3מעבדה מס'

α2[ – קלונידין לרצפטורים H3קישור ]אדרנרגיים

מטרות:

עבור קלונידיןKd. קביעת 1

אדרנרגיים α2. קביעת ריכוז הרצפטורים ה-2(Bmax)בממברנה

R+L RL

Kd=[R][L]/[RL]

הגדרות:

•RL = B )bound(רצפטור וליגנד קשורים

•R + RL = Bmax מקסימום אתרי קישור לליגנד

אדרנרגיים בממברנותα2 = מס' הרצפטורים ה-

•L = F מזניחים את( ליגנד חופשי B לעומת F)

שיטות להפרדת ליגנד חופשי מהקומפלקס

. צנטריפוגה1

חיסרון:

ליגנד חופשי יכול לשקוע, ולכן ההפרדה קשה.

. דיאליזה בשיווי משקל2

. לכן, B ו-A בשיווי משקל, ריכוז הליגנד החופשי יהיה זהה בתאים כמות הליגנד הקשור היא:

cpm B – cpm A = cpm )bound(

חיסרון:

- זמן רב עד הגעה לשיווי משקל

- יכולה להתרחש אינאקטיבציה או פירוק של הרצפטור

שיטה זו מתאימה גם לקבועי קישור קטנים )אפיניות נמוכה, -Kd)גבוה

הליגנד עלול להיקשר לממברנה של הדיאליזה -

פילטר מסיבי זכוכית. פילטרציה - 3

חיסרון:

ספיחה של ליגנדים הידרופוביים לסיבי הזכוכית. לכן, חייבים לשטוף וכתוצאה הקומפלקס עלול להתפרק )ולהסיט את שיווי

המשקל(.

נמוך = אפיניות גבוהה בין 5nM (Kd של כ- Kd לפיכך, מתאים ל-הליגנד והרצפטור(

Kon

R + L RL

Koff

Kd = Koff = [R][L]

Kon [RL]1 1

Sec M*sec

מאפיין ראקציה מסדר יחידות:ראשון כי הוא תלוי רק

RLבגורם אחד

מאפיין ראקציה מסדר שני כי הוא תלוי בשני

R + Lגורמים

Konמבטא את תנועת מקסימלי הוא קבוע הדיפוזיה : מקסימלי כל Konהחלקיקים )במים לדוגמא(. במצב של

RL מביאה ליצירת קומפלקס R ו Lהתנגשות בין

Kon)max( = 108M-1 * sec-1

:1-10nM בין Kdחישוב זמן מחצית חיים של קומפלקס עם

t1/2 = ln2 = ln2 = ln

Koff Kd*Kon )10-9~10-8(M*108M-1*sec-1

t1/2 = 0.7 - 7 sec

זהו ערך זמן מינימלי כיוון שחישבנו אותו על סמך קבוע הדיפוזיה (Kon.)מקסימלי

השיטה מוגבלת לבחירת קומפלקס רצפטור-ליגנד מתאים )עם מסקנה: מספיק נמוך(Kdערך

המשמעות המעשית עבורנו:

.פילטרציה מהירה )ע"י ואקום(1

(t1/2 )הגדלת Koff. עבודה בקור, להקטנת 2

שיטת הפילטרציה מותנית באפיניות הליגנד לרצפטור

cpm )B(

[clonidine] )F(

N

S

S+NNקישור לא ספציפי

Sקישור ספציפי

S+Nקישור כולל

אדרנרגייםα2 קישור ספציפי לרצפטורים •

קישור לא ספציפי לחלבונים ושומנים ממברנליים, סיבי •הפילטר ודפנות המבחנה

עקום הקישור הלא ספציפי הוא לינארי כי הוא תלוי רק •]L[ב-

עקום הקישור הספציפי הוא עקום רוויה כי אתרי הקישור •מוגבלים

קר בריכוז NA הקישור הלא ספציפי נקבע ע"י הוספת •גבוה

קר ולא בקלונידין קר?NAמדוע נעשה שימוש ב-

ישנם בממברנה אתרי קישור ספציפיים לקלונידין, • אדרנרגיים ואנו מעוניינים להחשיב אתרים α2שאינם

אלו כקישור לא ספציפי

• NA שונה מבנית מקלונידין, ולכן NA יכיר את ורק אותם הוא בלבד אדרנרגיים α2הרצפטורים ה-

יחסום. כך נוכל למדוד את הקישור הלא ספציפי שנובע α2מאתרים ספציפיים לקלונידין ושאינם רצפטורים

אדרנרגיים

הפילטרים הספוגים בקלונידין מסומן משמשים •total = B+Fלמדידת

שיטות לינאריזציה של עקומת הרוויה:

Bmax

Bרצפטורים קשורים

F ליגנד

50%

Kd

Bmax*F

B =

Kd + F

Vmax*[S]

V =

Km + [S]

כמו משוואת מיכאליס-מנטן:

אפשר להפוך את משוואת העקומה למשוואה של קו לינארי, ע"י

linweaver-burkהחלפת המונה במכנה ואז מקבלים את משוואת

1 = Kd * 1 + 1

B Bmax F Bmax

מנוסחת עקום הרוויה ולהפוך אותה Kdאפשר גם לבודד את ה-

scatchardלמשוואה של קו לינארי, ואז מקבלים את משוואת

)Bmax-B(*F

Kd =

B

B = Bmax - B

F Kd Kd

Linweaver-burk

-1/Kd

1/Bmaxa = Kd/Bmax

1/F

)1/nM(

1/B

)mg/fmol(

יתרון:

)ריכוזי רוויה(, נקודת החיתוך yרוב הנקודות מתרכזות ליד ציר ה- אמיןBmaxברורה ולכן

חיסרון:

)ריכוזים נמוכים( מפוזרות ומשפיעות Xהנקודות הרחוקות מציר ה- לא אמיןKdעל קביעת שיפוע הקו. לפיכך,

Scatchard

יתרון:

הינה Kdהנקודות מפוזרות לאורך הגרף באופן אחיד ולכן קביעת אמינה

חיסרון:

הולך וקטן עם העלאת B/F לא משתנה אבל Bבריכוזי רוויה, וקשה xהריכוז. לכן, יש פיזור אנכי של נקודות בקרבת ציר ה-

פחות אמינהBmaxלהחליט היכן לחתוך את הציר. לפיכך, קביעת

B/F

a = -1/Kd

Bmax

B

)fmol/mg(

B/F

( fmol/mg*nM)

Kd = )Bmax – B(F

B

B = Bmax – B

F Kd Kd

R+L RL

Kd=[R][L]/[RL]

הנחות עליהן מבוססים הפיתוחים:

ואין קואופרטיביות1:1 הוא RL. יחס קישור 1

(L=F. ריכוז הליגנד גדול בהרבה מריכוז הרצפטור )לכן 2

. הרצפטור יכול להיות במצב חופשי או בקומפלקס, ללא צורות 3ביניים

. כל המדידות נעשות במצב של שווי משקל4

שיטות לזיהוי קרינה:

פליטת אלקטרון תוך כדי התפרקות= βקרינת

מונה גייגר: האלקטרונים המשתחררים נקלטים •ע"י גז שעובר יינון ויוצר מתח חשמלי

חשיפה לפילם: האלקטרונים נקלטים ע"י יוני •Ag+ אלו מתחזרים, שוקעים ויוצרים בנד שחור .

על הפילם

פלט מונה סנטילציה: •

מתרגם את מעבד:cpmהאותות החשמליים ל-

דוגמא

רק התפרקות מדידה כפולה: שנמדדה בו זמנית ע"י שני

cpmהחיישנים תתורגם ל-

Photomultiplier:

אנרגיית הפוטון הופכת לפוטנציאל חשמלי, תוך

כדי הגברת הסיגנל

יש צורך להשתמש בנוזל סנטילציה, על מנת להגביר את הסיגנל נמוכה, כמו בטריטיום(β)רק במקרים בהם קרינת ה-

(dpm)יותר חומר רדיואקטיבי יותר התפרקויות

יותר אלקטרונים מעוררים פוטנציאל חשמלי גדול יותר

(cpm)יותר ספירות

אם כך:

dpm = disintegrations per minute

cpm = counts per minute

cpm/dpm = 0.5 = יעילות המונה

Ci = 1012*2.2 = מספר ההתפרקויות של גרם רדיום dpm

דקה

Specific radioactivity = Ci = כמות חומר חם

mmole סה"כ חומר

איזוטופים רדיואקטיביים הנמצאים בשימוש בביולוגיה:

טווח נדידה במים

טווח נדידה באוויר

איזוטופt1/2סוג קרינה

P32 ימיםβ14.3 מטר7.9 ס"מ0.8

S35 ימיםβ87.4 ס"מ26 מ"מ0.32

γ קרני( X)59.6ימים I126

C14 שניםβ5730 ס"מ24 מ"מ0.28

H3 שניםβ12.4 מ"מ6מ"מ 10-3*6