Άννα Γιοράν

Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, Ζωγράφου,

15784, Αθήνα Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Ινστιτούτο Βιολογικών Ερευνών &

Βιοτεχνολογίας, Βασ. Κων/νου 48, 11635, Αθήνα

ΕισαγωγήH ανθρώπινη Apolipoprotein J/Clusterin (CLU) είναι μια εκκρινόμενη ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη ~ 75-80 kDa η οποία εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς και βρίσκεται σε σχετικά μεγάλη συγκέντρωση σε όλα τα βιολογικά υγρά του ανθρώπου.

Στο αίμα η CLU δρα κυρίως ως Απολιποπρωτεΐνη και εντοπίζεται στα HDL κυστίδια. Εμφανίζει επίσης δράση μοριακής συνοδού (molecular chaperon).

Ανάπτυξης Διαφοροποίησης Γήρανσης Αθηροσκλήρωσης Διαβήτη Νευροεκφυλιστικών νόσων Καρκινογένεσης

Έχει προταθεί ότι η sCLU εμπλέκεται λειτουργικά σε μοριακές διαδικασίες:

Εισαγωγή

ΕισαγωγήΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣΟ καρκίνος του ήπατος είναι η έκτη συχνότερη κακοήθεια και η τρίτη συχνότερη αιτία θανάτου λόγω καρκίνου, παγκοσμίως. Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είναι η πιο συνήθης πρωτοπαθής κακοήθεια του ήπατος στους ενήλικες.

ΕισαγωγήΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΑΓΚΡΕΑΤΟΣΟ καρκίνος του παγκρέατος είναι ο 13ος πιο συχνός τύπος καρκίνου σε παγκόσμιο επίπεδο. Αρκετά συχνά έχει κακή πρόγνωση, γεγονός που τον καθιστά την 8η πιο συχνή αιτία θανάτου λόγω καρκίνου.

Σκοπός της μελέτης...

...είναι η διερεύνηση του λειτουργικού ρόλου της CLU σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά και παγκρεατικά κύτταρα και η καταγραφή των επαγώμενων φαινοτύπων είτε λόγω γονιδιακής υπερέκφρασης (μέθοδος διαγονιδίου - transgene) είτε μέσω επίτευξης γονιδιακής σιγής (μέθοδος μικρών RNAs παρεμβολής - siRNA) για το γονίδιο της CLU. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στη λειτουργική σχέση της sCLU με το σηματοδοτικό μονοπάτι INS/IGF-1.

Υλικά & Μέθοδοι

Ανθρώπινες ηπατικές (HepG2 και Huh-7) και παγκρεατικές (Panc1) καρκινικές κυτταρικές σειρές. HepG2

Huh-7 Panc1

Γονιδιακή υπερέκφραση

CLU specific siRNAoligonucleotide

Γονιδιακή σιγή

Ποσοτικό RT-PCR

Ανοσοστύπωμα

Αποτελέσματα

psCLUsCLU

GAPDHHu

h7

HepG

2

86 kDa

47 kDa

34 kDa47 kDa

Σύγκριση των ενδογενών επιπέδων έκφρασης της CLU μεταξύ των ηπατικών κυτταρικών σειρών.

Σύγκριση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυτταρικών σειρών Huh7 και ΗepG2.

Αποτελέσματα Απομόνωση κλωνοποιημένου πλασμιδίου από

μετασχηματισμένα βακτήρια. Πέψεις με περιοριστικές ενδονουκλεάσες.

Επιμόλυνση των κυτταρικών σειρών Huh7, HepG2 και Panc1 με το ανθρώπινο γονίδιο της CLU.

Moc

k-24

h

Moc

k-48

h

Vect

or-2

4h

Vect

or-4

8hCL

U-48

h

CLU-

24h

Huh7

HepG2

Panc1

psCLU

GAPDH

psCLU

sCLU

GAPDH

psCLU

sCLU

GAPDHΑναμενόμενες ζώνες:BamHI: 1567 bp, 5.5 kbEcoRI: 705 bp, 872 bp, 5.5 kb

Αποτελέσματα Έλεγχος της επίδρασης της υπερέκφρασης της CLU στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων Huh7,

HepG2 και Panc1.

Αποτελέσματα Επιμόλυνση των κυτταρικών σειρών Huh7, HepG2 και

Panc1 με sCLU-ειδικά siRNAs για τη μερική σίγηση της έκφρασης του γονιδίου CLU.

Moc

kSc

ram

ble

siRNA

Moc

kSc

ram

ble

siRNA

Huh7

HepG2

Panc1

GAPDH

CLU48h

72h

72h

Moc

k

Scra

mbl

e

siRNA

CLU

GAPDH

CLU

GAPDH

Έλεγχος της επίδρασης της μερικής σίγησης του γονιδίου της CLU στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων.

Αποτελέσματα Έλεγχος της επίδρασης της υπερέκφρασης της CLU στην έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο

σηματοδοτκό μονοπάτι INS/IGF-1.

Έλεγχος με RT-PCR. Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western.

Moc

k-24

h

Moc

k-48

h

Vect

or-2

4h

Vect

or-4

8h

CLU-

24h

CLU-

48h

ERK-1

p-Akt

Akt

GAPDH

mTOR

GAPDHSOS1

Huh7

HepG2

Panc1

Moc

k-48

h

Vect

or-2

4h

Vect

or-4

8hCL

U-48

h

CLU-

24h

Moc

k-24

h

Moc

k-48

h

Vect

or-2

4h

Vect

or-4

8hCL

U-48

h

CLU-

24h

Moc

k-24

h

ERK-1

p-Akt

Akt

GAPDH

mTOR

GAPDH

SOS1

ERK-1

GAPDH

mTOR

p-ERK

p-mTOR

SOS1GAPDH

Αποτελέσματα Έλεγχος της επίδρασης της μερικής σίγησης της CLU στα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο

σηματοδοτικό μονοπάτι INS/IGF-1.

Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western. Έλεγχος με RT-PCR.

Panc1

HepG2Huh7

ERK-1

Akt

GAPDH

mTOR

GAPDH

SOS1

GAPDH

Moc

kSc

ram

ble

siRNA

ERK-1

Akt

GAPDH

mTOR

GAPDH

SOS1

GAPDH

Moc

kSc

ram

ble

siRNA

Moc

k

Scra

mbl

esiR

NA

Akt

ERK-1

GAPDH

mTOR

p-ERK

p-Akt

GAPDHp-mTOR

GAPDH

Αποτελέσματα Έλεγχος με ανοσοστύπωμα κατά Western / ποσοτικοποίηση ζωνών.

Huh7

HepG2

Panc1 Panc1

Υπερέκφραση sCLU Σίγηση sCLU

Αποτελέσματα

Έλεγχος επίδρασης του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου Doxorubicin (DXR) στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των κυττάρων και στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου.

Συμπεράσματα

Τα ενδογενώς υψηλά επίπεδα έκφρασης της CLU σε καρκινικά κύτταρα ενδεχομένως συμβάλλουν σε μείωση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού και στην εμφάνιση χημειοανθεκτικότητας.

Εξωγενώς επαγώμενη υπερέκφραση της CLU μειώνει το πολλαπλασιαστικό δυναμικό ηπατικών και παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

Μείωση των επιπέδων έκφρασης της CLU αυξάνει το ρυθμό αύξησης ηπατικών και παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

Ενδεχομένως οι αλλαγές στην έκφραση της CLU να επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου mTOR.

Σύμφωνα με τα προκαταρκτικά πειράματα μας, τα επίπεδα έκφρασης της CLU δεν φαίνεται να επηρεάζουν άμεσα το μονοπάτι σηματοδότησης INS/IGF-1.

Ευχαριστίες...

Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών:Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών:

Ευστάθιος Σ. Γκόνος

Νίκη Χονδρογιάννη

Επιστημονικό προσωπικό του Προγράμματος Μοριακής και

Κυτταρικής Γήρανσης

ΕΚΠΑ, Τμήμα Βιολογίας:ΕΚΠΑ, Τμήμα Βιολογίας:

Ιωάννης Π. Τρουγκάκος (επιβλέπων)

Λουκάς Χ. Μαργαρίτης

Ιωάννης Γρίβας

Ελένη Τσακίρη