1

Δοµή και λειτουργία της ανθρώπινης αιµοσφαιρίνης

Μαΐλης Θεόφιλος

Η παρούσα εργασία ασχολείται µε τη δοµή και τη λειτουργία της ανθρώπινης αιµοσφαιρίνης. Αρχικά αναφέρεται ο κύριος ρόλος της αιµοσφαιρίνης η οποία είναι µια πρωτεΐνη µεταφορέας οξυγόνου, και είναι ο κύριος µεταφορέας στο αίµα. Όπως εξηγείται, το οξυγόνο δεσµεύεται στη σιδηρο-µορφή (+2) της αίµης, η οποία είναι µια πορφυρίνη µε κεντρικό άτοµο σιδήρου και βρίσκεται στενά συνδεδεµένη στην αιµοσφαιρίνη. Ακολουθεί η ανάλυση της δοµής της αιµοσφαιρίνης, που αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, κάθε µια µε µία οµάδα αίµης. Η τεταρτοταγής της δοµή Τ διατηρείται από δεσµούς άλατος µεταξύ διαφορετικών υποµονάδων επιτρέποντας χαµηλή συγγένεια για το Ο2, ενώ οι δεσµοί άλατος αυτοί λείπουν από τη µορφή R, που έχει υψηλή συγγένεια για το Ο2. Ιδιαίτερη σηµασία δίνεται στο γεγονός ότι η αιµοσφαιρίνη είναι µια αλλοστερική πρωτεΐνη, οι ιδιότητες της οποίας δηµιουργούνται από αλληλεπιδράσεις µεταξύ των υποµονάδων α και β. Εκτός από O2 µεταφέρει και Η+ και CO2, η δέσµευση των οποίων ρυθµίζεται από αλλοστερικές αλληλεπιδράσεις, δηλαδή αλληλεπιδράσεις µεταξύ διαφορετικών θέσεων στην ίδια πρωτεΐνη. Καταγράφονται επίσης ορισµένα αλλοστερικά φαινόµενα, όπως η συνεργειακή δέσµευση του οξυγόνου από την αιµοσφαιρίνη, στην οποία η δέσµευση του οξυγόνου από τη µια αίµη διευκολύνει τη δέσµευση οξυγόνου στις άλλες οµάδες αίµης του ίδιου µορίου, αλλά και η διευκόλυνση της αποµάκρυνσης του Ο2 από την αιµοσφαιρίνη που προκαλείται από τα Η+ και CO2, καθώς και η απελευθέρωση των Η

+ και CO2 µέσω του Ο2. Αυτές οι αλλοστερικές συνδέσεις µεταξύ των δεσµεύσεων Η+, CO2 και Ο2 αναφέρονται ως φαινόµενο Bohr. Επιπλέον, η συγγένεια της αιµοσφαιρίνης για το Ο2 φαίνεται ότι µειώνεται από το 2,3-διφωσφογλυκερικό. Ορισµένες φυσιολογικές παραλλαγές της αιµοσφαιρίνης για τις οποίες γίνεται λόγος είναι η HbA, κύρια αιµοσφαιρίνη στους ενήλικες που έχει δοµή υποµονάδων α2β2, η HbF που είναι η εµβρυϊκή αιµοσφαιρίνη, µε δοµή α2γ2 καθώς και η HbA2 που εµφανίζεται σε µικρότερο ποσοστό στους ενήλικες, µε δοµή α2δ2. Τέλος παραθέτονται ορισµένες αιµοσφαιρινοπάθειες, που είναι ανωµαλίες που προκαλούνται είτε από την παραγωγή ενός δοµικά ανώµαλου µορίου αιµοσφαιρίνης ή από τη σύνθεση ανεπαρκών ποσοτήτων φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης ή σπανιότερα και από τα δύο, όπως η δρεπανοκυτταρική αναιµία, µια µοριακή ασθένεια που προκαλείται όταν ένα άτοµο είναι οµοζυγώτης για το γονίδιο της δρεπανοκυττάρωσης και η ανώµαλη αιµοσφαιρίνη, S, χαρακτηρίζεται από αντικατάσταση του γλουταµινικού από βαλίνη στη θέση 6 της β-αλυσίδας.

Λέξεις Κλειδιά: αιµοσφαιρίνη, οµάδα αίµης, Τ µορφή, R µορφή, συνεργειακή δέσµευση οξυγόνου, φαινόµενο Bohr, 2,3-διφωσφογλυκερικό, αλλοστερικά φαινόµενα, αιµοσφαιρινοπάθειες, δρεπανοκυτταρική αναιµία.

Περιεχόµενα: 1. Εισαγωγή σελ.2 2-8. Στα αλλοστερικά φαινόµενα απαιτούνται

αλληλεπιδράσεις µεταξύ των υποµονάδων σελ.8 1-1. Δοµή και λειτουργία πρωτεϊνών σελ.2 2-9. Επικοινωνία µέσα σε ένα πρωτεϊνικό µόριο σελ.8 1-2. Το αίµα σελ.2 2-10. Η τεταρτοταγής δοµή της αιµοσφαιρίνης

αλλάζει σηµαντικά µε την οξυγόνωση σελ.8 2. Θεωρητικό υπόβαθρο σελ.3 2-11. Η δεοξυαιµοσφαιρίνη συγκρατείται από

δεσµούς άλατος µεταξύ διαφορετικών αλυσίδων σελ.9

2-1. Το οξυγόνο δεσµεύεται σε µια προσθετική οµάδα αίµης σελ.3

2-12. Η οξυγόνωση µετακινεί το άτοµο του σιδήρου προς το επίπεδο της πορφυρίνης σελ.9

2-2. Η αιµοσφαιρίνη αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες σελ.3

2-13. Ο µηχανισµός της συνεργειακής δέσµευσης οξυγόνου σελ. 9

2-3. Ανάλυση της αιµοσφαιρίνης µε ακτίνες Χ Σελ.4

2-14. Φυσιολογικές παραλλαγές αιµοσφαιρίνης σελ.10

2-4. Τα πιο σπουδαία κατάλοιπα αµινοξέων στην αλληλουχία σελ.4

2-15. Αιµοσφαιρινοπάθειες σελ.10

2-5. Η αιµοσφαιρίνη είναι µια αλλοστερική πρωτεΐνη σελ.4

2-16. Μοριακή παθολογία της αιµοσφαιρίνης σελ.14

2-6. Το οξυγόνο δεσµεύεται συνεργειακά στην αιµοσφαιρίνη σελ.5

3. Συµπεράσµατα σελ.15

2-7. Ουσίες που επηρεάζουν την πρόσδεση Ο2 σελ.6

4. Βιβλιογραφία σελ.15

2

1. Εισαγωγή: Η µετάβαση των ζωντανών οργανισµών από την αναερόβια στην αερόβια ζωή ήταν ένα σηµαντικό βήµα στη διαδικασία της εξέλιξης, γιατί αποκάλυψε µια πλούσια πηγή ενέργειας. Η ενέργεια που προκύπτει από τον µεταβολισµό της γλυκόζης παρουσία οξυγόνου είναι δεκαοχτώ φορές περισσότερη από αυτή που παράγεται απουσία οξυγόνου. Τα θηλαστικά ανέπτυξαν δύο κύριους µηχανισµούς για να παρέχουν στα κύτταρα τους διαρκώς αρκετό οξυγόνο. Ο πρώτος είναι το κυκλοφοριακό σύστηµα που παρέχει οξυγόνο στα κύτταρα. Ο δεύτερος είναι η χρήση µοριακών φορέων οξυγόνου για να ξεπεραστεί το πρόβληµα της µικρής διαλυτότητας του οξυγόνου στο νερό. Οι φορείς οξυγόνου στα θηλαστικά είναι η αιµοσφαιρίνη και η µυοσφαιρίνη. Η αιµοσφαιρίνη, που βρίσκεται στα ερυθροκύτταρα, λειτουργεί ως φορέας οξυγόνου στο αίµα και παίζει επίσης σηµαντικό ρόλο στη µεταφορά διοξειδίου του άνθρακα και των ιόντων υδρογόνου. Η µυοσφαιρίνη που βρίσκεται στους µυς, λειτουργεί ως δεξαµενή παροχής οξυγόνου και διευκολύνει την µετακίνηση οξυγόνου µέσα στους µυς.

1-1. Δοµή και λειτουργία πρωτεϊνών:

Όταν εξετάζουµε ένα κύτταρο µε το µικροσκόπιο ή όταν αναλύουµε την ηλεκτρική ή βιοχηµική του δραστηριότητα, στην ουσία παρατηρούµε τις πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες είναι οι δοµικοί λίθοι από τους οποίους συγκροτούνται τα κύτταρα και αποτελούν το µεγαλύτερο µέρος της ξηρής µάζας του κυττάρου. Επιπλέον, είναι υπεύθυνες για το σχήµα και τη δοµή του κυττάρου και επιτελούν όλες σχεδόν τις κυτταρικές λειτουργίες. Η δοµή και η χηµεία κάθε πρωτεΐνης αναπτύχθηκε και συντονίστηκε µέσα σε δισεκατοµµύρια χρόνια εξελικτικής ιστορίας. Εποµένως, από χηµική σκοπιά, δεν προξενεί έκπληξη το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες εµφανίζουν τη µεγαλύτερη δοµική και λειτουργική πολυπλοκότητα από όλα τα γνωστά µόρια. Οι περισσότερες πρωτεΐνες είναι πολύ µικρές για να παρατηρηθούν έστω και αδρά, ακόµα και µε ισχυρό ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Για να γίνει η µελέτη της αλυσίδας των αµινοξέων, πρέπει να παρατηρηθούν τα άτοµα που απαρτίζουν τα ξεχωριστά αµινοξέα. Για το σκοπό αυτό γενικά χρειάζονται οι ακτίνες Χ, που είναι µια µορφή ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας. Πριν από την εξέταση µιας πρωτεΐνης µε ακτίνες, προηγείται η αποµόνωσή της σε καθαρή µορφή. Επίσης πρέπει να καθοριστεί η αλληλουχία των αµινοξέων της: οι σχετικές πληροφορίες διευκολύνουν την ερµηνεία των δεδοµένων από την ανάλυση µε ακτίνες Χ. Οι πρωτεΐνες δεν είναι αδρανείς σωροί ύλης. Λόγω της διαφορετικής αλληλουχίας των αµινοξέων τους, οι πρωτεΐνες σχηµατίζουν µια τεράστια ποικιλία διαφορετικών διαµορφώσεων, η καθεµιά µε µοναδική τοπογραφία των χηµικών οµάδων της στην επιφάνεια. Η διαµόρφωση µιας πρωτεΐνης της δίνει µοναδική λειτουργία που βασίζεται στις χηµικές ιδιότητές της και στα προσεκτικά κατασκευασµένα τµήµατά της, των οποίων η λειτουργία είναι συζευγµένη µε χηµικά γεγονότα. Αυτή η ένωση της δοµής, της χηµείας και της δραστηριότητας προσδίδει στις πρωτεΐνες την ιδιαίτερη ικανότητα να συντονίζουν τις δυναµικές διεργασίες που συµβαίνουν στα ζωντανά κύτταρα. Στις πρωτεΐνες, η δοµή είναι αναπόσπαστα συνδεδεµένη µε τη λειτουργία. Ωστόσο, στο εσωτερικό του κυττάρου, οι περισσότερες πρωτεΐνες δεν λειτουργούν ακατάπαυστα, ούτε µε τη µέγιστη ταχύτητα. Αντίθετα, η δραστηριότητά τους ρυθµίζεται έτσι ώστε το κύτταρο να διατηρείται σε κατάσταση ισορροπίας, παράγοντας µόνο όσα µόρια χρειάζεται για να ευηµερεί υπό τις τρέχουσες συνθήκες. Η επίτευξη αυτής της ισορροπίας προϋποθέτει συντονισµένο έλεγχο της δραστηριότητας των πρωτεϊνών του κυττάρου και συνεκτίµηση των αντιδράσεων που πραγµατοποιούνται σε άλλα µέρη του κυττάρου.

1-2. Το αίµα:

Το αίµα αποτελείται από κύτταρα τα οποία αιωρούνται µέσα σε ένα υγρό, καλούµενο πλάσµα. Μεταφέρει οξυγόνο µε δυο τρόπους: περισσότερο από 98% του Ο2 φυσιολογικά δεσµεύεται στην αιµοσφαιρίνη µέσα στα ερυθροκύτταρα. Ένα ελάχιστο ποσοστό διαλύεται φυσικά στις υδάτινες φάσεις του πλάσµατος του αίµατος και του κυτταροπλάσµατος των κυττάρων του αίµατος. Τα κύτταρα του αίµατος περιλαµβάνουν τα ερυθροκύτταρα, τα λευκοκύτταρα και τα αιµοπετάλια, τα οποία είναι κυτταρικά θραύσµατα. Περισσότερο από το 99% των κυττάρων του αίµατος είναι ερυθροκύτταρα, τα οποία µεταφέρουν οξυγόνο στους ιστούς. Τα λευκοκύτταρα, προστατεύον τον οργανισµό από τις µολύνσεις και τον καρκίνο. Τα αιµοπετάλια συµβάλλουν στην αιµόσταση. Το πλάσµα αποτελείται από έναν µεγάλο αριθµό οργανικών και ανόργανων ουσιών διαλυµένων στο ύδωρ. Το έντονο ξανθοκίτρινο χρώµα του πλάσµατος οφείλεται κατά κύριο λόγο, στο προϊόν αποδόµησης της αιµοσφαιρίνης, που ονοµάζεται χολερυθρίνη. Οι πρωτεΐνες, αποτελούν το κύριο συστατικό του πλάσµατος, και µπορούν να ταξινοµηθούν σύµφωνα µε ορισµένες φυσικές και χηµικές αντιδράσεις τους, σε τρεις γενικές κατηγορίες: τις λευκωµατίνες, τις σφαιρίνες, και το ινωδογόνο, το οποίο συµµετέχει στην πήξη του αίµατος.

3

Κύρια λειτουργία των ερυθροκυττάρων είναι η µεταφορά του οξυγόνου, που προσλαµβάνεται από τους πνεύµονες, και του διοξειδίου του άνθρακα, που παράγεται από τα κύτταρα του σώµατος. Τα ερυθροκύτταρα περιέχουν µεγάλες ποσότητες µιας πρωτεΐνης, της αιµοσφαιρίνης, µε την οποία ενώνεται το οξυγόνο και, σε µικρότερο βαθµό, το διοξείδιο του άνθρακα, εναλλακτικά. Τα ερυθροκύτταρα είναι ειδικές διαφοροποιήσεις κυττάρων από τα οποία απουσιάζει πλήρως η εσωτερική διαµερισµατοποίηση και περιέχουν κυρίως τα µόρια της αιµοσφαιρίνης (περίπου 3x108 µόρια αιµοσφαιρίνης). Στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, τα ερυθροκύτταρα εµφανίζονται ως δίσκοι έχοντας τις δυο επιφάνειες κοίλες προς το κέντρο του δίσκου.

2-1. Το οξυγόνο δεσµεύεται σε µια προσθετική οµάδα αίµης:

Οι χρωµοπρωτεΐνες είναι σύµπλοκες πρωτεΐνες και εµφανίζονται έγχρωµες γιατί απορροφούν ορισµένα από µήκη κύµατος της ζώνης του ορατού φάσµατος της ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας. Στην περίπτωση των αιµοπρωτεΐνων, η απορρόφηση του φωτός οφείλεται στην προσθετική τους οµάδα, την αίµη, ένα µη πολυπεπτιδικό στοιχείο. Σε όλους τους ανώτερους πολυκύτταρους ζωικούς οργανισµούς, το µόριο των χρωµοπρωτεϊνών µεταφοράς οξυγόνου, συνίσταται από την ίδια πορφυρινική προσθετική οµάδα που είναι η αίµη, στην οποία δεσµεύεται το O2, και από το πρωτεϊνικό τµήµα που ονοµάζεται γλοβίνη ή σφαιρίνη. Η παρουσία της γλοβίνης καθιστά την δέσµευση του οξυγόνου στην αίµη αντιστρεπτή.

Η αίµη συνίσταται από ένα µόριο της πρωτοπορφυρίνης ΙΧ, στο κέντρο του οποίου βρίσκεται συνδεδεµένο ένα άτοµο σιδήρου. Οι πρωτοπορφυρίνες συνίστανται από τέσσερις δακτυλίους πυρρόλης που συνδέονται µεταξύ τους µε µεθενυλικές γέφυρες (=CH-), ώστε σχηµατίζεται ένας πολυκυκλικός δακτύλιος (τετραπυρρολικός δακτύλιος). Περιφερειακά στο δακτύλιο συνδέονται τέσσερις µεθυλικές (-CH3), δυο βινυλικές (-CH=CH2) και δυο προπιονικές (-CH2-CH2-COOH) οµάδες. Από αυτές, οι βινυλικές και οι µεθυλικές οµάδες είναι µη πολικές, ενώ οι προπιονικές είναι πολικές. Οι οµάδες αυτές είναι δυνατόν να διαταχθούν µε 15 διαφορετικούς τρόπους, ώστε προκύπτουν τα αντίστοιχα ισοµερή. Στα βιολογικά συστήµατα, απαντάται µόνο ένα ισοµερές, το οποίο ονοµάζεται πρωτοπορφυρίνη ΙΧ.

Στο µόριο της αίµης, τα τέσσερα άτοµα αζώτου στις κορυφές των πυρρολικών δακτυλίων της πρωτοπορφυρίνης ΙΧ ενώνονται µε δεσµούς συναρµογής µε ένα άτοµο δισθενούς σιδήρου. Οι άλλοι δύο δεσµοί συναρµογής του σιδήρου, ο έκτος και ο πέµπτος, παραµένουν ελεύθεροι και κατευθύνονται προς τα κάτω, κάθετα, του επίπεδου πλάνου του µορίου της αίµης. Ο δισθενής σίδηρος, είναι δυνατόν να οξειδωθεί και να µετατραπεί σε τρισθενή µορφή, χάνοντας ένα ηλεκτρόνιο. Το µόριο που φέρει τρισθενή σίδηρο ονοµάζεται αιµατίνη. Η αιµατίνη µε τη σειρά της είναι δυνατόν να αναχθεί και να µετατραπεί σε αίµη:

ΑΙΜΗ (Fe+2) AIMATINH (Fe+3)

Το άτοµο του σιδήρου µπορεί να λαµβάνει δύο καταστάσεις οξείδωσης: την σιδηρο- (+2) ή σιδηρι- (+3) κατάσταση, και οι αντίστοιχες µορφές αιµοσφαιρίνης ονοµάζονται: σιδηροαιµοσφαιρίνη και σιδηριαιµοσφαιρίνη. Η σιδηριαιµοσφαιρίνη λέγεται και µεθαιµοσφαιρίνη . Το οξυγόνο µπορεί να δεσµεύεται µόνο από τη σιδηροαιµοσφαιρίνη, δηλαδή την κατάσταση οξείδωσης +2.

4

2-2. Η αιµοσφαιρίνη αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες:

Η ανθρώπινη αιµοσφαιρίνη περιέχει τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες όµοιες ανά δύο. Οι τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες συγκρατούνται µε µη οµοιοπολικές δυνάµεις. Η κάθε αλυσίδα περιέχει µια οµάδα αίµης και µία θέση δέσµευσης οξυγόνου. Η δοµή της αιµοσφαιρίνης χαρακτηρίζεται ως τεταρτοταγής, και το τετραµερές της αιµοσφαιρίνης αποτελείται από δύο πανοµοιότυπα διµερή, (αβ)1 και (αβ)2. Οι δυο πολυπεπτιδικές αλυσίδες σε κάθε διµερές, συγκρατούνται σφιχτά µεταξύ τους, κυρίως µε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, οι οποίες φέρνουν σε στενή επαφή τις α και β υποµονάδες των δύο διµερών. Ανάµεσα στα µέλη του διµερούς, αναπτύσσονται επίσης ιοντικοί δεσµοί και δεσµοί υδρογόνου. Ωστόσο τα δυο διµερή έχουν την ικανότητα να κινούνται το ένα σε σχέση µε το άλλο, καθώς συγκρατούνται µεταξύ τους κυρίως µε πολικούς δεσµούς. Παρόλο ότι διαφέρει η αλληλουχία των αµινοξέων των αλυσίδων, οι τρισδιάστατες δοµές των α- και β- αλυσίδων της αιµοσφαιρίνης είναι όµοιες. Οι α- αλυσίδες της αιµοσφαιρίνης έχουν 141 κατάλοιπα αµινοξέων, ενώ οι β- αλυσίδες έχουν 146.

2-3. Ανάλυση της αιµοσφαιρίνης µε ακτίνες Χ:

Η αποκάλυψη της τρισδιάστατης δοµής της αιµοσφαιρίνης από τον Perutz ξεκίνησε το 1936. Η µεγαλύτερη δοµή που είχε αναλυθεί ως τότε ήταν της χρωστικής φθαλοκυανίνης, που περιέχει 58 άτοµα, ενώ το µόριο της αιµοσφαιρίνης είναι χίλιες φορές µεγαλύτερο. Με την χρήση της κρυσταλλογραφίας ακτινών Χ για τον προσδιορισµό χηµικών δοµών, το 1959 ο Perutz πέτυχε µια εικόνα ηλεκτρονικής πυκνότητας της οξυαιµοσφαιρίνης αλόγου σε χαµηλή διακριτική ικανότητα, ενώ αρκετά χρόνια αργότερα, δηµοσιεύθηκαν χάρτες υψηλής ευκρίνειας για τις οξυαιµοσφαιρίνες και τις δεοξυαιµοσφαιρίνες από άλογο και άνθρωπο.

Το µόριο της αιµοσφαιρίνης είναι σχεδόν σφαιρικό, µε διάµετρο 55Å. Οι τέσσερις αλυσίδες είναι πακεταρισµένες µαζί σε ένα τετράεδρο. Οι οµάδες της αίµης είναι τοποθετηµένες σε εσοχές κοντά στο εξωτερικό του µορίου, µία σε κάθε υποµονάδα. Οι τέσσερις θέσεις δέσµευσης απέχουν αρκετά µεταξύ τους, η απόσταση µεταξύ των πλησιέστερων ατόµων σιδήρου είναι 25Å. Κάθε αλυσίδα α είναι σε επαφή και µε τις δύο αλυσίδες β. Αντίθετα, υπάρχουν λίγα µόνο σηµεία επαφής µεταξύ των δύο αλυσίδων α ή µεταξύ των αλυσίδων β.

2-4. Τα πιο σπουδαία κατάλοιπα αµινοξέων στην αλληλουχία

Τα αµινοξέα αυτά είναι σηµαντικά για τη λειτουργία του µορίου της αιµοσφαιρίνης. Αρκετά από αυτά, επηρεάζουν άµεσα τη θέση δέσµευσης του οξυγόνου.

Το εσωτερικό του µορίου της αιµοσφαιρίνης είναι µη πολικό, και αυτός ο χαρακτήρας διατηρείται, καθώς στο εσωτερικό της αιµοσφαιρίνης τα αµινοξέα εµφανίζουν µεγάλη ποικιλία και η αλλαγή πάντα αφορά την αντικατάσταση ενός µη πολικού αµινοξέος από ένα άλλο. Το µη πολικό εσωτερικό µέρος της αιµοσφαιρίνης συµβάλλει στην σταθεροποίηση της τρισδιάστατης δοµής της. Αντίθετα, τα αµινοξέα στην επιφάνεια της αιµοσφαιρίνης δείχνουν µεγάλη ποικιλία, καθώς λίγα παραµένουν πάντοτε φορτισµένα θετικά ή αρνητικά.

Το µήκος και η κατεύθυνση των ελίκων σε όλες τις σφαιρίνες είναι παρόµοιο.

Αµετάβλητα αµινοξέα στις αιµοσφαιρίνες:

5

Θέση Αµινοξύ Ρόλος

F8 Ιστιδίνη Εγγύς ιστιδίνη- συνδεδεµένη µε την αίµη

E7 Ιστιδίνη Μακρινή ιστιδίνη κοντά στην αίµη

CD1 Φαινυλαλανίνη Επαφή µε την αίµη

F4 Λευκίνη Επαφή µε την αίµη

B6 Γλυκίνη Επιτρέπει την προσέγγιση των ελίκων Β και Ε

C2 Προλίνη Τερµατισµός της έλικας

HC2 Τυροσίνη Διασυνδέσεις µεταξύ των ελίκων H και F για τη σταθεροποίηση του µορίου

C4 Θρεονίνη Άγνωστος

H10 Λυσίνη Άγνωστος

2-5. Η αιµοσφαιρίνη είναι µια αλλοστερική πρωτεΐνη:

Η αιµοσφαιρίνη είναι ένα ευαίσθητο στις συνθήκες του περιβάλλοντος, και ένα πολύπλοκο µόριο. Εκτός από Ο2 µεταφέρει Η+ και CO2. Ακόµη, οι ιδιότητες δέσµευσης της αιµοσφαιρίνης ρυθµίζονται από αλληλεπιδράσεις διαφορετικών, µη γειτονικών θέσεων. Επιπλέον, η αιµοσφαιρίνη είναι αλλοστερική πρωτεΐνη, καθώς εµφανίζει τα εξής χαρακτηριστικά:

1. το O2 δεσµεύεται συνεργειακά στην αιµοσφαιρίνη, δηλαδή η δέσµευση ενός µορίου Ο2 στην αιµοσφαιρίνη διευκολύνει τη δέσµευση του επόµενου µορίου Ο2 στο ίδιο µόριο της αιµοσφαιρίνης.

2. η συγγένεια της αιµοσφαιρίνης για Ο2 εξαρτάται από το pH, ενώ ένας ακόµη παράγοντας που επηρεάζει τα χαρακτηριστικά δέσµευσης οξυγόνου της αιµοσφαιρίνης είναι το µόριο του CO2.

3. οργανικές φωσφορικές ενώσεις, όπως το 2,3- διφωσφογλυκερικό (BPG), αποτελούν έναν επιπλέον παράγοντα ρύθµισης της συγγένειας αιµοσφαιρίνης για Ο2, µε αποτέλεσµα η αιµοσφαιρίνη να έχει µικρότερη συγγένεια για το οξυγόνο.

Γενικά, η ικανότητα της αιµοσφαιρίνης να συνδέει το οξυγόνο αντιστρεπτά, επηρεάζεται από τους εξής παράγοντες: το pH του περιβάλλοντος, την pΟ2, την pCO2 και τη διαθεσιµότητα του 2,3-διφωσφογλυκερικού. Οι επηρεαστές αυτοί συνολικά ονοµάζονται «αλλοστερικοί» (δηλαδή άλλης θέσης), γιατί οι επιδράσεις τους σε µια περιοχή του µορίου της αιµοσφαιρίνης επηρεάζει την πρόσδεση οξυγόνου από οµάδα αίµης σε διαφορετική περιοχή του µορίου.

2-6. Το οξυγόνο δεσµεύεται συνεργειακά στην αιµοσφαιρίνη:

Ακολουθεί η καµπύλη απελευθέρωσης του οξυγόνου για την αιµοσφαιρίνη, η οποία είναι σιγµοειδής:

(Ο κορεσµός Y ορίζεται ως το ποσοστό κάλυψης των θέσεων δέσµευσης του O2)

Ο κορεσµός των θέσεων δέσµευσης του οξυγόνου, δίνεται ως συνάρτηση της µερικής πίεσης του οξυγόνου στο περιβάλλον διάλυµα.

6

Ο κορεσµός Y έχει τιµές που ποικίλλουν από 0 όπου όλες οι θέσεις είναι ελεύθερες, µέχρι 1 όπου όλες οι θέσεις είναι κατειληµµένες. Η συγγένεια της αιµοσφαιρίνης για το οξυγόνο χαρακτηρίζεται από την ποσότητα P50 που είναι η µερική πίεση του οξυγόνου όταν 50% των θέσεων είναι κατειληµµένες (δηλαδή όταν Υ=0,5). Για την αιµοσφαιρίνη, η P50 είναι 26 torrs. Γενικά ισχύει πως όσο πιο µεγάλη είναι η συγγένεια για το οξυγόνο, τόσο πιο µικρή είναι η P50.

Το γεγονός ότι η καµπύλη διάστασης του οξυγόνου για την αιµοσφαιρίνη είναι σιγµοειδής δείχνει ότι οι υποµονάδες συνεργάζονται κατά την πρόσληψη του οξυγόνου. Η απότοµη αύξηση της κλίσης της καµπύλης στην περιοχή κοντά στα 15 έως 35 torrs, δείχνει ότι παρόλο που είναι δύσκολο για το πρώτο µόριο οξυγόνου να προσδεθεί από την αιµοσφαιρίνη, η επόµενη πρόσδεση οξυγόνου συµβαίνει µε µεγάλη συγγένεια. Έτσι, η σιγµοειδής καµπύλη της πρόσδεσης του οξυγόνου, αντικατοπτρίζει συγκεκριµένες δοµικές αλλαγές που αρχίζουν σε µια οµάδα αίµης και µεταδίδονται σε άλλες οµάδες αίµης στο τετραµερές της αιµοσφαιρίνης. Το τελικό αποτέλεσµα είναι ότι η συγγένεια της αιµοσφαιρίνης για το τελευταίο οξυγόνο που προσδένεται είναι περίπου 300 φορές µεγαλύτερη από τη συγγένειά της για το πρώτο οξυγόνο που προσδένεται.

Σηµασία της σιγµοειδούς καµπύλης διάστασης του οξυγόνου: Η απότοµη κλίση της καµπύλης διάστασης του οξυγόνου για την περιοχή των συγκεντρώσεων οξυγόνου που υπάρχουν ανάµεσα στους πνεύµονες και στους ιστούς, επιτρέπει στην αιµοσφαιρίνη να φέρει και να παρέχει το οξυγόνο αποτελεσµατικά από περιοχές µεγάλων σε περιοχές µικρών pΟ2.

Η συνεργειακή δέσµευση του οξυγόνου από την αιµοσφαιρίνη διευκολύνει τη µεταφορά οξυγόνου:

Η δέσµευση του οξυγόνου στην αιµοσφαιρίνη είναι συνεργειακή, καθώς η δέσµευσή του από τη µια αίµη διευκολύνει τη δέσµευση του οξυγόνου από τις άλλες του ίδιου τετραµερούς, ενώ η απελευθέρωση του οξυγόνου της µιας αίµης διευκολύνει την απελευθέρωση του οξυγόνου από τις άλλες. Αυτό συµβαίνει γιατί οι οµάδες αίµης µιας αιµοσφαιρίνης επικοινωνούν µεταξύ τους. Γι’ αυτό, ο µηχανισµός συνεργειακής δέσµευσης

οξυγόνου από την αιµοσφαιρίνη λέγεται µερικές φορές: αλληλεπίδραση αίµης µε αίµη.

Η συνεργειακή δέσµευση του οξυγόνου από την αιµοσφαιρίνη, καθιστά την αιµοσφαιρίνη πιο αποτελεσµατικό µεταφορέα οξυγόνου. Ο κορεσµός οξυγόνου της αιµοσφαιρίνης αλλάζει πιο γρήγορα µε αλλαγές στη µερική πίεση του Ο2 από ό,τι θα άλλαζε αν οι θέσεις δέσµευσης του οξυγόνου ήταν ανεξάρτητες η µία της άλλης. Συγκεκριµένα, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, η συνεργειακή δέσµευση του οξυγόνου από την αιµοσφαιρίνη της δίνει τη δυνατότητα να µεταφέρει 1,83 φορές περισσότερο οξυγόνο, γεγονός που δεν ισχύει αν οι θέσεις δέσµευσης του οξυγόνου ήταν ανεξάρτητες. Έτσι, η συνεργατική

πρόσδεση του οξυγόνου, επιτρέπει στην αιµοσφαιρίνη να παρέχει περισσότερο οξυγόνο στους ιστούς, ακόµα και όταν υπάρχουν µικρές αλλαγές στην µερική πίεση του οξυγόνου. Για παράδειγµα, στους πνεύµονες η συγκέντρωση του οξυγόνου είναι µεγάλη και η αιµοσφαιρίνη εµφανίζεται ουσιαστικά κορεσµένη µε οξυγόνο. Αντίθετα, στους περιφερειακούς ιστούς η οξυαιµοσφαιρίνη απελευθερώνει το µεγαλύτερο µέρος του οξυγόνου της για να χρησιµοποιηθεί στον οξειδωτικό µεταβολισµό των ιστών.

2-7. Ουσίες που επηρεάζουν την πρόσδεση οξυγόνου:

2,3- Διφωσφογλυκερινικό

Το 2,3- Διφωσφογλυκερινικό (2,3- BPG) σχηµατίζεται στα ερυθρά αιµοσφαίρια από το ενδιάµεσο της γλυκόλησης 1,3- διφωσφογλυκερινικό. Στην κεντρική κοιλότητα, στον άξονα συµµετρίας του µορίου της αιµοσφαιρίνης, που σχηµατίζεται από τις τέσσερις υποµονάδες, προσδένεται το 2,3- BPG, προκαλώντας την αύξηση της ενέργειας που απαιτείται για τις αλλαγές στη διαµόρφωση που διευκολύνει την πρόσδεση του οξυγόνου. Αυτή η πολύ ανιοντική µορφή οργανικού φωσφόρου, βρίσκεται στα ανθρώπινα ερυθροκύτταρα περίπου στην ίδια µοριακή συγκέντρωση µε την αιµοσφαιρίνη. Απουσία BPG η P50 της αιµοσφαιρίνης είναι 1 torr, ενώ παρουσία της BPG η P50 της αιµοσφαιρίνης είναι 26 torr. Έτσι, το 2,3- BPG

7

ελαττώνει τη συγγένεια της αιµοσφαιρίνης για οξυγόνο κατά 26 φορές, µε αποτέλεσµα το οξυγόνο να ελευθερώνεται πιο εύκολα στους ιστούς όταν η αιµοσφαιρίνη περιέχει 2,3- BPG.

Το BPG δεσµεύεται ειδικά στη δεοξυαιµοσφαιρίνη σε αναλογία ένα µόριο BPG ανά τετραµερές αιµοσφαιρίνης. Η θέση δέσµευσης για το BPG αποτελείται από τρία θετικά φορτισµένα αµινοξέα σε κάθε µία από τις αλυσίδες β: την α αµινοµάδα στο αµινο-τελικό άκρο, τη λυσίνη ΕF6 και την ιστιδίνη Η21. αυτές οι οµάδες αλληλεπιδρούν µε το πολύ αρνητικά φορτισµένο BPG, που φέρνει σχεδόν τέσσερα αρνητικά φορτία σε φυσιολογικό pH.

Κατά την οξυγόνωση, το BPG αποµακρύνεται επειδή η κεντρική κοιλότητα γίνεται πολύ µικρή, ιδιαίτερα ο χώρος µεταξύ των ελίκων Η των αλυσίδων β στενεύει πολύ. Επίσης, η απόσταση µεταξύ των α αµινοµάδων αυξάνεται από 16 σε 20 Å, και αυτό τις εµποδίζει να δεσµεύουν τα φωσφορικά ενός µορίου BPG ταυτόχρονα.

Το αποτέλεσµα της πρόσδεσης του 2,3-BPG µπορεί να παρασταθεί σχηµατικά ως εξής:

HbO2 + 2,3-BPG Hb-2,3-BPG + O2

οξυαιµοσφαιρίνη δεοξυαιµοσφαιρίνη

Η εµβρυϊκή αιµοσφαιρίνη έχει υψηλότερη συγγένεια για το Ο2 από οτι η µητρική αιµοσφαιρίνη:

Η HbF έχει µια µικρότερη συγγένεια για 2,3- BPG από ότι η αιµοσφαιρίνη HbA του ενήλικα, και έτσι µια µεγαλύτερη συγγένεια για οξυγόνο. Αυτό οφείλεται στις δοµικές αλλαγές που προκύπτουν από τη διαφορά στη σύνθεση των αµινοξέων µεταξύ των γ-αλυσίδων της HbF και των β-αλυσίδων της HbA. Συγκεκριµένα, το αµινοξύ Η21 στην εµβρυϊκή αιµοσφαιρίνη είναι σερίνη αντί ιστιδίνης. Ως αποτέλεσµα, το οξυγόνο που ελευθερώνεται από την µητρική αιµοσφαιρίνη HbA, προσδένεται ευκολότερα από την αιµοσφαιρίνη HbF στο έµβρυο. Η αιµοσφαιρίνη F οξυγονώνεται στην άλλη πλευρά της κυκλοφορίας του πλακούντα σε βάρος της αιµοσφαιρίνης Α. Η υψηλότερη αυτή συγγένεια της αιµοσφαιρίνης F για το οξυγόνο οφείλεται στο γεγονός ότι η αιµοσφαιρίνη αυτή δεσµεύει το BPG λιγότερο σταθερά από ό,τι η αιµοσφαιρίνη Α. Απουσία του BPG η συγγένεια οξυγόνου της αιµοσφαιρίνης F είναι στην πραγµατικότητα µικρότερη από ό,τι της αιµοσφαιρίνης Α.

Έτσι, η µεταφορά οξυγόνου από την µητέρα στο έµβρυο, διευκολύνεται από τη δοµική διαφορά µεταξύ του µορίου της αιµοσφαιρίνης της µητέρας και εκείνου του εµβρύου.

Μεταβολή των επιπέδων του 2,3-BPG σε χρόνια υποξία ή αναιµία:

Η συγκέντρωση 2,3-BPG στα ερυθροκύτταρα αυξάνει σε περιπτώσεις χρόνιας υποξίας, όπως σε εκείνης που παρατηρείται σε αποφρακτικό πνευµονικό εµφύσηµα, ή σε µεγάλα υψόµετρα, όπου η αιµοσφαιρίνη που κυκλοφορεί µπορεί να εµφανίσει δυσκολία στην πρόσληψη επαρκούς ποσότητας οξυγόνου. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του 2,3-BPG είναι επίσης αυξηµένα σε χρόνια αναιµία, όπου λιγότερα από τα φυσιολογικά ερυθροκύτταρα είναι διαθέσιµα για την παροχή του οξυγόνου που χρειάζεται ο οργανισµός. Αυξηµένα επίπεδα του 2,3-BPG µειώνουν τη συγγένεια της αιµοσφαιρίνης προς το οξυγόνο, επιτρέποντας µεγαλύτερη εκφόρτιση οξυγόνου στα τριχοειδή των ιστών.

Ρόλος του 2,3-BPG στο µεταγγισµένο αίµα:

Το 2,3-BPG είναι σηµαντικό για τη φυσιολογική µεταφορά του οξυγόνου από την αιµοσφαιρίνη. Σε περιπτώσεις έλλειψης 2,3-BPG η αιµοσφαιρίνη συµπεριφέρεται µάλλον σαν «παγίδα» οξυγόνου παρά σαν σύστηµα µεταφοράς του. Αν και τα µεταγγισµένα ερυθροκύτταρα µπορούν να αποκαταστήσουν τα µειωµένα τους αποθέµατα σε 2,3-BPG µέσα σε 24 έως 48 ώρες, ασθενείς σε κρίσιµη κατάσταση µπορεί να κινδυνεύσουν σοβαρά αν τους γίνει µετάγγιση µεγάλων ποσοτήτων τέτοιου «απογυµνωµένου» αίµατος. Η έλλειψη του 2,3-BPG µπορεί να αποφευχθεί µε την προσθήκη στο αποθηκευτικό µέσο υποστρωµάτων, όπως η ινοσίνη. Η ινοσίνη, ένα µη φορτισµένο µόριο, εισέρχεται στα ερυθροκύτταρα όπου τα υπολείµµατα της ριβόζης αποδεσµεύονται, φωσφορυλιώνονται και µπαίνουν στην οδό της µονοφωσφορικής εξόζης, οπότε τελικά µετατρέπονται σε 2,3-BPG.

Πρόσδεση πρωτονίου

8

Στο φαινόµενο Bohr, η συγγένεια της αιµοσφαιρίνης για το οξυγόνο µειώνεται από την δέσµευση πρωτονίων από αυτήν. Το pH του αίµατος ελαττώνεται καθώς εισέρχεται στους ιστούς και η συγκέντρωση των πρωτονίων αυξάνει, επειδή το CO2 που παράγεται από τον µεταβολισµό, µετατρέπεται σε ανθρακικό οξύ µε αντίδραση που καταλύεται από την καρβονική ανυδράση στα ερυθρά αιµοσφαίρια. Η διάσταση του ανθρακικού οξέος παράγει πρωτόνια που αντιδρούν µε διάφορα κατάλοιπα αµινοξέων στην αιµοσφαιρίνη, προκαλώντας αλλαγές στη διαµόρφωση που προωθούν την απελευθέρωση του οξυγόνου.

Στους πνεύµονες, αυτή η διεργασία είναι αντιστρεπτή. Το οξυγόνο που προσδένεται στην αιµοσφαιρίνη, προκαλεί απελευθέρωση πρωτονίων που συνενώνονται µε διττανθρακικό µε σχηµατισµό ανθρακικού οξέος. Έτσι, µε την ελάττωση των πρωτονίων ,αυξάνει το pH του αίµατος. Η ανθρακική ανυδράση διασπά το ανθρακικό οξύ σε H2O και CO2 και το CO2 εκπνέεται. Γι’ αυτό, στους ιστούς όπου το pH είναι χαµηλό επειδή παράγεται CO2 από το µεταβολισµό, το οξυγόνο απελευθερώνεται από την αιµοσφαιρίνη. Στους πνεύµονες, όπου το pH του αίµατος είναι υψηλότερο, επειδή εκπνέεται CO2 , προσδένεται οξυγόνο στην αιµοσφαιρίνη.

Μηχανισµός του φαινοµένου BOHR:

Για κάθε µόριο Ο2 που απελευθερώνεται, δεσµεύεται την αιµοσφαιρίνη περίπου 0,5 Η+. η δέσµευση Η+ βοηθά στη ρύθµιση του pH στους ιστούς µε έντονη µεταβολική δραστικότητα. Αυτό υποδηλώνει ότι η αποµάκρυνση οξυγόνου αυξάνει τη συγγένεια ορισµένων θέσεων για H+. Ιδιαίτερα τα pK µερικών οµάδων, πρέπει να αυξηθούν κατά τη µετάβαση από οξυ- σε δεοξυ-αιµοσφαιρίνη. Αύξηση στο pK σηµαίνει µεγαλύτερη ικανότητα δέσµευσης Η+.

Ακολουθούν στο σχήµα φυσιολογικά pΚ ορισµένων λειτουργικών οµάδων στις πρωτεΐνες:

Το περιβάλλον της κάθε µιας µπορεί να αλλάζει την τιµή του pK είτε προς τα πάνω ή προς τα κάτω της τιµής.

Για το φαινόµενο Bohr, είναι υπεύθυνες κυρίως τρεις οµάδες: οι πλευρικές οµάδες στις ιστιδίνες 146β και 122α, καθώς και η α αµινοµάδα στην αλυσίδα α.

Το φαινόµενο του Bohr, µπορεί να παρασταθεί σχηµατικά ως εξής:

HbO2 + H+ HbH+ + O2

δεοξυαιµοσφαιρίνη οξυαιµοσφαιρίνη

όπου µια αύξηση σε πρωτόνια (ή µια πτώση της pO2) µετατοπίζει την ισορροπία προς τα δεξιά, ευνοώντας τη δεοξυαιµοσφαιρίνη, ενώ µια αύξηση στην pΟ2, ή ελάττωση

των πρωτονίων, µετατοπίζει την ισορροπία προς τα αριστερά.

Διοξείδιο του άνθρακα

Το CO2 δεσµεύεται στις τελικές αµινοµάδες της αιµοσφαιρίνης και ελαττώνει τη συγγένειά της για το οξυγόνο.

9

Από τον µεταβολισµό στους ιστούς, το µεγαλύτερο µέρος του CO2 που παράγεται µεταφέρεται στους πνεύµονες ως διττανθρακικό (όξινο ανθρακικό) ανιόν που παράγεται στα ερυθροκύτταρα από τη δράση της ανθρακικής ανυδράσης:

CO2 + Η2Ο HCO3- + H+

Το µεγαλύτερο µέρος από τα H+ που παράγονται σε αυτήν την αντίδραση, δεσµεύεται στη δεοξυαιµοσφαιρίνη.

Ωστόσο, τµήµα του CO2 είναι οµοιοπολικώς δεσµευµένο στην αιµοσφαιρίνη, µεταφέρεται ως καρβαµική οµάδα ενωµένη µε τις µη φορτισµένες α-αµινοµάδες της αιµοσφαιρίνης, γεγονός που δείχνεται σχηµατικά ως εξής:

Hb-NH2 + CO2 Hb-NH-COO- + H+

Στους ιστούς, το CO2 σχηµατίζει καρβαµιδικές ενώσεις µε Ν-τελικές αµινοµάδες δεοξυαιµοσφαιρίνης. Το δεσµευµένο καρβαµικό δηµιουργεί δεσµούς άλατος που σταθεροποιούν τη µορφή Τ, ή δεόξυ-µορφή της αιµοσφαιρίνης, οδηγώντας σε ελάττωση της συγγένειάς της προς το οξυγόνο.

Στους πνεύµονες, όπου η pO2 είναι υψηλή, το οξυγόνο προσδένεται στην αιµοσφαιρίνη και το προσδεµένο CO2 απελευθερώνεται.

Πρόσδεση του CO:

Το µονοξείδιο του άνθρακα προσδένεται ισχυρά (αλλά αντιστρεπτά) από το σίδηρο της αιµοσφαιρίνης, σχηµατίζοντας την καρβοµονοξυαιµοσφαιρίνη HbCO. Όταν το µονοξείδιο του άνθρακα προσδένεται σε µία ή περισσότερες οµάδες αίµης, η αιµοσφαιρίνη µετατοπίζεται στη χαλαρωµένη χωροδιάταξη, οπότε οι υπόλοιπες οµάδες της αίµης αποκτούν µεγάλη συγγένεια για το οξυγόνο. Το γεγονός αυτό µετατοπίζει την καµπύλη κορεσµού του οξυγόνου προς τα αριστερά και αλλάζει το φυσιολογικό σιγµοειδές σχήµα προς µια υπερβολή, οπότε η προσβληµένη αιµοσφαιρίνη αδυνατεί να ελευθερώσει το οξυγόνο στους ιστούς. Η δηλητηρίαση από µονοξείδιο του άνθρακα, αντιµετωπίζεται µε θεραπεία οξυγόνου που διευκολύνει τη διάσταση του CO.

2-8. Στα αλλοστερικά φαινόµενα απαιτούνται αλληλεπιδράσεις µεταξύ των υποµονάδων:

Η αλυσίδα α έχει µεγάλη συγγένεια για οξυγόνου, και η δέσµευση οξυγόνου από αυτήν είναι ανεξάρτητη από το pH, τη συγκέντρωση του CO2 και το επίπεδο του BPG. Οι ιδιότητες µιας αποµονωµένης αλυσίδας µοιάζουν πολύ µε αυτές της µυοσφαιρίνης. Η αποµονωµένη αλυσίδα β, φτιάχνει εύκολα τετραµερή β4, που ονοµάζονται αιµοσφαιρίνη Η, η οποία έχει και εκείνη υψηλή συγγένεια για το οξυγόνο και, όπως συµβαίνει µε την αλυσίδα α και την µυοσφαιρίνη, η αιµοσφαιρίνη β4 δεν έχει καµιά από τις αλλοστερικές ιδιότητες της αιµοσφαιρίνης. Άρα, οι αλλοστερικές ιδιότητες της αιµοσφαιρίνης εµφανίζονται από τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των υποµονάδων της. Η λειτουργική µονάδα της αιµοσφαιρίνης είναι ένα τετραµερές που αποτελείται από δυο διαφορετικά είδη πολυπεπτιδικών αλυσίδων.

2-9. Επικοινωνία µέσα σε ένα πρωτεϊνικό µόριο:

Η αιµοσφαιρίνη δεσµεύει τα µόρια: Η+, CO2, O2, BPG σε διαφορετικές θέσεις, καθώς τα µόρια αυτά έχουν πολύ διαφορετικές δοµές. Οι θέσεις αυτές επικοινωνούν µεταξύ τους µε αλλαγές στη στερεοδιάταξη της πρωτεΐνης και συγκεκριµένα µέσω αλλαγών της τεταρτοταγής δοµής της αιµοσφαιρίνης. Η αιµοσφαιρίνη, ως αλλοστερική πρωτεΐνη της οποίας τα λειτουργικά χαρακτηριστικά καθορίζονται από ειδικά µόρια στο περιβάλλον, αποτελείται από πολλές πολυπεπτιδικές αλυσίδες και η περιοχή επαφής µεταξύ δυο αλυσίδων, µπορεί να ενισχύει και να µεταφέρει αλλαγές δοµής από την µια υποµονάδα στην άλλη. Εποµένως, οι αλλοστερικές αλληλεπιδράσεις παίζουν πολύ σηµαντικό ρόλο στην κυτταρική λειτουργία.

2-10. Η τεταρτοταγής δοµή της αιµοσφαιρίνης αλλάζει σηµαντικά µε την οξυγόνωση:

Οι κρυσταλλογραφικές µελέτες µε ακτίνες Χ, έδειξαν ότι η οξυαιµοσφαιρίνη και η δεοξυαιµοσφαιρίνη διαφέρουν σηµαντικά στη τεταρτοταγή τους δοµή. Η τεταρτοταγής δοµή της δεοξυαιµοσφαιρίνης λέγεται µορφή Τ (tense ή taut= τεταµένη), ενώ αυτή της οξυαιµοσφαιρίνης λέγεται µορφή R (relaxed= χαλαρή).

10

Καθώς οι αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα δύο ευκίνητα διµερή της αιµοσφαιρίνης είναι σχετικά ασθενείς, αυτά καταλαµβάνουν διαφορετικές θέσεις ,µεταξύ τους στη δεοξυ-αιµοσφαιρίνη σε σύγκριση µε την οξυ-αιµοσφαιρίνη.

A. Τ µορφή: Όπως προαναφέρθηκε, η δεόξυ µορφή της αιµοσφαιρίνης ονοµάζεται «Τ» ή τεταµένη µορφή. Στην Τ µορφή, τα δύο αβ διµερή αλληλεπιδρούν µέσω ενός δικτύου ιοντικών δεσµών και δεσµών υδρογόνου που περιορίζει τη κίνηση των πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Η Τ, είναι η µορφή της αιµοσφαιρίνης που παρουσιάζει µικρή συγγένεια προς το οξυγόνο.

B. R µορφή: Με την πρόσδεση του οξυγόνου στην αιµοσφαιρίνη, κάποιοι ιοντικοί δεσµοί και δεσµοί υδρογόνου ανάµεσα στα αβ διµερή, διασπώνται. Αυτό οδηγεί στη δοµή «R» ή χαλαρή µορφή, όπου οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες έχουν µεγαλύτερη ελευθερία κίνησης. Η R, είναι η µορφή της αιµοσφαιρίνης που παρουσιάζει µεγάλη συγγένεια προς το οξυγόνο.

Υπάρχουν δύο είδη περιοχών επαφής µεταξύ των αλυσίδων α και β:

1. Του τύπου α1β1 (και η ταυτόσηµή της α2β2), στις οποίες παρατηρούνται µικρές δοµικές αλλαγές στη µετάβαση από οξυ- σε δεοξυ-αιµοσφαιρίνη.

2. Του τύπου α1β2 (και η πανοµοιότυπη α2β2), στις οποίες παρατηρούνται µεγάλες δοµικές αλλαγές στη µετάβαση από οξυ- σε δεοξυ-αιµοσφαιρίνη.

Ακόµη, το ζεύγος α1β1 στρέφεται σε σχέση µε το άλλο ζεύγος κατά 15ο. Μερικά άτοµα, στην επιφάνεια επαφής µεταξύ αυτών των ζευγών µετακινούνται µέχρι και 6Å.

Στην πραγµατικότητα, η επιφάνεια επαφής α1β2 είναι σχεδιασµένη να λειτουργεί σαν διακόπτης µεταξύ δύο εναλλακτικών δοµών. Οι δυο µορφές στην περιοχή επαφής σταθεροποιούνται από διαφορετικά ζεύγη δεσµών υδρογόνου. Αυτή η περιοχή επαφής είναι στενά συνδεδεµένη µε τις οµάδες της αίµης, εποµένως αλλαγές στη διαµόρφωση της δοµής είναι επόµενο να επηρεάζουν τις οµάδες αίµης. Η σπουδαιότητα της περιοχής επαφής τονίζεται από το γεγονός ότι τα περισσότερα αµινοξέα σ’ αυτήν διατηρούνται ίδια σε όλα τα είδη. Επίσης, σχεδόν όλες οι µεταλλάξεις σ’ αυτή την περιοχή επαφής εξαφανίζουν την αλληλεπίδραση µεταξύ οµάδων αίµης, ενώ µεταλλάξεις στην περιοχή α1β1 δεν την επηρεάζουν καθόλου.

2-11. Η δεοξυαιµοσφαιρίνη συγκρατείται από δεσµούς άλατος µεταξύ διαφορετικών αλυσίδων:

Στην οξυαιµοσφαιρίνη, τα καρβοξυ-τελικά άκρα των τεσσάρων αλυσίδων έχουν σχεδόν απόλυτη ελευθερία περιστροφής. Αντίθετα στην δεοξυαιµοσφαιρίνη τα τελικά άκρα είναι καθηλωµένα και όλα, καθώς και οι πλευρικές αλυσίδες των αµινοξέων του καρβοξυ-τελικού άκρου, συµµετέχουν σε δεσµούς άλατος (ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις). Η δεοξυαιµοσφαιρίνη είναι ένα «τεταµένο» και περιορισµένο σε κινήσεις µόριο σε σχέση µε την οξυαιµοσφαιρίνη, γιατί έχει αυτούς τους οκτώ δεσµούς άλατος. Το οξυγονωµένο µόριο είναι πιο συµπαγές.

2-12. Η οξυγόνωση µετακινεί το άτοµο του σιδήρου προς το επίπεδο της πορφυρίνης:

Στη δεοξυαιµοσφαιρίνη, το άτοµο του σιδήρου βρίσκεται περίπου 0,4 Å έξω από το επίπεδο της αίµης προς την εγγύς ιστιδίνη, έτσι ώστε η οµάδα της αίµης είναι κυρτωµένη προς την ίδια κατεύθυνση. Κατά την οξυγόνωση, το άτοµο του σιδήρου µετακινείται µέσα στο επίπεδο της πορφυρίνης για να δηµιουργήσει σταθερό δεσµό µε το Ο2 , και έτσι η αίµη γίνεται περισσότερο επίπεδη. Δοµικές µελέτες µε πολλές συνθετικές σιδηροπορφυρίνες έδειξαν ότι το άτοµο του σιδήρου βρίσκεται έξω από το επίπεδο της πορφυρίνης σε σύµπλοκα πέντε θέσεων συναρµογής, ενώ βρίσκεται µέσα, ή σχεδόν µέσα, στο επίπεδο σε σύµπλοκα έξι θέσεων συναρµογής.

Η µετακίνηση του ατόµου του σιδήρου µεταφέρεται σε άλλες υποµονάδες από την εγγύς ιστιδίνη:

Η εγγύς ιστιδίνη παίζει σηµαντικό ρόλο στη µετάδοση δοµικών αλλαγών από τη µια αίµη στην άλλη. Συγκεκριµένα, κατά την οξυγόνωση, το άτοµο του σιδήρου µετακινείται προς το επίπεδο της αίµης, έλκοντας την εγγύς ιστιδίνη µαζί του, και η µετακίνηση αυτή της ιστιδίνης F8 προκαλεί την µετατόπιση της έλικας F καθώς και την αλλαγή της γωνίας EF και της γωνίας FG. Οι αλλαγές αυτές στη στερεοδιάταξη µεταφέρονται στα σηµεία επαφής των υποµονάδων, όπου διασπούν τους δεσµούς άλατος µεταξύ των αλυσίδων. Εποµένως η οξυγόνωση επηρεάζει την ισορροπία µεταξύ των δύο τεταρτοταγών δοµών προς τη δοµή R.

11

2-13. Ο µηχανισµός της συνεργειακής δέσµευσης οξυγόνου:

Καθώς στο τεταµένο µόριο της αιµοσφαιρίνης υπάρχουν οκτώ δεσµοί άλατος µεταξύ των τεσσάρων υποµονάδων, που περιορίζουν το µόριο, προκειµένου να συµβεί οξυγόνωση, πρέπει να διασπαστούν ορισµένοι δεσµοί άλατος, ώστε να διευκολυνθεί η µετακίνηση του ατόµου του σιδήρου προς το επίπεδο της αίµης.

Η αιµοσφαιρίνη µπορεί να προσδέσει ένα µόριο οξυγόνου (Ο2) σε καθεµία από τις τέσσερις οµάδες αίµης. Πολύ περισσότεροι δεσµοί άλατος πρέπει να διασπαστούν για τη δέσµευση του πρώτου Ο2 στο µόριο, από ό,τι των υπολοίπων Ο2. Εποµένως, η δέσµευση του πρώτου µορίου Ο2 είναι ενεργειακά λιγότερο ευνοϊκή από ό,τι η δέσµευση των επόµενων µορίων οξυγόνου, καθώς χρειάζεται να δαπανηθεί ενέργεια για να διασπαστούν οι δεσµοί άλατος.

2-14. Φυσιολογικές παραλλαγές αιµοσφαιρίνης:

Στον άνθρωπο, το µεγαλύτερο ποσοστό της αιµοσφαιρίνης του ενηλίκου, περίπου το 95%, είναι του τύπου HbΑ, µε σύνθεση αλυσίδων α2β2.

Η αιµοσφαιρίνη Α (HbA) είναι µόνο ένα µέλος µιας οικογένειας λειτουργικά και δοµικά συναφών πρωτεϊνών, των αιµοσφαιρινών.

Ακολουθεί πίνακας µε τις φυσιολογικές αιµοσφαιρίνες ενηλίκων ανθρώπων:

Μορφή Σύσταση αλυσίδας Κλάσµα της ολικής αιµοσφαιρίνης

Hb A α2β2 90%

Hb F α2γ2 <2%

Hb A2 α2δ2 2-5%

Hb A1c α2β2-γλυκόζη 3-9%

Οι α-αλυσίδες σε αυτές τις αιµοσφαιρίνες είναι ίδιες.

Στο 4% του συνόλου της αιµοσφαιρίνης, αντιστοιχεί η αιµοσφαιρίνη Α2 (HbA2). Το τετραµερές αυτό έχει σύνθεση πολυπεπτιδικών αλυσίδων α2δ2. οι µεταλλάξεις του γονιδίου που κωδικοποιεί τη δ-σφαιρίνη δεν έχουν κλινικές εκδηλώσεις. Οι παραπάνω αυτοί τύποι της αιµοσφαιρίνης του ενηλίκου, δεν διακρίνονται µεταξύ τους από λειτουργική άποψη.

Μια άλλη ελάσσων αιµοσφαιρίνη είναι η εµβρυϊκή HbF, της οποίας οι υποµονάδες είναι οι α και γ σφαιρίνες. Η αιµοσφαιρίνη HbF είναι η κύρια αιµοσφαιρίνη του εµβρύου κατά το δεύτερο και το τρίτο τρίµηνο της κύησης, ενώ στον ενήλικο αντιστοιχεί σε λιγότερο από 1% του συνόλου της αιµοσφαιρίνης. Η σύσταση αυτή της αιµοσφαιρίνης F εµφανίζεται κατά τη διάρκεια των τελευταίων δύο τρίτων της ζωής του εµβρύου. Λίγο µετά τη σύλληψη, τα έµβρυα συνθέτουν αλυσίδες ζήτα (ζ) (οι οποίες είναι σαν τις αλυσίδες άλφα α) και αλυσίδες έψιλον (ε) (που είναι σαν τις αλυσίδες β). Κατά τη διάρκεια της ζωής του εµβρύου, η ζ αντικαθίσταται από α και η ε αντικαθίσταται από γάµµα (γ), η οποία αντικαθίσταται από β.

Αν και η HbF στους περισσότερους ενήλικους είναι µόλις ανιχνεύσιµη, αυξάνεται συχνά σε άτοµα που παρουσιάζουν κάποια µετάλλαξη στην αιµοσφαιρίνη του ενηλίκου, όπως συµβαίνει στην δρεπανοκυτταρική αναιµία, µε αποτέλεσµα το ποσοστό της στο σύνολο της αιµοσφαιρίνης να αντιστοιχεί στο 15-20%.

Αιµοσφαιρίνη Α1c: Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, η HbA υφίσταται αργή, µη ενζυµική γλυκοζυλίωση, η έκταση της οποίας εξαρτάται από τη συγκέντρωση στο πλάσµα µιας συγκεκριµένης εξόζης. Η πιο άφθονη µορφή γλυκοζυλιωµένης αιµοσφαιρίνης είναι η HbA1c. Περιέχει υπολείµµατα γλυκόζης συνδεδεµένα κυρίως µε τις –NH2 οµάδες των αµινοτελικών βαλινών στις αλυσίδες β-γλοβίνης. Αυξηµένες ποσότητες της HbA1c εµφανίζονται στην

12

αιµοσφαιρίνη ασθενών µε σακχαρώδη διαβήτη, γιατί η HbA στα άτοµα αυτά, έρχεται σε επαφή µε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις γλυκόζης κατά τη διάρκεια των 120 ηµερών ζωής των ερυθροκυττάρων.

2-15. Αιµοσφαιρινοπάθειες:

Οι αιµοσφαιρινοπάθειες έχουν παραδοσιακά χαρακτηριστεί ως µια οικογένεια ανωµαλιών που προκαλούνται είτε από την παραγωγή ενός δοµικά ανώµαλου µορίου αιµοσφαιρίνης ή από τη σύνθεση ανεπαρκών ποσοτήτων φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης ή σπανιότερα και από τα δύο. Η δρεπανοκυτταρική αναιµία HbS, η νόσος της αιµοσφαιρίνης C HbC και τα σύνδροµα στης θαλασσαιµίας, είναι αντιπροσωπευτικοί τύποι αιµοσφαιρινοπαθειών που µπορούν να παρουσιάσουν σοβαρές κλινικές συνέπειες.

Ταξινόµηση των αιµοσφαιρινοπαθειών:

Αιµοσφαιρίνη Μετάλλαξη Βιοχηµική µεταβολή Ταξινόµηση Κλινικές συνέπειες

Hb Helsinki

(σπάνια)

Lys82β Met

Το τετραµερές παρουσιάζει µειωµένη σύνδεση µε το 2,3- διφωσφογλυκερικό

Αυξηµένη συγγένεια για το O2

Ήπια πολυκυτταραιµία (αύξηση του αριθµού των ερυθροκυττάρων)

Hb Titusville

(σπάνια)

Asp94α Asn

Η επιφάνεια επαφής των ετεροδιµερών έχει αλλοιωθεί µε αποτέλεσµα να σταθεροποιείται η κατάσταση Τα

Μειωµένη συγγένεια για το Ο2

Ήπια κυάνωση (βαθύ κυανο-ιώδες χρώµα δέρµατος λόγω πτωχής οξυγόνωσης)

HbM Boston

(σπάνια)

His58α Tyr

Η αντικατάσταση της άπω ιστιδίνης προκαλεί δοµική διαταραχή του θυλάκου της αίµης και µείωση του φαινοµένου Bohr

Σίδηρος αίµης

(µεθαιµοσφαιρίνη)

Κυάνωση του δέρµατος και των βλεννογόνων

HbS

(συχνή)

Glu6β Val

Η αποξυγονωµένη πρωτεΐνη πολυµερίζεται στα µικρά αγγεία

Διαταραχή της διαλυτότητας

Αιµολυτικές και αγγειοαποφρακτικές κρίσεις, έντονος πόνος

Hb Gunn Hill

(σπάνια)

Δ β 91-95 Η διαγραφή µιας κρίσιµης σηµασίας λευκίνης, που είναι απαραίτητη για την επαφή µε την αίµη, οδηγεί σε ατελή αναδίπλωση της πρωτεΐνης

Ασταθής πρωτεΐνη Σχηµατισµός σωµατίων Heinz (έγκλειστα µετουσιωµένης αιµοσφαιρίνης), ίκτερος (κίτρινη χροιά δέρµατος και σκληρού χιτώνα από µεταβολίτες της αίµης), υπέρχρωση ούρων

Hb Agnana

(σπάνια)

β94[+TG]

156 αµνοξέα

Η µετατόπιση πλαισίου προκαλεί επιµήκυνση και σύνθεση µιας ασταθούς και µη λειτουργικής πρωτεΐνης

Παθολογική σύνδεση

Σοβαρή αναιµία και άλλες επιπλοκές, συµβατές µε µεσογειακή αναιµία (µειωµένη σύνθεση ορισµένων πολυπεπτιδικών αλυσίδων)

Η δρεπανοκυτταρική αναιµία είναι µια κληρονοµούµενη χρόνια αιµολυτική νόσος:

Η δρεπανοκυτταρική αναιµία µεταδίδεται γενετικά και οι ασθενείς είναι οµοζυγώτες σε ένα µη φυσιολογικό γονίδιο που βρίσκεται σε αυτοσωµικό χρωµόσωµα. Οι φορείς της ασθένειας κληρονοµούν από τον ένα γονέα το µη φυσιολογικό γονίδιο και από τον άλλο γονέα το

13

φυσιολογικό αλληλόµορφο, και οι ετεροζυγώτες αυτοί συνήθως δεν εµφανίζουν συµπτώµατα της ασθένειας. Ωστόσο ορισµένοι φορείς δεν είναι εντελώς ασυµπτωµατικοί. Η έντονη φυσική άσκηση σε µεγάλο υψόµετρο, τα αεροπορικά ταξίδια και η αναισθησία, εγκυµονούν κινδύνους για τους φορείς του στίγµατος.

Στην δρεπανοκυτταρική αναιµία, µεγάλος αριθµός ερυθροκυττάρων αποκτούν λεπτές και επιµήκεις µορφές σε σχήµα δρεπανιού και ηµισελήνου. Αυτά τα δρεπανοκυτταρικά ερυθροκύτταρα παγιδεύονται σε µικρά αιµοφόρα αγγεία, πράγµα που δυσκολεύει την κυκλοφορία και οδηγεί στην καταστροφή πολλών οργάνων. Τα δρεπανοειδή κύτταρα είναι πιο εύθραυστα από τα κανονικά κύτταρα, αιµολύονται εύκολα και εποµένως έχουν µικρότερη διάρκεια ζωής από ό,τι τα κανονικά κύτταρα και αυτό οδηγεί σε σοβαρή αναιµία. Το χρόνιο χαρακτηριστικό της ασθένειας σηµατοδοτείται από κρίσεις όπου το ποσοστό των δρεπανοκυττάρων είναι ιδιαίτερα υψηλό και κατά τη διάρκεια µιας τέτοιας κρίσης, ο ασθενής µπορεί να βρεθεί σε καταπληξία (σοκ). Μόνο 1% των ερυθροκυττάρων της κυκλοφορίας του ετεροζυγώτη είναι δρεπανοειδή κύτταρα, σε αντίθεση µε το 50% του οµοζυγώτη.

Η διαλυτότητα της δρεπανοκυτταρικής δεοξυ-αιµοσφαιρίνης είναι αφύσικα χαµηλή:

Η αιµοσφαιρίνη των δρεπανοειδών ερυθροκυττάρων δεν είναι φυσιολογική. Η δεοξυγονωµένη µορφή της δρεπανοκυτταρικής αιµοσφαιρίνης έχει αφύσικα χαµηλή διαλυτότητα, µόνο το 4% της διαλυτότητας της φυσιολογικής δεοξυγονωµένης αιµοσφαιρίνης. Όταν ένα πυκνό διάλυµα δρεπανοκυτταρικής αιµοσφαιρίνης δεοξυγονώνεται, δηµιουργείται ένα ινώδες ίζηµα. Αυτό το ίζηµα είναι που αλλάζει τη µορφή των ερυθροκυττάρων και τους προσδίδει σχήµα δρεπανιού. Η δρεπανοκυτταρική αιµοσφαιρίνη ονοµάζεται συνήθως αιµοσφαιρίνη S (HbS), για να διαχωριστεί από την αιµοσφαιρίνη Α (HbA), τη φυσιολογική αιµοσφαιρίνη των ενηλίκων.

Η αιµοσφαιρίνη S έχει ανώµαλη ηλεκτροφορητική κινητικότητα:

Το 1949, ο Linus Pauling και οι συνεργάτες του έψαξαν πειραµατικά τις διαφορές µεταξύ της αιµοσφαιρίνης των φυσιολογικών ατόµων και αυτών που είχαν στίγµα ή δρεπανοκυτταρική αναιµία µε ηλεκτροφόρηση. Βρήκαν ότι το ισοηλεκτρικό σηµείο της δρεπανοκυτταρικής αιµοσφαιρίνης είναι υψηλότερο αυτού της φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης και στην οξυγονωµένη και στη µη οξυγονωµένη µορφή.

Φυσιολογική Δρεπανοκυτταρικής αναιµίας Διαφορά

Οξυαιµοσφαιρίνη 6,87 7,09 0,22

Δεοξυαιµοσφαιρίνη 6,68 6,91 0,23

Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι υπάρχει διαφορά στον αριθµό ή το είδος των ιοντισµένων οµάδων στις δύο αιµοσφαιρίνες. Από την καµπύλη οξεοβασικής τιτλοδότησης της αιµοσφαιρίνης στην περιοχή του pH 7, υπολογίστηκε ότι η µεταβολή κατά µια µονάδα pΗ στο διάλυµα της αιµοσφαιρίνης δηµιουργεί αλλαγή σε 13 φορτία περίπου. Η διαφορά κατά 0,23 στο ισοηλεκτρικό pH εποµένως αντιστοιχεί σε τρία φορτία ανά µόριο αιµοσφαιρίνης. Το συµπέρασµα ήταν ότι η δρεπανοκυτταρική αιµοσφαιρίνη έχει από δύο έως τέσσερα περισσότερα θετικά φορτία ανά µόριο από ό,τι η φυσιολογική αιµοσφαιρίνη.

Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης σε αλκαλικό pΗ, η HbS µετακινείται πιο αργά προς την άνοδο (θετικό ηλεκτρόδιο) από την HbA. Η αλλαγµένη αυτή ικανότητα της HbS οφείλεται στην απουσία του αρνητικά φορτισµένου υπολείµµατος γλουταµικού στις δύο β-αλυσίδες, οπότε η HbS καθίσταται λιγότερο αρνητική από την HbA. Ηλεκτροφόρηση αιµοσφαιρίνης που παίρνουµε από ερυθροκύτταρα που έχουν υποστεί λύση, χρησιµοποιείται κατά κανόνα για τη διάγνωση του δρεπανοκυτταρικού στίγµατος και της δρεπανοκυτταρικής νόσου.

Οι ασθενείς µε δρεπανοκυτταρική αναιµία, οι οποίοι είναι οµοζυγώτες για το γονίδιο της δρεπανοκυττάρωσης, έχουν αιµοσφαιρίνη S αλλά όχι αιµοσφαιρίνη A. Αντίθετα, οι φορείς του στίγµατος, οι οποίοι είναι ετεροζυγώτες για το γονίδιο της δρεπανοκυττάρωσης, έχουν και τα δύο είδη της αιµοσφαιρίνης σε περίπου ίδιες ποσότητες. Εποµένως, η µελέτη του Pauling αποκάλυψε «µια ξεκάθαρη περίπτωση όπου έχουµε αλλαγή σε ένα πρωτεϊνικό µόριο εξαιτίας της αλλαγής ενός µόνο αλληλόµορφου γονιδίου». Αυτή ήταν η πρώτη απόδειξη της ύπαρξης µιας µοριακής ασθένειας.

14

Στη δρεπανοκυτταρική αιµοσφαιρίνη αλλάζει ένα µόνο αµινοξύ στην αλυσίδα βήτα (β):

Αιµοσφαιρίνη Α: Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-

Αιµοσφαιρίνη S: Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-

β 1 2 3 4 5 6 7 8

Η αιµοσφαιρίνη S περιέχει βαλίνη αντί για γλουταµινικό στη θέση 6 της αλυσίδας β.

Συγκεκριµένα, ένα µόριο HbS περιέχει δύο φυσιολογικές αλυσίδες α-γλοβίνης και δύο µεταλλαγµένες αλυσίδες β-γλοβίνης (βs) στις οποίες το γλουταµινικό της θέσης έξι έχει αντικατασταθεί από µία βαλίνη.

Η δρεπανοκυτταρική αιµοσφαιρίνη έχει κολλώδεις περιοχές στην επιφάνειά της:

Η αντικατάσταση του γλουταµινικού από την βαλίνη στη θέση 6 των αλυσίδων β έχει ως αποτέλεσµα να τοποθετείται ένα µη πολικό κατάλοιπο στο εξωτερικό της αιµοσφαιρίνης S, καθώς η πλευρική αλυσίδα της βαλίνης είναι ιδιαίτερα µη πολική, ενώ του γλουταµινικού είναι πολύ πολική. Η αντικατάσταση αυτή ελαττώνει σηµαντικά τη διαλυτότητα της δεοξυγονωµένης αιµοσφαιρίνης S αλλά έχει µικρή σηµασία για τη διαλυτότητα της οξυγονωµένης αιµοσφαιρίνης S.

Η µοριακή βάση της δρεπανοκυττάρωσης µπορεί να αναλυθεί ως εξής:

1. Στην επιφάνεια κάθε µιας από τις αλυσίδες β δηµιουργείται, στην αιµοσφαιρίνη S, µια κολλώδης περιοχή που προκύπτει από την αντικατάσταση γλουταµινικού οξέος από βαλίνη. Αυτή η κολλώδης περιοχή βρίσκεται και στις δυο µορφές οξυ- και δεοξυ- αιµοσφαιρίνης S, αλλά δεν υπάρχει στην αιµοσφαιρίνη Α.

2. Στη γωνία EF κάθε αλυσίδας β της δεοξυαιµοσφαιρίνης S υπάρχει µια υδρόφοβη θέση η οποία είναι συµπληρωµατική στην κολλώδη επιφάνεια. Η συµπληρωµατική θέση σε ένα µόριο δεοξυαιµοσφαιρίνης S µπορεί να δεσµεύεται από την κολλώδη θέση µιας άλλης δεοξυαιµοσφαιρίνης S, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία αλυσίδων µεγάλου µήκους που προκαλούν αλλαγή του σχήµατος των ερυθροκυττάρων.

3. Στην οξυαιµοσφαιρίνη S, η συµπληρωµατική θέση είναι καλυµµένη, η κολλώδης επιφάνεια είναι παρούσα ,αλλά δεν µπορεί να δεσµευθεί σε µια άλλη οξυαιµοσφαιρίνη S γιατί η κολλώδης συµπληρωµατική θέση δεν υπάρχει.

Εποµένως η δρεπανοκυττάρωση εµφανίζεται όταν υπάρχει υψηλή συγκέντρωση δεοξυγονωµένης µορφής της αιµοσφαιρίνης S.

Όταν εµφανίζεται δρεπανοκυττάρωση σε ένα µικρό αιµοφόρο αγγείο, η απόφραξη του αγγείου δηµιουργεί τοπικά µια περιοχή χαµηλής συγκέντρωσης οξυγόνου. Περισσότερη αιµοσφαιρίνη παίρνει τη δεοξυ-µορφή και εποµένως εµφανίζεται περισσότερη δρεπανοκυττάρωση.

Σε µεγάλο υψόµετρο, που τα επίπεδα του οξυγόνου είναι αφύσικα χαµηλά, µπορεί να δηµιουργηθεί δρεπανοκυττάρωση και σε ένα άτοµο µε στίγµα δρεπανοκυττάρωσης, που είναι συνήθως ασυµπτωµατικό.

Η δεοξυαιµοσφαιρίνη S δηµιουργεί επιµήκη ελικοειδή ινίδια:

Η δεοξυαιµοσφαιρίνη S δηµιουργεί ινώδες ίζηµα που αλλάζει το σχήµα των ερυθροκυττάρων και τους δίνει το σχήµα δρεπάνου. Το κύριο ίζηµα αποτελείται από ινίδια που έχουν διάµετρο 215 Å, κάθε ινίδιο από τα οποία εµφανίζεται σαν µία έλικα δεκατεσσάρων αλυσίδων. Ένα σηµαντικό χαρακτηριστικό αυτής της έλικας είναι ότι κάθε µόριο αιµοσφαιρίνης S έρχεται σε επαφή µε τουλάχιστον άλλα 8 µόρια.

Είναι εντυπωσιακό το πειραµατικό εύρηµα ότι η ταχύτητα παραγωγής των ινιδίων είναι ανάλογη της πραγµατικής συγκέντρωσης δεοξυαιµοσφαιρίνης S στη δεκάτη δύναµη, εποµένως ο σχηµατισµός ινιδίων είναι µια πολύ συντονισµένη αντίδραση.

Το υψηλό ποσοστό στίγµατος οφείλεται στην προστασία που προσδίδει ενάντια στην ελονοσία:

Οι ετεροζυγώτες για δρεπανοκυττάρωση διαθέτουν πλεονεκτήµατα, τα οποία δεν εµφανίζονται στους οµοζυγώτες, αλλά ούτε στους φυσιολογικούς οµοζυγώτες. Συγκεκριµένα, οι άνθρωποι µε το στίγµα της δρεπανοκυττάρωσης προστατεύονται από την πιο θανατηφόρα µορφή ελονοσίας. Στην Αφρική η εµφάνιση του γονιδίου δρεπανοκυττάρωσης φτάνει έως και 40% και υπάρχει συσχέτιση µεταξύ της εµφάνισης

15

ελονοσίας και της συχνότητας εµφάνισης του γονιδίου δρεπανοκυττάρωσης στην Αφρική. Αυτό αποτελεί παράδειγµα ισορροπηµένου πολυµορφισµού, καθώς ο ετεροζυγώτης προστατεύεται από την ελονοσία και δεν υποφέρει από τη δρεπανοκυττάρωση, ενώ ο φυσιολογικός οµοζυγώτης είναι ευάλωτος στην ελονοσία.

Στην ελονοσία που προκαλείται από το παράσιτο Plasmodium falciparum, ο οργανισµός αυτός ζει υποχρεωτικά τµήµα του κύκλου ζωής του στα ερυθροκύτταρα. Επειδή τα κύτταρα αυτά σε ετερόζυγα άτοµα για την HbS, όπως και στους οµοζυγώτες, έχουν µικρότερη διάρκεια ζωής από ότι στα φυσιολογικά άτοµα, το παράσιτο δεν µπορεί να ολοκληρώσει αυτό το στάδιο της ανάπτυξής του. Το γεγονός αυτό αποτελεί ένα επιλεκτικό πλεονέκτηµα για τους ετεροζυγώτες που ζουν σε περιοχές όπου η ελονοσία είναι κύρια αιτία θανάτου.

Η νόσος της αιµοσφαιρίνης C:

Όπως η HbS, η HbC είναι µια παραλλαγµένη αιµοσφαιρίνη που εµφανίζει µια µοναδική αντικατάσταση στην έκτη θέση της αλυσίδας της β-γλοβίνης. Στην περίπτωση αυτή, το γλουταµινικό έχει αντικατασταθεί από µια λυσίνη. Ασθενείς οµόζυγοι για την αιµοσφαιρίνη C γενικά εµφανίζουν σχετικά ήπια χρόνια αιµολυτική αναιµία. Οι ασθενείς αυτοί δεν υποφέρουν από εµφραγµατικές κρίσεις και δεν απαιτείται ειδική θεραπεία.

Νόσος της αιµοσφαιρίνης SC:

Στη νόσο αυτή, µερικές αλυσίδες β-γλοβίνης έχουν υποστεί δρεπανοκυτταρική µετάλλαξη, ενώ άλλες αλυσίδες β-γλοβίνης εµφανίζουν τη µετάλλαξη που απαντάται στη νόσο HbC. Ασθενείς µε τη νόσο HbSC είναι διπλά ετερόζυγοι, γιατί αµφότερα τα γονίδιά τους για τη β-γλοβίνη δεν είναι φυσιολογικά, αν και διαφέρουν το ένα από το άλλο. Τα επίπεδα της αιµοσφαιρίνης στη νόσο HbSC τείνουν να είναι υψηλότερα από εκείνα της δρεπανοκυτταρικής αναιµίας και µπορεί να βρίσκονται ακόµα και στα χαµηλά επίπεδα της φυσιολογικής κατάστασης. Η κλινική πορεία των ενηλίκων µε τη νόσο HbSC διαφέρουν από εκείνα της δρεπανοκυτταρικής αναιµίας όπου οι ασθενείς έχουν γενικά οδυνηρές κρίσεις που αρχίζουν από την παιδική ηλικία. Οι ασθενείς της νόσου HbSC εµφανίζουν συχνά καλή υγεία ώσπου να υποστούν κάποια εµφραγµατική κρίση. Η κρίση αυτή εµφανίζεται συχνά µετά από γέννα ή χειρουργική επέµβαση και µπορεί να αποβεί µοιραία.

Οι θαλασσαιµίες είναι γενετικές ανωµαλίες στη σύνθεση της αιµοσφαιρίνης:

Οι θαλασσαιµίες χαρακτηρίζονται από αλλαγές στη σύνθεση µιας ή περισσότερων αλυσίδων αιµοσφαιρίνης. Η αλυσίδα που επηρεάζεται δηλώνεται µε την προσθήκη ενός προσθετικού όπως στην α-θαλασσαιµία. Η ονοµασία αυτή της ασθένειας προέρχεται από τη λέξη «θάλασσα» καθώς παρατηρείται υψηλό ποσοστό εµφάνισης ορισµένων µορφών θαλασσαιµίας µεταξύ των ανθρώπων που ζουν κοντά στη Μεσόγειο θάλασσα. Πράγµατι, σε µέρη της Ιταλίας, περίπου το 20% του πληθυσµού είναι φορείς του γονιδίου αυτής της ασθένειας.

Οι θαλασσαιµίες δηµιουργούνται από πολλές διαφορετικές µεταλλάξεις που οδηγούν στην απώλεια ή την ανώµαλη λειτουργία µίας αλυσίδας αιµοσφαιρίνης µε διαφορετικούς τρόπους:

1. Απώλεια του γονιδίου

2. Το γονίδιο υπάρχει αλλά η σύνθεση ή η επεξεργασία του RNA δεν είναι φυσιολογική. Μεταλλάξεις µέσα στα ιντρόνια ή κοντά στα σηµεία συνόρων ιντρονίων-εξονίων µπορεί να οδηγήσουν σε µη κανονικό µάτισµα του πρωτογενούς µεταγραφήµατος RNA.

3. Το mRNA της αιµοσφαιρίνης παράγεται σε φυσιολογικές ποσότητες αλλά κωδικοποιεί µη φυσιολογική πρωτεΐνη. Για παράδειγµα, µετάλλαξη ενός κωδικονίου αµινοξέος σε κωδικόνιο λήξης έχει ως αποτέλεσµα τον πρόωρο τερµατισµό της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η αποµάκρυνση ή η προσθήκη ενός νουκλεοτιδίου, που ονοµάζεται πλαισιοκινητική µετάλλαξη, οδηγεί σε µια τελείως διαφορετική αλληλουχία αµινοξέων µετά την µετάλλαξη. Οι περισσότερες από αυτές τις αλυσίδες αιµοσφαιρίνης είναι ασταθείς και γρήγορα αποικοδοµούνται.

Οι α-θαλασσαιµίες είναι ανωµαλίες κατά τις οποίες η σύνθεση των αλυσίδων α-σφαιρίνης είναι ελαττωµένη ή ανύπαρκτη. Επειδή το γένωµα κάθε ατόµου περιέχει τέσσερα αντίγραφα του γονιδίου κάθε γλοβίνης, υπάρχουν διάφορα επίπεδα έλλειψης των αλυσίδων α-γλοβίνης. Αν ένα από τα τέσσερα γονίδια είναι ελαττωµατικό, το άτοµο χαρακτηρίζεται ως «σιωπηλός φορέας» της α-θαλασσαιµίας, επειδή δε συµβαίνει καµία σωµατική εκδήλωση της νόσου. Αν δύο γονίδια α-γλοβίνης είναι

16

ελαττωµατικά, το άτοµο θεωρείται ότι φέρει το στίγµα της α-θαλασσαιµίας. Αν τρία είναι ελαττωµατικά, το άτοµο έχει τη νόσο της αιµοσφαιρίνης H, µια ήπια έως µέσης σοβαρότητας αιµολυτική αναιµία. Αν και τα τέσσερα γονίδια της α-γλοβίνης είναι ελαττωµατικά, εµφανίζεται εµβρυϊκός ύδρωψ οπότε το έµβρυο πεθαίνει γιατί οι αλυσίδες της α-γλοβίνης απαιτούνται για τη σύνθεση της HbF.

Στις β-θαλασσαιµίες, η σύνθεση των αλυσίδων της β-γλοβίνης είναι ελαττωµένη ή ανύπαρκτη, ενώ η σύνθεση των αλυσίδων της α-γλοβίνης είναι φυσιολογική. Οι αλυσίδες α-γλοβίνης δεν µπορούν να σχηµατίσουν σταθερά τετραµερή και εποµένως κατακρηµνίζονται, προκαλώντας τον πρόωρο θάνατο των κυττάρων που αρχικά προορίζονταν να γίνουν ώριµα ερυθροκύτταρα. Επειδή υπάρχουν µόνο δύο αντίγραφα κάθε γονιδίου β-γλοβίνης, άτοµα µε ελαττωµατικά γονίδια έχουν είτε στίγµα β-θαλασσαιµίας (ελάσσων β-θαλασσαιµία) αν έχουν µόνο ένα ελαττωµατικό γονίδιο β-γλοβίνης, ή µείζονα β-θαλασσαιµία, αν και τα δύο γονίδια είναι ελαττωµατικά. Επειδή το γονίδιο της β-γλοβίνης δεν εκφράζεται παρά σε προχωρηµένα στάδια της κύησης, οι σωµατικές εκδηλώσεις της β-θαλασσαιµίας εµφανίζονται µόνο µετά τη γέννηση. Τα άτοµα εκείνα µε ελάσσονα β-θαλασσαιµία, παράγουν µερικές β-αλυσίδες και συνήθως δεν απαιτούν ειδική θεραπεία. Αντίθετα, τα βρέφη εκείνα που γεννιούνται µε µείζονα β-θαλασσαιµία είναι φαινοµενικά υγιή κατά τη γέννηση, αλλά γίνονται σοβαρά αναιµικά συνήθως κατά τη διάρκεια του πρώτου ή του δεύτερου έτους της ζωής τους. Οι ασθενείς αυτοί απαιτούν τακτικές µεταγγίσεις αίµατος.

2-16. Μοριακή παθολογία της αιµοσφαιρίνης:

Με την εξέταση ασθενών µε κλινικά συµπτώµατα και ηλεκτροφορητική ανάλυση σε φυσιολογικούς πληθυσµούς, έχουν ανακαλυφθεί περισσότερες από τρείς χιλιάδες διαφορετικές ανώµαλες αιµοσφαιρίνες. Οι περισσότερες ανώµαλες αιµοσφαιρίνες δεν δίνουν ιδιαίτερα πλεονεκτήµατα σε ένα άτοµο και είναι σχεδόν πάντα ουδέτερες ή επικίνδυνες. Οι ανώµαλες αιµοσφαιρίνες είναι διαφορετικών τύπων:

1. Αλλαγές στην εξωτερική επιφάνεια. Με εξαίρεση την αιµοσφαιρίνη S, σχεδόν όλες οι αντικαταστάσεις στην επιφάνεια του µορίου της αιµοσφαιρίνης είναι ακίνδυνες.

2. Αλλαγές στο ενεργό κέντρο. Η ελαττωµατική υποµονάδα δεν µπορεί να δεσµεύσει οξυγόνο, λόγω της δοµικής αλλαγής κοντά στην αίµη, που επηρεάζει άµεσα τη δέσµευση του οξυγόνου. Για παράδειγµα, αντικατάσταση της ιστιδίνης από τυροσίνη στην εγγύς ή τη µακρινή θέση ως προς την αίµη σταθεροποιεί τη σιδηρι-µορφή που δεν µπορεί πια να δεσµεύει οξυγόνο. Το οξυγόνο της πλευρικής αλυσίδας της τυροσίνης σχηµατίζει ιοντικό δεσµό µε το σιδηρι-ιόν της αίµης. Μεταλλαγµένες αιµοσφαιρίνες που χαρακτηρίζονται από µόνιµη σιδηρι-κατάσταση για τα δύο µόρια της αίµης ονοµάζονται αιµοσφαιρίνες Μ. Το γράµµα Μ καθορίζει ότι οι αλλαγµένες πλευρικές αλυσίδες βρίσκονται στη µορφή µεθαιµοσφαιρίνης (σιδηρι-αιµοσφαιρίνης). Αυτοί οι ασθενείς εµφανίζουν συνήθως κυάνωση. Η ασθένεια έχει βρεθεί µόνο σε ετεροζυγώτες, γιατί οι οµοζυγώτες δεν επιβιώνουν.

3. Αλλαγές στη τριτοταγή δοµή. Η αντικατάσταση ενός αµινοξέος παρεµποδίζει την πολυπεπτιδική αλυσίδα από το να αποκτήσει τη φυσιολογική της διαµόρφωση. Αυτές οι αιµοσφαιρίνες είναι συνήθως ασταθείς. Για παράδειγµα, στην αιµοσφαιρίνη Hammersmith, η φαινυλαλανίνη στη CD1, δίπλα στην αίµη, αντικαθίσταται από σερίνη. Η συγγένεια αυτής της αιµοσφαιρίνης για την αίµη της είναι πολύ χαµηλότερη από τη φυσιολογική. Αντικαταστάσεις αµινοξέων σε θέσεις µακριά από την αίµη, µπορούν επίσης να παρεµποδίσουν την αιµοσφαιρίνη από το να αναδιπλώνεται στη φυσική της διάταξη. Μια αντιπροσωπευτική µετάλλαξη είναι η αιµοσφαιρίνη Riverdale-Bronx, που είναι αργινίνη στη θέση της γλυκίνης στη Β6. αυτή η µεταλλαγµένη αιµοσφαιρίνη δεν αναδιπλώνεται φυσιολογικά επειδή η αργινίνη στη Β6 είναι πολύ µεγάλη για να ταιριάζει στο στενό χώρο µεταξύ των ελίκων Β και Ε.

4. Αλλαγές στη τεταρτοταγή δοµή. Μερικές µεταλλάξεις στα σηµεία επαφής των υποµονάδων οδηγούν σε απώλεια των αλλοστερικών ιδιοτήτων. Αυτές οι αιµοσφαιρίνες συνήθως έχουν ανώµαλη συγγένεια για το οξυγόνο. Η περιοχή επαφής α1β2 που αλλάζει ουσιαστικά κατά την οξυγόνωση, είναι ιδιαίτερα ευάλωτη στις επιδράσεις µεταλλάξεων.

17

3. Συµπεράσµατα: Η αιµοσφαιρίνη βρίσκεται αποκλειστικά στα ερυθροκύτταρα, όπου η κύρια λειτουργία της είναι να µεταφέρει οξυγόνο από τους πνεύµονες στα τριχοειδή των ιστών. Η αιµοσφαιρίνη Α είναι η κύρια αιµοσφαιρίνη στους ενήλικες και αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, δύο α και δύο β, που συγκρατούνται µεταξύ τους µε µη οµοιοπολικές αλληλεπιδράσεις. Κάθε υποµονάδα έχει τµήµατα µε δοµή α-έλικας και µια κοιλότητα για την πρόσδεση της αίµης.

Η αιµοσφαιρίνη µπορεί να προσδέσει ένα µόριο οξυγόνου σε κάθε µια από τις τέσσερις οµάδες αίµης. Ο βαθµός κορεσµού των θέσεων πρόσδεσης οξυγόνου σε ολόκληρο το µόριο της αιµοσφαιρίνης, µπορεί να ποικίλει από µηδέν έως 100%, αν όλες οι θέσεις είναι κατειληµµένες. Η καµπύλη διάστασης του οξυγόνου για την αιµοσφαιρίνη είναι σιγµοειδής, δείχνοντας ότι οι υποµονάδες συνεργάζονται κατά την πρόσληψη του οξυγόνου, σύµφωνα µε το φαινόµενο της αλληλεπίδραση αίµης-αίµης.

Η ικανότητα της αιµοσφαιρίνης να προσδένει το οξυγόνο αντιστρεπτά επηρεάζεται από την pΟ2, το pH του περιβάλλοντος, την pCO2 και τη διαθεσιµότητα του 2,3-διφωσφογλυκερικού, και οι επηρεαστές αυτοί ονοµάζονται αλλοστερικοί, καθώς οι επιδράσεις τους σε µια περιοχή του µορίου της αιµοσφαιρίνης επηρεάζει την πρόσδεση οξυγόνου από οµάδα αίµης σε διαφορετική περιοχή του µορίου.

Η ανθρώπινη αιµοσφαιρίνη HbA είναι µόνο ένα µέλος µιας οικογένειας λειτουργικά και δοµικά συναφών πρωτεϊνών, των αιµοσφαιρινών. Μερικές αιµοσφαιρίνες, όπως η HbF, που έχει δοµή α2γ2, συντίθεται φυσιολογικά µόνο κατά τη διάρκεια της εµβρυϊκής ανάπτυξης, ενώ άλλες όπως η HbA2 συντίθενται στους ενήλικες, αν και σε χαµηλά επίπεδα σε σύγκριση µε την ΗbΑ.

Οι αιµοσφαιρινοπάθειες αποτελούν µια οικογένεια ανωµαλιών που προκαλούνται είτε από την παραγωγή ενός δοµικά ανώµαλου µορίου αιµοσφαιρίνης, ή από τη σύνθεση ανεπαρκών ποσοτήτων φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης ή και από τα δυο. Η δρεπανοκυτταρική αναιµία HbS, η νόσος της αιµοσφαιρίνης C HbC και τα σύνδροµα της θαλασσαιµίας είναι αντιπροσωπευτικοί τύποι αιµοσφαιρινοπαθειών που µπορεί να παρουσιάσουν σοβαρές κλινικές συνέπειες. Οι πρώτες δύο καταστάσεις, προκαλούνται από την παραγωγή αιµοσφαιρίνης µε διαφορετική αλληλουχία αµινοξέων, ενώ οι θαλασσαιµίες προκαλούνται από την ελαττωµένη παραγωγή φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης.

Οι µεταλλαγµένες αιµοσφαιρίνες, µπορούν να ταξινοµηθούν ανάλογα µε το τύπο της δοµικής µεταβολής, τη διαταραχή της λειτουργίας και τα κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου που προκαλούν. Ενώ πολλές από αυτές τις µεταλλαγµένες µορφές εκδηλώνουν φαινοτύπους που µπορούν να προβλεφθούν, υπάρχουν µερικές µεταλλάξεις µε πλειοτροπική επίδραση σε πολλές από τις ιδιότητες του µορίου της αιµοσφαιρίνης. Με λίγες εξαιρέσεις, οι παραλλαγές της αιµοσφαιρίνης κληρονοµούνται ως αυτοσωµατικά υπολειπόµενα χαρακτηριστικά. Σε µερικές περιπτώσεις εντοπίζονται διπλοί ετεροζυγώτες.

Στη δρεπανοκυτταρική αναιµία, που είναι µια οµόζυγη διαταραχή υπολειπόµενου χαρακτήρα , η µεταλλαγµένη αιµοσφαιρίνη HbS περιέχει βαλίνη αντί για γλουταµινικό στη θέση 6 της αλυσίδας β, έτσι ένα µόριο HbS περιέχει δύο φυσιολογικές αλυσίδες α-γλοβίνης και δύο µεταλλαγµένες αλυσίδες β-γλοβίνης (βs) στις οποίες το γλουταµινικό της θέσης έξι έχει αντικατασταθεί από µία βαλίνη. Τα άτοµα µε ετερόζυγη δρεπανοκυτταρική αναιµία χαρακτηρίζονται από αυξηµένη αντίσταση στην προσβολή από ελονοσία.

4. Βιβλιογραφία: 1. Γρηγόρης Διαµαντίδης, Εισαγωγή στη Βιοχηµεία, University studio press.

2. Baynes- Dominiczak, Ιατρική Βιοχηµεία, Εκδόσεις επιστηµονικές: Παρισιάνου Α.Ε., Επιµέλεια: Α. Καλοφούτης.

3. Dawn B. Marks- Allan D. Marks- Colleen M. Smith, Ιατρική Βιοχηµεία-κλινική προσέγγιση, Ιατρικές εκδόσεις: Π.Χ. Πασχαλίδης.

4. Lubert Stryer (1997), Βιοχηµεία, Πανεπιστηµιακές εκδόσεις Κρήτης.

5. Pamela C. Champe/ Richard A. Harvey, Βιοχηµεία, Επιστηµονικές εκδόσεις «Γρ. Παρισιάνος», Μετάφραση: Άρης Γεωργόπουλος, Ράνη Σβάρνα. Εικονογραφηµένες ανασκοπήσεις του Lippincott.

6. Alberts/ Bray/ Hopkin/ Johnson/ Lewis/ Raff/ Roberts/ Walter, βασικές αρχές Κυτταρικής Βιολογίας (2η έκδοση) τόµος Ι, ιατρικές εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης.

18

7. Walter F. Boron/ Emile L. Boulpaep, Ιατρική φυσιολογία κυτταρική και µοριακή προσέγγιση Τόµοι ΙΙ&ΙΙΙ, Ιατρικές εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης.