Εφαρµογές της

Βιοτεχνολογίας στην Ιατρική

Βιοτεχνολογία

Έχει συµβάλλει:α) στην έγκαιρη διάγνωση µιας

ασθένειαςβ) Την πρόληψη σοβαρών

ασθενειών (εµβόλια)γ) Στην αποτελεσµατική θεραπεία

(φαρµακευτική αγωγή, «γενετική διόρθωση», γονιδιακή θεραπεία)

Φορείς ανασυνδυασµένου DNA

• Οι φορείς είναι αρκετά µεγάλοι ώστε να µπορούν να ενσωµατώνουν προς µεταφορά γονίδια.

• Συνήθως είναι κυκλικά µόρια ώστε η πιθανότητα διάσπασής τους από τα ένζυµα του δέκτη να περιορίζεται.

• Γενικώς περιέχουν ρυθµιστικές αλληλουχίες όπως σηµεία έναρξης της αντιγραφής, υποκινητές κ.α. ώστε να µπορούν να αντιγράφονται και να εκφράζονται.

• Περιέχουν γονίδια δείκτες (π.χ. γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά) ώστε να διευκολύνεται ο εντοπισµός των κυττάρων που τους έχουν προσλάβει.

30kbpΙός (Αδενοιός, ρετροϊός,

Βακτηριοφάγος)

10 kbpΠλασµίδιο

ΜΕΓΙΣΤΟ ΜΗΚΟΣ DNA ΠΟΥ

ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΕΙΤΥΠΟΣ ΦΟΡΕΑ

Ιοί που παρασιτούν στον άνθρωπο και προκαλούν αναπνευστικά νοσήµατα

όπως το κοινό κρυολόγηµα. Είναι κατάλληλοι για τη µεταφοράγενετικού υλικού µε τη µέθοδο της γονιδιακής θεραπείας. Πριν τηχρησιµοποίησή τους ως φορείς έχουν υποστεί γενετική τροποποίηση

ώστε να καταστούν ακίνδυνοι.Το γενετικό υλικό των αδενοιών :• είναι δίκλωνο γραµµικό DNA,• δεν ενσωµατώνεται στο γονιδίωµα του κυττάρου στο οποίο

εισέρχονται, • δεν αυτοδιπλασιάζεται,• µπορεί όµως να εκφράζεται, (εκτός των γονιδίων που καθορίζουν την

παραγωγή των πρωτεϊνών του καψιδίου τους, λόγω της γενετικής

τροποποίησης που έχουν υποστεί).Συνεπώς µετά την εισαγωγή τους στο κύτταρο δέκτη δεν γίνεται

συναρµολόγηση νέων ιών και το κύτταρο που τους έχει δεχτεί δεν

λύεται, ενώ εκφράζει το ξένο γενετικό υλικό που µεταφέρουν.

Αδενοϊοί

Οι ιοί των βακτηρίων. Είναι κατάλληλοι για τη µεταφορά µεγάλωνγονιδίων σε καλλιέργειες βακτηρίων.

Βακτηριοφάγοι

ΛΕΠΤΟΜΕΡΕΙΕΣ ΤΗΣ ∆ΡΑΣΗΣ ΤΟΥΣΤΥΠΟΣ ΙΟΥ

Τεχνικές εισαγωγής του φορέα στο κύτταρο ή τον οργανισµό

δέκτη• Θερµικό σοκ (Heat shock): Τα κύτταρα δέκτες επωάζονται σε ένα

διάλυµα που περιέχει ιόντα K+, και το διάλυµα θερµαίνεται απότοµα στους 40 οC.

• Ηλεκτροδιαπόρηση (Electroporation): Tα κύτταρα δέχονται την επίδραση υψηλής τάσης µε αποτέλεσµα την παροδική διακοπή της συνέχειας της µεµβράνης τους και την εισαγωγή του φορέα στο εσωτερικό τους, µέσω των ανοιγµάτων που έχουν δηµιουργηθεί.

• (Gene gun): Mε την τεχνική αυτή κύτταρα «πυροβολούνται» µε µικροσκοπικά σωµατίδια χρυσού που έχουν επικαλυφθεί µε το προς µεταφορά DNA.

