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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
T E S I S
MEXICO, D.F. 2007
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienónico.
PARA OBTENER EL TITULO DE:
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO
P R E S E N T A N:
ALEJANDRA GUADARRAMA REYNA
ALBERTO MARTINEZ MARTINEZ
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
AGRADECIMIENTOS
La realización del presente trabajo fue posible gracias al
financiamiento otorgado para la Dirección General de Asuntos
de Personal Académico a través del proyecto DGAPA IN201506
Y por el Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología a través de
sus proyectos: CONACYT 41231 y CONACYT C01-18.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Navarrete por su apoyo, experiencia y conocimientos
compartidos durante el desarrollo de este proyecto.
Al Dr. Jesús Arrieta por su apoyo en la realización de este
trabajo.
A mis compañeros del laboratorio 126 del conjunto E.
Departamento de Farmacia de la Facultad de Química por su
apoyo durante el desarrollo de la tesis.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
INDICE
Página
INTRODUCCIÓN........................................................................................... 1
1. FUNDAMENTO TEÓRICO........................................................................ 3
1.1. Úlcera gástrica……………………………………...………………….... 3
1.1.1. Etiología y patología…………………………………………….... 4
1.1.2. Sintomatología…..………………………………………………... 6
1.2. Modelos experimentales de inducción de lesiones gástricas…….... 7
1.2.1. Inducción de lesiones gástricas por etanol…………………... 7
1.3. Mecanismos de defensa de la mucosa gástrica...…………………… 8
1.3.1. Factores funcionales…………….………………………………. 8
1.3.2. Factores neuronales…………………………………………….. 8
1.3.3. Factores humorales……………...…………………….……....... 10
1.4. Mecanismo de defensa de la mucosa gástrica independiente de
prostaglandinas…………………………………………………………...
14
1.4.1. Grupos sulfhidrilo (GSH)………………………………..……... 14
1.4.2. Factor de crecimiento epidérmico…………………………….. 14
1.4.3. Somatostatina………………………………………………….... 15
1.4.4. Meciadanol……………………………………………...……….. 15
1.5. Tromboxanos (TXB2)………………………………………..………… 15
1.6 Leucotrienos (LTB4)…………………………………………………...... 16
1.7. Metabolitos aislados de plantas con actividad antiulcerosa………... 17
1.7.1 Triterpenos………………………………………………………. 17
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...................................................... 19
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
3. HIPÓTESIS............................................................................................... 20
4. OBJETIVO GENERAL……………………………………………………….. 21
5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS……………………………………………….... 21
6. METODOLOGÍA……………………………………………………………..... 22
6.1 Animales………………………………………………………………... 22
6.2 Fármacos...……………………………………………………………….. 22
6.3 Cuantificación de los niveles de nitratos………………………….. 22
6.3.1 Análisis de muestras……………………………………………….. 23
6.4 Cuantificación de los niveles de tromboxanos y leucotrienos……… 25
6.4.1 Purificación de las muestras……………………………………… 25
6.4.2 Cuantificación de los niveles de TXB2…………………………… 27
6.4.2.1. Análisis de las muestras………………………………… 27
6.4.3. Cuantificación de los niveles de LTB4…………………….…….. 28
6.4.3.1. Análisis de las muestras...…………………………….. 28
6.5 Cuantificación de los niveles de grupos sulfhidrilo (GSH)…………... 30
6.5.1. Análisis de las muestras………………………………………..... 31
6.6. Análisis estadístico……………………………………………………… 31
7. RESULTADOS………………………………………………………………… 33
7.1. Niveles de nitratos en jugo gástrico…………………………………… 33
7.2. Niveles de TXB2 en jugo gástrico………………................................ 33
7.3. Niveles de LTB4 en jugo gástrico…………………………………....... 33
7.4. Niveles de GSH en tejido gástrico……………………………………. 43
8. ANÁLISIS DE RESULTADOS……………………………………………..... 48
8.1. Efecto sobre los niveles de nitratos después de la
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
administración intragástrica de estigmasterol, β-lupeol y β-
sitosterol…………………………………………………………………..
48
8.2. Efecto sobre los niveles de tromboxanos TXB2 después de la
administración intragástrica de estigmasterol, β-lupeol y β-
sitosterol………………………………………….……………………...
48
8.3. Efecto sobre los niveles de leucotrienos LTB4 después de la
administración intragástrica de estigmasterol, β-lupeol y β-
sitosterol………………………………………….……………………….
49
8.4. Efecto sobre los niveles de grupos sulfhidrilos (GSH) después
de la administración intragástrica de estigmasterol, β-lupeol,
ácido 3α-hidroximasticadienónico y ácido 3β-
hidroximasticadienónico …………………………………………………
50
9. CONCLUSIONES......................................................................................
52
10. PERSPECTIVAS……………………………………………………………..
53
11. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………… 54
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
RESUMEN
Se conoce que el óxido nítrico y los grupos sulfhidrilos están involucrados en el
mecanismo de acción gastroprotector del β-lupeol, el estigmasterol y el β-
sitosterol; también, se sabe que para el ácido 3α-hidroximasticadienónico
únicamente se encuentran implicados los grupos sulfhidrilos en su mecanismo
de acción. Por otro lado, se desconoce que papel desempeñan los
tromboxanos (TXB2) y leucotrienos (LTB4) en su actividad gastroprotectora de
los compuestos mencionados anteriormente; por lo que, en el presente trabajo
se determinaron los niveles de óxido nítrico, TXB2 y LTB4 en jugo gástrico de
rata; mientras que los niveles de grupos sulfhidrilos se cuantificaron en tejido
epitelial. Encontrándose que los niveles de ON se incrementaron notablemente
cuando se administró estigmasterol y β-lupeol (9.87, 10.98 µM/mL)
respectivamente, no obstante, el pretratamiento con β-sitosterol, solo presento
un incremento parcial con respecto al grupo control; mientras que en TXB2
solo se presentó un incremento parcial en los compuestos evaluados y
finalmente; para el LTB4 y GSH no hubo un incremento con su respectivo grupo
control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
1
INTRODUCCIÓN
Actualmente existen muchos fármacos para el tratamiento de la úlcera gástrica,
como son los antiácidos, los antisecretores y los citoprotectores. Sin embargo,
este padecimiento sigue teniendo un alto índice de morbilidad y mortalidad
(Hoogerwerf y Pasricha, 2001), lo que demuestra que las herramientas
terapéuticas con las que se cuenta en la actualidad no constituyen una garantía
de solución del cuadro patológico en todos los casos, lo que justifica que se
busquen nuevas alternativas terapéuticas.
En relación con lo anterior, dentro de la cultura herbolaria de nuestro país, se
tiene el registro de más de 56 plantas utilizadas para el tratamiento especifico
de la úlcera gástrica y la gastritis, sin embargo a sólo dos de ellas se les han
identificado los metabolitos responsables de su actividad gastroprotectora,
Hippocratea excelsa y Amphipterigium adstringens (Navarrete et. al., 2002,
Arrieta et. al., 2003). En el caso de Hippocratea excelsa (Cancerina), los
metabolitos responsables de dicha actividad son: β-sitosterol, β-D-glucósido de
β–sitosterol y epicatequina. Mientras que para Amphipterigium adstringens
(Cuachalalate) los metabolitos responsables de su actividad gastroprotectora
son: el ácido 3α-hidroximasticadienónico, el ácido epi-oleanólico y el β-
sitosterol (Arrieta, 2003). Para el ácido 3α-hidroximasticadienónico se reporta
que los grupos sulfhidrilos son importantes en su mecanismo gastroprotector
(Arrieta et. al., 2003), mientras que para el β-sitosterol el óxido nítrico y los
grupos sulfhidrilos, participan de manera importante en su mecanismo de
acción (Arrieta et. al., 2003) Mientras que para el estigmasterol y el β-lupeol
que son otros metabolitos que tienen actividad gastroprotectora (Sánchez,
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
2
2003; Sandoval, 2004).
Sin embargo, no se sabe con certeza de que manera el óxido nítrico, el
tromboxanos (TXB2) y el leucotrienos (LTB4) están involucrados en el
mecanismo de acción del β-lupeol, el estigmasterol y el β-sitosterol; tal como,
los grupos sulfhidrilos en el mecanismo de acción del ácido 3α-
hidroximasticadienónico, el β-lupeol y el estigmasterol; por lo que el presente
trabajo se encaminó a cuantificar los niveles de óxido nítrico, TXB2, LTB4 y
grupos sulfhidrilos después la inducción de la lesión gástrica con etanol.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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I. FUNDAMENTO TEÓRICO.
1.1. Úlcera Gástrica.
