected ? Am.J.Kidney Dis. 1991,Vol. XVIII, No. 2: 154 - 158.

4. Lesavre, P. Antineutrophil cytoplasmic antibodies antigen specificity. Am. J. Kidney Dis. 1991,Vol. XVIII, No. 2: 159 - 163.

5. Hagen, E.C. et al. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies: a review of the antigens involved, the assays, and the clinical and possible pathogenic consequences.Blood 1993,Vol.81: 1996 - 2000.

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Biogefährdung Riesco biológico Risque biologique Biological risk Rischio biologico Risco biológico

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Ausreichend für “n” Tests Contenido suficiente para ”n” tests Contenu suffisant pour “n” tests Contains sufficient for “n” tests Contenuto sufficiente per “n” saggi Contém o suficiente para “n” testes

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SUGGESTIONS POUR LA RÉSOLUTION DES PROBLÈMES / DÉPANNAGE ERREUR CAUSES POSSIBLES / SUGGESTIONS Aucune réaction colorimétrique de l'essai - non distribution du conjugué - contamination du conjugué et/ou du substrat - erreurs dans l'exécution du dosage (par ex., distribution accidentelle des réactifs dans le mauvais ordre ou en provenance des mauvais flacons, etc.) Réaction trop faible (DO trop basse) - conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) - temps d'incubation trop court, température d'incubation trop basse Réaction trop intense (DO trop élevée) - conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) - temps d'incubation trop long, température d'incubation trop élevée - mauvaise qualité de l'eau utilisée pour la solution de lavage (bas degré de déionisation) - lavages insuffisants (conjugué non entièrement éliminé) Valeurs inexplicablement hors plage - contamination des pipettes, embouts ou récipients - lavages insuffisants (conjugué non entièrement éliminé) CV% intra-essai élevé - les réactifs et/ou les bandes n'ont pas atteint la température ambiante avant usage - le laveur de microplaques ne lave pas correctement (suggestion : nettoyer la tête du laveur) CV% inter-essai élevé - conditions d'incubation non constantes (temps ou température) - contrôles et échantillons non distribués en même temps (avec les mêmes intervalles) (contrôler l'ordre de distribution) - variabilité intrinsèque des opérateurs