• Μικροέγχυση: Το κύτταρο δέκτης σταθεροποιείται τοποθετούµενο στο στόµιο µιας πιπέττας. Ταυτόχρονα µε µια άλλη πιπέττα που είναι ιδιαίτερα λεπτή (µικροπιπέττα) το ξένο γενετικό υλικό διοχετεύεται κατ’ ευθείαν στον πυρήνα του κυττάρου δέκτη.

• Λιποσώµατα: Το προς µεταφορά γενετικό υλικό καλύπτεται από λιπίδια οπότε σχηµατίζεται ένα µικρό µεµβρανώδες κυστίδιο, το λιπόσωµα. Το λιπόσωµα συντήκεται µε τη µεµβράνη του κυττάρου δέκτη (µερικές φορές και µε την ίδια την πυρηνική µεµβράνη) και έτσι εισάγεται το ξένο γενετικό υλικό στο εσωτερικό του κυττάρου.

Σήµερα:

Έχουν κλωνοποιηθεί περισσότερες από 300 φαρµακευτικές πρωτεΐνες, που έχουν παραχθεί µε την τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA.

Μεταξύ των πρώτων µορίων που παρασκευάστηκαν είναι η ινσουλίνη, οι ιντερφερόνες και η αυξητική ορµόνη.

αντικαρκινικός παράγονταςπαράγοντας νέκρωσης όγκων

θεραπεία καρκίνου και ασθενειών του

ανοσοποιητικού συστήµατοςιντερλευκίνες

αντιικοί και αντικαρκινικοί παράγοντεςιντερφερόνες (α, β, γ)

θεραπεία του διαβήτηινσουλίνη

θεραπεία αχονδροπλασίαςαυξητική ορµόνη

θεραπεία αιµορροφιλίας βπαράγοντας IX

θεραπεία αιµορροφιλίας απαράγοντας VIII

θεραπεία αναιµίαςερυθροποιητίνη

θεραπεία τραυµάτωνεπιδερµικός αυξητικός παράγοντας

αναλγητικοί παράγοντεςενδορφίνες και εγκεφαλίνες

θεραπεία γυναικείας στειρότηταςχοριονική γοναδοτροπίνη

θεραπεία οστεοπόρωσηςκαλσιτονίνη

θεραπεία εµφυσήµατοςα1-αντιθρυψίνη

ΧρήσηΠρωτεΐνη

Μονοκλωνικάαντισώµατα

Τα µονοκλωνικά αντισώµατα έχουν πολυάριθµες εφαρµογές και λειτουργούν ως:

1) Ανοσοδιαγνωστικά

2) Θεραπευτικά

3) Για την επιλογή οργάνων συµβατών για µεταµόσχευση

ΓΟΝΙ∆ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ

ΑΝΑΦΕΡΕΤΑΙ ΣΕ ΕΝΑ ΣΥΝΟΛΟ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΣΑΝ ΣΚΟΠΟ ΤΗΝ

ΕΠΙ∆ΙΟΡΘΩΣΗ ΕΛΛΑΤΩΜΑΤΙΚΩΝ ΓΟΝΙ∆ΙΩΝ ΠΟΥ ΕΙΝΑΙ ΥΠΕΥΘΥΝΑ ΓΙΑ ΤΗΝ

ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ∆ΙΑΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

• ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΕΛΛΑΤΩΜΑΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙ∆ΙΟΥ ΜΕ ΕΝΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΓΟΝΙ∆ΙΟ

• ΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΓΟΝΙ∆ΙΟ ΜΕΤΑΦΕΡΕΤΑΙ ΑΠΟ ΕΝΑΝ ΦΟΡΕΑ ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΟΧΟΥΣ ΤΟΥ ΑΣΘΕΝΗ

• ΠΙΟ ΣΥΝΗΘΙΜΕΝΟΣ ΦΟΡΕΑΣ:

ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΜΕΝΟΣ ΙΟΣ

ΙΟΙ - ΦΟΡΕΙΣ• ΡΕΤΡΟΙΟΙ ΤΥΠΟΥ A : ∆ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ∆ΙΚΛΩΝΟΥ DNA ΜΕ

ΒΑΣΗ ΤΟ RNA-ΓΟΝΙ∆ΙΩΜΑ ΤΟΥΣ: ΤΑ ΑΝΤΙΓΡΑΦΑ ΑΥΤΑ ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ ΕΝΣΩΜΑΤΩΘΟΥΝ ΣΤΑ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΑ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΞΕΝΙΣΤΗ

• A∆ΕΝΟΙΟΙ ΤΥΠΟΥ A ΜΕ ΓΟΝΙ∆ΙΩΜΑ ∆ΙΚΛΩΝΟΥ DNA: ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΕΣ ΚΑΙ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΙΚΕΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ

• Α∆ΕΝΟΕΞΑΡΤΩΜΕΝΟΙ ΙΟΙ ΤΥΠΟΥ Α ΜΕ ΜΟΝΟΚΛΩΝΟ DNA: ΕΙΣΑΓΕΙ ΤΟ ΓΟΝΙ∆ΙΩΜΑ ΤΟΥ ΣΕ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΗ ΘΕΣΗ ΣΤΟ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ 19

• ΙΟΣ ΤΟΥ ΕΡΠΗ ΜΕ ΓΟΝΙ∆ΙΩΜΑ ∆ΙΚΛΩΝΟΥ DNA: Ο ΟΠΟΙΟΣ ΠΡΟΣΒΑΛΛΕΙ ΤΑ ΝΕΥΡΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

ΜΗ ΙΟΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΦΟΡΕΩΝ• ΑΜΕΣΗ ΠΑΡΟΧΗ ΤΟΥ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΥ DNA

ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΟΧΟΥΣ -ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΟΥΣ ΤΥΠΟΥΣ ΙΣΤΩΝ-ΜΕΓΑΛΗ ΠΟΣΟΣΤΗΤΑ DNA (ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΝ∆ΕΣΗ).

• ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΜΕ Υ∆ΑΤΙΝΟ ΠΥΡΗΝΑ ΠΟΥ ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ ΠΕΡΑΣΟΥΝ ΤΟ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΟ ΜΕΣΑ ΑΠΟ ΤΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΟΧΩΝ.

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΓΟΝΙ∆ΙΑΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

• ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΟΥ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΓΟΝΙ∆ΙΟΥ ΣΕ ΤΥΧΑΙΑ ΘΕΣΗ ΣΤΟ ΓΟΝΙ∆ΙΩΜΑ

• ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΕΛΑΤΤΩΜΑΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙ∆ΙΟΥ ΜΕ ΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΜΕ ΟΜΟΛΟΓΟ ΑΝΑΣΥΝ∆ΥΑΣΜΟ

• ΕΠΙ∆ΙΟΡΘΩΣΗ ΤΟΥ ΕΛΑΤΤΩΜΑΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙ∆ΙΟΥ ΜΕ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΠΟΥ ΕΧΕΙ ΣΑΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΝ ΕΠΑΝΑΦΟΡΑ ΤΗΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙ∆ΙΟΥ

• ΑΛΛΑΓΗ ΤΟΥ ΤΡΟΠΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙ∆ΙΟΥ

Γονιδιακή θεραπεία

• Περισσότερες από 4000 ασθένειες οφείλονται σε γονιδιακές µεταλλάξεις. Όλες σχεδόν προκαλούν δυσµορφίες, το 80% όλων διανοητική καθυστέρηση και το 1/5 από αυτές θάνατο σε παιδική ηλικία.

• 1990: θεραπεία της ασθένειας που οφείλεται στην έλλειψη της απαµινάσης της αδενοσίνης (ex-vivo).

• 1993: Θεραπεία της κυστικής ίνωσης(in vivo)

Απαµινάση της αδενοσίνης (ADA)

Θεραπεία κυστικής ίνωσης 1993.Σύστηµα που εφαρµόστηκε από τον Anderson και συν µε την ανάπτυξη «έξυπνων» φορέων.

ΓΟΝΙ∆ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑΠΟΥ ΒΡΙΣΚΟΜΑΣΤΕ

ΣΗΜΕΡΑ;

• ∆ΕΝ ΥΠΑΡΧΕΙ ΕΠΙΣΗΜΗ ΕΓΚΡΙΣΗ ΠΩΛΗΣΗΣ ΠΡΟΙΟΝΤΟΣ ΓΙΑ ΓΟΝΙ∆ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ.

• ΟΛΕΣ ΟΙ ΠΡΟΣΠΑΘΕΙΕΣ ΠΑΡΑΜΕΝΟΥΝ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΕΠΙΠΕ∆Ο ΚΑΙ Η ΕΠΙΤΥΧΙΑ ΤΩΝ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ ΕΙΝΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΗ

ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΥΡΕΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ∆ΙΑΚΗΣ

ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

• ΜΙΚΡΟΣ ΧΡΟΝΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΑ ΟΠΟΙΑ ΕΧΕΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΘΕΙ ΤΟ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΟ ΜΟΡΙΟ DNA

• ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΙΩΝ ΩΣ ΦΟΡΕΙΣ ΤΟΥ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΟΥ DNA

ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΟΥ ΑΣΘΕΝΗ• 1999, ΚΛΙΝΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ: 18-ΕΤΗΣ ΠΕΘΑΝΕ ΑΠΟ ΠΟΛΥΟΡΓΑΝΙΚΗ

ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ 4 ΗΜΕΡΕΣ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΓΙΑ ΕΛΛΕΙΨΗ OTCD (ORNITHINE TRANSCARBAMYLASE)

• 2002 & 2003, ΓΑΛΛΙΑ: ΠΑΙ∆ΙΑ ΠΟΥ ΣΥΜΜΕΤΕΙΧΑΝ ΣΕ ΚΛΙΝΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΑΝΕΠΤΥΞΑΝ ΛΕΥΚΑΙΜΙΑGene therapy for treating children with X-SCID (sever combined immunodeficiency) or the "bubble boy" disease is stopped in France when the treatment causes leukemia in one of the patients. See 'Miracle' gene therapy trial halted at NewScientist.com (October 3, 2002).

• ∆ΥΣΚΟΛΙΑ ΣΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ∆ΙΑΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΣΤΑ ΠΟΛΥΠΑΡΑΓΟΝΤΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ (ΚΑΡ∆ΙΑΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ, ΑΡΘΡΙΤΙΣ, ∆ΙΑΒΗΤΗΣ, ΝΟΣΟΣ ALZHEIMER)

ΠΡΟΣΦΑΤΑ ΕΠΙΤΕΥΓΜΑΤΑ ΣΤΟΝ

ΤΟΜΕΑ ΤΗΣ ΓΟΝΙ∆ΙΑΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΓΟΝΙ∆ΙΩΝ ΣΤΑ ΝΕΥΡΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΕΠΕΝ∆ΥΜΕΝΩΝ ΜΕ PEG ΠΟΥ ∆ΙΑΠΕΡΝΟΥΝ ΤΟΝ ΑΙΜΟΤΟΕΓΚΕΦΑΛΙΚΟ ΦΡΑΓΜΟ

• ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ ΒΗΜΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ PARKINSON NewScientist.com (March 20, 2003).

ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ Ι∆ΙΟΤΗΤΑΣ ΜΙΚΡΩΝ ∆ΙΚΛΩΝΩΝ ΤΜΗΜAΤΩΝ RNA (short interfering RNAs:siRNAs) NA ΕΜΠΟ∆ΙΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΕΛΑΤΤΩΜΑΤΙΚΩΝ ΓΟΝΙ∆ΙΩΝ

• ΝΟΣΟΣ Huntington's at NewScientist.com(March 13, 2003).

ΠΡΟΣΠΑΘΕΙΑ ∆ΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΕΝΟΣ ΤΕΧΝΗΤΟΥ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΟΣ 47ου (artificial human)ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΟΧΟΥΣ.

Human Genome Project

• ∆ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΛΕΠΤΟΜΕΡΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΧΑΡΤΩΝ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΓΟΝΙ∆ΙΩΜΑΤΟΣ ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΓΟΝΙ∆ΙΩΜΑΤΟΣ ΑΛΛΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ

• ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΗΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΓΟΝΙ∆ΙΩΜΑΤΟΣ

To πρόγραµµα του ανθρώπινου γονιδιώµατος

• Προσδιορισµός γονιδίων που σχετίζονται µε ασθένειες

• Σύγκριση γονιδιωµάτων διαφορετικών οργανισµών

• Σύγκριση γονιδιωµάτων διαφορετικών οµάδων πληθυσµών

• Οργάνωση του γονιδιώµατος, ποσοστό δοµικών και ρυθµιστικών γονιδίων, ποσοστό επαναλαµβανόµενων αλληλουχιών

• Προσδιορισµός λειτουργίας γονιδίων• Παραγωγή προϊόντων