La mucosa del estómago y parte alta del duodeno normalmente están
protegidas de la acción irritante del ácido gástrico por una capa de moco y
bicarbonato. Las células epiteliales de la mucosa se descaman continuamente
y son sustituidas; las pequeñas lesiones se reparan rápidamente, sin embargo,
si una porción de la superficie de la mucosa sufre erosión, la secreción ácida
puede causar dolor llamándose comúnmente úlcera. Las úlceras pépticas son
lesiones en la mucosa duodenal o gástrica que han sido provocadas por la
digestión del ácido y la pepsina y se vuelven vulnerables a ella. Esto deja una
zona desnuda de la mucosa susceptible a la digestión posterior. La mejor forma
de diferenciar la erosión y la úlcera es por su profundidad. La pérdida de tejido
mucoso es decir, la erosión; se regenera por la formación de epitelio sin
formación de cicatriz, la lesión que se extiende a través de la muscularis
mucosae se regenera mediante el desarrollo de tejido de granulación. Una
úlcera aguda se caracteriza por bordes y fondo donde el tejido conjuntivo es
escaso o no existe, mientras que una úlcera crónica posee tejido fibroso
abundante en sus bordes y en su base.
Para la úlcera duodenal, la característica mas notable es el aumento de masa
celular tipo parietal, lo que trae como consecuencia un incremento en la
capacidad secretora, además, existe aumento de vaciado gástrico, que tiene
como resultado un aumento de carga ácida para el duodeno, ya que gran parte
de la proteína amortiguadora ha sido consumida o vaciada por el estómago.
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1.1.1. Etiología y patología. El desarrollo de la úlcera péptica es el resultado
de una zona localizada de necrosis y digestión del revestimiento del tubo
digestivo. Esto deja una zona sin moco en la mucosa gástrica, susceptible a la
posterior digestión (Sodeman y Sodeman, 1988). El ácido y la pepsina son los
principales agentes causales de las úlceras. En las úlceras de tipo I, que se
producen en el estómago, hay poca o ninguna hipersecreción de ácido. En las
úlceras de tipo II abarcan tanto las úlceras gástricas, astrales, prepilóricas y
duodenales, caracterizándose por existir hipersecreción de ácido y trastorno de
los efectos de retroalimentación negativa de la acidificación en la descarga de
gastrina y la secreción sostenida de ácido (Brunton, 1996).
La causa ordinaria de la ulcera péptica es el desequilibrio entre la secreción de
jugo gástrico y el grado de protección de la barrera mucosa gastroduodenal. En
ocasiones la úlcera avanza hasta los vasos sanguíneos causando hemorragia,
o atraviesa completamente la pared intestinal, penetrando en órganos vecinos
o creando una perforación libre en la cavidad peritoneal. Casi siempre hay
actividad regeneradora que en cualquier momento puede lograr la curación de
la úlcera, especialmente si esta se protege del jugo gástrico (Sodeman y
Sodeman, 1988).
Los pacientes con úlceras prepilóricas tienden a secretar una mayor cantidad
de ácido y pepsina que los sujetos normales. La hipersecreción ácida
observada en la mayoría de los pacientes con úlcera duodenal puede deberse
principalmente a cuatro factores los cuales son:
1. Un incremento de células parietales que origina una mayor capacidad de
producción de ácido.
2. Un aumento de la estimulación de la secreción ácida.
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3. Un incremento de la sensibilidad de las células parietales a los estímulos
normales.
4. Una disminución de la inhibición de la secreción ácida y de la liberación de la
gastrina (Lloyd et. al., 1988, Lam, 1984, Spiro, 1987).
Además del daño producido por el ácido y la pepsina, se ha reportado que
Helicobacter pylori participa en el desarrollo de la úlcera. La asociación más
común de H. pylori y los humanos es con mucho la colonización gástrica
asintomática, ya que esta bacteria permanece fija a la capa de moco y no
penetra las capas epiteliales de la mucosa, sin embargo no se han identificado
toxinas citodestructivas (Kumar, 1995; Ballesteros, 2000; Rodríguez et. al.,
2000). Una vez instalada la bacteria en las células parietales; esta induce
varias anormalidades en la función gástrica como la estimulación de ácido
durante la ingesta de los alimentos, un deterioro de la inhibición normal del
desarrollo de la gastrina, incremento de la masa celular parietal y una
reducción en la secreción duodenal del bicarbonato. (Peek et. al., 1997).
El consumo de tabaco también participa en el desarrollo de la úlcera debido a
que retarda su cicatrización, se incrementan las complicaciones y la
probabilidad de morir en los fumadores. Se han descrito varios mecanismos de
acción del tabaco, como son una mayor secreción de ácido-pepsina,
aceleración gástrica originada por una mayor carga ácida al duodeno,
defectos en la secreción pancreática de bicarbonato, aumento del reflujo
duodenal gástrico, disminución del flujo sanguíneo y de prostaglandinas. No
obstante, estos efectos son variables, por lo que es imposible señalar cual de
ellos es más relevante (Lyndell et. al.; 1997).
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El consumo de fármacos anti-inflamatorios no esferoidales (AINE’S) esta
relacionado con la úlcera gástrica, ya que estos, inhiben a las enzimas
responsables de la síntesis de prostaglandinas, lo que provoca una disminución
en la producción de moco, bicarbonato y flujo sanguíneo, lo que se traduce
como un daño para la mucosa gástrica y en casos graves conlleva a dos de
sus complicaciones más graves como la hemorragia digestiva y la perforación
(Flores, 2003).
Ciertas enfermedades como: la cirrosis hepática, la insuficiencia renal crónica,
la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y el transplante renal; se han
asociado al desarrollo de la úlcera péptica. Así mismo existen padecimientos
como: la artritis reumatoide, la enfermedad coronaria, el hiperparatiroidismo, la
litiasis renal, la pancreatitis crónica y la fibrosis quística que también están
relacionados con la úlcera gástrica (Rodríguez et. al., 2000).
1.1.2. Sintomatología. La mayor parte de las úlceras pépticas causan dolor
epigástrico corrosivo, quemante o taladrante, pero una minoría significativa,
presenta complicaciones como hemorragia o perforaciones. El dolor tiende a
empeorar por la noche y se presenta generalmente de una a tres horas
después de las comidas durante el día. Las manifestaciones adicionales son
nauseas, vómito, distensión, eructos y pérdida de peso importante (originando
el espectro de alguna enfermedad maligna oculta). En forma ocasional,
en las úlceras penetrantes el dolor es referido a la espalda, al cuadrante
superior izquierdo o al tórax, y se puede interpretar de manera equivocada
como de origen cardiaco. (Kumar et. al., 1995; Soll, 1994).
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1.2. Modelos experimentales de Inducción de Lesiones Gástricas.
Estos modelos se realizan con el propósito de evaluar la eficacia de los
tratamientos terapéuticos (Silen,1988). Existen diferentes modelos
experimentales de inducción de las lesiones gástricas los cuales deben
reproducir tan fielmente como sea posible, el padecimiento como ocurre en los
seres humanos (Galvin et. al., 1992). Algunos de ellos son: Inducción de
lesiones gástricas con etanol, producción de lesiones gástricas con agentes
necrosantes, producción de úlceras gástricas con ácido acético, producción de
lesiones gástricas con AINE`S, lesiones gástricas por ligadura del píloro e
inducción de lesiones gástricas por estrés.
1.2.1. Inducción de lesiones gástricas con etanol. En las lesiones
producidas por la administración oral de etanol se utilizan concentraciones que
van del 40% al 70% (Hawkey et. al., 1988). Las lesiones hemorrágicas
aparecen en un lapso de 1 a 2 horas posteriores a la administración. El etanol
a concentraciones altas promueve la solubilización de la superficie de la
mucosa gástrica, agotamiento de la mucina intracelular con una difusión
luminal de mucosustancias y liberación de electrolitos a través del lumen
gástrico. El etanol concentrado también causa una rápida destrucción de las
células epiteliales de la mucosa con la formación de áreas necróticas, donde el
etanol y las macromoléculas atraviesan el tejido subyacente provocando que el
daño gástrico aumente en su profundidad debido a que el etanol absoluto libera
enzimas lisosomales y citosólicas. Se ha reportado que existe relación del daño
gástrico por etanol con la reducción en los niveles de moco y grupos sulfhidrilos
(Szabo et. al., 1990).
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1.3. Mecanismos de Defensa de la Mucosa Gástrica.
En general, los mecanismos de la mucosa gástrica, para protegerla de los
factores agresivos como el ácido clorhídrico, la bilis, los fármacos anti-
inflamatorios y el estrés consisten en factores funcionales, humorales y
neuronales. La secreción moco-alcalino, la capa de fosfolípidos, la
microcirculación y la motilidad son acciones funcionales; la síntesis y secreción
de prostaglandinas, así como la liberación de óxido Nítrico son factores
humorales y las neuronas sensibles a capsaicina desencadenan acciones
neuronales (Tsukimi et. al. 2001; Arrieta et. al. 2006).
1.3.1 Factores funcionales. Las sustancias secretadas en el lumen como el
ácido, el moco y el bicarbonato permiten que la mucosa gastrointestinal tenga
una resistencia notable a los factores que la dañan, como el ácido y la pepsina.
La función principal del ácido gástrico es disminuir los niveles de bacterias en el
intestino delgado. El epitelio actúa como una barrera a la difusión pasiva
de sustancias perjudiciales y cuando el epitelio es dañado se puede reparar
muy rápidamente por un proceso conocido como "restitución", que implica la
migración de células epiteliales sanas a la lesión (Wallace et. al., 2001). La
microcirculación gástrica esta involucrada en el mantenimiento de la mucosa
gastrointestinal modulando la liberación del ON en el endotelio vascular
(Calatayud et, al., 2001).
1.3.2. Factores neuronales. Existen evidencias tanto morfológicas como
funcionales de que las neuronas sensibles a capsaicina inervan el tracto
gastrointestinal. Se ha demostrado que estas neuronas contribuyen a la
protección de la mucosa. La aplicación local de capsaicina da como resultado
una activación neuronal y liberación de neuropéptidos, tales como la sustancia
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Fosfolípidos
Araquidonato
5-HPETE
Leucotrienos
Endoperóxido cíclico
Figura 1. Metabolismo del ácido araquidónico (Parente et. al., 2003).
p, calcitonina y neuroquinina los cuales provocan un incremento del flujo
sanguíneo en la mucosa gástrica (Tsukimi et. al., 2001).
Fosfolipasa A2
5- Lipooxigenasa
COX- 1 o COX-2
TXB2
Vasoconstrictor, activador de la
agregación plaquetaria
PGI2 Vasodilatador,
hiperalgésico, inhibidor de la agregación
plaquetaria
PGD2 Vasodilatador, inhibidor
de la agregación plaquetaria
PGF2 Broncoconstrictor,
contracción miometrial.
PGE2 Vasodilatador,
hiperalgésico y citoprotector.
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1.3.3. Factores humorales. Las prostaglandinas son un grupo de ácidos
grasos oxigenados de cadena larga derivados de un sustrato común el ácido
araquidónico (Figura 1). Son sustancias naturales que se encuentran en
todas las células de mamíferos. Las prostaglandinas difieren entre si por
cambios en el anillo de cinco átomos de carbono y en las dos cadenas laterales
unidas al anillo (Robert, 1987).
Las prostaglandinas se encuentran ampliamente distribuidas en el sistema
digestivo y están involucradas en cierto número de procesos fisiológicos
incluyendo la motilidad, flujo sanguíneo, secreción de moco, bicarbonato y
reducción de la secreción de ácido.
La mucosa gástrica resiste una gran variedad de factores nocivos endógenos y
exógenos, ya que existe una regeneración continua de prostaglandinas
E2 y prostaciclina (PGI2) donde la mayoría de los mecanismos de la mucosa
gástrica son estimulados o facilitados por prostaglandinas exógenas ó
endógenas.
El daño gástrico inducido por la supresión de la síntesis de prostaglandinas
puede ser prevenido por la administración de oxido nítrico (Atay et. al., 2000),
ya que el ON en condiciones aeróbicas estimula la conversión de ácido
araquidónico a prostaglandinas E2 y D2 (Hajjar et al., 1994).Recientes estudios
en rutas enzimáticas del metabolismo del ácido araquidónico revelan que la
síntesis de prostaglandinas depende de la actividad de la Ciclooxigenasa
(COX) como el paso inicial para la formación de eicosanoides, tales como
prostaglandinas (PGE2) y tromboxanos (TXB2), además el ácido araquidónico a
través de la 5-lipooxigenasa (LOX) origina los leucotrienos (LTB4) (Brzozowski,
2003).
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Se han establecido dos isoformas de la COX catalogadas como COX-1 y COX-
2. La COX-1 se encuentra en el organismo de manera constitutiva. Esta
isoforma, genera prostaglandinas que están involucradas en la protección de la
mucosa gastrointestinal. La isoforma COX-2 es inducida por una gran variedad
de agentes tales como: citosinas, mitógenos, endotoxinas, factores de
crecimiento, y lipopolisacáridos; generando prostaglandinas las cuales están
implicadas en los procesos de inflamación (Atay et. al., 2000).
Se ha propuesto que la COX1 y la COX-2 actúan en conjunto para mantener la
integridad de la mucosa gástrica en condiciones normales y el daño se
desarrolla cuando ambas isoenzimas son inhibidas. La mucosa puede resistir al
daño provocado por ácidos exógenos mediante la COX-1, solo si la COX-2 es
inducida y asiste a la COX-1. La inducción de la COX-2 puede ocurrir durante
el daño de la mucosa gástrica provocada por isquemia o úlcera gástrica donde
el daño se reduce y acelera la cicatrización (Figura 2). La COX-2 es esencial
para el mantenimiento de la integridad de la mucosa gástrica con otros
mediadores del sistema de defensa gástrica como ON o neuronas aferentes
(Peskar, 2001).
El óxido nítrico es un simple gas diatómico producido en la mucosa gástrica a
partir del aminoácido L-arginina por la enzima óxido nítrico sintasa
(SON) y desempeña un papel importante en la traducción de señales. Se ha
demostrado que agentes liberadores de óxido nítrico, tales como la
nitroglicerina y nitroprusiato de sodio, inhiben el daño gástrico inducido por HCl
50 mM o etanol al 70%. Los inhibidores no selectivos de la SON, tales como
nitro-L-arginina (L-NA) y L-NAME, evitan la citoprotección en presencia de
irritantes suaves, ya que, se considera que el óxido nítrico producido por la
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SON participa de manera importante en la integridad y mantenimiento de la
mucosa gástrica (Tsukimi et. al., 2001).
Figura 2. Papel que desempeñan la COX-1 y la COX-2 en el mecanismo de protección de la
mucosa gástrica.
Se sabe que el óxido nítrico esta implicado en el mantenimiento de la integridad
de la mucosa gástrica mediante el aumento de su flujo sanguíneo, así como; en
la producción de prostaglandinas. Sin embargo, aun no esta claro como el
óxido nítrico incrementa los niveles de prostaglandinas.
En la literatura se han reportado algunas teorías para tratar de explicar como el
óxido nítrico incrementa los niveles de prostaglandinas:
1. Se sugiere que el anión superóxido (O2-) es generado durante la activación
de la COX y se cree que participa en la auto-inactivación de la COX. El óxido
nítrico interacciona con el O2- y limita la cantidad de los radicales libres
COX-1
NEURONAS AFERENTES
NO
COX-2
MANTENIMIENTO E INTEGRIDAD
PROTECCION CONSTITUTIVA
MANTENIMIENTO E INTEGRIDAD
MUCOSA NORMAL
PROTECCION
INCREMENTA LA RESISTENCIA
ASISTE A COX-1
DAÑO PENDIENTE
INDUCCION
DAÑO (I-R)
MINIMIZA EL DAÑO
INDUCCION
INDUCCION ÚLCERACION
ACELERACION DE CICATRIZACION
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
13
Figura 3. Hipótesis del mecanismo del óxido nítrico en la generación de prostaglandinas en
defensa de la mucosa gástrica.
necesarios para su inactivación (Figura 3). Es por lo tanto, que el óxido nítrico
aumenta los niveles de la prostaglandinas (Salvemini et, al., 1997).
2.- Por otro lado el óxido nítrico nitrosila residuos de cisteína en la reacción
catalítica de la COX, favoreciendo la formación de nitrosotioles, lo que
puede conducir a cambios conformacionales en la estructura de la enzima
dando como resultado un incremento en la eficacia de la reacción (Salvemini
et, al., 1997).
3.- Cuando el óxido nítrico y O2- interactúan para formar la molécula citotóxica
peroxinitrilo (ONOO-), esta al descomponerse origina el radical hidroxilo (OH-)
COX
L-ARGININA
NOS
O + NO
ONOO
OH
PROSTAGLANDINAS
O2, OH
AMINOACIDOS
( )
(¿)
( + )
( + )
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
14
el cual al parecer interactúa con la COX provocando cambios
conformacionales en la estructura de la COX provocando un incremento en la
actividad catalítica de dicha enzima (Salvemini et, al., 1997).
1.4. Mecanismo de Defensa de la Mucosa Gástrica Independiente de
Prostaglandinas.
Esta protección incluye sustancias citoprotectoras que no estimulan la
biosíntesis de prostaglandinas en la mucosa gástrica. Entre estos se
encuentran los grupos sulfhidrilos (GSH), el factor de crecimiento epidérmico,
somatostatina y meciadanol (Huang et. al., 2000).
1.4.1 Grupos Sulfhidrilos (GSH). En 1981 Szabo reportó que los compuestos
que contienen grupos sulfhídrilo protegen a la mucosa gástrica del daño
inducido por etanol. De estas observaciones se deduce que los grupos
sulfhídrilo son citoprotectores de la mucosa gástrica y pueden participar en la
citoprotección inducida por las prostaglandinas. Los grupos sulfhídrilo son
requeridos para la síntesis de prostanoides y para la activación de los
receptores de las prostaglandinas, además son responsables de la defensa
de la mucosa gástrica, ya que influyen en la permeabilidad de la membrana y
captura de radicales libres (Szabo et. al., 1981; Konturek et. al., 1987; Shorrock
et. al., 1988; Maity et. al., 1998).
1.4.2. Factor de crecimiento epidérmico. Es un polipéptido producido por las
glándulas salivales y de Brunner. Estimula la síntesis de RNA y DNA en la
mucosa gástrica, además; favorece el crecimiento y la diferenciación celular
acelerando la reparación de la mucosa gástrica (Chao et. al., 2003). Se ha
reportado que tiene un efecto inhibidor de la secreción ácido gástrica, pero en
dosis no antisecretoras ha mostrado una protección del estómago contra las
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
15
lesiones producidas por aspirina, además previene la formación de lesiones por
estrés en ratas. Sin embargo, no esta del todo definido su participación en la
defensa gastroduodenal humana (Shorrock et. al., 1988; Allen et. al., 1993;
Jones et. al., 1999).
1.4.3. Somatostatina. La somatostatina es una hormona peptídica, distribuida
ampliamente en el organismo que se ha utilizado en el tratamiento de lesiones
agudas del tracto gastroduodenal (Puente et. al., 1995).
1.4.4 Meciadanol. Es un inhibidor de la histidina descarboxilasa y tiene acción
gastroprotectora contra el daño producido por etanol y aspirina, posiblemente
producida por la disminución de la formación de histamina en la mucosa
(Konturek et. al., 1990).
1.5. Tromboxanos.
Es el mayor metabolito de ácido araquidónico producido por plaquetas (vía
COX-1). Las plaquetas producen más del 95% de los tromboxanos detectables
en suero, siendo otra fuente los neutrofilos. Los Tromboxanos son potentes
vasoconstrictores y agonistas para la agregación plaquetaria. Cualquier
reducción en el flujo sanguíneo puede provocar que la mucosa sea más
susceptible al daño gástrico, también se ha sugerido que los tromboxanos
contribuyen de manera importante en la ulceración del tracto gastrointestinal.
Los Tromboxanos tienen la capacidad de estimular la liberación de
Leucotrienos y la adherencia de leucocitos en el endotelio vascular,
contribuyendo al daño de la mucosa a través de una modulación la respuesta
inflamatoria (Wallace et. al., 2001).
Con el desarrollo de los inhibidores de la síntesis de TXB2 fue posible definir la
contribución de estos, en el daño de la mucosa gástrica en modelos
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
16
experimentales para la inducción de lesiones gástricas. La inhibición de la
síntesis de tromboxanos demostró que reduce el daño provocado por sales
biliares o por etanol. Takahashi y colaboradores demostraron que el TXB2 se
encuentra en niveles elevados en tejido dañado del estómago y que la
inhibición de la síntesis de tromboxano, acelera la curación de las úlceras por
promoción de la regeneración de la mucosa. Hawkey y colaboradores
reportaron que no existen cambios en los niveles de tromboxano en el tejido
gástrico tomado de pacientes con úlcera (Wallace et. al., 2001).
1.6. Leucotrienos.
Los leucotrienos son sintetizados a partir del ácido araquidónico, el paso
limitante en la síntesis de leucotrienos lo constituye la enzima 5-lipooxigenasa
(LOX). Existe diferentes tipos de leucotrienos, sin embargo es conveniente
dividirlos en dos principales clases las cuales son: leucotrienos tipo B4 (LTB4) y
leucotrienos peptídicos (LCT4, LDT4, Y LTE4). La síntesis de Leucotrienos
ocurre comúnmente en células epiteliales, inmunocitos y células endoteliales.
En la mucosa gástrica, la masa celular es la mayor fuente de leucotrienos tipo
peptídicos, mientras que en los neutrofilos predominan los leucotrienos tipo B4
(Wallace et. al., 2001).
El rol que desempeñan los leucotrienos en la mucosa gástrica ha sido
estudiado extensamente en años recientes, los leucotrienos estimulan la
secreción de la pepsina lo que provoca una reducción del flujo sanguíneo de la
mucosa gástrica, además interfirieren en el vaciado gástrico (Atay et. al.,
2000).
Los productos de la LOX dañan la integridad de la mucosa gástrica y aumentan
los efectos provocados por agentes nocivos. Se ha propuesto que los
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
17
inhibidores de la LOX y los antagonistas de los leucotrienos disminuyen las
lesiones gástricas inducidas por varios agentes necrosantes (Atay et al., 2000).
1.7. Metabolitos aislados de plantas con actividad gastroprotectora.
Se han aislado e identificado diferentes tipos de metabolitos de plantas usadas
para el tratamiento de la úlcera gástrica, como son los flavonoides, las
saponinas, taninos, los alcaloides, algunos polisacáridos, aceites, gomas y
mucílagos, entre los que destacan los triterpenos siendo estos los más
comunes.
1.7.1. Triterpenos. Estructuralmente están conformados por tres unidades de
isoprenos y se ha propuesto previamente que el grupo hidroxilo en posición C3
es importante para esteroles y triterpenos en su actividad gastroprotectora
(Arrieta et. al., 2006; Navarrete et. al., 2002).
Se ha reportado que varios triterpenos incluyendo la carbenoxolona, el ácido
oleanólico, y otros esteroles poseen actividad gastroprotectora. Por ejemplo, el
acetato de Lupeol aislado de Spilanthes ocymifolia, el taraxerol aislado de
Taraxacum officinale y el ácido ursólico aislado de Psychotria adenophylla;
inhiben las lesiones gástricas causadas por estrés en ratas (Gupta et. al., 1981;
Snykers et. al., 1989). También el ácido oleanólico el cual se encuentra
presente en especies como Prosopis granulosa, Calendula, Helianthus y
Solidazo poseen actividad antiulcerosa cuando la lesión es inducida con
Aspirina, Indometacina, Reserpina y Tetragastrina (Gupta et. al., 1981; Snykers
et. al., 1989).
De las plantas que se ha aislado la mayor cantidad de compuestos triterpenicos
con actividad gastroprotectora se encuentran Hippocratea excelsa (cancerina) y
Amphiterygium adstringens (cuachalalate). De la cancerina, los metabolitos
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
18
responsables de dicha actividad son: β-sitosterol, β-D-glucósido de β-sitosterol,
epicatequina y la mezcla de α- y β- amirinas (Navarrete et. al., 2002). Mientras
que para el cuachalalate se reporta que los metabolitos responsables de la
actividad biológica son: el ácido 3α-hidroximasticadienónico, ácido epi-
oleanólico y β-sitosterol (Arrieta et. al., 2003).
Existe evidencia de que el β-sitosterol presenta actividad gastroprotectora en
úlcera gástrica inducida con ácido acético y en el modelo de inducción de
lesiones gástricas con etanol en ratas (Arrieta et. al., 2006). También se ha
reportado que en el efecto gastroprotector del β-sitosterol están involucradas
las protaglandinas (Arrieta, 2003).
Se ha reportado que, tanto el estigmasterol como el β-lupeol presentan
actividad gastroprotectora contra las lesiones gástricas inducidas con etanol en
rata Wistar y que en su mecanismo de gastroprotección están involucradas las
prostaglandinas (Sánchez, 2003; Sandoval, 2004).
Por otro lado para el ácido 3α-hidroximasticadienónico se ha reportado que
presenta efecto gastroprotector importante y en su mecanismo de acción
participan los grupos sulfhidrilo (Flores, 2003).
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
19
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
Se ha descrito que para el 3α-hidroximasticadienónico los grupos sulfhidrilos
participan de manera importante en su mecanismo de acción (Arrieta et. al.,
2003); mientras que, para el β-sitosterol el óxido nítrico y los grupos sulfhidrilos
están implicados en su gastroprotección (Arrieta et. al., 2006). De la misma
manera, el estigmasterol y el β-lupeol tienen actividad gastroprotectora con la
participación de los grupos sulfhidrilos, el óxido nítrico y las prostaglandinas en
su mecanismo gastroprotector (Sánchez, 2003; Sandoval, 2004).
Sin embargo, no se conoce si efectivamente se incrementan los niveles de los
grupos sulfhidrilos cuando se administra el ácido 3α-hidroximasticadienónico,
estigmasterol y β-lupeol, cuando se inducen lesiones gástricas con etanol.
También se ignora si existe un aumento en los niveles de oxido nítrico en el
jugo gástrico por la administración de estigmasterol, β-lupeol y β-sitosterol en el
proceso de lesiones gástricas. Así mismo, se desconoce la función que
desempeñan los LTB4 y TXB2 cuando se administran estigmasterol, β-
sitosterol y β-lupeol. Por lo que en el presente trabajo se cuantificaron los
niveles de ON, LTB4 y TXB2 en jugo gástrico y los niveles grupos sulfhidrilos
en tejido gástrico de rata para explicar de qué forma están involucrados en el
mecanismo de acción gastroprotector de esos productos naturales.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
20
3. HIPÓTESIS.
La administración intragástrica de estigmasterol, β-lupeol y β-sitosterol;
incrementaran los niveles de oxido nítrico y modificarán los niveles de
tromboxanos TXB2 y leucotrienos LTB4 en el jugo gástrico al inducir daño
gástrico con etanol.
Mientras que la administración del ácido 3α-hidroximasticadienónico, del ácido
β- hidroximasticadienónico, del estigmasterol y del β-lupeol incrementarán los
niveles de los grupos sulfhidrilos en tejido gástrico en el mismo proceso de
inducción de daño gástrico.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
21
4. OBJETIVO GENERAL.
Cuantificar los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos
sulfhidrilo en estómago de rata después de la administración intragástrica de
estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico en el
modelo de inducción de daño gástrico con etanol.
5. OBJETIVOS ESPECÌFICOS.
1. Inducir la lesión gástrica por la administración de etanol en rata Wistar. 2. Cuantificar los niveles de nitratos, tromboxano B2 y leucotrieno B4 en jugo
gástrico de rata pretratadas con estigmasterol, β-lupeol y β-sitosterol
respectivamente, en lesiones gástricas inducidas con etanol.
3. Cuantificar los niveles de grupos sulfhidrilo en tejido gástrico de rata
pretratadas con estigmasterol, β-lupeol, ácido 3α-hidroximasticadienónico y
ácido 3 β-hidroximasticadienónico en lesiones gástricas inducidas con etanol.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
22
6. METODOLOGÍA.
6.1. Animales. Todos los experimentos se realizaron con ratas Wistar macho
de un peso de 175 a 200 g, adquiridos del Centro UNAM-Harlan (Harlan
México S. A. de C. V.). Los animales fueron tratados de acuerdo a la Norma
Oficial Mexicana para el cuidado de los animales (NOM-062-Z00-1999) y en
conformidad con las reglas internacionales para el cuidado de los animales de
laboratorio. Las ratas se colocaron de manera individual en cajas con un piso
de alambre para evitar la coprofagía, estas se privaron de alimento 24 horas
antes de la experimentación teniendo libre acceso al agua. Todos los
experimentos se realizaron usando de 6-8 animales por grupo (Navarrete et.
al., 1998).
6.2. Fármacos.
Los compuestos fueron suspendidos en Tween 80 al 0.5 % preparándose
minutos antes de realizar los experimentos y administrados vía oral. Las ratas
control recibieron únicamente Tween 80 al 0.5 % a una dosis de 0.5 mL/100 g
de peso administrado oralmente. El estigmasterol y β-sitosterol se adquirieron a
Sigma Aldrich Corporation (95% de pureza). El Ácido 3α-
hidroximasticadienónico se aisló del extracto metanólico de cuachalalate
preparado de forma industrial por laboratorios Mixim (Flores, 2003). El β-lupeol
se aisló del extracto hexánico de Pseudobombax ellipticum (Sandoval, 2004).
6.3. Cuantificación de los niveles de nitratos.
Para la cuantificación de los niveles de nitratos, se administraron en
experimentos separados estigmasterol (300 mg/kg p. o.), β-lupeol (30 mg/kg p.
o) y β-sitosterol
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
23
(30 mg/kg, p. o.) respectivamente, 30 minutos después los animales fueron
tratados con 1 mL de etanol absoluto, administrado por vía intragástrica, de
forma independiente del peso. Dos horas después de la administración del
etanol, se administro 1 mL de solución salina intragástricamente y de forma
inmediata el contenido gástrico fue aspirado, las muestras obtenidas fueron
almacenadas a -80ºC para su posterior análisis. Este procedimiento se
realizo de la misma manera para la cuantificación de tromboxanos (TXB2) y
leucotrienos (LTB4) como se representa en el Diagrama 1.
6.3.1. Análisis de las muestras. Las muestras fueron descongeladas a
temperatura ambiente, a partir de este punto estas fueron tratadas de acuerdo
al método descrito por el producto comercial para la cuantificación de
nitratos/nitritos (Cayman Chemical Corporation), que en primer lugar se realiza
la conversión de nitratos a nitritos por medio de la enzima nitrato reductasa y
finalmente la adición del reactivo de Griess para convertir los iones nitritos en
un diazocompuesto de color púrpura, que finalmente se mide
espectrofotométricamente a 405 nm para la determinación de la concentración
de nitratos y cuya técnica se describe a continuación:
Realización de la curva Standard: Se colocó en un tubo de ensaye 0.9 mL de
solución amortiguadora y se adicionaron 0.1 mL de estándar reconstituido de
nitratos para obtener una concentración stock de 200 µM. Posteriormente se
realizaron diluciones para obtener concentraciones de 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 y
35 µM; las muestras control solamente contenían solución amortiguadora,
cada muestra fue analizada por triplicado.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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Diagrama 1. Obtención de muestras de jugo gástrico de rata para la cuantificación de oxido
nítrico, tromboxanos y leucotrienos pretratadas con estigmasterol (300 mg/Kg p.o.), β-lupeol (30
mg/Kg p.o.) y β-sitosterol (30 mg/Kg p.o.) respectivamente sobre daño gástrico inducido con
etanol.
Guardar a -80°C
Extraer jugo gástrico
Administración de estigmasterol (300 mg/Kg p.o.), β-lupeol (30
mg/kg p.o.) y β-sitosterol (30 mg/Kg p. o.), respectivamente
Administrar 1 mL de etanol absoluto
Ratas Wistar (175-200 g)
Ayuno por 24 horas
30 minutos
2 horas
Oxido Nítrico Tromboxanos Leucotrienos
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
25
Las muestras fueron centrifugadas a 3000 rpm durante 10 minutos, de cada
una se tomaron 80 µL de sobrenadante los cuales se colocaron en los pozos
de la placa. A las muestras anteriores, se les adicionó 10 µL de la mezcla
enzima cofactor y 10 µL de la mezcla nitrato reductasa dejándose incubar a
temperatura ambiente por 3 horas.
Después, se adicionaron 50 µL del reactivo de Griess 1 e inmediatamente 50
µL del reactivo de Griess 2, incubando por 10 minutos a temperatura ambiente,
tiempo suficiente para la formación de un color azul (Indicativo de la presencia
de nitratos); posteriormente la placa fue leída a una longitud de 540 nm
utilizando para ello un lector de ELISA modelo 680 Microplate Reader de la
marca BIO-RAD (Konturek et. al., 2001; Konturek et. al., 1998.; Ka-Shun Ko et.
al., 2004; Sobko et. al., 2004).
6.4. Cuantificación de los niveles de tromboxanos y leucotrienos.
6.4.1. Purificación de las muestras. Las muestras se descongelaron, dejando
que alcanzaran la temperatura ambiente, posteriormente se tomo 1 mL de
cada una de las muestras y se les adiciono 1 mL de una mezcla etanol/agua en
proporción 4:1 y 20 µL de ácido acético glacial. Se incubaron por 5 minutos a
temperatura ambiente, posteriormente se centrifugaron a 2500 rpm durante 2
minutos. A continuación se tomo 1 mL del sobrenadante de las muestras
centrifugadas el cual se colocó en una columna específica para la purificación
de prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos (Amprep C18, Amersham
Pharmacia Biotechnologies), previamente humectada dos veces con 1 mL de
etanol al 10%. De forma inmediata se eluyó la columna con 1 mL de agua
destilada y después con 1 mL de hexano y finalmente con 0.75 mL de acetato
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
26
Diagrama 3. Proceso de purificación de jugo gástrico de rata pretratadas con estigmasterol (300
mg/Kg p.o.), β-lupeol (30 mg/Kg p.o.) y β-sitosterol (30 mg/Kg p.o.) respectivamente, sobre
daño gástrico inducido con etanol para la obtención de prostanoides.
Purificar 1 mL de sobrenadante por columna AMPREP C18
(Chang et. al., 2001)
Descongelas muestras
TXB2 LTB4
Evaporar las fracciones que contienen prostanoides bajo una atmósfera de nitrógeno
Guardar a -80ºC
1 mL etanol: agua (4:1) + 20 µL de ácido acético glacial
Incubar por 5 min a Temp. Amb. y centrifugar a 2500 rpm
2 minutos
Agua: hexano y acetato de etilo (1:1:0.75)
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
27
de etilo que fue donde se obtuvieron las prostaglandinas, tromboxanos y
leucotrienos.
El acetato de etilo fue evaporado con nitrógeno (Gianfranco et. al., 2004) y las
muestras se guardaron a -80 ºC para su posterior análisis (Diagrama 3).
6.4.2. Cuantificación de los niveles de tromboxanos TXB2.
6.4.2.1. Análisis de las muestras. Las muestras fueron tratadas de acuerdo al
método descrito por el paquete comercial para el inmunoensayo enzimático de
tromboxanos TXB2 (Assay Designs) basado en una competencia del TXB2 y
del conjugado acetilcolistenerasa -TXB2 para un antisuero de conejo-TXB2 y
con el reactivo de Ellmann se desarrollará una reacción enzimática de color
amarillo y cuya técnica se describe a continuación:
Para la realización de la curva estándar, se colocaron 100 µL de una solución
stock cuya concentración fue de 100000 pg/mL en un tubo de ensaye con 0.9
mL de solución amortiguadora, a continuación se realizaron diluciones para
obtener concentraciones de 10000, 3333, 1111,370, 123, 41.1 y 13.7 pg/mL;
las muestras control solamente contenían solución amortiguadora; cada
muestra fue analizada por duplicado.
Se tomaron 100 µL de cada una de las muestras, las cuales fueron colocadas
en los pozos de la placa que contenían suero anti-ratón IgG, Inmediatamente,
se les adicionó 50 µL del conjugado azul TXB2 HS-EIA, con excepción de los
pozos marcados como actividad total y blancos. Posteriormente, se le adicionó
50 µL de anticuerpo amarillo TXB2 HS-EIA a cada uno de ellos, con excepción
de los pozos mencionados anteriormente. La placa se colocó en incubación
durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
28
Al termino de este, se aspiro el contenido de todos los pozos y se lavó cada
uno de ellos con 400 µL de solución amortiguadora (Tris salino con detergente)
tres veces; al finalizar los lavados se aspiraron nuevamente y se secaron los
pozos con papel absorbente. Posteriormente, se les adicionó 5 µL del
conjugado azul TXB2 HS-EIA a los pozos de actividad total. A todos los pozos
se les adicionó 200 µL de substrato pNpp (Buffer de p-nitrofenil fosfato) y se
dejo incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos, tiempo suficiente
para que desarrolla color verde e inmediatamente se les adicionó 50 µL de una
solución Stop (fosfato trisódico). La placa fue leída a una longitud de 405 nm
utilizando el lector de ELISA (Diagrama 4).
6.4.3. Cuantificación de los niveles de leucotrienos LTB4.
6.4.3.1. Análisis de muestras. Las muestras fueron tratadas de acuerdo al
método descrito por el paquete comercial para el inmunoensayo enzimático de
leucotrienos LTB4 (Assay Designs) cuyo fundamento es similar al mencionado
a la técnica de TXB2 y cuya técnica se describe a continuación:
Para la realización de la curva standard, se colocaron 100 µL de una solución
stock cuya concentración fue de 120000 pg/mL en un tubo de ensaye con 0.9
mL de solución amortiguadora, a continuación se realizaron diluciones para
obtener concentraciones de 12000, 3000, 750, 188 y 46.9 pg/mL; las
muestras control solamente contenían solución amortiguadora; cada muestra
fue analizada por duplicado.
Se Colocaron 100 µL de cada una de las muestras en los pozos de la placa
que contenían suero anti-ratón IgG, posteriormente, se les adicionó 50
µL del conjugado azul LTB4 HS-EIA, con excepción de los pozos marcados
como actividad total y blancos. Inmediatamente, se le adicionó 50 µL de
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
29
Diagrama 4. Cuantificación de TXB2 y LTB4 en jugo gástrico de rata pretratadas con
estigmasterol (300 mg/Kg p.o.), β-lupeol (30 mg/Kg p.o.) y β-sitosterol (30 mg/Kg p.o.)
respectivamente, sobre el daño gástrico inducido con etanol.
100 µL de muestra
Adición de 50 µL de conjugado y anticuerpo, respectivamente.
Incubar de 2 h a temperatura ambiente
Adición de 5 mL de conjugado y
200 µL de substrato, respectivamente.
Incubar 45 minutos a temperatura ambiente
Incubar de 2 h a 37°C
Adición de 50 µL de solución stop
Adición de 50 µL de solución stop
Leer a 405 nm. (TXB2)
Leer a 405 nm. (LTB4)
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
30
anticuerpo amarillo LTB4 HS-EIA a cada uno de ellos, con excepción de los
pozos mencionados anteriormente. La placa se colocó en incubación durante 2
horas a temperatura ambiente con agitación. Al termino de este, se aspiro el
contenido de todos los pozos y se lavó cada uno de ellos con 400 µL de
solución amortiguadora (Tris salino con detergente) tres veces; al finalizar los
lavados se aspiraron nuevamente y se secaron los pozos con papel
absorbente. Posteriormente, se les adicionó 5 µL del conjugado azul LTB4 HS-
EIA a los pozos de actividad total. A todos los pozos se les adicionó 200 µL de
substrato pNpp (Buffer de p-nitrofenil fosfato) y se incubó a 37ºC durante 2
horas, tiempo suficiente para que desarrolla color verde e inmediatamente
después se les adicionó 50 µL de una solución Stop (fosfato trisódico). La placa
fue leída a una longitud de 405 nm. Utilizando un lector de ELISA (Diagrama 4).
6.5. Cuantificación de los niveles de grupos sulfhidrilos (GSH).
Para la cuantificación de los niveles de grupos sulfhidrilos se administraron los
compuestos estigmasterol (300 mg/kg p.o.), β-lupeol (30 mg/kg p.o.), el ácido
3α-hidroximasticadienónico (30 mg/kg p.o.) y el ácido 3α-
hidroximasticadienónico (30 mg/kg p.o.), 30 minutos después se administro 1
mL de etanol, transcurridas 2 horas los animales fueron sacrificados con éter
etílico e inmediatamente, los estómagos fueron removidos, realizando una
incisión por medio de la curvatura mayor tomando muestras en el cuerpo de la
mucosa. La mucosa fue pesada (0.5 g aproximadamente) y después; se le
adicionó 2 mL de solución amortiguadora de fosfatos (NaH2PO4 0.1 N mas
Sacarosa 0.25 N a pH 7.4) Las muestras obtenidas fueron almacenadas a -
80ºC para su posterior análisis.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
31
6.5.1. Análisis de las muestras. Para cuantificar GSH en la mucosa gástrica,
la técnica empleada esta basada en una reacción con el DNTB formando una
reacción de color amarillo (indicativo de una formación del complejo GSH-TNB)
y cuya técnica se describe a continuación:
Las muestras obtenidas fueron descongeladas a temperatura ambiente,
posteriormente homogeneizadas con un dispersor ULTRA-TURRAX modelo T8
de la marca IKA y centrifugadas a 4000 rpm durante 15 minutos a 4ºC en una
microcentrífuga refrigerada Micromax RF modelo 120 de la marca Termo
Electrón Corporation. Del sobrenadante se tomó 1 mL de muestra e
inmediatamente se le adicionó 3.75 mL de solución amortiguadora Tris-HCl
pH 8.2, 1.25 mL de DNTB (5,5`-Dithio-bis(2-dinitrobenzoico ácido)) y 20 mL de
metanol. Se les dejo reposar
por 5 minutos a temperatura ambiente, tiempo suficiente para la formación de
color amarillo (indicativo de la presencia de GSH). Las muestras fueron leídas a
una longitud de 412 nm (Diagrama 5), usando para ello un espectrofotómetro
Hitachi modelo 200-100.
Los resultados obtenidos fueron expresados en µM por gramo de tejido,
(Takeuchi et. al., 1989; Sedlak et. al., 1968; Pongpiriyadacha et. al., 2003).
6.6. Análisis estadístico.
Los resultados obtenidos, se analizaron utilizando una prueba de análisis de
varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnet (Montgomery, 1991), en
caso de requerirlo.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
32
Diagrama 5. Cuantificación de GSH en tejido de estomago de rata con lesiones gástricas
inducidas con etanol y pretratadas con estigmasterol, β-lupeol y ácido 3α-
hidroximasticadienónico.
Ratas Wistar (175- 200 g)
Guardar a -80°C
Pesar y suspender en solución amortiguadora
Extraer tejido gástrico
Administración de estigmasterol, β-lupeol y ácido 3α-hidroximasticadienònico, respectivamente.
Administrar 1 mL de etanol absoluto
Leer a 412 nm
Ayuno por 24 horas
30 minutos
2 horas
Descongelar a temperatura ambiente, homogenizar y centrifugar a 4000 rpm (15 min a 4ºC)
Pesar y suspender en solución amortiguadora
Tomar 1 mL de sobrenadante + 3.75 mL de TRIS-HCL + 1.25 mL DNTB
5 min Temp. Amb.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
33
7. RESULTADOS. 7.1. Niveles de nitratos en jugo gástrico.
Después de la administración de estigmasterol y β-lupeol los niveles de
nitratos se incrementaron notablemente (9.87 + 1.13 µM/mL y 10.98 + 1.12
µM/mL respectivamente) en relación al grupo control tratado con el vehículo
(5.28 + 1.22 µM/mL) y al grupo normal que no llevó tratamiento (2.58 + 0.81
µM/mL) como lo indican las Gráficas 1 y 2 respectivamente. Por otro lado para
el β-sitosterol los niveles de nitratos (5.75 + 1.07 µM/mL) no se incrementaron
(Gráfica 3), ya que no existe una diferencia estadísticamente significativa
respecto al grupo control.
7.2. Niveles de TXB2 en jugo gástrico.
Los niveles de TXB2 se incrementaron tanto para el grupo control (829 + 105
pg/mL) como para los grupos tratados con 300 mg/kg de estigmasterol (672 +
127 pg/mL, Gráfica 4), 30 mg/kg β-Lupeol (822 + 98 pg/mL, Gráfica 5) y 30
mg/kg β-sitosterol (732 + 90 pg/mL, Gráfica 6) mostrando una diferencia
significativa respecto al grupo normal (233 + 50 pg/mL).
7.3. Niveles de LTB4 en jugo gástrico
Los resultados obtenidos de los niveles de LTB4 en ratas pretratadas con
estigmasterol (6954 + 63 pg/mL), β-Lupeol (7550 + 231 pg/mL) y β-sitosterol
(7216 + 150 pg/mL), se muestran en las Gráficas 7, 8 y 9, donde los niveles de
LTB4 no se incrementaron de manera significativa en ninguno de los casos. Los
niveles obtenidos para el grupo control fueron 6799 + 131 pg/mL, y para el
grupo normal fueron 6534 + 146 pg/mL.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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NT
RA
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CO
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CIO
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N (µΜµΜµΜµΜ
/ml)
/ml)
/ml)
/ml)
0
2
4
6
8
10
12
NNNN CCCC EEEE
aaaa
bbbb
aaaa
Grafica 1. Niveles de Oxido Nítrico (ON) en jugo gástrico de rata pretratadas con Estigmasterol
(E; 300 mg/kg, p.o.) sobre lesiones gástricas inducida con etanol. Cada barra representa la
media + EEM de al menos seis determinaciones. a: indica diferencia significativa (p < 0.05) con
respecto al grupo Normal (N) y b indica diferencia significativa (p < 0.05) con respecto al grupo
Control (C).
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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CO
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N (µΜµΜµΜµΜ
/ml)
/ml)
/ml)
/ml)
0
2
4
6
8
10
12
14
NNNN CCCC LLLL
aaaa
bbbb
aaaa
Grafica 2. Niveles de ON en jugo gástrico de rata pretratadas con β- lupeol (L, 30 mg/kg, p.o.)
sobre úlcera gástrica inducida con etanol. Cada barra representa la media + EEM de al menos
seis determinaciones a: indica diferencia significativa con respecto al grupo Normal (N) y b, p <
0.05 indica diferencia significativa con respecto al grupo Control (C).
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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NC
EN
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(C
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CE
NT
RA
CIO
N D
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N (µΜµΜµΜµΜ
/ml)
/ml)
/ml)
/ml)
0
2
4
6
8
NNNN CCCC SSSS
a
a
Grafica 3. Niveles de ON en jugo gástrico de rata pretratadas con β-sitosterol (S, 30 mg/kg, p.o)
sobre las lesiones inducidas con etanol. Cada barra representa la media + EEM de al menos seis
determinaciones. a: indica diferencia significativa (p < 0.05) con respecto al grupo Normal (N). C
= grupo control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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CO
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CE
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XB
22 22 (
pg/
ml)
(pg/
ml)
(pg/
ml)
(pg/
ml)
0
200
400
600
800
1000
NNNN CCCC EEEE
a
a
Grafica 4. Niveles de TXB2 en jugo gástrico de rata pretratadas con Estigmasterol (E, 300 mg/kg,
p.o.) sobre las lesiones inducidas con etanol. Cada barra representa la media + EEM de al
menos seis determinaciones. a: indica diferencia significativa (p<0.05) con respecto al grupo
Normal (N). C= grupo Control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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ml)
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ml)
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ml)
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ml)
0
200
400
600
800
1000
NNNN CCCC LLLL
a a
Grafica 5. Niveles de TXB2 en jugo gástrico de rata pretratadas con β- lupeol (L, 30 mg/kg, p.o.)
sobre lesiones inducidas con etanol. Cada barra representa la media + EEM de al menos seis
determinaciones. a: p < 0.05 indica diferencia significativa con respecto al grupo Normal (N). C =
grupo control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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CIO
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22 22 (
pg/
ml)
(pg/
ml)
(pg/
ml)
(pg/
ml)
0
200
400
600
800
1000
NNNN CCCC SSSS
a
a
Grafica 6. Niveles de TXB2 en jugo gástrico de rata pretratadas con β-sitosterol (S, 30 mg/kg,
p.o.) sobre lesiones inducidas con etanol. Cada barra representa la media + EEM de al menos
seis determinaciones. a: p < 0.05 indica diferencia significativa con respecto al grupo Normal
(N). C= grupo control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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CIO
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pg/
ml)
(pg/
ml)
(pg/
ml)
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ml)
0
2000
4000
6000
8000
NNNN CCCC EEEE
Grafica 7. Niveles de LTB4 en jugo gástrico de rata pretratadas con Estigmasterol (E, 300 mg/kg,
p.o.) sobre lesiones inducidas con etanol. Cada barra representa la media + EEM de al menos
seis determinaciones. N = Grupo Normal y C = grupo Control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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pg/
ml)
(pg/
ml)
(pg/
ml)
(pg/
ml)
0
2000
4000
6000
8000
10000
NNNN CCCC LLLL
Grafica 8. Niveles de LTB4 en jugo gástrico de rata pretratadas con β- lupeol (L, 30 mg/kg, p.o.)
sobre lesiones inducidas con etanol. Cada barra representa la media + EEM de al menos seis
determinaciones N = Grupo Normal y C = grupo Control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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TB
44 44 (
pg/
ml)
(pg/
ml)
(pg/
ml)
(pg/
ml)
0
2000
4000
6000
8000
NNNN CCCC SSSS
Grafica 9. Niveles de LTB4 en jugo gástrico de rata pretratadas con β-sitosterol (S, 30 mg/kg,
p.o) sobre lesiones inducidas con etanol. Cada barra representa la media + EEM de al menos
seis determinaciones. N = Grupo Normal y C = grupo Control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
43
7.4. Niveles de GSH en tejido gástrico.
Como se muestra en la Gráfica 10 a 12 los niveles de GSH obtenidos al
administrar estigmasterol (156.77 + 4.5 µM/g de tejido), β-lupeol (174.85 +
10.58 µM/g de tejido) o ácido 3α-hidroximasticadienónico (158.73 + 13.0 µM/g
de tejido fueron menores al grupo control (199.16 + 11.77 µM/g de tejido), pero
no de manera significativa, registrándose niveles similares a los obtenidos con
el grupo normal (152.83 + 24.20 µM/g de tejido). Durante la etapa de
purificación del ácido 3α-hidroximasticadienónico, se aisló e identificó el
compuesto ácido 3β-hidroximasticadienónico, el cual mostró niveles de GSH de
172.81 + 14.77 µM/g en tejido gástrico a la dosis de 30 mg/kg, p. o.,
encontrándose que tampoco los niveles se incrementan de manera significativa
al compararse con el grupo normal y el control de vehículos como se muestra
en la Gráfica 13.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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GSH
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ejid
o)
M/g
tej
ido)
M/g
tej
ido)
M/g
tej
ido)
0
50
100
150
200
250
NNNN CCCC EEEE
Grafica 10. Niveles de GSH en tejido de estómago de rata pretratadas con Estigmasterol (E,
300 mg/kg, p.o.) sobre lesiones gástricas inducidas con etanol. Cada barra representa la media +
EEM de al menos seis determinaciones. N = Grupo Normal y C = grupo Control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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ido)
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tej
ido)
M/g
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ido)
0
50
100
150
200
250
NNNN CCCC LLLL
Grafica 11. Niveles de GSH en tejido de estómago de rata pretratadas con β- lupeol (L, 30
mg/kg, p.o.) sobre lesiones gástricas inducidas con etanol. Cada barra representa la media +
EEM de al menos seis determinaciones. N = Grupo Normal y C = grupo Control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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/g t
ejid
o)
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ido)
M/g
tej
ido)
M/g
tej
ido)
0
50
100
150
200
250
NNNN CCCC 3333αααα
Grafica 12. Niveles de GSH en tejido de estómago de rata pretratadas con Ácido 3α-
hidroximasticadienónico (3α, 30 mg/kg, p.o.) sobre lesiones gástricas inducidas con etanol. Cada
barra representa la media + EEM de al menos seis determinaciones. N = Grupo Normal y C =
grupo Control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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DE
GSH
(C
ON
CE
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RA
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SH (
CO
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GSH
(C
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SH (µµ µµ
M/g
tej
ido)
M/g
tej
ido)
M/g
tej
ido)
M/g
tej
ido)
0
50
100
150
200
250
NNNN CCCC 3333ββββ
Grafica 13. Niveles de GSH en tejido de estómago de rata pretratadas con Ácido 3β-
hidroximasticadienónico (3β, 30 mg/kg, p.o.) sobre lesiones gástricas inducidas con etanol. Cada
barra representa la media + EEM de al menos seis determinaciones. N = Grupo Normal y C =
grupo Control.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
48
8. ANÁLISIS DE RESULTADOS.
8.1. Efecto sobre los niveles de nitratos después de la administración
intragástrica de estigmasterol, β-lupeol y β-sitosterol.
El papel que desempeña el óxido nítrico en la defensa y/o daño de la mucosa
gastrointestinal ha sido sujeto de muchos estudios (Gianfranco et. al., 2004).
Se ha reportado que el óxido nítrico favorece la citoprotección de la mucosa
gástrica, a través del incremento del flujo sanguíneo y la inhibición de la
liberación de metabolitos oxigenados en la microcirculación gástrica, además
regula la producción de prostaglandinas e interactúa con prostanoides y
neuropéptidos sensoriales, regulando la integridad de la mucosa gástrica
(Martin et. al., 2001; Matsuda et. al., 1999). Sin embargo, existen controversias
sobre el rol predominante del óxido nítrico en el tracto gastrointestinal: protector
o dañino (Wallace et. al., 2001). En el presente estudio se observó que el
estigmasterol y el β-lupeol estimulan la producción de óxido nítrico en jugo
gástrico del estómago de rata, lo cual sugiere, que el ON esta implicado de
manera importante en el mecanismo de acción de estos compuestos, mientras
que el β-sitosterol no presentó aumento en los niveles de nitratos, lo que
sugiere que el ON no esta implicado en su mecanismo de acción.
8.2. Efecto sobre los niveles de tromboxanos TXB2 después de la
administración intragástrica de estigmasterol, β-lupeol y β-sitosterol.
Los tromboxanos son producidos a partir del ácido araquidónico (vía COX-1),
son potentes vasoconstrictores y agonistas para la agregación plaquetaria. Por
lo que una reducción en el fluido gástrico potencialmente generaría en la
mucosa mayor susceptibilidad al daño gástrico causado por agentes nocivos.
Se ha sugerido que los tromboxanos pueden contribuir a la formación de
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
49
úlceras gástricas a través de la modulación de la respuesta inflamatoria
(Wallace et. al., 2001), además de que los tromboxanos tienen la capacidad de
estimular la liberación de los leucotrienos B4 y la adherencia de leucocitos al
endotelio vascular, favoreciendo así el daño gástrico (Wallace et. al., 2001).
Con el desarrollo de inhibidores de la síntesis de tromboxanos, fue posible
definir la contribución de estos en las lesiones gástricas en modelos
experimentales; donde se ha reportado que los inhibidores de tromboxanos
demostraron reducir el daño gástrico inducido por sales biliares o por etanol
(Wallace et. al., 2001). Por otro lado Takahashi et. al., (1999), demostró que en
el estómago de rata con un alto índice de tejido gástrico dañado, el tromboxano
B2 acelera la cicatrización de las lesiones gástricas por regeneración de la
mucosa gástrica. Los niveles de tromboxano B2 por el pretratamiento con
estigmasterol, β- sitosterol y β- lupeol fueron mayores a los del grupo normal
lo que sugiere que el tromboxano B2 participa en la gastroprotección de estos
compuestos, que de acuerdo con lo propuesto por Takahashi et. al., (1999), lo
que estaría haciendo el tromboxano B2 sería favorecer la cicatrización.
8.3. Efecto sobre los niveles de leucotrienos LTB4 después de la
administración intragástrica de estigmasterol, β-lupeol y β-sitosterol.
Los leucotrienos LTB4 son sintetizados a partir del ácido araquidónico por
medio de la enzima 5-Lipooxigenasa, que generalmente ocurre en las células
epiteliales y endoteliales (Wallace et. al., 2001). En la mucosa gástrica, los
leucotrienos LTB4 estimulan la liberación de metabolitos reactivos del oxígeno
que contribuyen al daño del tejido gástrico asociado con la inflamación. Se
reporta que los leucotrienos no parecen producir ulceración gástrica, pero
pueden favorecer el daño gástrico inducido por agentes tales como etanol y
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
50
ácido en ratas (Wallace et. al., 1990). Se han propuesto dos teorías para tratar
de explicar la participación del LTB4 en el daño gástrico; una de ellas propone
que los leucotrienos pueden incrementar la susceptibilidad de la mucosa al
daño gástrico debido a una reducción del flujo sanguíneo en la mucosa
gástrica; la otra sugiere que el efecto del LTB4 esta relacionado con otros
mecanismos nocivos para la mucosa gástrica (Wallace et. al., 1990). La
administración previa del estigmasterol, β-sitosterol y β-lupeol no
incrementaron los niveles de LTB4, con respecto a los niveles normales, lo cual
sugiere que estos compuestos no disminuyen los niveles del LTB4 por lo tanto
no participan en su mecanismo de acción.
8.4. Efecto sobre los niveles de grupos sulfhidrilos (GSH) después de la
administración intragástrica de estigmasterol, β-lupeol, ácido 3α-
hidroximasticadienonico y 3β-hidroximasticadienónico.
Los grupos sulfhidrilo han sido implicados significativamente en la conservación
de la integridad gástrica, particularmente cuando las especies reactivas de
oxígeno son involucradas en la fisiología del daño gástrico. Los radicales libres
derivados del oxígeno son asociados con las lesiones gastrointestinales, y los
antioxidantes previenen la formación de lesiones inducidas por varios agentes
necrosantes (Pongpiriyadacha et. al, 2003; Gianfranco et. al., 2004).
El daño gástrico inducido por etanol está asociado a una reducción significativa
en los niveles de GSH en la mucosa gástrica de seres humanos y en animales
experimentales (Gianfranco et. al., 2004; Takeuchi et. al., 1989). Además, la
administración de GSH previene el daño gástrico inducido por etanol en seres
humanos y aquellos tratamientos con compuestos donadores de GSH protegen
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
51
a la mucosa gástrica contra el daño provocado por agentes necrozantes, estrés
o isquemia (Gianfranco et. al., 2004).
Se ha reportado además, que los incrementos o la disminución de GSH
endógenos pueden inducir citoprotección contra el daño inducido por etanol, y
que la prevención o agravación de estas lesiones puede estar asociado con el
incremento de la permeabilidad vascular o la inhibición de la motilidad gástrica
(Takeuchi et. al., 1989).
La administración de estigmasterol, ácido 3α-hidromasticadienònico, β-lupeol y
el ácido 3β-hidroximasticadienònico no modificaron los niveles de GSH en la
mucosa gástrica, lo que sugiere que el mecanismo gastroprotector de estos
compuestos es distinto a la participación de los grupos GSH endógenos.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
52
9. CONCLUSIONES. Las conclusiones que se desprenden del presente trabajo son las siguientes:
1. Los niveles de nitratos en jugo gástrico de rata se incrementaron
significativamente al ser pretratadas con estigmasterol y β-lupeol, pero no así
con el β-sitosterol; en el modelo de inducción de lesiones gástricas con etanol.
2. Los niveles de TXB2 y LTB4 en jugo gástrico no se modificaron por el
tratamiento con estigmasterol, β-lupeol y β-sitosterol.
3. Los niveles de grupos sulfhidrilo en tejido gástrico no se modificaron por el
tratamiento con estigmasterol, β-lupeol, ácido 3α-hidroximasticadienónico y
ácido 3β-hidroximasticadienónico.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
53
10. PERSPECTIVAS.
1. Evaluar la actividad gastroprotectora del estigmasterol, β-lupeol, ácido 3α-
hidroximasticadienónico y el ácido 3β-hidroximasticadienónico utilizando
inhibidores de PGE2, COX y GSH, respectivamente; sobre lesiones gástricas
inducidas con etanol en rata Wistar y cuantificar los niveles PGE2, GSH, TXB2
y LTB4 para conocer más acerca de sus mecanismos de acción.
2. Sintetizar los derivados metilado, acetilado, succínico y ftalato del ácido 3β-
hidroximasticadienónico y evaluar su actividad gastroprotectora.
3. Desarrollar un método analítico para aislar e identificar el ácido 3α-
hidroximasticadienónico y su isómero el ácido 3β-hidroximasticadienónico.
Cuantificación de los niveles de óxido nítrico, tromboxano B2, leucotrieno B4 y grupos sulfhidrilo en estómago de rata originada por la administración de estigmasterol, β-lupeol, β-sitosterol y ácido 3α-hidroximasticadienonico.
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