1

ΜΕΡΟΣ ΙII: ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝΚΕΦΑΛΑΙΟ 9

Ο Πυρήνας

ΕΙΣΑΓΩΓΗΗ παρουσία πυρήνα είναι το βασικό γνώρισμα που διαφοροποιεί τα ευκαρυωτικά κύτταρα από ταπροκαρυωτικά. Στεγάζοντας το γονιδίωμα του κυττάρου, ο πυρήνας χρησιμεύει ως χώροςαποθήκευσης της γενετικής πληροφορίας και ως κέντρο ελέγχου για το κύτταρο. Στον πυρήναγίνεται η αντιγραφή του DNA, η μεταγραφή, καθώς και η ωρίμανση του RNA, ενώ στοκυτταρόπλασμα λαμβάνει χώρα μόνο το τελικό στάδιο της γονιδιακής έκφρασης (η μετάφραση).

Ο διαχωρισμός του γονιδιώματος από το κυτταρόπλασμα, που γίνεται με τον πυρηνικό φάκελο,επιτρέπει τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω μηχανισμών που απαντώνται αποκλειστικάστους ευκαρυώτες. Ενώ στους προκαρυώτες το mRNA μεταφράζεται όσο η μεταγραφή τουβρίσκεται ακόμη σε εξέλιξη, το mRNA των ευκαρυωτών υπόκειται σε αρκετές μορφές μετα-μεταγραφικής επεξεργασίας προτού μεταφερθεί από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Επομένως,η παρουσία του πυρήνα επιτρέπει τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω μετα-μεταγραφικώνμηχανισμών, όπως είναι το εναλλακτικό μάτισμα. Περιορίζοντας την πρόσβαση επιλεγμένωνπρωτεϊνών στο γενετικό υλικό, ο πυρηνικός φάκελος προσφέρει επίσης νέες ευκαιρίες για έλεγχοτης γονιδιακής έκφρασης στο επίπεδο της μεταγραφής. Για παράδειγμα, η έκφραση ορισμένωνευκαρυωτικών γονιδίων ελέγχεται από τη ρυθμιζόμενη μεταφορά μεταγραφικών παραγόντων απότο κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, η οποία είναι μια μορφή μεταγραφικής ρύθμισης που δεδιαθέτουν οι προκαρυώτες. Ο διαχωρισμός επομένως της θέσης του γονιδιώματος από τη θέσηόπου πραγματοποιείται η μετάφραση του mRNA έχει κεντρικό ρόλο στη γονιδιακή έκφραση τωνευκαρυωτών.

9.1. Ο πυρηνικός φάκελος και η κυκλοφορία μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και τοκυτταρόπλασμαΟ πυρηνικός φάκελος διαχωρίζει τα περιεχόμενα του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα καισυγκροτεί το δομικό πλαίσιο του πυρήνα. Οι δύο μεμβράνες του πυρηνικού φακέλου δρουν ωςφραγμοί που εμποδίζουν την ελεύθερη διέλευση μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και τοκυτταρόπλασμα, με αποτέλεσμα ο πυρήνας να συνιστά ένα διακριτό βιοχημικό διαμέρισμα. Οιμόνοι δίαυλοι που διαπερνούν τον πυρηνικό φάκελο είναι τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, ταοποία επιτρέπουν τη ρυθμιζόμενη ανταλλαγή μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και τοκυτταρόπλασμα. Η επιλεκτική διακίνηση πρωτεϊνών και RNA μέσω των πυρηνικών πόρων αφενόςκαθορίζει την εσωτερική σύσταση του πυρήνα και αφετέρου έχει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση τηςγονιδιακής έκφρασης των ευκαρυωτών.

Η δομή του πυρηνικού φακέλουΟ πυρηνικός φάκελος (nuclear envelope) έχει πολύπλοκη δομή. Αποτελείται από δύο πυρηνικέςμεμβράνες την πυρηνική λάμινα (nuclear lamina), η οποία τον επενδύει εσωτερικά, και τασύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (Εικ. 9.1). Ο πυρήνας περιβάλλεται από ένα σύστημα δύοομόκεντρων μεμβρανών, που ονομάζονται εσωτερική και εξωτερική πυρηνική μεμβράνη (internaland external nuclear membrane). Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη αποτελεί συνέχεια τουενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ), με συνέπεια ο χώρος ανάμεσα στην εσωτερική και την εξωτερικήπυρηνική μεμβράνη να συνδέεται άμεσα με τον αυλό του ενδοπλασματικού δικτύου. Η εξωτερικήπυρηνική μεμβράνη είναι λειτουργικά όμοια με τις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου καιφέρει ριβοσώματα στην κυτταροπλασματική της επιφάνεια, διαφέρει όμως σε μικρό βαθμό ωςπρος την πρωτεϊνική της σύσταση, καθώς είναι πλούσια σε μεμβρανικές πρωτεΐνες πουπροσδένονται στον κυτταροσκελετό και δε διαθέτει τις πρωτεΐνες που προσδίδουν στο ΕΔ τησωληνοειδή του οργάνωση. Αντίθετα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη φέρει πρωτεΐνες πουεντοπίζονται αποκλειστικά στον πυρήνα, όπως είναι οι πρωτεΐνες που προσδένονται στηνπυρηνικά λάμινα.

Ευάγγελος Κωλέττας, B.Sc (HONS), Ph.D.(LON)Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο ΒιολογίαςΙατρική Σχολή, Παν/μιο Ιωαννίνων

2

ΕΙΚΟΝΑ 9.1: Ο πυρηνικός φάκελος. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει:(Α) έναν πυρήνα. Η εσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη ενώνονται στα σύμπλοκα τωνπυρηνικών πόρων (βέλη), και(Β) τη συνέχεια της εξωτερικής πυρηνικής μεμβράνης με το ενδοπλασματικό δίκτυο.(Γ) Σχηματική αναπαράσταση του πυρηνικού φακέλου. Η εσωτερική πυρηνική μεμβράνηεπενδύεται από την πυρηνική λάμινα, η οποία χρησιμεύει ως θέση προσάρτησης της χρωματίνης.

Η λειτουργία των πυρηνικών μεμβρανών είναι ζωτικής σημασίας, καθώς δρουν ως έναφραγμός που διαχωρίζει το περιεχόμενο του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα. Όπως όλεςοι κυτταρικές μεμβράνες, κάθε πυρηνική μεμβράνη είναι μια φωσφολιπιδική διπλοστιβάδαδιαπερατή μόνο από μικρά μη πολικά μόρια.

Άλλα μόρια δεν μπορούν να διαπεράσουν τη διπλοστιβάδα με διάχυση. Η εσωτερική καιη εξωτερική πυρηνική μεμβράνη ενώνονται στα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, πουείναι οι μοναδικοί δίαυλοι μέσω των οποίων μπορούν να διαπεράσουν τον πυρηνικόφάκελο μικρά πολικά μόρια και μακρομόρια (Εικ. 9.2). Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρουείναι μια πολύπλοκη δομή που ευθύνεται για την επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών και RNAανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα.

3

ΕΙΚΟΝΑ 9.2: Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει πυρηνικούς πόρους.Σε αυτό το παρασκεύασμα πυρηνικού φακέλου που έχει υποστεί τεμαχισμό υπό ψύξη διακρίνονταιπολλοί πυρηνικοί πόροι (βέλη).

Η πυρηνοπλασματική επιφάνεια της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης επενδύεται από τηνπυρηνική λάμινα (nuclear lamina), ένα ινώδες δίχτυ που παρέχει στον πυρήνα δομική στήριξη (Εικ.9.3).

Η πυρηνική λάμινα αποτελείται από ινώδεις πρωτεΐνες μοριακής μάζας 60 έως 80 kDa πουονομάζονται λαμίνες (lamins) καθώς και από τις πρωτεΐνες που συνδέονται με αυτές. Οι λαμίνεςείναι μια κατηγορία πρωτεϊνών των ενδιάμεσων ινιδίων. Οι άλλες κατηγορίες πρωτεϊνών τωνενδιάμεσων ινιδίων συναντώνται στον κυτταροσκελετό. Τα κύτταρα των θηλαστικών διαθέτουν τρίαγονίδια για τις λαμίνες, τα Α/C, Β1 και B2, που κωδικοποιούν τουλάχιστον επτά διακριτέςπρωτεΐνες.

ΕΙΚΟΝΑ 9.3: Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει την πυρηνική λάμινα. Ηλάμινα είναι ένα δίκτυο ινιδίων που βρίσκεται κάτω από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη καιεκτείνεται στο εσωτερικό του πυρήνα [Aebi Α, Cohn J. Buhle L & Gerace L (1986) Nature 323:560].

Σημείωση: Ο κυτταροσκελετός (cytoskeleton) αποτελείται από ένα σύστημα ινιδίων: τα λεπτά ινίδιαή ινίδια ακτίνης (actin filaments) πάχους 7-10 nm, τα παχύτερα ινίδια, τους μικροσωληνίσκους(microtubules) (25 nm) και τα ενδιάμεσα ινίδια (intermediate filaments), ινίδια με ενδιάμεσο πάχος10-12 nm.

4

Πυρηνικές λαμίνες, ινώδεις πρωτεΐνες ΜΒ 60-80 kDa, που σχηματίζουν ενδιάμεσα ινίδια τύπου V,πάχους 10-12 nm.

Δύο τύποι πυρηνικών λαμινών με όμοια δομή που κωδικοποιούνται από 3 γονίδια:● Λαμίνες τύπου Α: A, C, C2 και ΑΔ10 που κωδικοποιούνται από το γονίδιο A/C (LMNA) καιπροκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα. Οι λαμίνες A και C είναι οι κύριοι τύποι, ενώ η C2 εκφράζεταιστους όρχεις και η ΑΔ10 στα σωματικά κύτταρα με άγνωστο ρόλο.● Λαμίνες τύπου Β: B1, B2 και B3 που κωδικοποιούνται από τα γονίδια Β1 (LMNB1) και B2(LMNB2). Η λαμίνη B3 εκφράζεται στους όρχεις και κωδικοποιείται από το γονίδιο LMNB2εναλλακτικό μάτισμα.

Οι λαμίνες φέρουν μια μικρή Ν-τελική περιοχή 10-20 καταλοίπων, την κεφαλή, μια κεντρική α-ελικοειδή επικράτεια που περιέχει 4 περιοχές 1Α, 1Β, 2Α και 2Β σπειρωμένου σπειράματος πουδιαχωρίζονται από τις συνδετικές περιοχές L1, L12 και L2, και μια μεγάλη C-τελική περιοχή (ουρά)που φέρει μια Ig σφαιρική επικράτεια και ένα διατηρημένο πλαίσιο CAAX (όπου C, cys) πουυπόκειται φαρνεσυλίωση.

Οι λαμίνες, όπως και άλλες πρωτεΐνες των ενδιάμεσων ινιδίων, συνδέονται μεταξύ τουςσχηματίζοντας δομές με υψηλότερο βαθμό οργάνωσης (Εικ. 9.4), αν και θεωρείται ότι η σύνδεσητων λαμινών διαφέρει σε έκταση και πολικότητα από αυτήν που συναντάται σε άλλα ενδιάμεσαινίδια. Το πρώτο στάδιο σύνδεσης των λαμινών είναι η αλληλεπίδραση δύο λαμινών που οδηγείστον σχηματισμό ενός διμερούς. Στο διμερές αυτό, οι περιοχές α-έλικας των δύο πολυπεπτιδικώναλυσίδων τυλίγονται η μία γύρω από την άλλη σχηματίζοντας μια δομή που ονομάζεταισπειρωμένο σπείραμα (coiled coil). Στη συνέχεια, τα διμερή λαμίνης συνδέονται μεταξύ τουςσχηματίζοντας την πυρηνική λάμινα.

5

ΕΙΚΟΝΑ 9.4: Μοντέλο συναρμολόγησης των λαμινών. Τα πολυπεπτίδια λαμίνης σχηματίζουνδιμερή στα οποία οι κεντρικές περιοχές α-έλικας δύο πολυπεπτιδικών αλυσίδων τυλίγονται η μίαγύρω από την άλλη. Στην περαιτέρω συναρμολόγηση μπορεί να συνεισφέρουν η κατά σειράσύνδεση των διμερών, με την οποία σχηματίζονται γραμμικά πολυμερή, και η πλευρική σύνδεσητων πολυμερών, με την οποία σχηματίζονται δομές υψηλότερης οργάνωσης.

Η σύνδεση των λαμινών με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη διευκολύνεται από τη μετα-μεταφραστική προσθήκη λιπιδίων - πρενυλίωση των καρβοξυτελικών καταλοίπων κυστεΐνηςΕπιπλέον, οι λαμίνες προσδένονται σε ειδικές πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης,όπως είναι η εμερίνη και ο υποδοχέας της λαμίνης Β, μεσολαβώντας στην πρόσδεση τους στονπυρηνικό φάκελο και συμβάλλοντας στην τοποθέτηση και στην οργάνωση τους μέσα στον πυρήνα(Εικ. 9.5). Η πυρηνική λάμινα προσδένεται επίσης στη χρωματίνη μέσω των ιστονών Η2Α καιΗ2Β, καθώς και μέσω άλλων πρωτεϊνών της χρωματίνης. Αν και η πυρηνική λάμινα προσδένεταιάμεσα στο DNA, δεν έχει διευκρινιστεί κατά πόσο αυτή η αλληλεπίδραση είναι σημαντική για τοκύτταρο. Επιπρόσθετα, οι λαμίνες σχηματίζουν ένα χαλαρό δίχτυ που εκτείνεται σε ολόκληρο τοεσωτερικό του πυρήνα. Στις λαμίνες προσδένονται πολλές πυρηνικές πρωτεΐνες που συμμετέχουνστη σύνθεση του DNA, στη μεταγραφή ή στην τροποποίηση της χρωματίνης, παρόλο που ησημασία αυτών των αλληλεπιδράσεων μόλις έχει αρχίσει να κατανοείται.

ΕΙΚΟΝΑ 9.5: Ηπυρηνική λάμινα. Ηεσωτερική πυρηνικήμεμβράνη περιέχειαρκετές διαμεμβρανικέςπρωτεΐνες, όπως είναι ηεμερίνη και ο υποδοχέαςτης λαμίνης Β (LBR,Lamin B Receptor), πουαλληλεπιδρούν με τιςλαμίνες του πυρήνα. Οιλαμίνες και οι πρωτεΐνεςπου συνδέονται μεαυτές αλληλεπιδρούνεπίσης με τη χρωματίνη.

6

Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρουΤα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (nuclear pore complexes) είναι οι μόνοι δίαυλοι πουεπιτρέπουν τη μεταφορά μικρών πολικών μορίων, ιόντων και μακρομορίων (πρωτεϊνών και RNA)ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Πρόκειται για εξαιρετικά ευμεγέθεις δομές μεδιάμετρο περίπου 120 nm και εκτιμώμενη μοριακή μάζα ~125x103 kDa, δηλαδή μέγεθος 30 φορέςμεγαλύτερο από το μέγεθος ενός ριβοσώματος. Στα σπονδυλωτά, το σύμπλοκο του πυρηνικούπόρου αποτελείται από περίπου 30 διαφορετικές πρωτεΐνες που ονομάζονται νουκλεοπορίνες, οιπερισσότερες από τις οποίες είναι παρούσες σε πολυάριθμα αντίγραφα. Το σύμπλοκο τουπυρηνικού πόρου έχει θεμελιώδη ρόλο στη φυσιολογία όλων των ευκαρυωτικών κυττάρων, καθώςελέγχει τη διακίνηση μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Τα μόρια RNA πουσυντίθενται στον πυρήνα εξάγονται στο κυτταρόπλασμα, προκειμένου να λάβουν μέρος στηνπρωτεϊνοσύνθεση. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες που απαιτούνται για τη λειτουργία του πυρήνα (π.χ.μεταγραφικοί παράγοντες) θα πρέπει να μεταφερθούν από το κυτταρόπλασμα, όπου γίνεται ησύνθεση τους, στον πυρήνα. Επιπρόσθετα, πολλές πρωτεΐνες παλινδρομούν συνεχώς (shuttle)ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα.

Η μεταφορά μορίων μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου μπορεί να γίνει με δύοδιαφορετικούς μηχανισμούς, ανάλογα με το μέγεθος των μορίων (Εικ. 9.6):

Τα μικρά μόρια και μερικές πρωτεΐνες μοριακής μάζας μικρότερης των 20-40 kDa διέρχονταιελεύθερα από τον πόρο προς οποιαδήποτε από τις δύο κατευθύνσεις: από το κυτταρόπλασμαπρος τον πυρήνα ή από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα. Αυτά τα μόρια περνούν με παθητικήδιάχυση από το υδατικό μέσο ανοικτών διαύλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου, πουεκτιμάται ότι έχουν διάμετρο ~9 nm.

Ωστόσο, οι περισσότερες πρωτεΐνες και τα περισσότερα μόρια RNA δεν μπορούν να περάσουναπό αυτούς τους ανοικτούς διαύλους. Τα μεγαλύτερα αυτά μακρομόρια περνούν από τον κεντρικόδίαυλο του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου, που έχει διάμετρο ~10-40 nm, με μια ενεργήδιεργασία κατά την οποία κατάλληλες πρωτεΐνες και RNA αναγνωρίζονται και μεταφέρονταιεπιλεκτικά προς μία συγκεκριμένη κατεύθυνση (είτε από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα είτεαπό το κυτταρόπλασμα προς τον πυρήνα).

ΕΙΚΟΝΑ 9.6: Κυκλοφορία μορίων μέσω των συμπλόκων των πυρηνικών πόρων. Τα μικράμόρια μπορούν να διέλθουν ταχύτατα, με παθητική διάχυση, από ανοικτούς διαύλους τουσυμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Αντίθετα, τα μακρομόρια (πρωτεΐνες και RNA) μεταφέρονται μεέναν επιλεκτικό μηχανισμό που απαιτεί κατανάλωση ενέργειας.

μικρά μόριακαι πρωτεΐνεςMB<20-40 kDa

ΠρωτεΐνεςMB>40 kDκαι μόρια RNA

7

Η απεικόνιση των συμπλοκών των πυρηνικών πόρων με ηλεκτρονική μικροσκοπίααποκαλύπτει μια δομή με οκταπλή συμμετρία, οργανωμένη γύρω από έναν μεγάλο κεντρικόδίαυλο (Εικ. 9.7). Ο κεντρικός αυτός δίαυλος αποτελεί την οδό μέσω της οποίας διασχίζουν τονπυρηνικό φάκελο οι πρωτεΐνες και τα RNA.

ΕΙΚΟΝΑ 9.7: Φωτογραφίαηλεκτρονικού μικροσκοπίου πουδείχνει σύμπλοκα πυρηνικών πόρων.Στην κάτοψη αυτή διακρίνονταιμεμονωμένα σύμπλοκα πυρηνικώνπόρων, τα οποία αποτελούνται από οκτώδομικές υπομονάδες που περιβάλλουνέναν κεντρικό δίαυλο.

Λεπτομερείς δομικές μελέτες, όπως η ανάλυση εικόνας βάσει υπολογιστή, έχουν οδηγήσει στηνανάπτυξη τρισδιάστατων δομικών μοντέλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου (Εικ. 9.8).Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου αποτελείται από 8 ακτίνεςδιατεταγμένες γύρω από έναν κεντρικό δίαυλο. Οι 8 ακτίνες συνδέονται με δακτυλίους στηνπυρηνική και στην κυτταροπλασματική επιφάνεια, συγκροτώντας μια δομή που βρίσκεταιαγκυροβολημένη στο εσωτερικό του πυρηνικού φακέλου σε θέσεις όπου συνενώνονται ηεσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη. Ινίδια πρωτεϊνών εκτείνονται τόσο από τονκυτταροπλασματικά όσο και από τον πυρηνικό δακτύλιο, σχηματίζοντας μια διακριτή καλαθοειδήδομή στην πλευρά του πυρήνα.

ΕΙΚΟΝΑ 9.8: Μοντέλο του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Το σύμπλοκο: αποτελείται απόένα συγκρότημα οκτώ ακτίνων προσδεδεμένων σε δακτυλίους στην κυτταροπλασματική και στηνπυρηνική πλευρά του πυρηνικού φακέλου. Το συγκρότημα δακτυλίων-ακτίνων περιβάλλει ένανκεντρικό δίαυλο. Από τον κυτταροπλασματικό δακτύλιο εκτείνονται κυτταροπλασματικά ινίδια, ενώαπό τον πυρηνικό δακτύλιο εκτείνονται ινίδια που σχηματίζουν τον πυρηνικό κάλαθο.

8

9

Επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών από και προς τον πυρήναΚάθε λεπτό μεταφέρονται επιλεκτικά μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος αρκετά εκατομμύριαμακρομόρια. Η βάση αυτής της επιλεκτικής κυκλοφορίας μορίων μέσω του πυρηνικού φακέλου έχεικατανοηθεί καλύτερα για πρωτεΐνες που εισάγονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Τέτοιουείδους πρωτεΐνες καλύπτουν όλες τις πτυχές της δομής και της λειτουργίας του γονιδιώματος καιείναι, για παράδειγμα, ιστόνες, DNA πολυμεράσες, RNA πολυμεράσες, μεταγραφικοί παράγοντες,παράγοντες ματίσματος και πολλές άλλες πρωτεΐνες. Η στόχευση αυτών των πρωτεϊνών στονπυρήνα γίνεται μέσω ειδικών αλληλουχιών αμινοξέων που ονομάζονται σήματα πυρηνικούεντοπισμού (NLS; Nuclear Localisation Signals), που αναγνωρίζονται από υποδοχείς πυρηνικήςμεταφοράς (nuclear transport receptors) και κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών μέσω τουσυμπλόκου του πυρηνικού πόρου.

Το πρώτο σήμα πυρηνικού εντοπισμού που έχει χαρτογραφηθεί λεπτομερώς χαρακτηρίστηκεαπό τον Alan Smith και τους συνεργάτες του το 1984. Αυτοί οι ερευνητές μελέτησαν το αντιγόνο Ττου ιού SV40 (Simian Virus 40) των πιθήκων, μια πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονιδίωματου ιού SV40 και προωθεί την έναρξη της αντιγραφής του ιικού DNA σε κύτταρα που έχουνμολυνθεί με αυτόν τον ιό . Όπως αναμενόταν, εφόσον πρόκειται για μια πρωτεΐνη αντιγραφής, ηφυσική θέση εντόπισης του αντιγόνου Τ βρέθηκε ότι είναι πυρηνική. Ωστόσο, η μετάλλαξη ενός καιμόνο καταλοίπου λυσίνης εμποδίζει την εισαγωγή του αντιγόνου Τ στον πυρήνα και οδηγεί σεσυσσώρευση του στο κυτταρόπλασμα. Αυτή η παρατήρηση, σε συνδυασμό με άλλες μελέτες πουακολούθησαν, οδήγησε στην ταυτοποίηση του σήματος πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ,που αντιστοιχεί στην αλληλουχία επτά αμινοξέων Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val. Αυτή ηαλληλουχία βρέθηκε ότι: (α) είναι αναγκαία για τη μεταφορά του αντιγόνου Τ στον πυρήνα, και (β)όταν ενσωματώνεται σε άλλες πρωτεΐνες που έχουν ως φυσική θέση εντόπισης τους τοκυτταρόπλασμα, είναι ικανή να τις κατευθύνει και να οδηγήσει σε συσσώρευση τους στον πυρήνα.

Σήματα πυρηνικού εντοπισμού έχουν πλέον ταυτοποιηθεί σε πολλές πρωτεΐνες. Ορισμένες απόαυτές τις αλληλουχίες-σήματα, όπως είναι η αλληλουχία του αντιγόνου Τ, έχουν μικρή έκταση καιείναι πλούσιες σε βασικά αμινοξέα (όπως λυσίνη και αργινίνη). Συχνά όμως τα αμινοξέα πουσχηματίζουν το σήμα πυρηνικού εντοπισμού βρίσκονται κοντά το ένα στο άλλο, αλλά δεν είναιδιαδοχικά μεταξύ τους. Για παράδειγμα, το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της νουκλεοπλασμίνης(μιας πρωτεΐνης που συμμετέχει στη συγκρότηση της χρωματίνης) αποτελείται από δύο μέρη: έναζεύγος Lys-Arg και 4 κατάλοιπα λυσίνης που ακολουθούν έπειτα από ένα μεσοδιάστημα δέκααμινοξέων (Εικ. 9.9). Τόσο η αλληλουχία Lys-Arg, όσο και η αλληλουχία Lys-Lys-Lys-Lys είναιαπαραίτητες για την πυρηνική στόχευση. Ωστόσο, τα 10 αμινοξέα που μεσολαβούν ανάμεσα σεαυτές τις αλληλουχίες μπορούν να αντικατασταθούν με μεταλλαξιγένεση χωρίς να επηρεαστεί οπυρηνικός εντοπισμός. Αυτό το σήμα πυρηνικού εντοπισμού που αποτελείται από δύο ξεχωριστάστοιχεία αλληλουχίας χαρακτηρίζεται ως διπαραγοντικό (bipartite). Παρόμοια διπαραγοντικά μοτίβαλειτουργούν ως σήματα εντοπισμού πολλών πυρηνικών πρωτεϊνών και είναι πιθανόν νασυναντώνται συχνότερα απ' ότι το συνεχές, απλούστερο σήμα πυρηνικού εντοπισμού τουαντιγόνου Τ. Αν και πολλά διπαραγοντικά σήματα πυρηνικού εντοπισμού αποτελούνται απόαλληλουχίες βασικών αμινοξέων, που συχνά ονομάζονται βασικά ή «κλασικά» σήματα πυρηνικούεντοπισμού, άλλα σήματα πυρηνικού εντοπισμού εμφανίζουν μεγάλη ποικιλία αμινοξικήςαλληλουχίας και δομής. Μερικά από αυτά τα σήματα αποτελούνται από μοτίβα αλληλουχίας πουαπέχουν κατά πολύ στην πρωτοταγή δομή της πρωτεΐνης και η ενεργότητά τους εξαρτάται από τηνκανονική αναδίπλωση της πρωτεΐνης στην τριτοταγή της δομή.

Σήματα πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localisation Signal; NLS)1. Μονοπαραγοντικά σήματα NLS: Διαδοχική (ενιαία) αλληλουχία αμινοξέων στα σήματα NLS: π.χ.η αλληλουχία του αντιγόνου-Τ.2. Διπαραγοντικά (bipartite) σήματα NLS: Tα αμινοξέα που σχηματίζουν το σήμα NLS βρίσκονταικοντά το ένα στο άλλο, αλλά δεν είναι διαδοχικά μεταξύ τους. π.χ. το σήμα NLS τηςνουκλεοπλασμίνης (συμμετέχει στη συγκρότηση της χρωματίνης) αποτελείται από 2 μέρη πουχωρίζονται από ένα συνδετικό μεσοδιάστημα 10 αμινοξέων. Και οι δύο αυτές ξεχωριστέςαλληλουχίες είναι απαραίτητες για την πυρηνική στόχευση. Τα 10 αμινοξέα που μεσολαβούνανάμεσα σε αυτές τις αλληλουχίες μπορούν να αντικατασταθούν με μεταλλαξιγένεση χωρίς ναεπηρεαστεί ο πυρηνικός εντοπισμός. Τα διπαραγοντικά κλασσικά σήματα NLS είναι συχνότερα,άλλα υπάρχουν και σήματα NLS που εμφανίζουν μεγάλη ποικιλία αμινοξικής αλληλουχίας καιδομής.

10

ΕΙΚΟΝΑ 9.9: Σήματα πυρηνικού εντοπισμού. Το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Ταντιστοιχεί σε μια ενιαία αλληλουχία αμινοξέων. Αντίθετα, το σήμα πυρηνικού εντοπισμού τηςνουκλεοπλασμίνης είναι διπαραγοντικό, καθώς αποτελείται από δύο αλληλουχίες, μία Lys-Arg καιμία Lys-Lys-Lys-Lys, μεταξύ των οποίων μεσολαβεί ένα μεσοδιάστημα 10 αμινοξέων.

ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ: Η ταυτοποίηση των ημάτων πυρηνικού εντοπισμούΤο ευρύτερο πλαίσιο: Η διατήρηση του πυρήνα ως διακριτού βιοχημικού διαμερίσματος απαιτείέναν μηχανισμό διαχωρισμού μεταξύ πρωτεϊνών του πυρήνα και πρωτεϊνών τουκυτταροπλάσματος. Μελέτες κατά τη δεκαετία του 1970 έδειξαν ότι μικρά μόρια διαχέονταιταχύτατα μέσω του πυρηνικού φακέλου, αλλά οι περισσότερες πρωτεΐνες δεν μπορούν ναδιέλθουν με αυτόν τον τρόπο. Επομένως, φαινόταν πιθανό ότι οι πυρηνικές πρωτεΐνεςαναγνωρίζονται με κάποιον ειδικό τρόπο από τις θέσεις σύνθεσης τους στο ριβοσώματα τουκυτταροπλάσματος και μεταφέρονται επιλεκτικά στον πυρήνα.

Προηγούμενα πειράματα του Günter Blobel και των συνεργατών του είχαναποδείξει ότι η στόχευση πρωτεϊνών στο ενδοπλασματικό δίκτυο γίνεται μέσωσηματοδοτικών αλληλουχιών μικρού μήκους. Ο Alan Smith και συνεργάτες (1984)διεύρυναν αυτή τη θεώρηση στη στόχευση των πυρηνικών πρωτεϊνών, καθώςταυτοποίησαν μια μικρή αλληλουχία αμινοξέων που λειτουργεί ως σήμα πυρηνικούεντοπισμού.

Τα πειράματα: Για τις μελέτες πυρηνικού εντοπισμού σε ζωικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκε ωςμοντέλο μια ιική πρωτεΐνη, το αντιγόνο Τ του ιού SV40. Ο DNA ιός Simian Virus 40 (SV40) ανήκειστην οικογένεια των ιών πολυώμα, που το γονιδίωμα του είναι κυκλικό μεγέθους 5 kb.

11

Το αντιγόνο Τ είναι μια πρωτεΐνη 94 kDa απαραίτητη για την αντιγραφή του DNA του ιού SV40και κανονικά εντοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων που έχουν μολυνθεί από τον ιό.Προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο του A. Smith και της Janet Butel [Landford & Butel (1984)Cell 37:801-813] έδειξαν ότι μεταλλαγή του καταλοίπου Lys-128 είτε προς Thr ή προς Asnεμπόδιζε τη συσσώρευση του αντιγόνου Τ στον πυρήνα κυττάρων πιθήκου και τρωκτικών. Ταμεταλλαγμένα μόρια αντιγόνου Τ δεν μπορούσαν να μεταφερθούν στον πυρήνα, αλλά παρέμενανστο κυτταρόπλασμα, γεγονός που υποδεικνύει ότι η Lys-128 αποτελεί τμήμα ενός σήματοςπυρηνικού εντοπισμού. Ο Smith και συνεργάτες έλεγξαν αυτή την υπόθεση εφαρμόζοντας δύοδιαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις. Καταρχήν, προσδιόρισαν την επίδραση διαφόρωνελλειμμάτων στον υποκυτταρικό εντοπισμό του αντιγόνου Τ και έδειξαν ότι μεταλλαγμένα αντιγόναΤ με απαλοιφή αμινοξέων είτε μεταξύ των καταλοίπων 1 και 126 είτε μεταξύ του καταλοίπου 136και του καρβοξυτελικού άκρου συσσωρεύονταν κανονικά στον πυρήνα, ενώ ένα μετάλλαγμα μεαπαλοιφή των καταλοίπων των αμινοξέων 127-132 παρέμενε στο κυτταρόπλασμα. Κατά συνέπεια,υπεύθυνη για τον πυρηνικό εντοπισμό του αντιγόνου Τ φαινόταν να είναι η αλληλουχία τωνκαταλοίπων 127-132.

PKKKRKV PKTKRKV ή PKNKRKVΠλασμιδιακά DNA που κωδικοποιούν για χιμαιρικές πρωτεΐνες οι οποίες φέρουν αλληλουχίες τουSV40 σε σύντηξη με την κινάση του πυροσταφυλικού εισήχθησαν σε κύτταρα με μικροένεση. Στησυνέχεια, προσδιορίστηκε ο κυτταρικός εντοπισμός των υβριδικών πρωτεϊνών μέσω μικροσκοπίαςανοσοφθορισμού.(Α) Η υβριδική πρωτεΐνη περιέχει ένα ακέραιο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του ιού SV40

(αλληλουχία 126-132).(Β) Το σήμα πυρηνικού εντοπισμού έχει απενεργοποιηθεί με απαλοιφή των καταλοίπων των

αμινοξέων 131 και 132.

Για να προσδιορίσουν αν αυτή η αλληλουχία ήταν ικανή να υπαγορεύσει τη στόχευση άλλωνπρωτεϊνών στον πυρήνα, οι ερευνητές κατασκεύασαν χιμαιρικά μόρια ενώνοντας την αλληλουχία126-132 του αντιγόνου Τ με πρωτεΐνες που υπό κανονικές συνθήκες εντοπίζονταν στοκυτταρόπλασμα. Τα πειράματα αυτά απέδειξαν ότι η προσθήκη της αλληλουχίας 126-132 τουαντιγόνου Τ είτε στη β-γαλακτοζιδάση είτε στην κινάση του πυροσταφυλικού αρκεί για να οδηγήσεισε συσσώρευση αυτών των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών στον πυρήνα. Επομένως, αυτή ημικρή αλληλουχία αμινοξέων του αντιγόνου Τ του ιού SV40 λειτουργεί ως σήμα πυρηνικούεντοπισμού, δηλαδή είναι μια αλληλουχία αναγκαία και ικανή για τη στόχευση των πρωτεϊνών γιαεισαγωγή στον πυρήνα.

Ο αντίκτυπος: Ο Smith και οι συνεργάτες του στην εργασία που δημοσίευσαν το 1984διατύπωσαν την άποψη ότι το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ του ιού SV40«αντιπροσωπεύει μια πρότυπη μορφή παρόμοιων αλληλουχιών που συναντώνται και σε άλλεςπυρηνικές πρωτεΐνες». Αυτά τα σήματα αλληλουχιών υπαγορεύουν τη στόχευση πρωτεϊνών γιαεισαγωγή στον πυρήνα και κατά συνέπεια έχουν βασικό ρόλο στον καθορισμό της βιοχημικήςταυτότητας του πυρήνα και στη διατήρηση της θεμελιώδους οργάνωσης του ευκαρυωτικούκυττάρου σε διαμέρισμα πυρήνα και διαμέρισμα κυτταροπλάσματος. Τα σήματα πυρηνικούεντοπισμού είναι πλέον γνωστό ότι αναγνωρίζονται από κυτταροπλασματικούς υποδοχείς πουμεταφέρουν τις πρωτεΐνες-υποστρώματά τους μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Η

12

ταυτοποίηση των σημάτων πυρηνικού εντοπισμού αποτέλεσε λοιπόν ένα βήμα προόδουκαθοριστικής σημασίας για την κατανόηση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήνα.

Μηχανισμός πυρηνικής μεταφοράς.(a) Μόρια μικρότερα από 40 kDa (και με διάμετρο 4-5 nm) περνούν διαμέσου του συμπλόκου τουπυρηνικού πόρου (NPC) χωρίς να απαιτούν πρωτεΐνες-μεταφορείς, αλλά με απλή διάχυση. Ηεπιλεκτική διαπεροτότητα του NPC παρεμποδίζει την απλή διάχυση των μεγαλυτέρων μορίων.Μεγαλύτερα μόρια όπως οι πρωτεΐνες ΜΒ>40 kDa και RNAs δεσμεύονται σε Larger cargoes (suchas proteins and some mRNAs) δεσμεύονται σε υποδοχείς πυρηνικής μεταφοράς πουαναγνωρίζουν αλληλουχίες-σήματα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) και αλληλουχίες-σήματαπυρηνικής εξαγωγής.

Η διέλευση μακρομορίων από τον πυρηνικό πόρο ρυθμίζεται από την πρωτεΐνη Ran. Πρόκειταιγια έναν τύπο μικρών πρωτεϊνών πρόσδεσης GTP, η διαμόρφωση και η ενεργότητα της οποίαςρυθμίζεται από την πρόσδεση και την υδρόλυση GTP. Παραδείγματα μικρών πρωτεϊνώνπρόσδεσης GTP είναι οι πρωτεΐνες Ras, αρκετοί από τους μεταφραστικούς παράγοντες πουσυμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση, οι πρωτεΐνες Arf και Rab, και οι πρωτεΐνες Rac, Rho καιCdc42.

Τι απαιτείται για τη μεταφορά μεγαλυτέρων πρωτεϊνικών μορίων (ΜΒ>40 kDa) και RNAs;

1. Πρωτεΐνη προς μεταφορά (πρωτεΐνη-φορτίο) που να φέρει ένα σήμα πυρηνικού εντοπισμού(NLS) ή και σήμα πυρηνικής εξαγωγής (nuclear export signal; NES)

2. Πρωτεΐνες-φορείς, π,χ. ιμπορτίνες και εξπορτίνες3. Πρωτεΐνη Ran και καταλυτικός κύκλος Ran/GTP - Ran/GDP

Τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού αναγνωρίζονται από υποδοχείς πυρηνικής μεταφοράς πουονομάζονται ιμπορτίνες (importins) επειδή μεταφέρουν πρωτεΐνες στο εσωτερικό του πυρήνα. Ηδιέλευση μακρομορίων από τον πυρηνικό πόρο ρυθμίζεται από μια πρωτεΐνη που ονομάζεται Ran.Πρόκειται για έναν τύπο μικρών πρωτεϊνών πρόσδεσης GTP, η διαμόρφωση και η ενεργότητα τηςοποίας ρυθμίζεται από την πρόσδεση και την υδρόλυση GTP. Άλλα παραδείγματα μικρώνπρωτεϊνών πρόσδεσης GTP είναι οι πρωτεΐνες Ras, αρκετοί από τους μεταφραστικούςπαράγοντες που συμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση, οι πρωτεΐνες Arf και Rab, καθώς και οιπρωτεΐνες Rac, Rho και Cdc42. Όσον αφορά την πρωτεΐνη Ran, τα ένζυμα που ενεργοποιούν τηνυδρόλυση του GTP προς GDP εντοπίζονται στην κυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικούφακέλου, ενώ τα ένζυμα που ενεργοποιούν την ανταλλαγή GDP με GTP εντοπίζονται στηνπυρηνική πλευρά (Εικ. 9.10). Επομένως, δεν υπάρχει ισόποση κατανομή των Ran/GTP από τιςδύο πλευρές του πυρηνικού πόρου. Στο εσωτερικό του πυρήνα διατηρείται υψηλότερησυγκέντρωση μορίων Ran/GTP, που καθορίζει την κατεύθυνση της πυρηνικής μεταφοράς τωνπρωτεϊνών-φορτίων που αναγνωρίζουν οι ιμπορτίνες.

13

ΕΙΚΟΝΑ 9.10: Κατανομή της Ran/GTP μεταξύ των δύο πλευρών του πυρηνικού φακέλου.Η άνιση κατανομή της Ran/GTP μεταξύ των δύο πλευρών του πυρηνικού φακέλου διατηρείταιχάρη στον εντοπισμό της πρωτεΐνης ενεργοποίησης της GTPάσης Ran (Ran GAP, Ran GTPase-Αctivating Protein) στο κυτταρόπλασμα και του παράγοντα ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνηςRan (Ran GEF, Ran Guanine nucleotide Exchange Factor) στον πυρήνα. Στο κυτταρόπλασμα, ηRan GAΡ (η οποία προσδένεται στα κυτταροπλασματικά ινίδια του συμπλόκου του πυρηνικούπόρου) ενεργοποιεί την υδρόλυση του GTP που είναι προσδεδεμένο στη Ran, οδηγώντας σεμετατροπή της Ran/GTP σε Ran/GDP. Στον πυρήνα, η Ran GEF ενεργοποιεί την ανταλλαγή τουGDP που είναι προσδεδεμένο στη Ran με GTP, οδηγώντας σε μετατροπή του Ran/GDP σεRan/GTP. Κατά συνέπεια, το εσωτερικό του πυρήνα διατηρεί μια υψηλή συγκέντρωση Ran/GTP.

Η πρωτεΐνη Ran ρυθμίζει τη διέλευση πρωτεϊνών από τον πυρηνικό πόρο ελέγχοντας τηνενεργότητα των υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς. Η εισαγωγή πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκουτου πυρηνικού πόρου ξεκινά όταν μια συγκεκριμένη ιμπορτίνη προσδεθεί στο σήμα πυρηνικούεντοπισμού μιας προς μεταφορά πρωτεΐνης στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 9.11). Κατόπιν, αυτό τοσύμπλοκο ιμπορτίνης/φορτίου προσδένεται σε πρωτεΐνες των κυτταροπλασματικών ινιδίων τουσυμπλόκου του πυρηνικού πόρου και η μεταφορά προχωρεί με διαδοχική πρόσδεση σε ειδικέςπρωτεΐνες του πυρηνικού πόρου που βρίσκονται πλησιέστερα στην πυρηνική πλευρά τουσυμπλόκου του πόρου. Ιδιαίτερα σημαντικές για τη διεργασία αυτή είναι ορισμένες πρωτεΐνες(νουκλεοπορίνες) που επενδύουν τον κεντρικό δίαυλο του πόρου, που φέρουν πολλαπλέςεπαναλήψεις Phe-Gly και ονομάζονται πρωτεΐνες FG. Ακολούθως, στην πυρηνική πλευρά τουπόρου, το σύμπλοκο ιμπορτίνης/φορτίου διίσταται καθώς προσδένεται σε αυτό η RanGTP. Ηπρόσδεση αυτή προκαλεί μια αλλαγή στη διαμόρφωση της ιμπορτίνης, που εκτοπίζει από τοσύμπλοκο την πρωτεΐνη-φορτίο και την απελευθερώνει στο εσωτερικό του πυρήνα.

14

Στη συνέχεια, το σύμπλοκο ιμπορτίνης-Ran/GTP εξάγεται από τον πυρήνα μέσω τουσυμπλόκου του πυρηνικού πόρου και επιστρέφει στο κυτταρόπλασμα, όπου το GTP υδρολύεται σεGDP. Με αυτόν τον τρόπο αποδεσμεύεται η ιμπορτίνη, που μπορεί πλέον να προσδεθεί σε μια νέαπρωτεΐνη-φορτίο στο κυτταρόπλασμα και να συμμετάσχει σε έναν νέο κύκλο πυρηνικήςμεταφοράς. Η Ran/GDP που παράγεται στο κυτταρόπλασμα μεταφέρεται πίσω στον πυρήνα μέσωτου δικού της μεταφορέα (που ονομάζεται NTF2), όπου και αναγεννάται η Ran/GTP.

ΕΙΚΟΝΑ 9.11: Μεταφορά πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου.Η μεταφορά μιας πρωτεΐνης μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου αρχίζει με τηναναγνώριση της αλληλουχίας πυρηνικού εντοπισμού της (NLS, Nuclear Localization Sequence)από έναν υποδοχέα πυρηνικής μεταφοράς (ιμπορτίνη). Το σύμπλοκο της πρωτεΐνης-φορτίου μετην ιμπορτίνη προσδένεται σε ειδικές πρωτεΐνες του πυρηνικού πόρου στα κυτταροπλασματικάινίδια. Στη συνέχεια, μεταφέρεται μέσω του πυρηνικού πόρου, καθώς προσδένεται διαδοχικά σεπρωτεΐνες που βρίσκονται όλο και βαθύτερα στο εσωτερικό του. Στην πυρηνική πλευρά τουπόρου, το σύμπλοκο φορτίου/ιμπορτίνης διασπάται λόγω της πρόσδεσης Ran/GTP στηνιμπορτίνη. Η αλλαγή διαμόρφωσης της ιμπορτίνης εκτοπίζει την πρωτεΐνη-φορτίο και τηναπελευθερώνει στο εσωτερικό του πυρήνα. Το σύμπλοκο ιμπορτίνης-Ran/GTP εξάγεται και πάλιαπό τον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου και η πρωτεΐνη ενεργοποίησης της GTPάσης (RanGAP) υδρολύει το GTP, που φέρει η Ran, προς GDP, προκαλώντας απελευθέρωση τηςιμπορτίνης στο κυτταρόπλασμα.

15

To NPC καθορίζει την αμφίδρομη πυρηνο-κυτταροπλασματική μεταφορά μορίων.(A) ΗΜ σάρωσης της δομής του NPC από την κυτταροπλασματική (επάνω) και από τηνπυρηνοπλασματική πλευράς (κάτω) στον πυρηνικό φάκελο ενός ωοκυττάρου του Xenopus laevis.(B) Η πυρηνική μεταφορά μέσω υποδοχέων διεξάγεται σε διαδοχικά στάδια. Ένας υποδοχέας(ιμπορτίνη) αναγνωρίζει το σήμα NLS μιας πρωτεΐνης-φορτίου και σχηματίζει ένα σύμπλοκο (1). Τοσύμπλοκο δεσμεύεται στην κυτταροπλασματική πλευρά του NPC (2) και στη συνέχεια μετακινείταιπρος το εσωτερικό του διαύλου του NPC λόγω των χαμηλής συγγένειας αλληλεπιδράσεων του μετις νουκλεοπορίνες που φέρουν FG (FG-Nups) (3). Καθώς το σύμπλοκο εξέρχεται από τον NPCπρος τον πυρήνα, διίσταται (4) και απελευθερώνει την πρωτεΐνη-φορτίο. Η διάσταση οφείλεται στηδέσμευση της πυρηνικής RanGTP στον υποδοχέα. Για την εξαγωγή του υποδοχέα, η RanGTPδεσμευμένη στο σύμπλοκο υποδοχέα-πρωτεΐνης υδρολύεται σε RanGDP από την ενεργοποιούσαRan GTPάση, RanGAP, προκαλώντας την διάσταση του συμπλόκου. Ο παράγοντας ανταλλαγήςνουκλεοτιδίων γουανίνης, RanGEF, εντοπίζεται στον πυρήνα και αναπαράγει την RanGTP σευψηλές συγκεντρώσεις, ενώ η RanGDP μεταφέρεται πίσω στον πυρήνα από την NTF2 (δεναπεικονίζεται).

16

Μερικές πρωτεΐνες παραμένουν στο εσωτερικό του πυρήνα μετά την εισαγωγή τους από τοκυτταρόπλασμα, πολλές άλλες όμως παλινδρομούν συνεχώς μεταξύ πυρήνα καικυτταροπλάσματος. Μερικές από αυτές τις πρωτεΐνες λειτουργούν ως φορείς για τη μεταφοράάλλων μορίων, όπως μορίων RNA, ενώ άλλες συντονίζουν διάφορες λειτουργίες του πυρήνα καιτου κυτταροπλάσματος (π.χ. ρυθμίζουν τις ενεργότητες μεταγραφικών παραγόντων). Η εξαγωγήπρωτεϊνών από τον πυρήνα υπαγορεύεται από ειδικές αλληλουχίες αμινοξέων, που ονομάζονταισήματα πυρηνικής εξαγωγής (nuclear export signals). Τα σήματα πυρηνικής εξαγωγής, όπως καιτα σήματα πυρηνικού εντοπισμού, αναγνωρίζονται από υποδοχείς μέσα στον πυρήνα. Οιυποδοχείς των σημάτων πυρηνικής εξαγωγής, που ονομάζονται εξπορτίνες (exportins), βρίσκονταιμέσα στον πυρήνα και κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών από τον πυρήνα προς τοκυτταρόπλασμα μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Πολλές από τις εξπορτίνες, όπως καιοι ιμπορτίνες, ανήκουν σε μια οικογένεια υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς που είναι γνωστοί μετο όνομα καρυοφερίνες (karyopherins) (Πίνακας. 9.1).

ΠΙΝΑΚΑΣ 9.1: Καρυοφερίνες με γνωστά υποστρώματα

Η καρυοφερίνη Kapα / Kapβ1 ή ιμπορτίνη είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από 2υπομονάδες, την ιμπορτίνη-α που αναγνωρίζει και δεσμεύεται σε ένα σήμα NLS μιας πρωτεΐνης,και από την ιμπορτίνη-β που αλληλεπιδρά με νουκλεοπορίνες και FG-NUPs καθώς το σύμπλοκομετακινείται διαμέσου του κεντρικού διαύλου του NPC. Η εξπορτίνη Crm1 αναγνωρίζει σήματαNES πλούσια σε leu.

Σήματα πυρηνικής εξαγωγής (Nuclear Export Signal; NES)Η εξαγωγή πρωτεϊνών από τον πυρήνα υπαγορεύεται από ειδικές αλληλουχίες αμινοξέων, πουονομάζονται σήματα πυρηνικής εξαγωγής (NES; Nuclear Export Signals). Τα NES, όπως και ταNLS, αναγνωρίζονται από υποδοχείς μέσα στον πυρήνα. Οι υποδοχείς των NES, οι εξπορτίνες(nuclear export proteins ή exportins), βρίσκονται μέσα στον πυρήνα και κατευθύνουν τη μεταφοράτων πρωτεϊνών από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα μέσω του NPC. Πολλές από τιςεξπορτίνες, όπως και οι ιμπορτίνες, ανήκουν σε μια οικογένεια υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς,τις καρυοφερίνες (karyopherins).

Ένα σήμα πυρηνικής εξαγωγής είναι μια μικρή αλληλουχία υδρόφοβων αμινοξέων σε μιαπρωτεΐνη η οποία θα πρέπει να μεταφερθεί από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα διαμέσου τουNPC, με έναν από τους μηχανισμούς της πυρηνικής μεταφοράς.

17

Τα σήματα NES αναγνωρίζονται από υποδοχείς, τις εξπορτίνες. Τα πιο συχνά αλλά καιεξελικτικά διατηρημένα σήματα NES αποτελούνται από την αλληλουχία αμινοξέων:

LxxxLxxLxLόπου ‘L’ είναι ένα υδρόφοβο κατάλοιπο, συνήθως λευκίνη (leu), και ‘x’ οποιοδήποτε άλλο αμινοξύ.

Η καρυοφερίνη CRM1 έχει ταυτοποιηθεί ως ο υποδοχές πυρηνικής εξαγωγής πρωτεϊνών πουφέρουν σήματα NES πλούσια σε leu. Η πυρηνική εξαγωγή διαμεσολαβούμενη από την CRM1μπορεί να παρεμποδιστεί αποτελεσματικά με τη χρήση του μυκητοκτόνου λεπτομυκίνης Β (LMB),καταδεικνύοντας την ύπαρξη αυτού του μηχανισμού πυρηνικής εξαγωγής.

Μηχανισμός μεταφοράς προς τον πυρήνα (Nuclear import):Οι εξπορτίνες προσδένονται στην πρωτεΐνη Ran, μια πρωτεΐνη που απαιτείται για την εισαγωγή

και για την εξαγωγή από τον πυρήνα (Εικ. 9.12). Ωστόσο, ενώ η πρόσδεση της Ran/GTP στιςιμπορτίνες προκαλεί διάσπαση των συμπλοκών μεταξύ των ιμπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, η πρόσδεση της στις εξπορτίνες συμβάλλει στον σχηματισμό σταθερών συμπλοκώνμεταξύ των εξπορτινών και των αντίστοιχων πρωτεϊνών-φορτίων. Επομένως, η πρόσδεση τηςRan/GTP στις εξπορτίνες καθορίζει τη μετακίνηση των πρωτεϊνών που περιέχουν σήματαπυρηνικής εξαγωγής προς το κυτταρόπλασμα. Έτσι, στο εσωτερικό του πυρήνα σχηματίζονταισταθερά σύμπλοκα μεταξύ των εξπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, στα οποίασυμβάλλει και η πρόσδεση της Ran/GTP. Μετά τη μεταφορά αυτών των συμπλοκών στηνκυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικού φακέλου, η υδρόλυση του GTP και η αποδέσμευση τηςRan/GDP οδηγούν σε αποδέσμευση της πρωτεΐνης-φορτίου, που απελευθερώνεται στοκυτταρόπλασμα. Στη συνέχεια, οι εξπορτίνες ανακυκλώνονται και επιστρέφουν στον πυρήνα μέσωτου πυρηνικού πόρου, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκ νέου.9.1 Animation: Εισαγωγή και εξαγωγή Πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρουhttp://sites.sinauer.com/cooper6e/animation0901.html

ΕΙΚΟΝΑ 9.12: Εξαγωγή πρωτεϊνών από τον πυρήνα. Στονπυρήνα σχηματίζονται σύμπλοκα μεταξύ πρωτεϊνών-φορτίωνπου φέρουν σήματα πυρηνικής εξαγωγής (NES, NuclearExport Signals), εξπορτινών και Ran/GTP. Μετά τη διέλευσηαπό το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου, η Ran GAPενεργοποιεί την υδρόλυση του προσδεδεμένου GTP,οδηγώντας σε σχηματισμό Ran/GDP και απελευθέρωση τηςπρωτεΐνης-φορτίου και της εξπορτίνης στο κυτταρόπλασμα. HRAN·GDP που προκύπτει αλληλεπιδρά με τον πυρηνικόπαράγοντα μεταφοράς NTF2 και μετατοπίζεται πίσω στονπυρήνα μέσω του NPC όπου ο παράγοντας ανταλλαγήςνουκλεοτιδίων γουανίνης RAN GEF, RCC1, αποκαθιστά ταεπίπεδα της RAN·GTP. Οι εξπορτίνες ανακυκλώνονται καιεπιστρέφουν στον πυρήνα μέσω του NPC, ώστε να μπορούννα χρησιμοποιηθούν εκ νέου.

18

Μεταφορά από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα ή Πυρηνική εξαγωγή (Nuclear proteinexport).Πυρηνικές πρωτεΐνες εξαγωγής (Nuclear export proteins), οι εξπορτίνες δεσμεύονται στον πυρήναστην πρωτεΐνη προς εξαγωγή καθώς επίσης και στην RAN/GTP και μετακινούνται διαμέσου τουNPC προς το κυτταρόπλασμα.

Ενώ η πρόσδεση της Ran/GTP στις ιμπορτίνες προκαλεί διάσπαση των συμπλοκών μεταξύ τωνιμπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, η πρόσδεση της στις εξπορτίνες συμβάλλει στονσχηματισμό σταθερών συμπλοκών μεταξύ των εξπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων.Επομένως, η πρόσδεση της Ran/GTP στις εξπορτίνες καθορίζει τη μετακίνηση των πρωτεϊνώνπου περιέχουν σήματα NES προς το κυτταρόπλασμα. Έτσι, στο εσωτερικό του πυρήνασχηματίζονται σταθερά σύμπλοκα μεταξύ των εξπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, σταοποία συμβάλλει και η πρόσδεση της Ran/GTP.

Μετά τη μεταφορά αυτών των συμπλοκών στην κυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικούφακέλου, η ενεργοποιούσα RAN·GTPάση, RANGAP, προκαλεί την υδρόλυση της GTP από τηνRAN σε συνεργασία με δύο πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την RAN·GTP (RAN·GTP-bindingproteins RANBP1 & RANBP2; δεν απεικονίζονται) στην κυτταροπλασματική πλευρά του μεαποτέλεσμα αποδέσμευση της πρωτεΐνης-φορτίου, που απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα. Ησυγκέντρωση της RAN·GTP στο κυτταρόπλασμα είναι χαμηλή. Το σύμπλοκο RAN·GDP πουπροκύπτει αλληλεπιδρά με τον πυρηνικό παράγοντα μεταφοράς NTF2 και μετατοπίζεται πίσωστον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου όπου ο παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίωνγουανίνης RAN GEF (Guanine nucleotide ecchange factor), RCC1, αποκαθιστά τα επίπεδα τηςRAN·GTP. Στη συνέχεια, οι εξπορτίνες ανακυκλώνονται και επιστρέφουν στον πυρήνα μέσω τουπυρηνικού πόρου, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκ νέου.

Ρύθμιση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήναΗ μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα είναι ένα ακόμη επίπεδο στο οποίο μπορούν να ελεγχθούν οιενεργότητες των πυρηνικών πρωτεϊνών. Οι μεταγραφικοί παράγοντες είναι λειτουργικοί μόνο ότανβρίσκονται μέσα στον πυρήνα και επομένως η ρύθμιση της εισαγωγής και της εξαγωγής τωνπρωτεϊνών αυτών προς και από τον πυρήνα συνιστά έναν νέο τρόπο ελέγχου της γονιδιακήςέκφρασης. Η ρυθμιζόμενη εισαγωγή στον πυρήνα μεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνικώνκινασών έχει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής συμπεριφοράς, καθώς παρέχει ένανμηχανισμό μέσω του οποίου σήματα που λαμβάνονται στην επιφάνεια του κυττάρου μπορούν ναμεταδοθούν στον πυρήνα. Η σημασία της ρυθμιζόμενης εισαγωγής στον πυρήνα αποδεικνύεταιαπό το ότι η αλλαγή στη συγγένεια της αλληλεπίδρασης δύο μόλις πρωτεϊνών του συμπλόκου τουπυρηνικού πόρου προς τον υποδοχέα πυρηνικής μεταφοράς έχει συμβάλει στον εξελικτικόδιαχωρισμό των ειδών Drosophila melanogaster και Drosophila simulans.

Σε έναν συγκεκριμένο μηχανισμό ρύθμισης, οι μεταγραφικοί παράγοντες (ή άλλες πρωτεΐνες)συνδέονται με κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες που καλύπτουν τα σήματα πυρηνικού εντοπισμούτους και οδηγούν σε παραμονή των παραγόντων αυτών στο κυτταρόπλασμα, εφόσον τα σήματαπυρηνικού εντοπισμού δεν είναι πλέον αναγνωρίσιμα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί ομεταγραφικός παράγοντας NF-κB, που ενεργοποιείται σε κύτταρα των θηλαστικών από πολλάδιαφορετικά εξωκυτταρικά σήματα (Εικ. 9.13). Στο κυτταρόπλασμα μη διεγερμένων κυττάρων, οNF-κB σχηματίζει ένα ανενεργό σύμπλοκο με μια πρωτεΐνη-αναστολέα (την ΙκΒ). Η πρόσδεση τηςΙκΒ καλύπτει το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του NF-κB, εμποδίζοντας τη μεταφορά του στονπυρήνα. Σε διεγερμένα κύτταρα, η πρωτεΐνη ΙκΒ φωσφορυλιώνεται και αποικοδομείταιπρωτεολυτικά μέσω της ουβικιτίνης, επιτρέποντας στον NF-κB να εισέλθει στον πυρήνα και ναενεργοποιήσει τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων του.

19

ΕΙΚΟΝΑ 9.13: Ρύθμιση της εισαγωγής μεταγραφικών παραγόντων στον πυρήνα.Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κΒ διατηρείται στο κυτταρόπλασμα υπό μορφή ανενεργούσυμπλόκου με την πρωτεΐνη ΙκΒ, η οποία καλύπτει την αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού του(NLS). Όταν δεχτεί τα κατάλληλα εξωκυτταρικά σήματα, η ΙκΒ φωσφορυλιώνεται καιαποικοδομείται μέσω πρωτεόλυσης, επιτρέποντας την εισαγωγή του NF-κΒ στον πυρήνα. Ομεταγραφικός παράγοντας Pho4 του σακχαρομύκητα διατηρείται στο κυτταρόπλασμα λόγω τηςφωσφορυλίωσης ενός καταλοίπου σερίνης που βρίσκεται κοντά στην αλληλουχία πυρηνικούεντοπισμού του. Η ρυθμιζόμενη αποφωσφορυλίωση του καταλοίπου αυτού οδηγεί σε έκθεση τουNLS και επιτρέπει μεταφορά του Pho4 στον πυρήνα.

Η εισαγωγή άλλων μεταγραφικών παραγόντων στον πυρήνα ρυθμίζεται άμεσα μέσω τηςφωσφορυλίωσής τους και όχι μέσω σύνδεσης με πρωτεΐνες-αναστολείς. Για παράδειγμα, ομεταγραφικός παράγοντας Pho4 του σακχαρομύκητα φωσφορυλιώνεται σε ένα κατάλοιπο σερίνηςπου βρίσκεται δίπλα στο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του. Η φωσφορυλίωση στη θέση αυτήπροκαλεί αναστολή του παράγοντα Pho4, γιατί παρεμποδίζει την εισαγωγή του στον πυρήνα. Υπόκατάλληλες συνθήκες, όμως, η ρυθμιζόμενη αποφωσφορυλίωση αυτής της θέσης επιτρέπει τημετατόπιση του παράγοντα Pho4 στον πυρήνα και την ενεργοποίηση του.

Επομένως η ρύθμιση της νουκλεοκυτραοπλασματικής μεταφοράς είναι δυναμική καιδιαφορετική.

Διαμοριακές και ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις (NF-κB ήp53, αντίστοιχα) ρυθμίζουν τη μεταφορά μιας πρωτεΐνης-φορτίου.

Η πυρηνική εισαγωγή του ετεροδιμερούς p65-p50 του μεταγραφικού παράγοντα ΝF-κBρυθμίζεται από μια διαμοριακή κάλυψη του NLS. Ο αναστολέας του NF-κB, IκBα παρεμποδίζειάμεσα το NLS του p65-p50, με αποτέλεσμα τον κυτταροπλασματικό εντοπισμό του ετεροδιμερούς.

20

Όμως όταν ένα κύτταρο δεχθεί προφλεγμονώδη ερεθίσματα, η ΙκΒα φωσφορυλιώνεται καιαποδομείται από το πρωτεόσωμα, και επομένως το ετεροδιμερές του NF-κΒ, p65-p50απελευθερώνεται και μετατοπίζεται (μεταφέρεται) στον πυρήνα με το μηχανισμό των ιμπορτινώνα/β διαμέσου του NPC.

Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 παλινδρομεί μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος,και αυτή η κίνηση εξαρτάται από τη φάση του κυτταρικού κύκλου. Υπό συνθήκες κυτταρικού στρες,η p53 συγκρατείται στον πυρήνα με έναν μηχανισμό κάλυψης του σήματος NES. Η p53 σχηματίζειομοτετραμερή με αποτέλεσμα το σήμα NES να αποκρύπτεται και να παρεμποδίζεται μ’ αυτόν τοντρόπο η αλληλεπίδραση της με την εξπορτίνη Crm1/kapβ. Η νουκλεοκυτταροπλασματικήμεταφορά της p53 ισχυροποιείται επίσης λόγω της επαγόμενης από στρες πολύ-ADP-ριβοσυλίωση της, η οποία παρεμποδίζει την αλληλεπίδραση της με την Crm1. Ελαττώματα πουπαρεμποδίζουν την πυρηνική διατήρηση της p53 σχετίζονται με έναν αριθμό νεοπλασμάτων,αναδεικνύοντας τη σημασία του κατάλληλου κυτταρικού εντοπισμού μιας πρωτεΐνης.

Η πυρηνική εισαγωγή / εξαγωγή είναι βασικές διαδικασίες που εμπλέκονται στη ρύθμισητης γονιδιακής έκφρασης στα ευκαρυωτικά και οι όποιες υπόκεινται σε ρύθμιση

Ενώ πολλές πρωτεΐνες μεταφέρονται επιλεκτικά από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, ταπερισσότερα μόρια RNA εξάγονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Εφόσον οι πρωτεΐνεςσυντίθενται στο κυτταρόπλασμα, η εξαγωγή από τον πυρήνα μορίων mRNA, rRNA, tRNA καιmiRNA αποτελεί ένα καθοριστικό βήμα της γονιδιακής έκφρασης στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ηεξαγωγή αυτών των μορίων RNA μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου είναι, όπως και ηεισαγωγή πρωτεϊνών, μια ενεργή, εξαρτώμενη από ενέργεια, διεργασία που απαιτείαλληλεπίδραση των υποδοχέων μεταφοράς με το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου.

21

Μεταφορά των μορίων RNAΕνώ πολλές πρωτεΐνες μεταφέρονται επιλεκτικά από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, ταπερισσότερα μόρια RNA εξάγονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Εφόσον οι πρωτεΐνεςσυντίθενται στο κυτταρόπλασμα, η εξαγωγή από τον πυρήνα μορίων mRNA, rRNA, tRNA καιmiRNA αποτελεί ένα καθοριστικό βήμα της γονιδιακής έκφρασης στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ηεξαγωγή αυτών των μορίων RNA μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου είναι, όπως και ηεισαγωγή πρωτεϊνών, μια ενεργή, εξαρτώμενη από ενέργεια, διεργασία που απαιτείαλληλεπίδραση των υποδοχέων μεταφοράς με το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου. Ιμπορτίνες καιεξπορτίνες της οικογένειας των καρυοφερινών είναι υπεύθυνες για τη μεταφορά των περισσότερωνμορίων tRNA, rRNA, miRNA και μικρών πυρηνικών RNA μέσω ενός μηχανισμού εξαρτώμενουαπό Ran/GDP. Ωστόσο, τα μόρια mRNA εξάγονται από τον πυρήνα μέσω ενός συμπλόκου δύοπρωτεϊνών (γνωστού με το όνομα «εξαγωγέας mRNAs»), από τις οποίες η μία εμφανίζει συγγένειαμε τον μεταφορέα της Ran/GDP, δηλαδή τον NTF2. Αυτός ο μηχανισμός μεταφοράς των μορίωνmRNA φαίνεται να είναι ανεξάρτητος της πρωτεΐνης Ran.

Μικρά RNAs όπως τα tRNAs και miRNAs εξάγονται με σχετικά απλές πορείες, με τη δέσμευσητους σε υποδοχείς εξαγωγείς (καρυοφορίνες), όπως οι ιμπορτίνες και οι εξπορτίνες και Ran/GTP.Τα μεγαλύτερα μόρια όπως τα rRNAs και τα snRNAs συγκροτούνται σε πολύπλοκαριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια (Ribonucleoproteins; RNP) και στρατολογούν τις καρυοφερίνεςδιαμέσου μιας κατηγορίας ειδικών προσαρμοστικών πρωτεϊνών και χρησιμοποιούν Ran/GTP. Ηεξαγωγή των mRNAs είναι μοναδική καθώς εκτός από τη συγκρότηση σε RNPs, είναι συζευγμένημε τη μεταγραφή (σακχαρομύκητες) και με το μάτισμα (μετάζωα), και δεν χρησιμοποιούν Ran/GTP,αλλά διεξάγεται μέσω ενός συμπλόκου δύο πρωτεϊνών, γνωστού με το όνομα «εξαγωγέαςmRNAs»).

Οι κύριες πορείες πυρηνικής εξαγωγής μορίων RNA: tRNA, microRNA (miRNA), snRNA,mRNA, rRNA. Σε κάθε περίπτωση απεικονίζεται το μετάγραφο RNA μετά την επεξεργασία, τηνωρίμανση, και την συγκρότηση τους σε σύμπλοκα με παράγοντες εξαγωγής [οι προσαρμοστικέςπρωτεΐνες εξαγωγής (export adaptors) εμφανίζονται μπλε, οι πρωτεϊνικοί υποδοχείς μεταφοράς(export receptors) με κίτρινο]. Απεικονίζονται επίσης τα επικρατή δομικά χαρακτηριστικά στα προ-RNAs (μονόκλωνες/δίκλωνες περιοχές RNA, βρόγχοι, εξόνια και ιντρόνια, 5' cap και 3' πολυ(A)ουρά). Στην πορεία εξαγωγής mRNA, απεικονίζεται η ονομασία των πρωτεϊνών των μεταζώων καισακχαρομυκήτων, και τα mRNAs μαζί με επιπλέον προσαρμοστικές πρωτεΐνες και παράγοντεςδέσμευσης RNA (RNA-binding factors) με οβαλ πορτοκαλί. Στην πορεία του rRNA, απεικονίζονταιο γενικός ‘εξαγωγέας’ στα ευκαρυωτικά, CRM1, και δύο βοηθητικές πρωτεΐνες εξαγωγής, Mex67-Mtr2 και Arx1, που έχουν μελετηθεί στον σακχαρομύκητα. CBC, Σύμπλοκο δέσμευσης cap (Cap-binding complex); Exp, Εξπορτίνη (exportin).

22

Τα RNA μεταφέρονται μέσω του πυρηνικού φακέλου υπό μορφή συμπλοκώνριβονουκλεοπρωτεΐνης (RNP; Ribonucleoprotein complexes) (Εικ. 9.14). Τα ριβοσωμικά RNAσυνδέονται αρχικά με ριβοσωμικές πρωτεΐνες και με ειδικές πρωτεΐνες επεξεργασίας RNA μέσαστον πυρηνίσκο, δημιουργώντας τις δύο ριβοσωμικές υπομονάδες 60S και 40S. Οι υπομονάδεςαυτές στη συνέχεια μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 9.31) μέσω ενός μηχανισμού στονοποίο συμμετέχει η καρυοφερίνη Crm1. Η εξαγωγή τους από τον πυρήνα επιτυγχάνεται μέσω τηςαναγνώρισης σημάτων πυρηνικής εξαγωγής που περιέχονται σε πρωτεΐνες του συμπλόκου κάθεριβοσωμικής υπομονάδας. Τα μόρια pre-mRNA και mRNA συνδέονται με ένα σύνολο τουλάχιστον20 πρωτεϊνών κατά την επεξεργασία τους στον πυρήνα έως και τη μεταφορά τους στοκυτταρόπλασμα. Αυτή η μεταφορά επιτυγχάνεται μέσω του συμπλόκου του εξαγωγέα mRNA, πουστρατολογείται στο επεξεργασμένο mRNA. Τα μόρια tRNA και πρόδρομες μορφές των μορίωνmRNA εξάγονται από τον πυρήνα άμεσα συνδεδεμένα με την εξπορτίνη t και την εξπορτίνη 5, πουείναι οι αντίστοιχοι μεταφορείς τους.

ΕΙΚΟΝΑ 9.14: Μεταφορά ενός συμπλόκου ριβονουκλεοπρωτεΐνης. Τα κύτταρα τωνσιελογόνων αδένων των εντόμων παράγουν ευμεγέθη σύμπλοκα ριβονουκλεοπρωτεΐνης (RNΡ),τα οποία περιέχουν 35-40 kb RNA και έχουν συνολική μάζα περίπου 30 εκατομμύρια Da. Σε αυτήτη σειρά φωτογραφιών ηλεκτρονικού μικροσκοπίου παρουσιάζονται (Α) η πρόσδεση ενός τέτοιουRNΡ σε ένα σύμπλοκο πυρηνικού πόρου και (Β-Δ) η αποδίπλωση του RNA κατά τη μεταφορά τουστο κυτταρόπλασμα [Mehlin H, et al. (1992) Cell 69: 605].

23

Μεταφορά μορίων tRNA και miRNA

● Τα tRNAs εξάγονται από την εξπορτίνη-t που δρα ως υποδοχέας τους.● Η μεταφορά tRNA απαιτεί Ran/GTP.● Η εξαγωγή tRNA μπορεί να επηρεαστεί από τροποποιήσεις του tRNAs.● Τα tRNAs μπορούν να επαναεισαχθούν στον πυρήνα.

Τα πρωτογενή μετάγραφα miRNAs (pre-mRNAs) εξάγονται από τον πυρήνα με τη δράση τηςεξπορτίνης-5 και η επεξεργασία τους διεξάγεται στο κυτταρόπλασμα● Η εξαγωγή tRNAs διεξάγεται από την εξπορτίνη-t που δρα ως υποδοχέας τους και απαιτεί

Ran/GTP.● Η εξαγωγή tRNA μπορεί να επηρεαστεί από τροποποιήσεις του tRNAs.● Τα tRNAs μπορούν να επαναεισαχθούν στον πυρήνα.● Τα πρωτογενή μετάγραφα miRNAs (pre-mRNAs) εξάγονται από τον πυρήνα με τη δράση της

εξπορτίνης-5 και η επεξεργασία τους διεξάγεται στο κυτταρόπλασμα

Πυρηνική εξαγωγή μορίων tRNA και miRNA(α) Η μεταγραφή ενός γονιδίου tRNA από την RNA πολυμεράση III (Pol III) παράγει ένα

πρωτογενές μετάγραφο, που μερικές φορές περιέχει ένα ιντρόνιο, με επιμηκύνσεις των 5’ και 3’άκρων. Μετά την επεξεργασία των 5’ και 3’ άκρων, τροποποιήσεις βάσεων (κόκκινοι κύκλοι) καιτην προσθήκη των νουκλεοτιδίων CCA στο 3‘ άκρο, τα παραγόμενα tRNAs μπορούν ναακολουθήσουν διαφορετικές πορείες εξαγωγής. Τα tRNA που περιέχουν ένα ιντρόνιο ήελεύθερα ιντρονίου tRNAs (με ένα αμινοξύ ή όχι) μεταφέρονται με την πορεία που εξαρτάταιαπό την εξπορτίνη-t/Los1, μεταξύ άλλων την αλληλουχία CAA. Μετά την εξαγωγή στοκυτταρόπλασμα και τη διάσταση του tRNA από τον υποδοχέα, το tRNA που περιέχει έναιντρόνιο υφίσταται μάτισμα από τις πρωτεΐνες ματίσματος που εντοπίζονται στην εξωτερικήμιτοχονδριακή μεμβράνη, στους σακχαρομύκητες. Το ώριμο tRNA διοχετεύεται στη συνέχειαστα ριβοσώματα από παράγοντες αποδέσμευσης όπως Cex1 και eEF1.

(β) Για τα miRNA, απεικονίζεται μόνον η παραγωγή του πρωτογενούς mRNA (προ-mRNAs) πουμεταγράφεται από την Pol II. Τα miRNAs μπορεί να κωδικοποιούνται από ένα γονίδιο miRNA

24

που εντοπίζεται στο ιντρόνιο ενός γονιδίου που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη (αριστερός κλάδος) ήαπό ένα ξεχωριστό γονίδιο miRNA (δεξιός κλάδος). Και στις 2 περιπτώσεις, το πρωτογενέςμετάγραφο διασπάται από το σύμπλοκο Drosha-DGCR8 σχηματίζοντας ένα προ-mRNA πουφέρει μια δομή μίσχου-βρόγχου (stem-loop structure). Επιπλέον, παράγεται ένα miRNA πουέχει υποστεί μάτισμα μετά από την αποκοπή ενός ιντρονικού mRNA. Το προ-miRNA που φέρειμια προεξοχή 2 νουκλεοτιδίων στο 3' άκρο του αναγνωρίζεται ειδικά από την εξπορτίνη-5 καιμεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα, όπου διίσταται από τον υποδοχέα του μετά την υδρόλυση τουRanGTP. Μετά την αποδέσμευση του από την εξπορτίνη-5, το Dicer διασπά επιπλέον το prο-miRNA και παράγει ένα μονόκλωνο miRNA, το οποίο συγκροτείται σε ένα επαγόμενο σύμπλοκοαποσιώπησης RNA (RNA-induced silencing complex; RISC). Με μπλε χρώμα φαίνεται ηπεριοχή του RNA που αντιστοιχεί σε ένα ώριμο miRNA.

25

Μεταφορά των μορίων mRNA, rRNA και snRNAΤα μόρια mRNA, rRNA και snRNA μεταφέρονται μέσω του πυρηνικού φακέλου υπό μορφήσυμπλοκών ριβονουκλεοπρωτεΐνης (RNP; Ribonucleoprotein complexes).

Στον πυρήνα, τα προ-mRNA (pre-mRNA) συγκροτούνται σε ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωματίδια ταπρο-mRNP (pre-mRNP) ή ετερογενή πυρηνικά mRNP ή hnRNP.

Πυρηνική εξαγωγή των μορίων mRNA: Τα πρόδρομα μόρια pre-mRNA συνθέτονται από τηνRNA πολυμεράση (Pol)-II, αποκτούν την 5’ καλύπτρα 7-μεθυλογουανοσίνης (Cap) όπουδεσμεύονται οι πρωτεΐνες CBC (Cap Binding Protein Complex), υπόκεινται σε εναλλακτικό μάτισμακαι υφίστανται επεξεργασία και προσθήκη της 5’ πολύ-Α ουράς. Κατά τη συγκρότηση αυτών τωνεπεξεργασμένων μορίων mRNA σε ένα ώριμο σύμπλοκο ριβονουκλεοπρωτεϊνών (mRNPs)συνδέονται με ένα σύνολο τουλάχιστον 20 πρωτεϊνών. Η μεταφορά του mRNP από τον πυρήναστο κυτταρόπλασμα επιτυγχάνεται μέσω του συμπλόκου του εξαγωγέα mRNA, που στρατολογείταιστο επεξεργασμένο mRNA.

Εξαγωγή mRNA συζευγμένη με το μάτισμα.Στα μετάζωα, η εξαγωγή mRNA είναι συζευγμένημε το μάτισμα και εξαρτάται από την παρουσίατης 5’ cap που αλληλεπιδρά με το σύμπλοκοTREX (THO - υποσύμπλοκο) και στη συνέχειαστρατολογείται στο mRNP. Στη συνέχειαστρατολογείται ο υποδοχέας εξαγωγής mRNA,TAP–p15 (κίτρινο), και προσαρμοστικέςπρωτεΐνες (μπλε). Πολλά mRNA εξάγονται με τομηχανισμό Crm1-Ran/GTP με τον οποίο τοσύμπλοκο Crm1-Ran/GTP προσδένει στιςπρωτεΐνες CBC, διαμέσου μιας προσαρμοστικήςπρωτεΐνης HuR.

26

Πυρηνική εξαγωγή των μορίων rRNAΤα ριβοσωμικά RNA συνδέονται αρχικά με ριβοσωμικές πρωτεΐνες και με ειδικές πρωτεΐνεςεπεξεργασίας RNA μέσα στον πυρηνίσκο, δημιουργώντας τις δύο ριβοσωμικές υπομονάδες 60Sκαι 40S. Οι υπομονάδες αυτές στη συνέχεια μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα μέσω ενόςμηχανισμού στον οποίο συμμετέχει η καρυοφερίνη Crm1. Η εξαγωγή τους από τον πυρήναεπιτυγχάνεται μέσω της αναγνώρισης σημάτων NES που περιέχονται σε πρωτεΐνες τουσυμπλόκου κάθε ριβοσωμικής υπομονάδας, ιδιαίτερα στην προσαρμοστική πρωτεΐνη Nmd3. Οιάλλοι υποδοχείς εξαγωγής Mex67-Mtr2 και Arx1 δεσμεύονται άμεσα στην υπομονάδα pre-60S.

Πυρηνική εξαγωγή των ριβοσωμικών υπομονάδων: Η εξαγωγή της ριβοσωμικής υπομονάδςpre-60S στο σακχαρομύκητα αρχίζει με τη συγκρότηση της στον πυρηνίσκο με μια πολυσταδιακήκαι πολύπλοκη διαδικασία. Μόλις το σωμάτιο pre-60S εξάγεται στο νουκλεόπλασμα στρατολογείδιάφορους υποδοχείς εξαγωγής.

Ο υποδοχέας εξαγωγής Crm1 δεσμεύεται παρουσία της RanGTP στην αλληλουχία πυρηνικήςεξαγωγής (NES) της προσαρμοστικής πρωτεΐνης Nmd3. Οι άλλοι υποδοχείς εξαγωγής Mex67–Mtr2 και Arx1 δεσμεύονται άμεσα στην υπομονάδα pre-60S.

Μετά τη μετατόπιση του διαμέσου του NPC, απομακρύνονται στο κυτταρόπλασμα οιπαράγοντες εξαγωγής από σωμάτιο pre-60S. Η Crm1 διίσταται από την Nmd3 με την υδρόλυσητης RanGTPάση (RanGAP). Η Nmd3 απελευθερώνεται από την Lsg1 GTPάση και αντικαθίσταταιαπό τη ριβοσωμική πρωτεΐνη and Rpl10. Η Arx1 αποδεσμεύεται από τον παράγοντααπελευθέρωσης Rei1.

Δεξιά απεικονίζεται ο δίαυλος του NPC και οι υποδοχείς εξαγωγής που αλληλεπιδρούν με τοσωμάτιο pre-60S particle και τις νουκλεοπορίνες FG. Οι υποδοχείς εξαγωγής εμφανίζονται μεκίτρινο, οι προσαρμοστικές πρωτεΐνες με μπλε και οι παράγοντες αποδέσμευσης/απελευθέρωσηςμε ροζ.

27

Μεταφορά των μορίων snRNA: Σε αντιδιαστολή με τα μόρια mRNA, tRNA και rRNA, πουασκούν τη λειτουργία τους στο κυτταρόπλασμα, πολλά μικρά μόρια RNA (snRNA και snoRNA)λειτουργούν μέσα στον πυρήνα ως συστατικά του μηχανισμού επεξεργασίας RNA. Τα snRNAμεταφέρονται αρχικά από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, όπου συνδέονται με πρωτεΐνες για νασχηματίσουν λειτουργικά snRNP και στη συνέχεια επαναφέρονται στον πυρήνα (Εικ. 9.15). Στηνεξαγωγή των μορίων snRNA στο κυτταρόπλασμα συμμετέχουν η πρωτεΐνη Crm1 και άλλοιυποδοχείς μεταφοράς που προσδένονται στις 5' καλύπτρες 7-μεθυλογουανοσίνης των snRNA,ενώ για τη μεταφορά των snRNP από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα ευθύνονται αλληλουχίεςπου φέρουν οι πρωτεΐνες snRNP.

ΕΙΚΟΝΑ 9.15: Μεταφορά των snRNA μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος.Τα μικρά πυρηνικά RNA (snRNA) εξάγονται αρχικά από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα μέσωμιας εξπορτίνης (Crm1) που αναγνωρίζει την καλύπτρα 7-μεθυλογουανοσίνης του 5΄ άκρου. Στοκυτταρόπλασμα, τα snRNA συνδέονται με πρωτεΐνες και σχηματίζουν snRNP, τα οποία στησυνέχεια μεταφέρονται και πάλι στον πυρήνα.

Μικρά RNAs όπως τα tRNAs και miRNAs εξάγονται με σχετικά απλές πορείες, με τη δέσμευσητους σε υποδοχείς εξαγωγείς (καρυοφορίνες). Τα μεγαλύτερα μόρια RNA, όπως τα rRNAs καιmRNAs, καθώς επίσης και τα snRNAs συγκροτούνται σε πολύπλοκα ριβονουκλεοπωτεϊνικάσωμάτια (Ribonucleoproteins; RNP) και στρατολογούν τις πρωτεΐνες εξαγωγής διαμέσου μιαςκατηγορίας ειδικών προσαρμοστικών πρωτεϊνών. Η εξαγωγή των mRNAs είναι μοναδική καθώςείναι συζευγμένη με τη μεταγραφή (σακχαρομύκητες) και με το μάτισμα (μετάζωα). Η κατανόησητων μηχανισμών που διασυνδέουν το σχηματισμό των RNPs με την εξαγωγή των mRNAs καιrRNAs αποτελούν πεδία έρευνας.

28

9.2. Εσωτερική οργάνωση του πυρήναΟ πυρήνας δεν είναι απλώς ένας σάκος όπου χρωματίνη, μόρια RNA και πυρηνικές πρωτεΐνεςκινούνται ελεύθερα σε ένα υδατικό διάλυμα. Αντίθετα, ο πυρήνας διαθέτει μια εσωτερική δομή πουεξασφαλίζει την οργάνωση του γενετικού υλικού και τον καταμερισμό των πυρηνικών λειτουργιών.Στα ζωικά κύτταρα, ένα χαλαρά οργανωμένο πλέγμα πυρηνικών λαμινών εκτείνεται από τηνπυρηνική λάμινα ως το εσωτερικό του πυρήνα. Αυτές οι λαμίνες χρησιμεύουν ως θέσειςπρόσδεσης της χρωματίνης και οργανώνουν άλλες πρωτεΐνες σε δομές λειτουργικών πυρηνικώνσωματίων. Μέσα στον πυρήνα, η χρωματίνη είναι οργανωμένη σε μεγάλους βρόχους DNA,συγκεκριμένες περιοχές των οποίων προσδένονται στο στρώμα των λαμινών μέσω πρωτεϊνώνπρόσδεσης λαμινών που βρίσκονται στη χρωματίνη. Πολλές πυρηνικές πρωτεΐνες σχηματίζουνσύμπλοκα εξαρτώμενα από λαμίνες, που με τη σειρά τους σχηματίζουν πυρηνικά σωμάτια πουσυμμετέχουν στην επιδιόρθωση του DNA, στην οργάνωση της χρωματίνης, στη γονιδιακή ρύθμισηκαι στη μεταγωγή σήματος. Θεωρείται ότι αυτός ο ρόλος της πυρηνικής λάμινας και των λαμινώνστον καταμερισμό των λειτουργιών της επιδιόρθωσης του DNA και της μεταγραφής γονιδίωναποτελεί τη βάση πολλών διαφορετικών γενετικών ασθενειών που σχετίζονται με τις λαμίνες.

Απεικόνιση των αλληλεπιδράσεων των λαμινών με πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικήςμεμβράνης, του πυρηνικού πόρου και πυρηνοπλάσματος. Οι λαμίνες βρίσκονταισυγκεντρωμένες στην πυρηνική λάμινα (παχιές κόκκινες γραμμές) καθώς επίσης και διάσπαρτεςστο πυρηνόπλασμα (λεπτές κόκκινες γραμμές).

29

Μοντέλο των πυρηνικών λαμίνων και των αλληλεπιδράσεων τους με γειτονικές πρωτεΐνες.Οι λαμίνες αλληλεπιδρούν με συναφείς πρωτεΐνες (lamina-associated proteins (LBR, LAP2,emerin, MAN1, nesprins-1 & -2), αλλά και με άλλες πυρηνικές πρωτεΐνες (BAF, Rb, SREBP1),ιστόνες και DNA (χρωματίνη).

Η σύνδεση των λαμινών με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη διευκολύνεται από τη μετα-μεταφραστική προσθήκη λιπιδίων - πρενυλίωση των καρβοξυτελικών καταλοίπων κυστεΐνης. Οιλαμίνες προσδένονται σε πρωτεΐνες της εσωτερική πυρηνική μεμβράνη , όπως η εμερίνη και οLBR, μεσολαβώντας στην πρόσδεση τους στον πυρηνικό φάκελο. Η πυρηνική λάμινα προσδένεταιστη χρωματίνη μέσω των ιστονών Η2Α και Η2Β, και άμεσα στο DNA. Οι λαμίνες σχηματίζουν έναχαλαρό δίχτυ που εκτείνεται σε ολόκληρο το εσωτερικό του πυρήνα. Στις λαμίνες προσδένονταιπολλές πυρηνικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη σύνθεση του DNA, στη μεταγραφή ή στηντροποποίηση της χρωματίνης, παρόλο που η σημασία αυτών των αλληλεπιδράσεων μόλις έχειαρχίσει να κατανοείται.

Η πυρηνική λάμινα, ένα ινώδες δίκτυο που αποτελείται κυρίως από λαμίνες, επενδύει τηνεσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Σ' αυτήν την περιοχή διεξάγονται αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης οι οποίες συνδέουν την χρωματίνη με την πυρηνική περιφέρεια, την πυρηνική λάμινα μετα σύμπλοκα NPC και τις πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης. Είναι επομένωςφανερό ότι αυτές οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις διασυνδέουν την περιφέρεια τουνουκλεοπλάσματος με τον κυτταροσκελετό. Ιδιαίτερα τα αυλικά τμήματα της οικογένειας τωνπρωτεϊνών SUN που εντοπίζονται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, αλληλεπιδρούν με τιςπρωτεΐνες νεσπρίνες (Nesprins), που ανήκουν στην οικογένεια των πρωτεϊνών KASH καιεντοπίζονται στην εξωτερική πυρηνική μεμβράνη. Στη συνέχεια κυτταροπλασματικές περιοχές(επικράτειες) των νεσπρίνες (nesprins) αλληλεπιδρούν με τα ινίδια ακτίνης, τουςμικροσωληνίσκους και τα ενδιάμεσα ινίδια του κυτταροσκελετού. Συνολικά αυτό το δίκτυο τωνπρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων ονομάζεται συνδετικό πρωτεϊνικό σύμπλεγμα του πυρηνικού

30

σκελετού και του κυτταροσκελετού (σύμπλεγμα LINC). Οι πρωτεΐνες του συμπλέγματος LINCπροσδένουν επίσης και στα κεντροσωμάτια, τα οποία εντοπίζονται κοντά στην εξωτερική πυρηνικήμεμβράνη.

Χρωμοσώματα και υψηλότερη οργάνωση δομής της χρωματίνηςΗ χρωματίνη συμπυκνώνεται σε υψηλό βαθμό κατά τη μίτωση, σχηματίζοντας τα συμπαγήμεταφασικά χρωμοσώματα που κατανέμονται στους θυγατρικούς πυρήνες (Εικ 5.15). Κατά τημεσόφαση, μέρος της χρωματίνης, η λεγόμενη ετεροχρωματίνη (heterochromatin) παραμένειιδιαίτερα συμπυκνωμένο και μεταγραφικά ανενεργό. Η υπόλοιπη χρωματίνη ή ευχρωματϊνη(euchromatin) είναι αποσυμπυκνωμένη και κατανέμεται σε ολόκληρο τον πυρήνα (Εικ. 9.16).

Τα κύτταρα περιέχουν δύο τύπους ετεροχρωματίνης: την ιδιοστατική ετεροχρωματίνη(constitutive heterochromatin), που περιέχει αλληλουχίες DNA που γενικά δε μεταγράφονται, όπωςείναι οι δορυφορικές αλληλουχίες που υπάρχουν στα κεντρομερή και τα τελομερή, και σε τμήματαφυλετικών χρωμοσωμάτων όπως το Υ, και τη δυνητική ετεροχρωματίνη (facultativeheterochromatin), που περιέχει αλληλουχίες που δε μεταγράφονται στο υπό εξέταση κύτταρο αλλάμεταγράφονται σε άλλους τύπους κυττάρων. Κατά συνέπεια, η δυνητική ετεροχρωματίνη μπορεί νααποσυμπυκνωθεί ως απόκριση σε ένα ερέθισμα και να γίνει μεταγραφικά ενεργή. Κατά συνέπεια,η ποσότητα της δυνητικής ετεροχρωματίνης ποικίλλει ανάλογα με τη μεταγραφική ενεργότητα τουκυττάρου, μια δεδομένη χρονική περίοδο. Για παράδειγμα, το γονίδιο της αιμοσφαιρίνης σε ένανευρώνα, και σε ένα ερυθροκύτταρο.

ΕΙΚΟΝΑ 9.16: Ετεροχρωματίνη σεμεσοφασικούς πυρήνες.Η ευχρωματίνη είναι κατανεμημένη σεολόκληρο τον πυρήνα. Η ετεροχρωματίνηυποδεικνύεται με τρίγωνα και ο πυρηνίσκος μεβέλος.

Η ετεροχρωματίνη έχει διάφορες λειτουργίες:• Αποσιώπιση έκφρασης γονιδίων• Δομική ακεραιότητα του γονιδιώματος

Η ετεροχρωματίνη αλληλεπιδρά με την πυρηνική λάμινα αλλά δεν εντοπίζεται στο σύμπλοκο τωνπυρηνικών πόρων. Επομένως, οι περιοχές στις οποίες αποκλείεται η χρωματίνη περιέχουνμεταγραφική ενεργά ευχρωματίνη.

31

Η περιφερειακή ετεροχρωματίνη αποκλείεται από το σύμπλοκο NPC.(a) Σχηματικό διάγραμμα της κατανομής της ετεροχρωματίνης κάτω από τον πυρηνικό φάκελο που

απεικονίζει τα κενά στα σύμπλοκα των NPC.(b) Στα θηλαστικά, η νουκλεοπορίνη TPR απαιτείται για να δημιουργήσει μια αποκλειστική ζώνη

ελεύθερης ετεροχρωματίνης κάτω από το σύμπλοκο NPC (+TPR). Η απώλεια της TRP μέσωπαρεμβολής RNAi οδηγεί στην κάλυψη της περιοχής του NPC με ετεροχρωματίνη (-TPR).

Η δυνητική χρωματίνη (Facultativeheterochromatin) μπορεί να ενεργοποιηθείως απόκριση σε διάφορα αναπτυξιακά ήεξωτερικά ερεθίσματα, με τη στρατολόγησηδιαφόρων πρωτεϊνικών συμπλεγμάτωνενεργοποίησης της μεταγραφής, απώλειατης ιστόνης Η1 και με ιστονικέςτροποποιήσεις.

Η προσθήκη της ιστόνης Η1 προάγει τη συμπύκνωση της χρωματίνης:

Trojer & Reinberg (2007) Molecular Cell 28:1-12

Αν και η μεσοφασική χρωματίνη φαίνεται να είναι ομοιόμορφα κατανεμημένη, στηνπραγματικότητα τα χρωμοσώματα είναι διατεταγμένα με οργανωμένο τρόπο και χωρίζονται σεδιακριτές λειτουργικές επικράτειες που έχουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής

32

έκφρασης. Τη μη τυχαία κατανομή της χρωματίνης στον μεσοφασικό πυρήνα εισηγήθηκε γιαπρώτη φορά το 1885 ο Carl Rabl, ο οποίος διατύπωσε την πρόταση ότι κάθε χρωμόσωμακαταλαμβάνει μια διακριτή επικράτεια, με τα κεντρομερή και τα τελομερή να προσδένονται σεαντίθετες πλευρές του πυρηνικού φακέλου (Εικ. 9.17).

ΕΙΚΟΝΑ 9.17: Οργάνωση τωνχρωμοσωμάτων.Αναπαραγωγή χειρόγραφων σχεδίωνχρωμοσωμάτων σε κύτταρα σαλαμάνδρας.(Α) Πλήρη χρωμοσώματα.(Β) Μόνο τα τελομερή (που εντοπίζονται στηνπυρηνική μεμβράνη). [Rabl C (1885)Morphologisches Jahrbuch 10: 214].

Αυτό το βασικό μοντέλο οργάνωσης της χρωματίνης επιβεβαιώθηκε το 1984 με λεπτομερείςμελέτες των πολυταινικών χρωμοσωμάτων των σιελογόνων αδένων της Drosophila. Όπωςδιαπιστώθηκε, τα χρωμοσώματα δεν τυλίγονται τυχαία το ένα γύρω από το άλλο, αλλά κάθεχρωμόσωμα καταλαμβάνει μια διακριτή περιοχή του πυρήνα (Εικ. 9.18). Τα χρωμοσώματασυνδέονται στενά με τον πυρηνικό φάκελο σε πολλές θέσεις. Πολλές από αυτές τις συνδέσειςοδηγούν σε καταστολή της γονιδιακής έκφρασης, κάποιες άλλες όμως, όπως οι συνδέσεις με τασύμπλοκα του πυρηνικού πόρου, προάγουν τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων.

ΕΙΚΟΝΑ 9.18: Οργάνωση των χρωμοσωμάτων τηςDrosophila

(Α) Μοντέλο του πυρήνα, στο οποίο παρουσιάζονται μεδιαφορετικά χρώματα οι βραχίονες των πέντεχρωμοσωμάτων. Υποδεικνύονται oι θέσεις των τελομερώνκαι των κεντρομερών.

(Β) Παρουσιάζονται οι δύο βραχίονες του χρωμοσώματος 3,προκειμένου να φανεί ο τοπολογικός διαχωρισμός τωνχρωμοσωμάτων. [Matdog D, et al. (1984) Nature 308: 414].

Μεμονωμένα χρωμοσώματα καταλαμβάνουν διακριτές επικράτειες στους πυρήνες τωνκυττάρων θηλαστικών (Εικ. 9.19). Τα ενεργώς μεταγραφόμενα γονίδια εντοπίζονται στηνπεριφέρεια αυτών των επικρατειών, δίπλα σε «διαύλους» που χωρίζουν τα χρωμοσώματα μεταξύτους. Θεωρείται ότι τα νεοσυντιθέμενα μόρια RNA απελευθερώνονται μέσα σε αυτούς τους«διαύλους» και εκεί λαμβάνει χώρα η επεξεργασία του RNA. Μεγάλο μέρος της ετεροχρωματίνηςεντοπίζεται στην περιφέρεια του πυρήνα, καθώς πρωτεΐνες που συνδέονται με την ετεροχρωματίνηπροσδένονται στο πλέγμα της πυρηνικής λάμινας. Εφόσον διαφορετικοί τύποι κυττάρωνεκφράζουν διαφορετικά γονίδια, η δυνητική ετεροχρωματίνη, καθώς και οι περιοχές τωνχρωμοσωμάτων που αλληλεπιδρούν με την πυρηνική λάμινα διαφέρουν μεταξύ διαφορετικώνκυττάρων και ιστών. Σε μερικά κύτταρα, τα κεντρομερή και τα τελομερή είναι συγκεντρωμένα σεαντίθετους πόλους, ενώ σε άλλα κύτταρα τα χρωμοσώματα διατάσσονται ακτινωτά. Οι θέσεις τωνχρωμοσωμάτων μέσα στον πυρήνα διαφέρουν επίσης ανάλογα με τον οργανισμό και τον τύπο τουιστού. Εξάλλου, η χρωματίνη στο εσωτερικό του πυρήνα αναδιοργανώνεται κατά την κυτταρικήδιαφοροποίηση και σε συντονισμό με αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Αν και αυτή η δυναμικήαναδιοργάνωση της χρωματίνης είναι πολύπλοκη και δεν έχει κατανοηθεί πλήρως, είναι γνωστό ότι

33

βασίζεται, τουλάχιστον εν μέρει, στην ακτίνη και στη μυοσίνη του πυρήνα - πρωτεΐνες πουχαρακτηρίστηκαν για πρώτη φορά στον κυτταροσκελετό.

Περίληψη στα

ΕΙΚΟΝΑ 9.19: Οργάνωση των χρωμοσωμάτων στον πυρήνατων θηλαστικών.

(Α) Ανιχνευτές επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών τουχρωμοσώματος 4 χρησιμοποιήθηκαν για πείραμα υβριδισμού σεένα ανθρώπινο κύτταρο. Τα δύο αντίγραφα του χρωμοσώματος4, το οποίο ταυτοποιείται με τον φθορισμό κίτρινου χρώματος,καταλαμβάνουν διακριτές επικράτειες μέσα στον πυρήνα.

(Β) Μοντέλο οργάνωσης των χρωμοσωμάτων. Τα χρωμοσώματακαταλαμβάνουν διακριτές επικράτειες, οι οποίες χωρίζονταιμεταξύ τους με διαχρωμοσωμικές περιοχές, όπου θεωρείται ότιλαμβάνουν χώρα η επεξεργασία και η μεταφορά του RNA.[Lamond AI & Earnshaw, WC (1999) Science 280: 547].

Τα χρωμοσώματα καταλαμβάνουν διακριτές περιοχές στον πυρήνα που ονομάζονται‘χρωμοσωμικές επικράτειες'.

Χρωμοσωμικές επικράτειες σε ινοβλάστες κοτόπουλου. (a) Μεταφασικά χρωμοσώματαινοβλαστών κοτόπουλου μετά από χρώση. (b) Τα ίδια μεταφασικά χρωμοσώματα μετά απόυβριδισμό ανιχνευτών που έχουν σημανθεί με μια φθορίζουσα χρωστική διαφορετικού χρώματος[Φθορίζων υβριδισμός πολλαπλών χρωμάτων in situ (mFISH; multicolour Fluorescence in situhybridisation). (c) Τα χρώματα της φθορίζουσας ουσίας που χρησιμοποιήθηκε για τη σήμανσηκάθε χρωμοσώματος. Χρωμόσωμα 1 - κόκκινο; Chr2 - πράσινο; Chr3 - μπλε; Chr4 - πορτοκαλί;

34

Chr5 - μωβ; Chr6 - ροζ; ChrZ - μπλε ανοικτό, κλπ. (d) Οπτική τομή διαμέσου του πυρήνα μιαςινοβλάστη κοτόπουλου που απεικονίζει με διαφορετικό χρώμα τις διαφορετικές χρωμοσωμικέςεπικράτειες, κάθε μια από τις οποίες αντιστοιχεί σε ένα διαφορετικό χρωμόσωμα. Κάθεχρωμόσωμα εντοπίζεται σε διαφορετική θέση στον πυρήνα, και τα ομόλογα χρωμοσώματα έχουνεπίσης διαφορετική θέση εντοπισμού μέσα στον πυρήνα (π.χ. χρωμοσώματα 2 και 5). [Misteli T.(2008) Chromosome territories: The arrangement of chromosomes in the nucleus. Nature Edu 1(1):167].

Όπως και το DNA στα μεταφασικά χρωμοσώματα (Εικ. 5.16), η χρωματίνη των μεσοφασικώνπυρήνων είναι οργανωμένη σε περιοχές βρόχων που περιέχουν περίπου 50-100 kb DNA. Ένακαλό παράδειγμα αυτής της οργάνωσης είναι τα εντόνως μεταγραφόμενα χρωμοσώματα τωνωοκυττάρων των αμφιβίων, όπου οι ενεργώς μεταγραφόμενες περιοχές DNA είναι ορατές στομικροσκόπιο ως μεγάλοι βρόχοι αποδιπλωμένης χρωματίνης (Εικ. 9.20). Αυτές οι περιοχέςφαίνεται ότι αντιστοιχούν σε διακριτές λειτουργικές μονάδες, οι οποίες ρυθμίζουν ανεξάρτητα τηγονιδιακή έκφραση.

ΕΙΚΟΝΑ 9.20: Φωτογραφία φωτονικού μικροσκοπίου που δείχνει ένα χρωμόσωμαωοκυττάρου αμφιβίου. Φαίνονται οι αποσυμπυκνωμένοι βρόχοι ενεργώς μεταγραφόμενηςχρωματίνης που εκτείνονται από έναν άξονα μη μεταγραφόμενης χρωματίνης υψηλήςσυμπύκνωσης.

35

Υποδιαμερίσματα μέσα στον πυρήναΗ εσωτερική οργάνωση του πυρήνα καταδεικνύεται περαιτέρω από τον καταμερισμό τωνπερισσότερων πυρηνικών διεργασιών σε συγκεκριμένες, διακριτές περιοχές του πυρήνα. Πολλάσημαντικά ένζυμα και πρωτεΐνες του πυρήνα εντοπίζονται σε διακριτά υποπυρηνικά σωμάτια μεσπογγοειδή δομή χαμηλής πυκνότητας, η οποία επιτρέπει την είσοδο και έξοδο μακρομορίων απότις υπόλοιπες περιοχές του πυρήνα. Για ορισμένες από αυτές τις δομές έχουν προσδιοριστείσήματα στόχευσης ή συγκράτησης. Η φύση και η λειτουργία αυτών των διακριτών πυρηνικώνδομών παραμένει ασαφής και η κατανόηση της ενδοπυρηνικής οργάνωσης συγκεκριμένωνβιοχημικών διαδικασιών αποτελεί ένα πεδίο έρευνας της κυτταρικής βιολογίας.

Πυρηνικά στίγματα (nuclear speckles): Συστατικά της συσκευής ματίσματος του RNAΣωμάτια PML: Αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη και αποτελούν θέσεις συσσώρευσηςμεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνών τροποποίησης της χρωματίνηςΣωμάτια Cajal: Περιέχουν τη χαρακτηριστική πρωτεΐνη κοϊλίνη (coilin) και πλήθος μικρών RNP. Τασωμάτια αυτά θεωρείται ότι λειτουργούν ως θέσεις συναρμολόγησης και επεξεργασίας των RNP.Πυρηνίσκος (nucleolus): Αποτελεί τη θέση μεταγραφής και επεξεργασίας του rRNA, καθώς και τηθέση έναρξης της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων.

Οι πυρήνες των κυττάρων των θηλαστικών περιέχουν ομαδοποιημένες θέσεις (εστίες)αντιγραφής DNA στις οποίες λαμβάνει χώρα η αντιγραφή πολλαπλών μορίων DNA. Αυτές οιδιακριτές θέσεις αντιγραφής του DNA προσδιορίστηκαν με πειράματα απεικόνισης τουνεοσυντιθέμενου DNA στο εσωτερικό των πυρήνων έπειτα από σήμανση των κυττάρων μεβρομοδεοξυουριδίνη, ένα ανάλογο θυμιδίνης που ενσωματώνεται στο DNA και μπορεί ναανιχνευθεί μέσω χρώσης με φθορίζοντα αντισώματα (Εικ. 9.21). Κατά την έναρξη της σύνθεσηςDNA, το DNA που μόλις είχε αντιγραφεί ανιχνεύθηκε σε ~20 εστίες που ήταν συγκεντρωμένεςγύρω από τον πυρηνίσκο και συνδεδεμένες με πυρηνικές λαμίνες. Στη συνέχεια, η διαδικασία τηςσύνθεσης του DNA επεκτάθηκε σε εκατοντάδες εστίες διάσπαρτες σε ολόκληρο τον πυρήνα.Εφόσον σε ένα διπλοειδές κύτταρο θηλαστικού μπορούν να είναι ενεργές ανά πάσα στιγμή ~4.000θέσεις έναρξης της αντιγραφής, καθεμία από αυτές τις εστίες αντιγραφής θα πρέπει να περιέχειπολλαπλές διχάλες αντιγραφής του DNA. Επομένως, η αντιγραφή του DNA λαμβάνει χώρα σεμεγάλες δομές που περιέχουν πολυάριθμα σύμπλοκα αντιγραφής οργανωμένα σε διακριτάλειτουργικά σωμάτια. Τα σωμάτια αυτά έχουν ονομαστεί εργοστάσια αντιγραφής.

36

ΕΙΚΟΝΑ 9.21: Ομαδοποιημένες θέσεις αντιγραφής του DNA. DNA που έχει μόλις αντιγραφείσημάνθηκε με σύντομη έκθεση των κυττάρων σε βρομοδεοξυουριδίνη, η οποία ενσωματώνεται στοDNA στη θέση της θυμιδίνης. Αυτή η αντικατάσταση επιτρέπει την ανίχνευση του νεοσυντιθέμενουDNA μέσω ανοσοφθορισμού μετά από χρώση με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει τηβρομοδεοξυουριδίνη. Παρατηρήστε ότι το νεοσυντιθέμενο DNA συναντάται σε διακριτές εστίες πουκατανέμονται σε ολόκληρο τον πυρήνα. Οι δύο φωτογραφίες δείχνουν την κατανομή στην αρχή καιστο τέλος της σύνθεσης του DNA αντίστοιχα [Kennedy BK, et al. (2000) Genes Dev. 14: 2855].

Πυρηνικά στίγματα: Ενώ τα ενεργώς μεταγραφόμενα γονίδια εμφανίζονται κατανεμημένα σεολόκληρο τον πυρήνα, τα συστατικά της συσκευής ματίσματος του RNA και RNPs είναισυγκεντρωμένα σε διακριτά πυρηνικά σωμάτια, που είναι γνωστά ως πυρηνικά στίγματα (nuclearspeckles). Τα πυρηνικά στίγματα έχουν είναι δομές με ακανόνιστα σχήματα και μέγεθος 0.8 - 1.8μm, και ένας τυπικός πυρήνας περιέχει 25-50 τέτοιες υποπυρηνικές δομές που δεν κατανέμονταιομοιόμορφα σε ολόκληρο τον πυρήνα.

Χρώσεις ανοσοφθορισμού όπου χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα που αναγνωρίζουν snRNP καιπαράγοντες ματίσματος κατέδειξαν ότι τα συστατικά της συσκευής ματίσματος RNA (π.χ. οιπρωτεΐνες SR) συμπεριλαμβανομένων των μικρών πυρηνικών ριβονουκλεοπρωτεϊνικών σωματίων(snRNPs) και μη-snRNP πρωτεϊνικών συμπλόκων ματίσματος (π.χ. SC35) συγκεντρώνονταιαποκλειστικά σε αυτές τις 20-50 διακριτές δομές πυρηνικών στιγμάτων και δεν κατανέμονταιομοιόμορφα σε ολόκληρο τον πυρήνα (Εικ. 9.22).

Θεωρείται ότι τα πυρηνικά στίγματα είναι θέσεις αποθήκευσης συστατικών της συσκευήςματίσματος, τα οποία στη συνέχεια στρατολογούνται σε ενεργώς μεταγραφόμενα γονίδια κατά τηνεπεξεργασία του pre-mRNA.

ΕΙΚΟΝΑ 9.22: Εντοπισμός συστατικών της συσκευήςματίσματος. Η χρώση με αντισώματα ανοσοφθορισμούδείχνει ότι οι παράγοντες ματίσματος συγκεντρώνονται σεδιακριτά σωμάτια στο εσωτερικό του πυρήνα, τα οποίαονομάζονται πυρηνικά στίγματα.

37

Οι πυρήνες περιέχουν και άλλους τύπους διακριτών δομών, όπως τα σωμάτια PML και τασωμάτια Cajal.

Οι πυρήνες περιέχουν επίσης αρκετούς άλλους τύπους διακριτών δομών. Εκτός από τουςπυρηνίσκους, μεταξύ των δομών αυτών περιλαμβάνονται τα σωμάτια PML και τα σωμάτια Cajal.

Τα σωμάτια PML (έχουν μέγεθος 0.3 - 1 μm και απαντώνται περίπου 5-20 σε έναν τυπικόπυρήνα. Τα σωμάτια PML ταυτοποιήθηκαν ως διακριτές θέσεις εντοπισμού μιας πρωτεΐνηςρύθμισης της μεταγραφής που συνδέεται με την οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (PML;Promyelocytic Leukemia). Τα σωμάτια PML αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη (Εικ. 9.23) καιαποτελούν θέσεις συσσώρευσης μεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνών τροποποίησης τηςχρωματίνης (όπως είναι οι απακετυλάσες των ιστονών), που ενδέχεται να στοχεύονται στασωμάτια PML από το μικρό πολυπεπτίδιο SUMO. Τα σωμάτια PML εντοπίζονται σε θέσειςπλούσιες σε γονίδια και μεταγραφικά ενεργές περιοχές της χρωματίνης. Ωστόσο, η λειτουργία τωνσωματίων PML παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Τα σωμάτια (Εικ. 9.24) περιέχουν τηχαρακτηριστική πρωτεΐνη κοϊλίνη (coilin) και πλήθος μικρών RNP. Τα σωμάτια αυτά θεωρείται ότιλειτουργούν ως θέσεις συναρμολόγησης και επεξεργασίας των RNP.

Αντίσωμα PML; Χρώση: HoeschtΕΙΚΟΝΑ 9.23: Ένα σωμάτιο PML. Το σωμάτιο PML (βέλος) περιβάλλεται από χρωματίνη.(Dellaire G, Nisman R, Bazett-Jones DP. 2004. Met. Enzymol. 375:456)

Τα σωμάτια Cajal μεγέθους 0.2-1 (έως 2) μm περιέχουν τη χαρακτηριστική πρωτεΐνη κοϊλίνη (p80coilin) και πλήθος μικρών RNP. Τα σωμάτια αυτά φαίνονται ως σπειρωμένα νημάτια και θεωρείταιότι λειτουργούν ως θέσεις συναρμολόγησης και επεξεργασίας των RNP, ιδιαίτερα των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων των μικρών πυρηνισκικών RNAs (snRNPs & snoRNPs).Υπάρχουν περίπου 6 σωμάτια Cajal ανά κύτταρο. Η κοϊλίνη είναι σημαντική για την επεξεργασίατων snRNPS αλλά επίσης διασυνδέει τα σωμάτια Cajal με τον πυρηνίσκο.

ΕΙΚΟΝΑ 9.24: Σωμάτια Cajal στον πυρήνα. (Α) Εικόνα του πυρήνα ενός κυττάρου HeLa σεμικροσκοπία αντίθεσης-διαφορικής συμβολής. Τα βέλη υποδεικνύουν τα δύο σωμάτια Cajal. (Β)Σήμανση του ίδιου πυρήνα με ανοσοφθορισμό, χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουντις πρωτεΐνες κοϊλίνη (πράσινο) και φιμπριλλαρίνη (κόκκινο). Η φιμπριλλαρίνη συναντάται τόσοστις πυκνές ινώδεις ζώνες των πυρηνίσκων όσο και στα σωμάτια Cajal. Η κοϊλίνη ανιχνεύεται μόνοστα σωμάτια Cajal [Gall JG (2000) Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 273].

38

Η κοϊλίνη (p80; ΜΒ~80 kDa) δεν εντοπίζεται μαζί τις θέσεις (εστίες) μεταγραφής DNA.(A) Κύτταρα HeLa επωάστηκαν με βρωμοδεοξυουριδίνη (Br-UTP) και στη συνέχειαμονιμοποιήθηκαν και επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κοϊλίνης. Οι θέσειςενσωμάτωσης της βρωμοδεοξυουριδίνης απεικονίζονται πράσινες, ενώ οι θέσεις που περιέχουνκοϊλίνη εμφανίζονται κόκκινες. Η κοϊλίνη εντοπίζεται σε σπειρωμένα σωμάτια (νημάτια) (άσπραβέλη) και σε πολυάριθμες πυρηνοπλασματικές εστίες (κεφαλές βελών).(B) Σε πυρήνες κυττάρων HeLa έγινε μικροέγχυση αντισωμάτων για την κοϊλίνη, και 24 h μετά τακύτταρα επωάστηκαν με Br-UTP. Οι μικροεστίες κοϊλίνης (κόκκινες) δεν συνεντοπίζονται με τιςθέσεις (εστίες) έναρξης της μεταγραφής (πράσινες). Bar, 10 μm. [Almeida F et al. (1998).Microinjection of anti-coilin antibodies affects the structure of coiled bodies. J Cell Sci 142:899].

39

Περίληψη διακριτών δομών στον πυρήνα

40

9.3. Ο πυρηνίσκος και η επεξεργασία του rRNAΤο εμφανέστερο από τα πυρηνικά σωμάτια είναι ο πυρηνίσκος (Εικ. 9.1), που αποτελεί τη θέσημεταγραφής και επεξεργασίας του rRNA, καθώς και τη θέση έναρξης της συναρμολόγησης τωνριβοσωμάτων. Τα κύτταρα απαιτούν μεγάλο αριθμό ριβοσωμάτων σε συγκεκριμένες χρονικέςστιγμές ώστε να ικανοποιήσουν τις ανάγκες τους για πρωτεϊνοσύνθεση. Τα ενεργώς αυξανόμενακύτταρα θηλαστικών περιέχουν 5-10 εκατομμύρια ριβοσώματα, τα οποία πρέπει να συντεθούνκάθε φορά που διαιρείται το κύτταρο. Ο πυρηνίσκος είναι ένα εργοστάσιο παραγωγήςριβοσωμάτων που πληροί την ανάγκη για ρυθμιζόμενη και αποδοτική παραγωγή RRNA και γιασυναρμολόγηση των ριβοσωμικών υπομονάδων. Οι πυρηνίσκοι έχουν επίσης έναν πιο γενικόρόλο στην τροποποίηση του RNA και αρκετοί τύποι μορίων RNA κινούνται από και προς τονπυρηνίσκο σε συγκεκριμένα στάδια της επεξεργασίας τους.

Ευκαρυωτικό ριβόσωμα και Γονίδια rRNA

Το ευκαρυωτικό ριβόσωμα διαθέτει μάζα ≈ 4.2 MDa και αποτελείται από δύο διακριτέςυπομονάδες διαφορετικού μεγέθους, τη μικρή και τη μεγάλη, οι οποίες αλληλεπιδρούν μεταξύ τουςκατά την πρωτεϊνοσύνθεση. Στο ριβοπρωτεϊνικό σύμπλοκο του ριβοσώματος μια αναλογίαRNA:πρωτεΐνη ίση με 2:1 έχει παγιωθεί στη διάρκεια της εξέλιξης και απαντάται στα ριβοσώματα

41

όλων των ειδών με εξαίρεση τα μιτοχόνδρια των θηλαστικών όπου η αναλογία είναι ανεστραμμένη.Τα ριβοσώματα χαρακτηρίζονται από τον συντελεστή καθίζησης σε διαβαθμισμένες στήλες CsClπου εμφανίζουν εκφρασμένο σε μονάδες Svedberg [10−13 S] ( Theodor H. E. Svedberg, NobelΧημείας 1926). Έτσι το ριβόσωμα των ευκαρυωτικών είναι γνωστό ως 80S, με μια μικρήυπομονάδα 40 S και μια μεγάλη υπομονάδα 60 S.

Οι ριβοσωματικές πρωτεϊνες (r-proteins) χαρακτηρίζονται από την υπομονάδα του ριβοσώματοςμε την οποία προσδένονται. Στον άνθρωπο υπάρχουν 33 πρωτεΐνες που συνδέονται με την μικρήυπομονάδα (S1-S33), μερικές από τις οποίες συμβάλλουν στη σταθερή πρόσδεση του mRNA, και50 πρωτεΐνες που συνδέονται με την μεγάλη υπομονάδα (L1-L50), μερικές από τις οποίεςσυμβάλλουν στη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης.

Η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα 40S φέρει μαζί με τις r-πρωτεϊνες S1-S33, και το 18S rRNA,ενώ η μεγάλη υπομονάδα 60S φέρει μαζί με τις r-πρωτεϊνες L1-L50, και τα ριβωσωμικά RNAs,28S, 5.8S και 5S rRNAs, τα οποία κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια.Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A Steitz και Ada E Yonath, Nobel Χημείας (2009) για τιςμελέτες τους στη δομή και τη λειτουργία του ριβοσώματος.

Γονίδια του ριβοσωμικού rRNA και οργάνωση του πυρηνίσκουΟ πυρηνίσκος (nucleolus), ο οποίος δεν περιβάλλεται από μεμβράνη, συνδέεται με τιςχρωμοσωμικές περιοχές όπου περιέχονται τα γονίδια 5,8S, 18S και 28S rRNA. Τα ριβοσώματατων ανώτερων ευκαρυωτών περιέχουν 4 τύπους RNA, τα 5S, 5,8S, 18S και 28S rRNA. Τα5.8S,18S και 28S rRNA μεταγράφονται ως ενιαία μονάδα μέσα στον πυρηνίσκο από την RNAπολυμεράση I, που παράγει ένα πρόδρομο ριβοσωμικό RNA, το 45S (Εικ. 9.25). Το 45S pre-rRNAυπόκειται σε επεξεργασία, από την οποία προκύπτουν το 18S rRNA της μικρής ριβοσωμικήςυπομονάδας (40S) και τα 5,8S και 28S rRNA της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας (60S). Ημεταγραφή του 5S rRNA, που επίσης συναντάται στη ριβοσωμική υπομονάδα 60S, λαμβάνει χώραεκτός του πυρηνίσκου στους ανώτερους ευκαρυώτες και καταλύεται από την RNA πολυμεράση III.

Προκειμένου να ανταποκριθούν στην ανάγκη για μεγάλο αριθμό μορίων rRNA, όλα τα κύτταραπεριέχουν πολυάριθμα αντίγραφα των γονιδίων rRNA. Το γονιδίωμα του ανθρώπου περιέχει ~200αντίγραφα του γονιδίου που κωδικοποιεί για τα 5,8S,18S και 28S rRNA και ~2.000 αντίγραφα τουγονιδίου που κωδικοποιεί για το 5S rRNA. Τα γονίδια των 5,8S, 18S και 28S rRNA ομαδοποιούνταισε συστοιχίες διαδοχικών επαναλήψεων σε 5 διαφορετικά ανθρώπινα χρωμοσώματα(χρωμοσώματα 13, 14,15, 21 και 22), ενώ τα γονίδια του 5S rRNA εντοπίζονται σε μία μόνοσυστοιχία διαδοχικών επαναλήψεων στο χρωμόσωμα 1.

ΕΙΚΟΝΑ 9.25: Τα γονίδια του ριβοσωμικού RNA. Κάθε γονίδιο rRNA αποτελεί μια μονάδαμεταγραφής που περιέχει τα 18S, 5,8S και 28S rRNA, καθώς και μεσοδιαστήματαμεταγραφόμενων αλληλουχιών. Τα γονίδια rRNA οργανώνονται σε συστοιχίες διαδοχικώνεπαναλήψεων, οι οποίες χωρίζονται μεταξύ τους από μεσοδιαστήματα μη μεταγραφόμενου DNA.Τα γονίδια 18S, 5,8S και 28S rRNA μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση I παράγοντας έναενιαίο pre-rRNA 45 S το οποίο υφίσταται επεξεργασία και μάτισμα παράγοντας τα 18S, 5,8S και28S rRNAs.

Γονίδιο 5S rRNA: Σε αντίθεση με τα γονίδια 5.8S, 18S και 28S rRNA που εντοπίζονται στονπυρηνίσκο όπου και μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση I, τα γονίδια 5S rRNA εντοπίζονταιστον πυρήνα ως συστοιχίες διαδοχικών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών, και μεταγράφονταιαπό την RNA πολυμεράση ΙΙΙ.

42

Οργάνωση των γονιδίων 5S rRNA. Τα γονίδια 5S rRNA εντοπίζονται σε πολλαπλά αντίγραφα,καθένα από τα οποία φέρει μια κωδική περιοχή 200 bp από το κωδικόνιο έναρξης της μεταγραφήςστο κωδικόνιο λήξης της μεταγραφής που μετά από επεξεργασία το ώριμο 5S rRNA πουενσωματώνεται στην μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα 60S, έχει μέγεθος 120 bp. Τα γονίδια 5SrRNA διαχωρίζονται μεταξύ τους με αλληλουχίες μεσοδιαστήματος (NTS; non transcribed DNAsegments) διαφορετικού μεγέθους.

Η σημασία της παραγωγής ριβοσωμάτων είναι ιδιαίτερα εμφανής στα ωοκύτταρα, όπου ταγονίδια rRNA ενισχύονται ώστε να υποστηριχτεί η σύνθεση του μεγάλου αριθμού ριβοσωμάτωνπου απαιτούνται για τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης των εμβρύων. Στα ωοκύτταρα του βατράχουXenopus, τα γονίδια rRNA πολλαπλασιάζονται ~2.000 φορές, με αποτέλεσμα να υπάρχουν έναεκατομμύριο περίπου αντίγραφα τους ανά κύτταρο. Αυτά τα πολλαπλασιασμένα γονίδια rRNAκατανέμονται σε χιλιάδες πυρηνίσκους (Εικ. 9.26), οι οποίοι υποστηρίζουν τη συσσώρευση σχεδόν1012 ριβοσωμάτων ανά ωοκύτταρο.

ΕΙΚΟΝΑ 9.26: Πυρηνίσκοι σε ωοκύτταρα αμφιβίων. Ταπολλαπλασιασμένα γονίδια rRNA ωοκυττάρων Xenopusσυγκεντρώνονται σε πολυάριθμους πυρηνίσκους (σκουρόχρωμεςκηλίδες). (Brown DD and Dawid IB. 1969. Science 160: 272.)

Από μορφολογική άποψη, ο πυρηνίσκος διακρίνεται σε τρεις περιοχές: το ινώδες κέντρο, τοπυκνό ινώδες συστατικό και το κοκκιώδες συστατικό (Εικ. 9.27). Αυτές οι διαφορετικές περιοχέςθεωρείται ότι αντιπροσωπεύουν τις θέσεις όπου επιτελούνται τα διαδοχικά στάδια της μεταγραφήςrRNA, της επεξεργασίας rRNA και της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων αντίστοιχα. Ητροποποίηση άλλων μικρών μορίων RNA, όπως αυτών του σωματίου αναγνώρισης σήματος,λαμβάνει χώρα σε άλλες περιοχές του πυρηνίσκου.

ΕΙΚΟΝΑ 9.27: Δομή του πυρηνίσκου. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει τοινώδες κέντρο (FC, Fibrillar Center), το πυκνό ινώδες συστατικό (DFC, Dense Fibrillar Component)και το κοκκιώδες συστατικό (G, Granular component) ενός πυρηνίσκου.

Ινώδες κέντρο: Μεταγραφή rRNA

Πυκνό ινώδεςσυστατικό:Επεξεργασία rRNA

Κοκκιώδεςσυστατικό:Συναρμολόγησηριβοσωμάτων

43

Έπειτα από κάθε κυτταρική διαίρεση, οι πυρηνίσκοι συνδέονται με τις χρωμοσωμικές περιοχέςπου περιέχουν τα γονίδια των 5.8S, 18S και 28S rRNA, που γι' αυτόν τον λόγο ονομάζονταιπεριοχές οργανωτή του πυρηνίσκου (nucleolar organizing regions). Ο σχηματισμός πυρηνίσκωναπαιτεί τη μεταγραφή του 45S pre-mRNA, που οδηγεί στη σύντηξη μικρών πρόδρομων σωματίωνπου περιέχουν παράγοντες επεξεργασίας και άλλα συστατικά του πυρηνίσκου. Στα περισσότερακύτταρα, πυρηνίσκοι που αρχικά είναι μεμονωμένοι συντήκονται, σχηματίζοντας έναν ενιαίο,μεγαλύτερο πυρηνίσκο. Το μέγεθος του πυρηνίσκου εξαρτάται από τη μεταβολική δραστηριότητατου κυττάρου, δηλαδή μεγάλοι πυρηνίσκοι συναντώνται σε κύτtαρα με έντονη πρωτεϊνοσυνθετικήενεργότητα. Αυτή η διακύμανση μεγέθους οφείλεται κυρίως σε διαφορές στο μέγεθος τουκοκκιώδους συστατικού του πυρηνίσκου, που αντανακλούν τα διαφορετικά επίπεδασυναρμολόγησης των ριβοσωμάτων.

Μεταγραφή και επεξεργασία του rRNAΚάθε περιοχή οργανωτή του πυρηνίσκου περιέχει μια συστοιχία διαδοχικά επαναλαμβανόμενωνγονιδίων rRNA, τα οποία χωρίζονται μεταξύ τους από μεσοδιαστήματα μη μεταγραφόμενου DNA.Τα γονίδια αυτά μεταγράφονται πολύ ενεργά από την RNA πολυμεράση I και επομένως είναιορατά με ευχέρεια σε ηλεκτρονική μικροσκοπία (Εικ. 9.28).

ΕΙΚΟΝΑ 9.28: Μεταγραφή γονιδίων rRNA. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνειτη χρωματίνη του πυρηνίσκου. Φαίνονται τρία γονίδια rRNA χωρισμένα μεταξύ τους απόμεσοδιαστήματα μη μεταγραφόμενου DNA. Κάθε γονίδιο rRNA περιβάλλεται από μια συστοιχίααυξανόμενων αλυσίδων RNA, σχηματίζοντας μια δομή που θυμίζει χριστουγεννιάτικο δέντρο.

Στις φωτογραφίες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, καθένα από τα γονίδια rRNA της συστοιχίαςφαίνεται να περιβάλλεται από αυξανόμενες αλυσίδες RNA πυκνής διάταξης, οι οποίες σχηματίζουνμια δομή που θυμίζει χριστουγεννιάτικο δέντρο. Η υψηλή πυκνότητα των αυξανόμενων αλυσίδωνRNA αντανακλά την υψηλή πυκνότητα των μορίων RNA πολυμεράσης, τα οποία συναντώνται μεμέγιστη πυκνότητα ενός περίπου μορίου πολυμεράσης ανά εκατό ζεύγη βάσεων της μήτρας DNA.

Στους ανώτερους ευκαρυώτες, το πρωτογενές μετάγραφο των γονιδίων rRNA είναι το μεγάλοpre-rRNA 45S, που περιέχει τα 18S, 5.8S και 28S rRNA, καθώς και μεταγραφόμενες περιοχέςμεσοδιαστήματος (Εικ. 9.29). Τόσο τα 5' άκρα όσο και τα 3' άκρα των pre-rRNA περιέχουνεξωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενης αλληλουχίας, ενώ μεταξύ των αλληλουχιών των 18S,5,8S και 28S rRNA υπάρχουν επίσης δύο εσωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενηςαλληλουχίας. Τα αρχικά βήματα επεξεργασία του μεταγράφου περιλαμβάνουν τομές στο εξωτερικόμεσοδιάστημα μεταγραφόμενης αλληλουχίας του 5' άκρου του pre-rRNA και απομάκρυνση τουεξωτερικού μεσοδιαστήματος μεταγραφόμενης αλληλουχίας του 3' άκρου. Ακολουθούν επιπλέοντομές, που οδηγούν στον σχηματισμό των ώριμων μορίων rRNA. Η επεξεργασία του rRNAακολουθεί παρόμοιο πρότυπο σε όλους τους ευκαρυώτες, αν και μπορεί να υπάρχουν διαφορέςως προς τη σειρά ή τον αριθμό των τομών.

44

ΕΙΚΟΝΑ 9.29: Επεξεργασία του pre-rRNA. Το μετάγραφο 45S pre-rRNA των ανώτερωνευκαρυωτών περιέχει εξωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενης αλληλουχίας (ETS, ExternalTranscribed Spacers) στα δύο άκρα του και εσωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενηςαλληλουχίας (ΙTS, Internal Transcribed Spacers) ανάμεσα στις αλληλουχίες των 18S, 5.8S και 28SrRNA. Το pre-rRNA υπόκειται σε επεξεργασία μέσω μιας σειράς τομών, από τις οποίες παράγονταιτα ώριμα rRNA.

Εκτός από τομές, η επεξεργασία του pre-rRNA περιλαμβάνει σε σημαντικό βαθμό τροποποίησηβάσεων, που προκύπτει τόσο από την προσθήκη μεθυλομάδων σε συγκεκριμένες βάσεις καικατάλοιπα ριβόζης όσο και από τη μετατροπή ουριδίνης σε ψευδοουριδίνη. Στα ζωικά κύτταρα, ηεπεξεργασία του pre-rRNA περιλαμβάνει μεθυλίωση ~100 καταλοίπων ριβόζης και 10 αζωτούχωνβάσεων, καθώς και σχηματισμό ~100 ψευδοουριδινών. Οι περισσότερες από αυτές τιςτροποποιήσεις συμβαίνουν κατά τη διάρκεια ή λίγο μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης του pre-rRNA, αν και ορισμένες από αυτές λαμβάνουν χώρα σε μετέπειτα στάδια της επεξεργασίας τουpre-rRNA.

Η επεξεργασία του pre-rRNA προϋποθέτει τη δράση πρωτεϊνών και μορίων RNA πουεδράζονται στον πυρηνίσκο. Είναι γνωστή η συμμετοχή μικρών πυρηνικών RNA (snRNA) στομάτισμα του pre-mRNA. Οι πυρηνίσκοι περιέχουν πάνω από 300 πρωτεΐνες και πολλά (~200)μικρά πυρηνισκικά RNA (snoRNA; small nucleolar RNA), που συμμετέχουν στην επεξεργασία τουpre-rRNA. Τα snoRNA, όπως και τα snRNA του σωματίου ματίσματος, σχηματίζουν σύμπλοκα μεπρωτεΐνες, δίνοντας snoRNP. Κάθε snoRNP αποτελείται από ένα μόριο snoRNA συνδεδεμένο με8-10 πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, τα snoRNP συγκεντρώνονται πάνω στο pre-rRNA και σχηματίζουνσύμπλοκα επεξεργασίας κατά τρόπο ανάλογο με τον σχηματισμό των σωματίων ματίσματος pre-mRNA.

Ορισμένα από τα snoRNA είναι υπεύθυνα για τις τομές του pre-rRNA, απ‘ όπου προκύπτουνπροϊόντα 18S, 5,8S και 28S. Για παράδειγμα, το snoRNA U3, που συναντάται σε ~200.000αντίγραφα ανά κύτταρο και είναι αυτό που υπάρχει σε μεγαλύτερη αφθονία στον πυρηνίσκο,απαιτείται για την τομή του pre-rRNA στα 5' εξωτερικά μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενηςαλληλουχίας. Ομοίως, το snoRNA U8 απαιτείται για την τομή του pre-rRNA ώστε να προκύψουν τα5,8S και 28S rRNA, ενώ το snoRNA U12 απαιτείται για την τομή του pre-rRNA ώστε να προκύψειτο 18S rRNA.

Τα περισσότερα snoRNA ωστόσο συμμετέχουν στη σύνθεση rRNA ως RNA-οδηγοί πουκατευθύνουν τις ειδικές τροποποιήσεις βάσεων του pre-rRNA, όπως είναι η μεθυλίωσησυγκεκριμένων καταλοίπων ριβόζης και ο σχηματισμός ψευδοουριδινών (Εικ. 9.30). Ταπερισσότερα snoRNA περιέχουν αλληλουχίες μικρού μήκους, ~15 νουκλεοτιδίων,συμπληρωματικές προς τις αλληλουχίες των 18S ή 28S rRNA, οι οποίες μάλιστα περιλαμβάνουν

45

τις θέσεις τροποποίησης βάσεων στο rRNA. Σχηματίζοντας ομόλογα ζεύγη βάσεων με τιςσυγκεκριμένες περιοχές του pre-rRNA, τα snoRNA λειτουργούν ως RNA-οδηγοί που καθοδηγούντα ένζυμα της μεθυλίωσης της ριβόζης ή της ψευδοουριδυλίωσης στις σωστές θέσεις του μορίουpre-rRNA. Η τροποποίηση βάσεων είναι απαραίτητη και σε άλλους τύπους RNA εκτός του rRNA.Ένα σχετικό παράδειγμα είναι το σωμάτιο αναγνώρισης σήματος RNA. Ο εντοπισμός των snoRNPστον πυρηνίσκο θεωρείται ότι αποτελεί τη βάση του γενικότερου ρόλου που έχει ο πυρηνίσκος στιςδιεργασίες τροποποίησης RNA.

ΕΙΚΟΝΑ 9.30: Ο ρόλος των snoRNA στην τροποποίηση των βάσεων του pre-rRNA. ΤαsnoRNA περιέχουν μικρές αλληλουχίες συμπληρωματικές με rRNA. Το ζευγάρωμα βάσεων μεταξύsnoRNA και pre-rRNA οδηγεί σε στόχευση των ενζύμων που καταλύουν τη χημική τροποποίησηαζωτούχων βάσεων (π.χ. μεθυλίωση) στις κατάλληλες θέσεις του pre-rRNA.

46

Η συναρμολόγηση των ριβοσωμάτωνΟ σχηματισμός των ριβοσωμάτων περιλαμβάνει τη συναρμολόγηση του πρόδρομου ριβοσωμικούRNA με ριβοσωμικές πρωτεΐνες και με το 5S rRNA (Εικ. 9.31). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τιςριβοσωμικές πρωτεΐνες μεταγράφονται έξω από τον πυρηνίσκο, από την RNA πολυμεράση II,παράγοντας μόρια mRNA που μεταφράζονται στα ριβοσώματα του κυτταροπλάσματος. Στησυνέχεια, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μεταφέρονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρηνίσκο, όπουσυναρμολογούνται μαζί με τα rRNA για να σχηματίσουν προριβοσωμικά σωμάτια. Αν και ταγονίδια του 5S rRNA μεταγράφονται επίσης έξω από τον πυρηνίσκο, από την RNA πολυμεράσηIII, τα 5S rRNA μεταφέρονται και αυτά στο εσωτερικό του πυρηνίσκου, όπου σχηματίζουνπροριβοσωμικά σωμάτια.

ΕΙΚΟΝΑ 9.31: Συναρμολόγηση του ριβοσώματος. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες εισάγονται από τοκυτταρόπλασμα στον πυρηνίσκο και αρχίζουν να συναρμολογούνται πάνω στο pre-rRNA πρινακόμη αρχίσει η επεξεργασία του. Κατά την επεξεργασία του pre-rRNA συναρμολογούνταιεπιπλέον ριβοσωμικές πρωτεΐνες και το 5S rRNA (το οποίο συντίθεται σε άλλη περιοχή τουπυρήνα), ώστε να σχηματιστούν προριβοσωμικά σωμάτια. Τα τελικά στάδια ωρίμανσηςλαμβάνουν χώρα μετά την εξαγωγή των προριβοσωμικών σωματίων στο κυτταρόπλασμα καιοδηγούν στον σχηματισμό των ριβοσωμικών υπομονάδων 40S και 60S.

Η σύνδεση ριβοσωμικών πρωτεϊνών με το rRNA ξεκινά ενώ η σύνθεση του pre-rRNA βρίσκεταιακόμη σε εξέλιξη και περισσότερες από τις μισές ριβοσωμικές πρωτεΐνες σχηματίζουν σύμπλοκομε το pre-rRNA πριν αρχίσει η τομή του. Οι υπόλοιπες ριβοσωμικές πρωτεΐνες καθώς και το 5SrRNA ενσωματώνονται στα προριβοσωμικά σωμάτια προοδευτικά κατά την τομή του pre-rRNA.Από τα αρχικά στάδια συναρμολόγησης του ριβοσώματος, η επεξεργασία των δύονεοσχηματιζόμενων ριβοσωμικών υπομονάδων ακολουθεί διαφορετική πορεία. Η επεξεργασία τηςμικρότερης υπομονάδας (40S), που περιέχει μόνο το 18S rRNA, είναι απλούστερη καιπεριλαμβάνει μόνο 4 ενδονουκλεολυτικές τομές. Στους ανώτερους ευκαρυώτες, η επεξεργασίααυτή ολοκληρώνεται μέσα στον πυρήνα, ενώ στον σακχαρομύκητα η τελική τομή που οδηγεί στονσχηματισμό του ώριμου 18S rRNA συμβαίνει μετά την εξαγωγή της υπομονάδας 40S στοκυτταροδιάλυμα. Η επεξεργασία της μεγαλύτερης υπομονάδας (60S), που περιέχει τα 28S, 5,8Sκαι 5S rRNA, περιλαμβάνει εκτενείς νουκλεολυτικές τομές και ολοκληρώνεται μέσα στονπυρηνίσκο. Επομένως, τα περισσότερα προριβοσωμικά σωμάτια στον πυρηνίσκο αντιστοιχούν σεπρόδρομα σύμπλοκα της μεγάλης υπομονάδας (60S). Τα τελικά στάδια ωρίμανσης τωνριβοσωμικών υπομονάδων ολοκληρώνονται μετά την εξαγωγή των προριβοσωμικών σωματίωνστο κυτταρόπλασμα και οδηγούν στον σχηματισμό των ενεργών υπομονάδων 40S και 60S τωνευκαρυωτικών ριβοσωμάτων.

47

Πιο αναλυτικά:

Βιογένεση ευκαρυωτικού ριβοσώματος. Σχηματισμός της μεγάλης (60S) και μικρήςριβοσωμικής (40S) υπομονάδας από τις οποίες προκύπτει το ευκαρυωτικό ριβόσωμα 80S.

Η βιογένεση των ριβοσωμάτων είναι μια καλά συντονισμένη διαδικασία στην οποία εμπλέκονται 3RNA πολυμεράσες και >150 μη ριβοσωμικούς παράγοντες οι οποίοι συμβάλλουν στην ωρίμανσητων ριβοσωμάτων. Τρία από τα 4 RNAs, 18S, 5.8S and 28S μεταγράφονται ως ενιαίο πρωτογενέςμεταγράφημα (pre-rRNA) 45S (ή 47S) από την RNA πολυμεράση I (RNA Pol I) στον πυρηνίσκο.Το τέταρτο rRNA, 5S, μεταγράφεται από την RNA πολυμεράση ΙΙI (RNA Pol ΙΙI) στον πυρήνα. Τα ,pre-rRNAs τροποποιούνται εκτενώς με ψευδοουριδιλίωση (Ψ) και μεθυλίωση (Μ), μια διαδικασία ηοποία συντονίζεται από μικρά πυρηνισκικά RNAs (small nucleolar RNAs; snoRNAs). Μολονότι οιτροποποιήσεις του rRNA δεν είναι κατανοητές, φαίνεται ότι είναι σημαντικές στις λειτουργίες τωνριβοσωμάτων. Για παράδειγμα, πρόσφατα καταδείχτηκε ότι η απώλεια της ψευδοουριδιλίωσηςμειώνει την πιστότητα της μετάφρασης, τη δέσμευση του tRNA τόσο στο ριβόσωμα όσον και στοmRNA.

Όλες οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες μεταγράφονται από την RNA Pol II και μεταφράζονται στοκυτταρόπλασμα. Στη συνέχεια εισάγονται στον πυρήνα όπου συγκροτούνται σε σύμπλοκο με τοpre-rRNA τη στιγμή που αυτό μεταγράφεται. Μερικές ριβοσωμικές πρωτεΐνες εμπλέκονται στηνεπεξεργασία του rRNA, στη συναρμολόγηση των ριβοσωμικών υπομονάδων και στην πυρηνικήεξαγωγή τους. Καθώς οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες συγκροτούνται σε σύμπλοκο με το pre-rRNA, τοpre-rRNA αναδιπλώνεται και υφίσταται μάτισμα για να σχηματιστούν τα 18S, 5.8S και 28S rRNAs.Το 18S rRNA μαζί με 33 ριβοσωμικές πρωτεΐνες (S1-S33) συναρμολογούνται και συγκροτούν τημικρή ριβοσωμική υπομονάδα 40S. Τα 28S, 5.8S και 5S rRNA μαζί με 50 ριβοσωμικές πρωτεΐνεςproteins (L1-L50) συναρμολογούνται και συγκροτούν τη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα 60S. Καιοι δύο ριβοσωμικές υπομονάδες εξάγονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (σελ. 60). RPL,Ριβοσωμική πρωτεΐνη της μεγάλης υπομονάδας; RPS, Ριβοσωμική πρωτεΐνη της μικρήςυπομονάδας (Xue S & Barna M. (2012). Specialized ribosomes: a new frontier in gene regulation andorganismal biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology 13:355-369).

48

ΜΟΡΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ: Ασθένειες που συνδέονται με την πυρηνική λάμινα

Οι ασθένειεςΤο 1966, οι Alan Emery και Fritz E. Dreifuss περιέγραψαν μια νέα μορφή μυϊκής δυστροφίας πουσυνδέεται με το χρωμόσωμα Χ. Κατά τα πρώτα στάδια της ασθένειας εμφανίζεται ακαμψία στουςαγκώνες, στον λαιμό και στις φτέρνες των ασθενών και συχνά υπάρχει αποκλεισμός αγωγής στηνκαρδιά. Τα συμπτώματα αυτά παρατηρούνται μέχρι την ηλικία των 10 ετών και συμπεριλαμβάνουν«ακροποδητί βάδιση» λόγω ακαμψίας του αχίλλειου τένοντα στις φτέρνες και δυσκολία κάμψηςτων αγκώνων. Από την ηλικία των 20 ετών οι ασθενείς αναπτύσσουν καρδιακά προβλήματα καιπολλές φορές κρίνεται απαραίτητη η χρήση βηματοδότη. Παρουσιάζεται σταδιακός εκφυλισμός καιεξασθένηση των μυών του ώμου και του βραχίονα, καθώς και των μυών της κνήμης, κάτι πουόμως συμβαίνει με αργό ρυθμό και συχνά δεν αποτελεί πρόβλημα προτού το άτομο φτάσει σεπροχωρημένη ηλικία.

Σχεδόν 30 χρόνια μετά την αρχική περιγραφή της ασθένειας διαπιστώθηκε ερευνητικά ότι ηφυλοσύνδετη μυϊκή δυστροφία Emery-Dreifuss οφειλόταν σε μεταλλαγές μιας άγνωστης μέχρι τότεδιαμεμβρανικής πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη αυτή ονομάστηκε εμερίνη, προς τιμήν του A. Emery.Σύντομα, αρκετές ερευνητικές ομάδες ανακάλυψαν ότι η εμερίνη είναι μια πρωτεΐνη πουεντοπίζεται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και απουσιάζει από τους ασθενείς που πάσχουναπό τη φυλοσύνδετη μυϊκή δυστροφία Emery-Dreifuss. Το εύρημα αυτό ήταν απροσδόκητο, καθώςφαινόταν ότι μεταλλάξεις μιας πρωτεΐνης του πυρηνικού φακέλου που εκφράζεται οε όλα τακύτταρα προκαλούν μια ιστοειδική ασθένεια. Αν και η πρωτεΐνη απουσίαζε από όλα τα κύτταρα τουσώματος των ασθενών, η παθολογία εκδηλωνόταν μόνο στον μυϊκό ιστό. Στη συνέχεια,αποκαλύφθηκε ότι η ίδια μορφή δυστροφίας μπορεί να κληρονομηθεί επίσης με μη φυλοσύνδετοτρόπο. Οι οικογένειες στις οποίες εμφανιζόταν η μη φυλοσύνδετη μορφή της μυϊκής δυστροφίαςEmery-Dreifuss έφεραν μεταλλάξεις στο γονίδιο LMNA, το γονίδιο που κωδικοποιεί τις πυρηνικέςλαμίνες Α και C. Μεταλλάξεις επομένως σε δύο διαφορετικά γονίδια - το γονίδιο μιας πρωτεΐνης τηςεσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης και το γονίδιο μιας από τις κυριότερες πυρηνικές λαμίνες -προκαλούν μυϊκή δυστροφία με την ίδια κλινική εικόνα.

Ακόμη μεγαλύτερη έκπληξη προκάλεσε το γεγονός ότι άλλες, παράλληλες μελέτες συνέδεσανδιαφορετικές μεταλλάξεις του γονιδίου LMNA με διαφορετικές ασθένειες: τη μερική λιποδυστροφίατύπου Dunnigan, τη διαταραχή Charcot-Marie-Tooth τύπου 2Β1 και το σύνδρομο προγηρίαςHutchinson-Gilford, μια ασθένεια που προκαλεί πρόωρη γήρανση. Μέχρι πρότινος, οι ιατροίταξινομούσαν τις ασθένειες αυτές σε διακριτές κατηγορίες, με κριτήριο τα κλινικά χαρακτηριστικάκαι τον τρόπο κληρονόμησης τους. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν εξάλλου ότι οι μεταλλάξεις μιαςάλλης πρωτεΐνης της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, του υποδοχέα της λαμίνης Β, αποτελούντη βάση της διαταραχής Peiger-Huët.

1. Μυϊκή δυστροφία Emery-Dreifuss: Μορφή φιλοσύνδετης μυϊκής δυστροφίας που συνδέεται με τοχρωμόσωμα Χ λόγω μεταλλάξεων της διαμεμβρανικής πρωτεΐνης του πυρηνικού φακέλου,εμερίνης [Alan Emery και Fritz E. Dreifuss (1996)]

Κατά τα πρώτα στάδια της ασθένειας εμφανίζεται ακαμψία στους αγκώνες, λαιμό και φτέρνεςτων ασθενών και συχνά υπάρχει αποκλεισμός αγωγής στην καρδιά. Τα συμπτώματα αυτάπαρατηρούνται μέχρι την ηλικία των 10 ετών και συμπεριλαμβάνουν «ακροποδητί βάδιση» λόγωακαμψίας του αχίλλειου τένοντα στις φτέρνες και δυσκολία κάμψης των αγκώνων. Από την ηλικίατων 20 ετών οι ασθενείς αναπτύσσουν καρδιακά προβλήματα και πολλές φορές κρίνεταιαπαραίτητη η χρήση βηματοδότη. Παρουσιάζεται σταδιακός εκφυλισμός και εξασθένηση των μυώντου ώμου και του βραχίονα, καθώς και των μυών της κνήμης, κάτι που όμως συμβαίνει με αργόρυθμό και συχνά δεν αποτελεί πρόβλημα προτού το άτομο φτάσει σε προχωρημένη ηλικία.

Το εύρημα ήταν απροσδόκητο, καθώς φαινόταν ότι μεταλλάξεις μιας πρωτεΐνης του πυρηνικούφακέλου που εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα προκαλούν μια ιστοειδική ασθένεια. Αν και η πρωτεΐνηαπουσίαζε από όλα τα κύτταρα του σώματος των ασθενών, η παθολογία εκδηλωνόταν μόνο στονμυϊκό ιστό.2. Η ίδια μορφή δυστροφίας μπορεί να κληρονομηθεί επίσης με μη φυλοσύνδετο τρόπο. Οιοικογένειες που εμφανιζόταν η μη φυλοσύνδετη μορφή της μυϊκής δυστροφίας Emery-Dreifussέφεραν μεταλλάξεις στο γονίδιο LMNA, το γονίδιο που κωδικοποιεί τις πυρηνικές λαμίνες Α και C.Μεταλλάξεις επομένως σε 2 διαφορετικά γονίδια - το γονίδιο μιας πρωτεΐνης της εσωτερικής

49

πυρηνικής μεμβράνης και το γονίδιο μιας από τις κυριότερες πυρηνικές λαμίνες - προκαλούν μυϊκήδυστροφία με την ίδια κλινική εικόνα.3. Παράλληλες μελέτες συνέδεσαν διαφορετικές μεταλλάξεις του γονιδίου LMNA με διαφορετικέςασθένειες:

- Μερική λιποδυστροφία τύπου Dunnigan- Διαταραχή Charcot-Marie-Tooth τύπου 2Β1- Σύνδρομο προγηρίας Hutchinson-Gilford, μια ασθένεια που προκαλεί πρόωρη γήρανση.

4. Διαταραχή Peiger-Huët που οφείλεται σε μεταλλάξεις μιας άλλης πρωτεΐνης της εσωτερικήςπυρηνικής μεμβράνης, του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR).

Σύνδρομο προγηρίας Hutchinson-Gilford, μια ασθένεια που προκαλεί πρόωρη γήρανση

(Α) Παιδί που πάσχει από προγηρία Hutchinson-Gilford.● Συχνότητα 1:4.000.000 νεογέννητα παγκοσμίως● Τα παιδιά με HGPS γεννιούνται φυσιολογικά και τα

συμπτώματα εμφανίζονται πριν την ηλικία των 2 ετών.● Τα παιδιά με HGPS πεθαίνουν με μέση ηλικία 13 ετών κυρίως

από καρδιακές επιπλοκές.● Το σύνδρομο Hutchinson-Gilford οφείλεται σε μεταλλάξεις του

γονιδίου LMNA.● Έχουν ταυτοποιηθεί >250 μεταλλάξεις στο γονίδιο LMNA που

προκαλούν διάφορες ασθένειες, και 21 απ’ αυτές προκαλούνσύνδρομα προγηρίας.

(B) Διάγραμμα της δομής ιντρονίων-εξονίων του γονιδίου LMNA και της πρωτεΐνης τηςλαμίνης Α. Οι σφαιρικές επικράτειες υποδεικνύονται με κόκκινο χρώμα και οι ραβδοειδείςεπικράτειες με κίτρινο. Στο μεταλλαγμένο γονίδιο του διαγράμματος υπάρχει μια έλλειψη 150 bp(μαύρο χρώμα) στο εξόνιο 11.

50

Ανοσοφθορισμός με χρήση αντισώματος για τη λαμίνηΑ σε ινοβλάστες δέρματος ενός φυσιολογικού ατόμου(αριστερά) και ενός ασθενή με HGPS (δεξιά) πουκαταδεικνύει τη δημιουργία πυρηνικών φυσαλίδων(nuclear blebbing).

Οι περισσότεροι ασθενείε με HGPS φέρουν τη μετάλλαξη 1824CT (G608G), που ενεργοποιεί μιακρυφή θέση ματίσματος που οδηγεί στην έκφραση μιας μορφής λαμίνης Α στην οποία υπάρχει μιααπάλειψη 50 αμινοξέων κοντά στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης, που αναφέρεται ωςLA50/προγερίνη (progerin). Σαν αποτέλεσμα η LA50/προγερίνη διατηρείται μόνιμαφαρνεσυλιωμένη και η συνάθροιση της στα κύτταρα των ασθενών σχετίζεται με την απώλεια τηςετεροχρωματίνης και με μεταβολές στη μεθυλίωση των ιστονών.

Μοριακή και κυτταρική βάσηΘεωρήθηκε ότι οι μεταλλάξεις των λαμινών θα προκαλούσαν γενικευμένα ελαττώματα στηναρχιτεκτονική του πυρήνα και σοβαρά προβλήματα στα ταχέως διαιρούμενα κύτταρα. Ωστόσο, ηδομή του πυρήνα των κυττάρων των ασθενών δεν εμφανίζει παρά ελάχιστες αποκλίσεις από τοφυσιολογικό. Το ερώτημα λοιπόν είναι με ποιον τρόπο οι μεταλλάξεις των πυρηνικών λαμινών ήτων πρωτεϊνών που προσδένονται σε αυτές προκαλούν διαφορετικές ιστοειδικές ασθένειες. Ηαπάντηση δεν είναι ακόμη γνωστή, όμως δύο είναι οι επικρατέστερες υποθέσεις.

Η πρώτη είναι η υπόθεση της «γονιδιακής έκφρασης». Σύμφωνα με αυτήν, η ενδεδειγμένηαλληλεπίδραση των δύο λαμινών Α και C με τον πυρηνικό φάκελο είναι απαραίτητη για τηνκανονική ιστοειδική έκφραση ορισμένων γονιδίων. Μεταγραφικώς ανενεργά γονίδια εντοπίζονταικατά προτίμηση στην περιφέρεια του πυρήνα, ενώ γονίδια που εκφράζονται συγκεντρώνονται στοκέντρο του πυρήνα, με πρότυπο κατανομής που εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Επομένως, ηβάση των παραπάνω ασθενειών θα μπορούσε να είναι μια αλλαγή στη γονιδιακή έκφραση λόγωελαττωματικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών.

Σύμφωνα με μια δεύτερη υπόθεση, την υπόθεση του «μηχανικού στρες», οι μεταλλαγές τουπυρηνικού συμπλόκου λαμινών-εμερίνης θεωρείται ότι εξασθενούν τη δομική ακεραιότητα ενός

51

ενιαίου κυτταροσκελετικού δικτύου. Σε όλα τα κύτταρα, η λάμινα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνηκαι τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων είναι στενά συνδεδεμένα μεταξύ τους. Σύμφωνα με τηνυπόθεση του «μηχανικού στρες», η λάμινα θα μπορούσε, μέσω ινιδίων που προσδένονται στοσύμπλοκο του πυρηνικού πόρου, να συνδέεται έμμεσα με τον κυτταροσκελετό των μυϊκώνκυττάρων. Μια τέτοια ερμηνεία αρμόζει περισσότερο στην περίπτωση των μυϊκών δυστροφιών.

Πρόληψη και θεραπείαΗ ανακάλυψη ότι μεταλλαγές σε κοινά εκφραζόμενες πρωτεΐνες του συμπλέγματος της πυρηνικήςλάμινας προκαλούν διαφορετικές κληρονομούμενες ιστοειδικές ασθένειες προκάλεσε έκπληξηστους επιστήμονες και άλλαξε τον γενικό τρόπο θεώρησης των πυρηνικών λαμινών. Περαιτέρωερευνητικές προσπάθειες απαιτούνται για να κατανοηθεί κατά πόσο η κλινική εικόνα για καθεμίααπό αυτές τις ασθένειες βασίζεται σε μειωμένη μηχανική σταθερότητα του πυρηνικού φακέλου ή σεαπορρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, η γνώση της μοριακής φύσης των ασθενειώναπλοποιεί σημαντικά τη διάγνωση τους και καθιστά πιθανή την εύρεση της κατάλληληςθεραπευτικής αντιμετώπισης. Ένα πρώτο βήμα προς αυτήν την κατεύθυνση αποτελεί η πρόσφατηανάπτυξη ενός πειραματικού μοντέλου του γονιδίου LMNA (knockout). Συμπτώματα μυϊκήςδυστροφίας Emery-Dreifuss εμφανίζονται στα ποντίκια αυτά κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Τέλος,οι ερευνητές γνωρίζουν πλέον ότι στις «λαμινοπάθειες» του πυρήνα είναι πιθανόν νασυμπεριλαμβάνονται αρκετές συγγενείς ασθένειες βραδείας ανάπτυξης.

Διαταραχή Peiger-Huët που οφείλεται σε μεταλλάξεις μιας άλλης πρωτεΐνης της εσωτερικήςπυρηνικής μεμβράνης, του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR)

Μεταλλάξεις στο γενετικό τόπου ιχθύωσης (ichthyosis) του ποντικού εντοπίζονται εντός τουγονιδίου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR), με αποτέλεσμα ο φαινότυπος τέτοιων διαγονιδιακώνζώων να είναι όμοιος με μια ανωμαλία στον άνθρωπο που ονομάζεται διαταραχή Pelger-Huët(PHA). Το γονίδιο του LBR εντοπίζεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 1.

Shultz LD, et al. (2002). Mutations at themouse ichthyosis locus are within the laminB receptor gene: a single gene model forhuman Pelger–Huët anomaly. Hum. Mol.Genet. 12:61-69.

Ραδιογραφία εμπρόσθιων και πίσωάκρων ποντικών ηλικίας 5 εβδομάδων.

Τομές δέρματος ενός φυσιολογικού καιενός ζώου με ιχθύωση.

52

Διαταραχή Peiger-Huët. Ασθενής με PHA οοποίος έχει κοντύτερα το τρίτο και το πέμπτοmetacarpals στο αριστερό του χέρι και από τοτρίτο στο πέμπτο metacarpals στο δεξί του χέρι.

Hoffmann et al. (2002). Mutations in the geneencoding the lamin B receptor produce an alterednuclear morphology in granulocytes (Pelger-Huetanomaly). Nature Genetics

Έκφραση του LBR με χρήση αντισώματος σε λεμφοκύτταρα ενός: (a) φυσιολογικού ατόμου,(b) ετεροζυγώτη, και (c) ομοζυγώτη που καταδεικνύει τη μειωμένη έκφραση του LBR στα(a)>(b)>(c).

53

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΙ ΟΡΟΙΟ πυρηνικός φάκελος και η κυκλοφορία μορίωνανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμαΗ δομή του πυρηνικού φακέλου: Ο πυρηνικόςφάκελος διαχωρίζει τα περιεχόμενα του πυρήνα από τοκυτταρόπλασμα, διατηρώντας τον πυρήνα ως έναδιακριτό βιοχημικό διαμέρισμα που στεγάζει το γενετικόυλικό και λειτουργεί ως θέση μεταγραφής καιεπεξεργασίας του RNA στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Οπυρηνικός φάκελος αποτελείται από την εσωτερική καιτην εξωτερική πυρηνική μεμβράνη, που ενώνονται στασύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, και από την πυρηνικήλάμινα, που υποστηρίζει την πυρηνοπλασματικήεπιφάνεια της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης.

πυρηνικός φάκελος (nuclear envelope),πυρηνική μεμβράνη (nuclear membrane),πυρηνική λάμινα (nuclear lamina), λαμίνη(lamin)

Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου: Τα σύμπλοκατων πυρηνικών πόρων είναι μεγάλες δομές πουπαρέχουν τις μοναδικές διόδους για τη διακίνηση μορίωνμεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Μικρά μόριαδιαχέονται ελεύθερα μέσω ανοικτών διαύλων τουσυμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Μακρομόριαμεταφέρονται επιλεκτικά με μια διαδικασία που απαιτείδαπάνη ενέργειας.

σύμπλοκο πυρηνικού πόρου (nuclear porecomplex)

Επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών από και προς τονπυρήνα: Οι πρωτεΐνες που προορίζονται για εισαγωγήστον πυρήνα περιέχουν σήματα πυρηνικού εντοπισμούπου αναγνωρίζονται από υποδοχείς που κατευθύνουν τημεταφορά αυτών των πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκουτου πυρηνικού πόρου. Οι πρωτεΐνες που παλινδρομούνμεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος περιέχουνσήματα πυρηνικής εξαγωγής που υπαγορεύουν τημεταφορά τους από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα.Στις περισσότερες περιπτώσεις, για τη μετακίνηση μέσωτου συμπλόκου του πυρηνικού πόρου απαιτείται η μικρήπρωτεΐνη Ran, μια πρωτεΐνη πρόσδεσης GTP πουκαθορίζει και την κατεύθυνση της μεταφοράς.

σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NuclearLocalization Signal), υποδοχέας πυρηνικήςμεταφοράς (nuclear transport receptor),ιμπορτίνη (importin), Ran, σήμα πυρηνικήςεξαγωγής (nuclear export signal), εξπορτίνη(exportin), καρυοφερίνη (karyopherin)

Animation 9.1

Ρύθμιση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήνα: Ηενεργότητα ορισμένων πρωτεϊνών, όπως τωνμεταγραφικών παραγόντων, ελέγχεται μέσω ρύθμισηςτης εισαγωγής και της εξαγωγής τους από και προς τονπυρήνα.Μεταφορά μορίων RNA: Τα RNA μεταφέρονται μέσωτου συμπλόκου του πυρηνικού πόρου υπό μορφήριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλοκών. Τα αγγελιαφόραRNA, τα ριβοσωμικά RNA και τα μεταφορικά RNAεξάγονται από τον πυρήνα ώστε να λάβουν μέρος στηνπρωτεϊνοσύνθεση. Αρκετές κατηγορίες μικρώνπυρηνικών RNA μεταφέρονται από τον πυρήνα στοκυτταρόπλασμα, όπου συνδέονται με πρωτεΐνεςσχηματίζοντας RNP, και στη συνέχεια επαναφέρονταιστον πυρήνα.Εσωτερική οργάνωση του πυρήναΟ Χρωμοσώματα και υψηλή οργάνωση δομής τηςχρωματίνης: Ο μεσοφασικός πυρήνας περιέχειετεροχρωματίνη, που είναι μεταγραφικά ανενεργή και

Ετεροχρωματίνη (heterochromatin)Ευχρωματίνη (euchromatin)

54

ιδιαίτερα συμπυκνωμένη, καθώς και ευχρωματίνη, ηοποία είναι αποσυμπυκνωμένη. Τα μεσοφασικάχρωμοσώματα διευθετούνται με οργανωμένο τρόπο στοεσωτερικό του πυρήνα και χωρίζονται σε μεγάλεςεπικράτειες βρόχων που λειτουργούν ως ανεξάρτητεςμονάδες.Υποδιαμερίσματα μέσα στον πυρήνα: Μερικέςδιαδικασίες που λαμβάνουν χώρα μέσα στον πυρήνα,όπως η αντιγραφή του DNA και ο μεταβολισμός τουmRNA, μπορεί να εντοπίζονται σε διακριτέςυποπυρηνικές δομές.Ο πυρηνίσκος και η επεξεργασία του rRNAΓονίδια του ριβοσωμικού RNA και οργάνωση τουπυρηνίσκου: Ο πυρηνίσκος συνδέεται με τα γονίδιαπου κωδικοποιούν για ριβοσωμικά RNA. Αποτελεί τηθέση της μεταγραφής rRNA, της επεξεργασίας rRNA, τηςσυναρμολόγησης των ριβοσωμάτων και τηςτροποποίησης αρκετών μικρών μορίων RNA.

πυρηνίσκος (nucleolus), περιοχή οργανωτήτου πυρηνίσκου (nucleolar organizing region)

Μεταγραφή και επεξεργασία του rRNA: Τοπρωτογενές μετάγραφο των γονιδίων rRNA είναι το pre-rRNA 45S, από την επεξεργασία του οποίουπροκύπτουν τα 18S, 5,8S και 28S rRNA. Η επεξεργασίατου pre-rRNA και άλλων μικρών RNA επιτυγχάνεταιμέσω μικρών πυρηνισκικών RNA (snoRNA).

μικρό πυρηνισκικό RNA (snoRNA; smallnucleolar RNA)

Η συναρμολόγηση των ριβοσωμάτων: Οι υπομονάδεςτων ριβοσωμάτων συναρμολογούνται μέσα στονπυρηνίσκο από rRNA και ριβοσωμικές πρωτεΐνες

55

Περίληψη στα ΑγγλικάChapter 9 Summary

• The Nuclear Envelope and Traffic between the Nucleus and the CytoplasmStructure of the nuclear envelope: The nuclear envelope separates the contents of the nucleusfrom the cytoplasm, maintaining the nucleus as a distinct biochemical compartment that housesthe genetic material and serves as the site of transcription and RNA processing in eukaryotic cells.The nuclear envelope consists of the inner and outer nuclear membranes (which are joined atnuclear pore complexes) and an underlying nuclear lamina.The nuclear pore complex: Nuclear pore complexes are large structures that provide the onlyroutes through which molecules can travel between the nucleus and the cytoplasm. Smallmolecules diffuse freely through the nuclear pore complex. Macromolecules are selectivelytransported either from nucleus to cytoplasm or from cytoplasm to nucleus.Selective transport of proteins to and from the nucleus: Proteins destined for import to thenucleus contain nuclear localization signals that are recognized by receptors that direct transportthrough the nuclear pore complex. Proteins that shuttle back and forth between the nucleus andthe cytoplasm contain nuclear export signals that target them for transport from the nucleus to thecytoplasm. In most cases, the small GTP-binding protein Ran is required for translocation throughthe nuclear pore complex and determines the directionality of transport.See Website Animation 9.1Regulation of nuclear protein import: The activity of some proteins, such as transcriptionfactors, is controlled by regulation of both their import to, and export from, the nucleus.Transport of RNAs: RNAs are transported through the nuclear pore complex as ribonucleoproteincomplexes. Messenger RNAs, ribosomal RNAs, and transfer RNAs are exported from the nucleusto function in protein synthesis. Several classes of small nuclear RNAs are initially transported fromthe nucleus to the cytoplasm where they associate with proteins to form RNPs; they then return tothe nucleus.

• Internal Organization of the NucleusChromosome organization and gene expression: The interphase nucleus containstranscriptionally inactive, highly condensed heterochromatin as well as decondensed euchromatin.Individual chromosomes occupy distinct territories within the nucleus and are divided into largelooped domains that function as independent units. Heterochromatin is frequently associated withthe nuclear envelope, whereas euchromatin is associated with nuclear pore complexes anddistributed throughout the nucleus.Sub-compartments within the nucleus: Many nuclear processes are localized to discretesubnuclear structures. DNA replication takes place within large complexes containing multiplereplication forks. Several types of nuclear bodies compartmentalize the nucleus and serve toconcentrate proteins and RNAs involved in a variety of aspects of gene expression.

• The Nucleolus and rRNA ProcessingRibosomal RNA genes and the organization of the nucleolus: The nucleolus is associated withthe genes for ribosomal RNAs. It is the site of rRNA transcription, rRNA processing, and ribosomeassembly.Transcription and processing of rRNA: The primary transcript of the rRNA genes is 45S pre-rRNA, which is processed to yield 18S, 5.8S, and 28S rRNAs. Processing of pre-rRNA and othersmall RNAs is mediated by small nucleolar RNAs (snoRNAs).Ribosome assembly: Ribosomal subunits are assembled within the nucleolus from rRNAs andribosomal proteins.Additional functions of the nucleolus: The nucleolus also functions in the processing of severaltypes of small non-ribosomal RNAs, including tRNAs, snRNAs and signal recognition particle RNA.