«ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ»

«ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ»

ΕΙΔΙΚΑ ΚΕΦΑΛΑΙΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣΕΙΔΙΚΑ ΚΕΦΑΛΑΙΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Διάλεξη:

Παρουσίαση: Δρ. Μ.Χ. Αντωνέλου, 07/05/08

ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

http://kyttariki.biol.uoa.gr, http://multimedia.biol.uoa.gr

Ιστοσελίδες μαθημάτων

http://kyttariki.biol.uoa.gr/

http://multimedia.biol.uoa.gr/

ΣΚΕΛΕΤΟΣ

βιμεντίνηδεσμίνη

Εκχύλιση κυττάρου με Triton X-100

3D structure


ΣΚΕΛΕΤΟΣ

2D-structure

Sp’s

4.1

actin

ίχνη Hb

σκελετοί

Κοντά πρωτονημάτια ακτίνης (33-37 nm)


ΣΚΕΛΕΤΟΣIδιαίτερα ανεπτυγμένος (65%) εξασφαλίζει μηχανικές ιδιότητες


ΣΚΕΛΕΤΟΣ

Αυτό το μοντέλο βρίσκει εφαρμογή και σε άλλους ιστούς/κύτταρα/ οργανίδια με διαφορετική όμως οργάνωση και λειτουργία

ΣΗΜΕΙΑ ΣΥΝΔΕΣΗΣ:

1) Sp-ank (band 3) (***)

2) Sp-4.1R-actin-p55-GpC

3) Rh, RhAG-ank

4) Sp, 4.1R PS


(Liu et al., 1987; J.Cell Biol., 104:527-536)

ΣΚΕΛΕΤΟΣ


Πυκνό και νηματώδες δίκτυο, αλλά με έκταση και αρνητική χρώση…

(Palek & Sahr,1992)

ΣΚΕΛΕΤΟΣ

ΣΚΕΛΕΤΟΣ

ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΖΕΥΞΗΣ:ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΖΕΥΞΗΣ:

Τα κομβικά σημεία διασταύρωσης

των SpT μεταξύ τους και με τα

πρωτονημάτια ακτίνης

Οριζόντιες διαπρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις σε επίπεδο SK

240-360 ΣΖ/μm2


ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ

•Eκτεταμένο, γραμμικό, εύκαμπτο, αρθρωτό, πολυλειτουργικό μόριο

•α, β υπομονάδες, ΑΥΤΟΣΥΓΚΡΟΤΟΥΜΕΝΕΣ σε διμερή, τετραμερή

•Πλευρική και αντιπαράλληλη σύνδεση (αβ)

•Head-to-head of 2 (αβ) tetramer α2β2

•3-6 nm, 200-260 nm


ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ

• Αρχαίες πρωτεΐνες, αλλά στην εξελιγμένη τους μορφή υπάρχουν μόνο στα μετάζωα

• 2 γονίδια α (chr1), 4 β-, 1 γονίδιο β-Η (chr14) (human)

• Συνδυασμοί ετεροτετραμερή λειτουργίες• Σκελετικός μυς, Golgi homo-Τ-β• Eπιθήλια, νευρικό σύστημα• αρχετυπικό μέλος υπεροικογένειας Sp και δικτύων

Sp σε άλλα κύτταρα, υποκυτταρικά οργανίδια και ιστούς


• Μοριακό ελατήριο

• Διμερή: 29-37 nm in situ, 100 nm σε έκταση

• Τετραμερή: 200-260 nm

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ


ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ

22 domains

**

Επαναλήψεις δομής τριπλής έλικας

19 domains

•Οι τριπλές έλικες σταθεροποιούνται από αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε υδρόφοβα κατάλοιπα που βρίσκονται σε συγκεκριμένες αποστάσεις μεταξύ τους ακολουθώντας ένα επαναλαμβανόμενο πρότυπο

•Ελατήρια προασαρμοζόμενου μήκους

•Δομική ομολογία, αλλά εν μέρει διαφορετικά λειτουργικά μόρια (αποικ)ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ

Υπο-domains κάθε υπομονάδας ανθεκτικά στη θρυψίνη (HE)

1D-SDS-PAGE

2D-electrophoresis


ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ

Oι σπεκτρίνες είναι μόρια αυτοσυγκροτούμενααυτοσυγκροτούμενα, υψηλή συγγένεια αλληλεπ.

Η αυτοσυγκρότηση in vitro είναι ανάλογη ΤoC και [Sp]

In vivo (37oC) ευνοούνται τα ΤSp λόγω πολύ υψηλής [Sp]

Tα TSp είναι η φυσιολογική μορφή συγκρότησης της Sp στο Sk (HE)

ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ

Πυρήνωση ετεροδιμερούς

β1-β4

α19-α22

Αρχικά αναπτύσσονται ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσειςηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε α και β-υπομονάδες στη θέση πυρήνωσης οι οποίες εξασφαλίζουν το ζευγάρωμα στη σωστή φάση των τριπλετών κατά μήκος του διμερούς. Μετά την αρχική διασύνδεση, το διμερές σταθεροποιείται από υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις έλικες (ασθενείς, αλλά πολλές), και περιελίσσεται η μία υπομονάδα γύρω από την άλλη σα σχοινί.


ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ

Αυτοσυγκρότηση ετεροτετραμερούς

α1α2

β17

υβριδική τριπλέτα

Mη-ομοιοπολική διασύνδεση, ενδογενής ιδιότητα (Hb)


ΣΠΕΚΤΡΙΝΗΑυτοσυγκρότηση ετεροτετραμερούς

•pH•Ιοντική ισχύ•Θερμοκρασία•Συγκέντρωση Sp

Υψηλής-συγγένειας Υψηλής-συγγένειας Sp-AnkSp-Ank τοπικές [Sp] υπομεμβρανικά που ευνοούν τον ολιγομερισμό

Αντίθετα, η διασύνδεση διασύνδεση Sp-actin Sp-actin είναι χαμηλής συγγένειαςείναι χαμηλής συγγένειας (μη-αυτοσυγκροτούμενη) και χρειάζεται την 4.1R

Συνδέσεις Sp: διαμεμβρανικές πρωτεΐνες απευθείας

διαμέσου ank

με φωσφολιπίδια


ΑΚΤΙΝΗ

•Μόνο β-ισομορφήβ-ισομορφή (βγ)•Κοντά πρωτονημάτια 33-37 Κοντά πρωτονημάτια 33-37 nmnm (δευτεροταγής δομή, αλληλεπιδράσεις)•Μονομερής ακτίνη (G) ΔΕΝ συμμετέχει στο Sk•Aπαντάται στα σύμπλοκα ζεύξης μαζί με 4.14.1RR και SpSp•Mετά την πρόσδεση ενός μορίου 4.1R προκαλούνται δομικές αλλαγές στο πρωτονημάτιο που ευνοούν την πρόσδεση extra 4.1R, Sp


4.1R

Βοηθητική Sp-actin, GpC-p55

Σύμπλοκα ζεύξης

200.000 αντίγραφα/RBC

Aρχετυπικό μέλος 4.1 family

Eγκέφαλος, ήπαρ, έντερο, πάγκρεας, μετασυναπτικές μεμβράνες, πυρήνας, κυτταρικοί σύνδεσμοι

Σχηματίζει πολυμοριακά σύμπλοκα με διαμεμβρανικές & άλλες πρωτεΐνες με ρόλο στη δομική σταθερότητα και μεταγωγή σήματος(Han et al., Nat.Struct.Biol., 7:871, 2000)

ΑΝΚ*


4.1R

•Οι αλληλεπιδράσεις της 4.1R ρυθμίζονται με φωσφορυλίωση και από το σύστημα calmodulin/Ca++ (αναστολή σύνδεσης σε μεμβράνη & Sp/actin).•H πρόσδεση Ca++ στην calmodulin αυξάνει (20x) την πρόσδεση της calmodulin στην εξαρτώμενη από ασβέστιο θέση πρόσδεσης calmodulin της 4.1. Αυτό προκαλεί αλλαγή στη διαμόρφωση της 4.1 που επιφέρει εξασθένιση των αλληλεπιδράσεών της με τις p55, GpC, B3

4.1R

Aρθρωτή πρωτεΐνη-3 domains: Ι. Πρόσδεσης σε μεμβράνη (PS, B3, p55, calmodulin) ΙΙ. Πρόσδεσης σε Sp/actin (σπονδυλόζωα, ΗΕ) III. COOH domain (απόλυτα συντηρημένο στα μετάζωα)

General

Brain

Neuron

ΘηλαστικάΘηλαστικά(εκτεταμέναγεγονόταεναλλακτικούματίσματοςκαι θέσεωνέναρξηςΜΦΡ mRNA)

RBC


4.1R

Ghosts (Laemmli-linear 5-15%)

•Ο καλύτερος δείκτης της ηλικίας του Ο καλύτερος δείκτης της ηλικίας του RBCRBC

•SDS-PAGE: 4.1α/β, 80 & 78 kDa

•Μετα-ΜΦΡ τροποποίηση της Asn502 που συμβαίνεισταδιακά και αργά και προκαλεί β α.

4.1β/α: περιφερική αιμόλυση, αυξημένα ΔΕΚ

•Πρόκειται για κοινό μηχανισμό σε πολλά είδη θηλαστικών αλλά η τιμή του λόγου διαφέρει απόείδος σε είδος.

4.1(-) ΗΕ


ΑΔΟΥΣΙΝΗ

•Βοηθητική πρωτεΐνη του συμπλόκου Sp-actin (τριαδικό σύμπλοκο)

•Υπάρχει μόνο στα μετάζωα

•Άνθρωπο: 3 υπομονάδες/γονίδια (α, β, γ)

•RBC: ετεροδιμερή αβ, 15.000 μόρια/RBC (διμερή και τετραμερή)

Αλληλεπιδρά με άλλες υπομονάδες αδουσίνης Προάγει σχηματισμό ολιγομερών

Sp/actinPhosphor.calmodulin

ΑΔΟΥΣΙΝΗ

Πρωτεΐνη κάλυψης των νηματίων ακτίνης (παρεμποδίζει μεταβολή μήκους τους και προάγει πρόσδεση Sp).

Συνδέεται απευθείας σε ακτίνη αλλά με μεγαλύτερη συγγένεια σε Sp/actin



p55•Μέλος οικογένειας MAGUKs (Membrane-associated Guanylate kinase homologues)

•Οργάνωση Sk στοιχείων, κυτταρική σήμανση, cell proliferation, καταστολή όγκων

•RBC: SDS-PAGE band 4.9

•4.1-GpC (δένει και στις δύο, αλλά δεν επιδρά στη συγγένεια αλληλεπίδρασης)

•(-)4.1R, (-)GpC ολοκληρωτική απώλεια p55

ΔΕΜΑΤΙΝΗ

• Zώνη 4.9

• Τριμερή (48, 52 kDa), 43.000/RBC

• Σφαιρική δομή

• Πακετάρισμα ακτίνης σε δέσμες

• Σύμπλοκο ζεύξης

• Με φωσφορυλίωση αναστέλλεται η λειτουργικότητά της


ΤΡΟΠΟΜΥΟΣΙΝΗ (ΤΜ)

•Actin-binding protein

•2 μονομερή που αυτοσυγκροτούνται κεφαλή με ουρά κατά μήκος των αυλάκων της διπλής έλικας ακτίνης

•Καθορίζουν μήκος 33-37nm

Έμμεσα ρυθμίζουν SpT

•4 γονίδια (α, β, γ και δ)

•RBC: 29/27 kDa, 70-80.000 copies/RBC

•Σύμπλοκα ζεύξης: ΤΜ5 (γ) και TM5b (α) σε ομο- ή ετεροδιμερή

•1) Αλληλεπιδρούν με 6 μόρια ακτίνης, 2) συγγένεια για ΤD/actinΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΤΡΟΠΟΜΟΝΤΟΥΛΙΝΗ (TD)

•Πρωτεΐνη κάλυψης ΤΜ

•Σφαιρική

•40.6 kda (πρώτα σε RBC)

•Iσομοριακή με ΤΜ.

•Αναστέλλει:

1)Συνεργατικότητα ΤΜ

2) Επιμήκυνση / αποπολυμερισμό ακτίνης


ΜΟΝΤΕΛΟ ΜΟΝΤΕΛΟ SUNG et al., 2000SUNG et al., 2000

Στην πτυχωτή επιφάνεια της ΤΜ5 δημιουργείται μία θέση πρόσδεσης ΤD

Η ΤΜ5 έχει 6 θέσεις πρόσδεσης ακτίνης

Το σύμπλοκο ΤΜ5/TD καθορίζει ως χάρακας το μήκος ακτίνης 33-37 nm

Tα πρωτονημάτια ακτίνης ευνοούν τηνπρόσδεση 6 SpT

Γεωμετρία εξαγωνικών πλεγμάτων Sk


ΑΓΚΥΡΙΝΗΠρωτεΐνη-συνδέτης (215 kDa), φωσφορυλίωση

Αρθρωτή (4 domains)

Sp (T)10x

Domain πρόσδεσης σε μεμβράνη(24 αντίγραφα αλληλουχίας 33ααΕπαναλήψεις ΑΝΚ)

Nεκρικό domain

COOH-domain ρύθμισης (εναλλακτ.μάτισμα)2.2* ank (186 kDa), ανθρώπινη αγκυρίνη


ΑΓΚΥΡΙΝΗ

(-) ank band 3 dimers

• Mία σειρά αντιπαράλληλων αναδιπλωμένων α-ελίκων συνδεόμενων με θηλιές σε διάταξη κάθετη ως προς τις έλικες

• Μεταγραφικοί παράγοντες, σκελετικές πρωτεΐνες, τοξίνες• Μηχανισμοί αναγνώρισης και πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις


ΑΓΚΥΡΙΝΗ

(Restricted, Broadly, Giant)•Μεταγωγή σήματος,•Ενδοκυττάρωση,•Πολωμένη κατανομή πρωτεϊνών στη μεμβρ.

Μακροφάγα

(2.400αα)

Πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα


ΠΑΛΛΙΔΙΝΗ (4.2)

72 kDa, 200.000 copies/RBC

Περιφερική με υδρόφοβες ιδιότητεςμε υδρόφοβες ιδιότητες

Φωσφορυλιωμένη

Ν-myristylated (myristic acid)

Παλμιτιλιωμένη (palmitic acid) (b3,p55)Το πρόσθετο υδρόφοβο τμήμαυδρόφοβο τμήμα αλληλεπιδράσεις με μεμβράνη

(-) ΙΙΙ exon επιθηλιακά κύτταραΕγκέφαλος, Νεφροί, Λεμφοκύτταρα, PLT

Tετραμερή-Hereditary spherocytosis-like (hemolytic anemia, εύθρ.RBC)

Band 3 (* ενίσχυση σύνδεσης Β3-Sk, εκχύλιση), ank, 4.1R(?), ΑΤΡΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου

ΣΚΕΛΕΤΟΣ

Oργάνωση αντιστρεπτά μεταβλητή –Πυκνός-Ελαστικός-Εκτατός

ΣΖ 2.8x

8x

Σύμφωνα με ένα μοντέλο, η διαφορετικού βαθμού συμπίεση συγκεκριμένων μορίων Sp προκαλεί αλλαγές στο γεωμετρικό σχήμα του γεωμετρικό σχήμα του SkSk και αντιστρ.παραμόρφωση της μεμβράνης αλλά όχι αλλαγή στη συνολική συνολική επιφανειακή έκταση επιφανειακή έκταση (ΣΖ, θραύση)

ΣΚΕΛΕΤΟΣ

Αλληλεπιδράσεων deformability (HE)

Αλληλεπιδράσεων σε ΣΖ membrane stability (HS)

AYTOAYTOΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΑΙ ΣΚΕΛΕΤΟΥΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΑΙ ΣΚΕΛΕΤΟΥ:1. Βοηθητικές πρωτεΐνες2. Ca++/calmodulin/calpain3. Phosphorylation4. Μετα-ΜΦΡ τροποποιήσεις: ΔΟΜΙΚΕΣ Ή ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΕΣ

Μη-αντιστρεπτές

μυριστιλίωση 4.2

οξείδωση

μη-ενζυματική γλυκοζυλίωση

πρωτεόλυση

Αντιστρεπτές

φωσφορυλίωση

ακυλίωση λιπαρών οξέων


ΣΚΕΛΕΤΟΣΟ Σκελετός ως μηχανισμός διαλογής πρωτεϊνών στο ερυθροκύτταρο

Η εξωκυστιδιοποίησηεξωκυστιδιοποίηση ρυθμίζεται από αλληλεπιδράσεις του Sk με τη μεμβράνη

Σκελετοί Sp-ANK εκτός της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης

1. Δομική υποστήριξη κυτταρικής μεμβράνης

2. Ρύθμιση κατανομής/λειτουργίας διαμεμβρανικών πρωτεϊνών και μεμβρ. ενζύμων σε πολωμένα κύτταρα

3. Διαλογή πρωτεϊνών

4. Αρχιτεκτονική πυρήνα κατά τη μίτωση

5. Ρύθμιση μονοπατιών μεταγωγής σήματος

ΣΚΕΛΕΤΟΙ Sp-Ank

RBC

•Πυκνοί

•Εκτεταμένοι

•Ομοιογενείς

•Κοντά πρωτονημάτια ακτίνης

ΕΚΤΟΣ RBC

•Σποραδικοί

•Μακρύτερα νημάτια ακτίνης

•Μικροσωληνίσκοι

•(δυνείνη, δυνακτίνη)

•υποδοχείς/ microdomains/πρωτεΐνες μη-RBC

Επιθήλια, Νευρικό, Golgi


GOLGI

Διατήρηση δομής, δυναμικής φύσης,διαμερισματοποίησης

Διαλογέας πρωτεϊνών ανάλογος τηςκλαθρίνης στα καλυμμένα βοθρία

1. Προσδένει ποικιλία πρωτεϊνών2. Επιλεκτική συγγένεια3. 2D-ολιγομερείς δομές4. Κατάσταση δυναμικής συγκρότησης

Ρυθμίζει συγκράτηση πρωτεϊνών στις μεμβράνες Golgi εμποδίζοντας την είσοδό τους σε εκκριτικά κυστίδια μεταφοράς


ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ

• Στα τελικά στάδια της ωρίμανσης ερυθροβλαστών σε ΔΕΚ, RBC σημειώνονται ριζικές αλλαγές (nucl., TfR, microtub, membr, Sk, S/V)

• Διαφοροποίηση δομικών συστατικών ερυθροβλάστεςRBC• Οι Sk πρωτεΐνες συντίθενται/συγκροτούνται σε Sk σε

διαφορετικές φάσεις κατά την ερυθροποίηση και σε ποικίλοντα ποσά

• Με την ωρίμανση αλλάζουν οι μηχανικές ιδιότητες κυττάρων (στα ΔΕΚ η διασύνδεση Sk μεμβράνης είναι ακόμα ασθενής) (?)

• Ο Sk αυτοσυγκροτείται (Μετα-ΜΦΡ) αλλά ή αυτοσυγκρότηση πρέπει να γίνεται υπομεμβρανικάυπομεμβρανικά.

1. επιλεκτική/ταχεία αποικοδόμηση β-σπεκτρίνης2. μεμβρανικοί υποδοχείς (akn)

3. «βοηθητικές πρωτεΐνες» (4.1R, TM5-TD)


• Η βιογένεση είναι μία σπάταλη διαδικασία (2-3x αSp/β)• Η σύναψη συμπλόκων σταθεροποιεί τα μόρια και τα προστατεύει

από τον καταβολισμό. • Sp, ank ασταθές/παροδικό προ-συγκροτούμενο κυτταροσκελετικό

δίκτυο (ανακύκλωση, 10% παροδική συγκρότηση)• Band 3, 4.1 ευσταθές membrane-associated system σύνθεση Sp, actin, ank, ανακύκλωση, συγκρότηση σε Sk σύνθεση Band 3, 4.1 (isoforms)

ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ

Ανθρώπινοι προερυθροβλάστες in situ σύγχρονη σύνθεση b3/Sp/ank.

(-/-)ΑΕ1 mouse φυσιολογική συγκρότηση Sk κατά τη διαφοροποίηση


ΤΕΛΟΣ Α’ ΜΕΡΟΥΣ


«ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ»

Documents

Transcript of «ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ»