Μύκητες

Βασίλειο Των Μυκήτων Ευκαρυωτικοί

μη φωτοσυνθετικοί οργανισμοί 1.500.000 είδη, 75.000 (3%) έχουν περιγραφεί

100-150 λοιμώξεις σε ανοσοεπαρκείς

Το δένδρο της ζωής

Ευκαρυωτικά κύτταρα

Μύκητες (πρώτιστα)

Πρωτόζωα (πρώτιστα)

Μετάζωα ή έλμινθες (ζωϊκό β.)

Προκαρυωτικά κύτταρα

Βακτήρια ή ευ-βακτήρια

Αρχαιοβακτήρια

Ιοί (δεν είναι κύτταρα) (20-200 nm)

Ιοειδή (5 nm)

Prions (<5 nm)

Ταξινόμηση Μικροοργανισμών

Χαρακτηριστικά προκαρυωτικών - ευκαρυωτικών

Χαρακτηριστικό Προκαρυωτικό Ευκαρυωτικό

DNA με πυρηνική μεμβράνη Όχι Ναι

Μίτωση Όχι Ναι

Χρωμοσώματα Ένα Πολλά

Μιτοχόνδρια Όχι Ναι

Μέγεθος ριβοσωμάτων 70S 80S

Χαρακτηριστικά μυκήτων

Μύκητες Φυτά Ζώα

Κυτταρικό τοίχωμα Κυτταροπλασματική μ.

Χιτίνη και γλυκάνη Εργοστερόλη

Κυτταρίνη Φυτοστερόλη

Όχι

Ετερότροφοι Ναι

Χλωροφύλλη Όχι Ναι Όχι

Πυρήνας Απλοειδής (περισσότεροι) 6-20 χρωμοσώματα

Διπλοειδής στην C. albicans

Διπλοειδής Διπλοειδής

Δομή Απλούστερη Όργανα ‘Οργανα, ιστοί

Αναπαραγωγή Σπόρια

Μύκητες

Ταξινόμηση ανάλογα: Μορφολογίας

Τρόπου πολλαπλασιασμού

Γενετικά χαρακτηριστικά

Μύκητες

Μακρομύκητες (μανιτάρια)

Μικρομύκητες Μυκηλιακοί ή υφομύκητες (moulds)

Ζύμες ή βλαστομύκητες (yeasts)

Δίμορφοι μύκητες

Aseptate Hyphae

Υφές χωρίς διαφραγμάτια

Διάμετρος 6-10 μm

Septate Hyphae

Υφές με διαφραγμάτια

Διάμετρος 3-4 μm

ΚΑΤΩΤΕΡΟΙ

ΜΥΚΗΤΕΣ

ΑΝΩΤΕΡΟΙ

ΜΥΚΗΤΕΣ

Υφομύκητες

Υφομύκητες

Aseptate Hyphae

Υφές χωρίς διαφραγμάτια

σε σταθερά διαστήματα

Διάμετρος 6-10 μm

ΖΥΓΟΜΥΚΗΤΕΣ

Septate Hyphae

Υφές με διαφραγμάτια

Διάμετρος 3-4 μm

ΑΣΚΟΜΥΚΗΤΕΣ

ΒΑΣΙΔΙΟΜΥΚΗΤΕΣ

ΔΕΥΤΕΡΟΜΥΚΗΤΕΣ

ΚΑΤΩΤΕΡΟΙ

ΜΥΚΗΤΕΣ

ΑΝΩΤΕΡΟΙ

ΜΥΚΗΤΕΣ

Κενοκυτικές υφές

Υφομύκητες

Μυκήλιο

Πλέγμα υφών

Θαλλός

Σύνολο μυκηλίων

ΒΛΑΣΤΙΚΟ ή ΘΑΛΛΙΚΟ

Στο θρεπτικό υλικό

ΕΝΑΕΡΙΟ ή ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟ

Πάνω από την επιφάνεια του θρεπτικού υλικού

Μέσα αναπαραγωγής μύκητα: σπόρια ή κονίδια

Φυγόκεντρη ανάπτυξη

Στρογγυλή αποικία in vitro

Κυκλική πλάκα in vivo

Μονοκύτταροι – μονοπύρηνοι οργανισμοί

Βλαστοκονίδια ή βλαστοσπόρια

Ψευδοϋφές: αλυσίδες επιμηκυμένων βλαστοκονιδίων

Ψευδομυκήλιο: πλέγμα ψευδοϋφών

βλαστοκονίδια

Ζυμομύκητες

περίσφιγξη

εκβλάστηση θυγατρικού

κυττάρου

Ασεξουαλικός: μίτωση (βλαστική ανάπτυξη / εκβλάστηση θυγατρικού κυττάρου από το μητρικό κύτταρο)

ανάμορφοι Μ

Σεξουαλικός: μείωση (σύζευξη δύο διαφορετικών στελεχών ή σύζευξη δύο μυκηλιακών κυττάρων / βλαστοκυττάρων του ίδιου μύκητα) [2 πυρήνες σε ζυγώτη] τελειόμορφοι Μ

Περισσότερα ανάμορφα στάδια: συνανάμορφοι

Όλα τα στάδια γνωστά: ολόμορφοι

Πολλαπλασιασμός

Ταξινόμηση μυκήτων ιατρικής σημασίας

Μυκηλιακοί μύκητες

Ζυγομύκητες

Κοινοκυττάριες ή κενοκυττικές υφές

Ζυγώτης

Σπόροι ενδογενείς (sporangiospore)

sporangium

Αντιπροσωπευτικά γένη:

Lichtheimia (Absidia)

Mucor

Rhizopus

Rhizomucor

Conidiobolus

Basidiobolus

Ταξινόμηση μυκήτων ιατρικής σημασίας

Μυκηλιακοί μύκητες

Ασκομύκητες

Αληθείς υφές με εγκάρσια διαφράγματα

Ασκοσπόριο

Κονίδιο (κονιδιοσπόριο)

Αντιπροσωπευτικά γένη:

Aspergillus

Penicillium

Paecilomyces

Fusarium

Δερματόφυτα

Blastomyces dermatitis *

Histoplasma capsulatum *

Ταξινόμηση μυκήτων ιατρικής σημασίας

Βασιδιομύκητες και ατελείς μύκητες

Βασιδιομύκητες

Ψευδοϋφές (σπάνια)

Βασιδιοσπόριο

Βλαστοκονίδιο

Ανάμορφοι (ατελείς) μύκητες

Ψευδοϋφές και αληθείς υφές

Βλαστοκονίδιο, αρθροσπόριο

Αντιπροσωπευτικό είδος:

Cryptococcus neoformans

Αντιπροσωπευτικά γένη:

Candida

Trichosporon

Geotrichum

Σεξουαλικός

πολλαπλασιασμός

Γαμετοκύστεις (θήκες με λεπτό τοίχωμα)

Anteridium (αρσενικό)

Oogonium (θυληκό)

Γαμέτες (μειοσπόρια)

ΚΑΤΩΤΕΡΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ (ΖΥΓΟΜΥΚΗΤΕΣ)

Γαμετοκύστεις = τελικά τμήματα υφών

εμιμήκυνση του ενός προς το άλλο

(zygophore) σύντειξη τοιχωμάτων

Zygosporagium δημιουργία στο εσωτερικό

ενός zygospore σποροκύστη

Σεξουαλικός

πολλαπλασιασμός

Δύο γενετικά συμβατές υφές

Ασκογόνιο (-)

Ανθερίδιο (+)

Ασκοσπόριο

ΑΣΚΟΜΥΚΗΤΕΣ

Σύντηξη των άκρων των υφών

βραχεία δικαρυωτική υφή σύντηξη

πυρήνων (καρυογαμία) μείωση

μία ή διαδοχικές μιτώσεις ασκός =

εξειδικευμένη και διευρυμένη υφή με 4-8 (+ & -)

ασκοσπόρια μέσα στο ασκοκάρπιο

Ασκοσκάρπιο • κλειστοθήκιο

• περιθήκιο • γυμνοθήκιο

Σεξουαλικός

πολλαπλασιασμός

Δύο γενετικά συμβατές υφές

Βασιδιοσπόριο

ΒΑΣΙΔΙΟΜΥΚΗΤΕΣ

Σύντηξη των άκρων των υφών διπύρηνη υφή επέκταση και σχηματισμός μικρής προεκβολής

(σύνδεσμος επικοινωνίας clamp connection)

διπλασιασμός πυρήνων και μεταφορά ενός ζεύγους

πυρήνων από το ένα τμήμα της υφής στο άλλο μέσω της προεκβολής καρυογαμία στο άκρο της υφής

βασίδιο (στο βασιδιοκάρπιο) 4 βασιδιοσπόρια (2+

και 2-

Ταξινόμηση

Φύλο Μορφολογία Υφές Σεξουαλική αναπαραγωγή

Ασεξουαλική αναπαραγωγή

Χυτριδιομύκητες Chytridiomycota

Μονοκύτταροι Ωοσπόρια ζωοσπόρια

Ζυγομύκητες Zygomycota

Υφομύκητες Ευρείες όχι διαφραγμάτια

Ζυγοσπόρια Σποραγγειοσπόρια

Ασκομύκητες Ascomycota

Υφομύκητες

Λεπτές με διαφραγμάτια

Ασκοσπόρια Κονίδια

Βασιδιομύκητες Basidiomycota

Υφομύκητες (σπάνια) Ζύμες

Λεπτές με διαφραγμάτια

Βασιδιοσπόριο Κονίδια (σπάνια)

Ανάμορφοι Δευτερομύκητες

Υφομύκητες Ζύμες

Ψευδο- & αληθείς υφές

Άγνωστη Κονίδια

1000 είδη Μη παθογόνα Υδάτινο περιβάλλον

Οικολογία - Επιδημιολογία

Ενδογενής προέλευση Γαστρεντερικός σωλήνας: C. albicans

Δέρμα: άλλα είδη Candida, Geotrichum

Εξωγενής προέλευση Έδαφος: H. capsulatum, C. neoformans, A. fumigatus,

ζυγομύκητες (Mucor,…)

Οικολογικές φωλιές με οργανικά υπολείμματα

Κοσμολίτικη κατανομή Candida, Cryptococcus, Aspergillus, δερματόφυτα,...

Περιορισμένη γεωγραφική κατανομή χρωμοβλαστομυκητίαση, μυκητώματα σε

τροπικά/υποτροπικά κλίματα

Ενδημική κατανομή Histoplasma duboisii στην Κ. Αφρική, P. marneffei ΝΑ Ασία

Παθογένεια

Μηχανισμοί παθογόνου δράσης:

Προσκόλληση

Είδη μουκορμυκώσεων: βλεννογόνος ρινός

Κονίδια Aspergillus: βλεννογόνος αναπνευστικού

C. albicans: βλεννογόνος στόματος, κόλπου

επιφάνειες από πλαστικό

Διείσδηση στους ιστούς

Μέσω ΜΦ μετά φαγοκυττάρωση: C. immitis, H. capsulatum

Ένζυμα: ελαστάση Α. fumigatus

πρωτεάση C. albicans

Ιστικός πολλαπλασιασμός

Ικανότητα πολλαπλασιασμού στους 37οC

Τροπισμός προς αγγεία Aspergillus

προς μήνιγγες και νευρικό ιστό Cryptococcus

Παθογένεια

Μηχανισμοί παθογόνου δράσης:

Διαφυγή ή τροποποίηση αμυντικών μηχανισμών ξενιστή

Έλυτρο προς αποφυγή φαγοκυττάρωσης: Cryptococcus

Προσκολλητίνες που μιμούνται υποδοχέα του συμπληρώματος (CR3 – CR2): C. albicans

Γλοιοτοξίνες ανασταλτικές της φαγοκυτταρικής λειτουργίας των ΜΦ: Α. fumigatus

Παθογόνος δράση ασπέργιλλου

Παθογόνος δράση ζυγομυκήτων

• Οι ζυγομύκητες είναι μοναδικοί μεταξύ των υφομυκήτων στην

ικανότητα να προκαλούν λοιμώξεις σε μεγαλύτερο φάσμα

ασθενών, από ότι άλλοι ευκαιριακοί παθογόνοι υφομύκητες.

• Εισπνοή των σπόρων τους ή εναπόθεσή τους στις ρινικές

θαλάμες.

• Η δερματική ζυγομύκωση είναι η πρώτη εκδήλωση σε ανοσοεπαρκείς ασθενείς, ως αποτέλεσμα εμβολιασμού μεγάλου φορτίου σπόρων σε βαθύτερους ιστούς του

δέρματος, λόγω εκτεταμένου τραυματισμού ή εγκαύματος.

• Οι σπόροι των ζυγομυκήτων αποτελούν τις τυπικές λοιμογόνες

μορφές των παραρρινίων και του δέρματος • Kυψελιδικά μακροφάγα: πρώτη γραμμή άμυνας

• Ουδετερόφιλα: δεύτερη γραμμή άμυνας

• Οι αγγειοδιηθητικές νηματοειδές μορφές είναι υπεύθυνες για

τη διείσδυση στους ιστούς και τη διασπορά τους σε διάφορα

όργανα.

Για πρόκληση λοίμωξης πρέπει οι ζυγομύκητες

να καταναλώσουν από τον ξενιστή αρκετό σίδηρο για να αναπτυχθούν ,

να αποφύγουν τους φαγοκυτταρικούς αμυντικούς μηχανισμούς και

να διεισδύσουν στα αγγεία για να διασπαρούν.

Παθογένεια

Μηχανισμοί άμυνας:

Δέρμα Τραυματισμός: κρυπτοκόκκωση, χρωμομύκωση, σποροτρίχωση

Προϋπάρχουσες βλάβες (έγκαυμα): Aspergillus

Λύση συνεχείας του λόγω ιατρικών χειρισμών Καθετήρες: καντιντίαση

Χειρουργικοί χειρισμοί: ασπεργίλλωση

Φαγοκυττάρωση (ΠΜΠ, ΜΦ) Ουδετεροπενικοί: καντιντίαση, ασπεργίλλωση, μουκορμύκωση

Συμπλήρωμα C3a, C5a: χημειοταξία

iC3b: οψονινοποίηση

Τ-λεμφοκύτταρα AIDS:κρυπτοκόκκωση, ιστοπλάσμωση,

κοκκιδιοειδομυκητίαση, επιφανειακές καντιντιάσεις Β-κύτταρα: όχι σημαντικός ρόλος

ΝΚ-κύτταρα: πειραματική λ. από Cryptococcus

Το MAC δεν είναι ικανό από μόνο του

να καταστρέψει κάποιο μύκητα

Παθογένεια

Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς

εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,

παρακοκκιοειδομυκητίαση

Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου

λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)

Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση

Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών

Καντιντίαση

Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

Histoplasmosis (Histoplasma capsulatum)

Coccidioidomycosis (Coccidioides immitis)

Blastomycosis (Blastomyces dermatitis)

Arthroconidia

Paracoccidioidomycosis (Paracoccidioides brasiliensis)

Παθογένεια

Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς

εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,

παρακοκκιοειδομυκητίαση

Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου

λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)

Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση

Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών

Καντιντίαση

Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

Χρωμοβλαστομύκωση

Από Cladophialophora

Μυκήτωμα

Άμεσο

Καλλιέργεια

Παθογένεια

Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς

εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,

παρακοκκιοειδομυκητίαση

Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου

λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)

Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση

Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών

Καντιντίαση

Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

Ζυγομύκωση

Δερματική

Ρινοκρανιακή

Ζυγομύκητες

Mycorales

Διαδεδομένοι στη φύση

Σαπρόφυτα

Έδαφος

Αποθηκευμένοι σπόροι

Φρούτα

Επιμόλυνση

Κοπράνων

Δειγμάτων δέρματος

Rhizopus arrhizus (oryzae)

R. rhizopodiformis

Lichtheimia (Absidia) corymbifera

Rhizomucor pusillus

Μυκηλιακοί μύκητες

Absidiacae

• Absidia s. str.: αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες < 40° C (μεσοφιλικοί)

• Leptomyces (μεσοφιλικοί)

• Lichtheimia: καλή ανάπτυξη σε θερμοκρασία σώματος

• L. corymbifera

• L. ramosa

• L. ornata

Boekhout Τ et al. 2009, 3:170–178

Κρυπτοκόκκωση (Cryptococcus neoformans)

Ασκομύκητες-Hyaline Hyphomycetes Aspergillus

A. fumigatus, A. flavus, …

Διαδεδομένος στη φύση Έδαφος, οργανικά υπολλείματα

Ρούχα

Κλιματιστικά – υγραντές αέρα

Υγρά διαλύματα

Μεγάλη παραγωγή σπόρων

170.000 σπόροι / gr.

Aerosol σε χειρισμούς της αποικίας 12χ106 σπόροι/m3

Μέγεθος και μορφολογία

ευνοούν τη διασπορά με αέρα

δίοδος από αναπνευστικό, μέχρι πν. κυψελίδες

Μυκηλιακοί μύκητες

Ασκομύκητες-Hyaline Hyphomycetes

Penicillium

Διαδεδομένος στη φύση Οργανικά υπολλείματα

Σε αποσύνθεση

Παλιά

Χρησιμοποίηση στη βιομηχανία τυριού

Παραγωγή πενικιλλίνης P. chrysogenum

Παραγωγή γριζεοφουλβίνης P. griseofulvum

Μυκηλιακοί μύκητες

P. marneffei

Ασκομύκητες-Hyaline Hyphomycetes

Fusarium

Διαδεδομένος στη φύση

Σαπρόφυτα ή παράσιτα φυτών

Δημητριακά

Ρύζι

Φρούτα

Καλαμοσάκχαρο

Βαμβάκι

Τοξίνες

(Μολυσμένα δημητριακά)

Acremonium (100 είδη)

Διαδεδομένος στη φύση

Μυκηλιακοί μύκητες

Παθογένεια

Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς

εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,

παρακοκκιοειδομυκητίαση

Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου

λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)

Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση

Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών

Καντιντίαση

Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

Ζυμομύκητες

Candida Ο συχνότερος: 83%

Φυσ. χλωρίδα βλεννογόνων

C. albicans: γαστρεντερικού

C. glabrata: ουρογεννητικού

C. tropicalis: γαστρεντερικού, ουροποιητικού

έδαφος, νερό,

δημητριακά

C. parapsilosis: φ.χ. δέρματος

Καντιντιάσεις

Παθογένεια

Διάκριση μυκήτων σε 5 ομάδες:

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ασθενούς

εισπνοή σπόρων νόσος σε «υγιείς» Ιστοπλάσμωση, βλαστομυκητίαση, κοκκιδιοειδομυκητίαση,

παρακοκκιοειδομυκητίαση

Πρόκληση λοίμωξης ως αποτέλεσμα τραυματισμού Σποροτρίχωση, χρωμοβλαστομύκωση

Παρουσία μύκητα στο περιβάλλον του ατόμου

λοίμωξη σε άτομο με ανοσολογική ανεπάρκεια Είσοδος από βλεννογόνους: μουκορμύκωση (ζυγομύκωση)

Είσοδος με εισπνοή σπόρων: κρυπτοκόκκωση, ασπεργίλλωση

Σαπροφυτικοί μύκητες που γίνονται ευκαιριακά λοιμογόνοι λόγω ορισμένων συνθηκών

Καντιντίαση

Δερματόφυτα: επιφανειακές λοιμώξεις δέρματος, τριχών, νυχιών

Τριχόφυτα

Μικρόσπορα

Μολυσματικό κηρίο

Διάγνωση Ξέσματα δέρματος – νυχιών

Τρίχες Υλικό

Άμεσο με ΚΟΗ

Νύχια Δέρμα

Ectothrix

Endothrix

Διάγνωση

Καλλιέργεια

Μικροσκόπηση

T. rubrum T. tonsurans

T. violaceum

Μακροκονίδια

Μικροκονίδια

Διάγνωση

Καλλιέργεια

Μικροσκόπηση

Μ. canis Epidermophyton floccosum

Μακροκονίδια

M. canis

Μακροκονίδια E. floccosum

Ζυμομύκητες

Malassezia M. furfur, M. pachydermatis

Χλωρίδα δέρματος (λιπόφιλοι μ.)

Trichosporon beigelii Διαδεδομένος στη φύση

Φ.Χ. δέρματος, ΓΣ, φάρυγγα

Geotrichum G. candidum: κοσμοπολίτικος μ.

(έδαφος, νερό)

στα φυτά, παράγωγα ζώων (γάλα) [βιομηχανία γάλακτος & τυριού]

G. capitatum: λιγότερο συχνός στο περιβάλλον

άνθρωπος (ΓΣ, ΑΣ)

Pityriasis versicolor

Malassezia spp.

Εργαστηριακή διάγνωση

Άμεση μικροσκοπική εξέταση

Καλλιέργεια – απομόνωση - ταυτοποίηση

Ανοσοδιαγνωστικές μέθοδοι

Ανίχνευση κυκλοφορούντων Ags

Ανίχνευση ειδικών Abs

Μοριακές τεχνικές

Ιστολογική εξέταση

Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά

Ι. Άμεση μικροσκοπική εξέταση

Χωρίς χρώση

Με χρώση Lactophenol blue (γιά όλα τα είδη δειγμάτων)

India ink [ανίχνευση γλυκοκάλυκα Cryptococcus neoformans]

Gram stain

May-Grunwald Giemsa

Μετά διαύγαση με KOH Κύρια πρακτική για νύχια, τρίχες, δέρμα (διάλυση

κερατίνης)

Μερικά δείγματα πύου ή εκκρίσεων

Χρώση Gram

Ζυμομύκητες (βλαστοκονίδια και ψευδοϋφές): Gram (+)

Υφομύκητες: Gram(-)

Υαλοϋφομύκητες (Aspergillus, Fusarium, Scedosporium) υφές διαμέτρου 4-6μm με παράλληλα και χωρίς περισφίξεις τοιχώματα ομοιόμορφα κατανεμημένα διαφραγμάτα διχοτόμηση υπό γωνία 450

Ζυγομύκητες (Mucor, Rhizopus) υφές ευρείες και ακανόνιστες χωρίς διαφραγμάτα με βολβοειδείς πλάγιες διογκώσεις διχοτόμηση υπό γωνία 900

Η μικροσκοπική εξέταση πολύ σημαντική αν

ο μύκητας είναι μη βιώσιμος λόγω

λήψης αντιμυκητιακής αγωγής

ΙΙ. Καλλιέργεια

Ειδικά υλικά απομόνωσης μυκήτων (Sabouraud) Χλωραμφαινικόλη: μη ανάπτυξη βακτηρίων Ακτιδιόνη: αναστολή ανάπτυξης σαπροφυτικών μυκήτων,

επιτρέπει ανάπτυξη παθογόνων (εκτός C. neoformans, Mucor)

Παράγοντες ανάπτυξης (βιταμινούχο υλικό για T. ochraceum) Υλικά με αίμα για δίμορφους μύκητες (φάση ζυμομύκητα)

Δύσκολη – αδύνατη για μερικούς μύκητες

Histoplasma - Rhinosporidium

Επώαση Μύκητες επιφανειακών μυκητιάσεων 260 C Μύκητες εν τω βάθει μυκητιάσεων 370 C

Διάρκεια Ζυμομύκητες: 24-48 h

Υφομύκητες (Aspergillus, Penicillium, Mucor): 2-4 d

Υπόλοιποι παθογόνοι μύκητες, δερματόφυτα: 6-15 d

Θρεπτικά καλλιεργητικά υλικά για την απομόνωση μυκήτων

Εκλεκτικό θρεπτικό υλικό Sabouraud dextrose agar (SDA) με αντιβιοτικά

Πενικιλλίνη 20U/mL, στρεπτομυκίνη 40U/mL, γενταμυκίνη 5μg/mL, χλωραμφαινικόλη 16μg/mL

Κυκλοεξαμίδη ή ακτιδιόνη 0.5μg/mL

Μη-εκλεκτικό θρεπτικό υλικό BHI (Brain Heart Infusion): απαιτητικοί μύκητες

[δίμορφοι (ιστόπλασμα)]

Αναστολή βακτηρίων

Αναστολή σαπροφυτικών μυκήτων

Αλλά και ευκαιριακά παθογόνα 1. C. neoformans 2. Τrichosporon asahii 3. Μερικά είδη Candida 4. Μερικά είδη Aspergillus 5. Πολλούς ζυγομύκητες Koneman, 6th ed. 2006

ΙΙ. Καλλιέργεια

Δείγματα αναπνευστικού

Πτύελα – βρογχικές εκκρίσεις

Επιμόλυνση από χλωρίδα στόματος

Επιμόλυνση από περιβάλλον

Απομόνωση Aspergillus όχι απόδειξη λοίμωξης (ύπαρξη προδιαθεσικών παραγόντων)

Καντιντουρία

Επιμόλυνση από χλωρίδα γεννητικού συστήματος

Ποσοτική καλλιέργεια

> 100.000 CFU / ml λοίμωξη

10.000 – 100.000 CFU / ml λοίμωξη πιθανή

< 10.000 CFU / ml επιμόλυνση

Λοίμωξη νεφρού: (+) υπερηβική κ/α, (+) κ/α αίματος,

(+) ορολογικές εξετάσεις σε ασθενή με προδιαθ. παράγοντες

Προσοχή στην αξιολόγηση θετικών καλλιεργειών

ΙΙ. Καλλιέργεια

Θετική κ/α αίματος

Θετική κ/α από 3 διαφορετικές περιοχές

Θετική κ/α άσηπτου υλικού

(εκτός ουροδόχου κύστης)

Προσοχή στην αξιολόγηση θετικών καλλιεργειών

Συστηματική μυκητίαση

Είδος μύκητα Αντιγόνο, αντίσωμα, ένζυμο,

μεταβολίτης Κλινικό δείγμα

C. neoformans Γλυκουρονοξυλομαννάνη* ΕΝΥ, ορός

Aspergillus Γαλακτομαννάνη * Ορός, BAL

(ENY, ούρα??)

Candida Μαννάνη, αντιμαννάνη* Ορός, ΕΝΥ

Candida Ενολάση Ορός

Candida Αντι-ενολάση & αντισώματα έναντι άλλων ενδοκυττάριων

αντιγόνων Ορός

Candida D-αραβινιτόλη Ορός

Μύκητες άλλοι

εκτός Ζυγομυκήτων και C. neoformans

(1,3)-β-D-γλυκάνη * Πλάσμα / ορός

* Χρησιμοποιείται στη ρουτίνα

ΙV. Μοριακές τεχνικές

Ανίχνευση DNA σε κλινικό δείγμα με PCR Aspergillus σε δείγματα αναπνευστικού

Όμως 25% υγιών ατόμων θετικό αποτέλεσμα λόγω αποικισμού

Candida από δείγματα αίματος Πρόβλημα επιμόλυνση λόγω αποικισμού δέρματος

Cryptococcus

Ειδικοί ανιχνευτές (probes) για γρήγορη ταυτοποίηση H. capsulatum

B. dermatitidis

C. immitis

Επιδημιολογική μελέτη απομονούμενων στελεχών

Μοριακές τεχνικές (PCR, real-time PCR)

Μέθοδοι μη προτυποποιημένες

Δεν συμπεριλαμβάνονται στα διαγνωστικά κριτήρια (Ascioglu S. et al. CID, 2002)

(De Pauw B., et al., CID, 2008)

Στάδια που πρέπει να προτυποποιηθούν:

1. παρασκευή κλινικού δείγματος

2. επιλογή του κατάλληλου στόχου πολλαπλασιασμού

3. μέθοδοι ανάγνωσης του αποτελέσματος

4. πρόληψη ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων

Εμπορικά διαθέσιμες μοριακές

τεχνικές

• Άμεσος υβριδισμός

▫ Σημασμένος probe με

φθορισμό FISH ή χρωμογόνο

CISH

DNA probes

peptide nucleic acid – PNA

probes

▫ Στόχος: rRNA

▫ Συνδυασμός με Gram χρώση

▫ Ταυτοποίηση σε 2 ½ h

Βακτήρια

Ζυμομύκητες

1. Μοριακές τεχνικές σε θετικές καλλιέργειες

C. albicans cells

detected by the C.

albicans PNA FISH

method appear as

bright green

fluorescent yeast

cells on a reddish

smear background

C. glabrata cells

are slightly visible

as reddish yeast

cells infiltrated in

the smear.

Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ Hybridization

Πώς εφαρμόζεται η PNA-FISH σε θετικές αιμοκαλλιέργειες

Οι μικροοργανισμοί αυτοί προκαλούν

> 90% των μικροβιαιμιών

Όριο ανίχνευσης: 3-30 CFU/ml

2. Μοριακές τεχνικές ανίχνευσης παθογόνου απευθείας

στο κλινικό δείγμα

Η μεθοδολογία “Spacer Technology” που χρησιμοποιεί το SeptiFast

test επιτρέπει τη διαφορική ανίχνευση σε επίπεδο είδους

16S 23S ITS (Spacer)

Generic Primers

(“pan bacteria”) Specific Probes

Group (e.g. Enterobacteriaceae)

Amplification curve

Cycles Tm

Probe Melting Point(s)

E. coli Enterobacter cloacae

Sample Two Tm = 84.4 C

Sample One Tm = 91 C

Non specific product

Negative Control

Δύο διαφορετικά προϊόντα PCR έχουν τελείως διαφορετική Tm.

Με την Real Time PCR μπορούμε να ανιχνεύσουμε την Tm ανεβάζοντας σταδιακά τη θερμοκρασία, ανοίγουν οι αλυσίδες, και φτάνοντας στο υψηλότερο σημείο όπου το 50 % του προϊόντος μας θα είναι αποδιαταγμένο.

Αυτό παρουσιάζεται από το λογισμικό του μηχανήματος σαν γράφημα που δείχνει τον αρνητικό λογάριθμο του φθορισμού προς την θερμοκρασία -dF/dT και παρουσιάζει για κάθε προϊόν PCR ένα ειδικό peak.

Mελέτη της καμπύλης αποδιάταξης του DNA

(Melting Curve Analysis)

Συνδυασμός λύσης και

μηχανικής δύναμης

για τη διάσπαση του

μυκητιακού κυτ. τοιχ.

15 διαφορετικά είδη

• Α. fumigatus

• A. flavus

• A. terreus

• A. niger

Στόχος: 18S rDNA

Internal control

Target sensitivity:

<=50 copies (~ 1 A. fumigatus genome)

A commercially available Aspergillus PCR assay provides a

methodology that is standardized and reagents that are quality

controlled. This facilitates multicenter evaluation of the clinical

utility of PCR diagnosis.

The performance of the MAP assay is comparable to that of the IHP

assay and to those in previously reported studies evaluating

commercial tests (GM enzyme-linked immunosorbent assay).

White PL et al., JCM 2011; 49:2169

Ασθενείς της μελέτης: 10 proven/probable IA (104 οροί) & 21 control χωρίς στοιχεία ΙΑ (66 οροί)

Comparison of MycAssay Aspergillus test with galactomannan

detection in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid samples of

haematological and ICU patients

• Aspergillus DNA in BAL fluid specimens from IA patients:

▫ high sensitivity and specificity rates and its performance was

comparable to that of GM.

• Improve the diagnosis of aspergillosis in haematological and critically ill

patients and warrants incorporation to routine work up to establish its

role in the management of these at risk patient groups.

R. Torelli et al., ECCMID 2011 & JCM 2011

Detection of Aspergillus in lung and other tissue samples

using the MycAssay Aspergillus real-time PCR kit.

• Ασθενείς: 9 μεταμοσχευμένοι και 33 με αιματολογική κακοήθεια

▫ Πνεύμονας (n = 30), δέρμα (n = 4), και άλλα.

Για όλα τα δείγματα

• Ευαισθησία και ειδικότητα 82% και 79% (σε σχέση με μικροσκοπική)

90% και 64% (σε σχέση με καλλιέργεια)

• Θετική και αρνητική προγνωστική αξία: 69% και 88% (καλλιέργεια)

88% και 69% (μικροσκοπική)

Lass-Flörl C et al., Can J Microbiol 2011;57:756

DNA arrays

Σύνολο μικρών στοιχείων ή

κηλίδων τακτοποιημένων σε

σειρές και στήλες σε στερεή

επιφάνεια (γυαλί ή διοξείδιο της

σιλικόνης).

Υβριδισμός μορίων-στόχων

του υπό εξέταση δείγματος με

μόρια σημασμένα

Ανάγνωση αποτελέσματος

Ανάλυση της εικόνας μέσω

Η/Υ

Garaizar J et al, FEMS Yeast Res, 2006;6:987

DNA ανιχνευτές ειδικοί του είδους

γονίδια αντοχής στα αντιμυκητιακά

γονίδια λοιμογόνων παραγόντων

C. glabrata

C. parapsilopsis

C. lipolytica

C. krusei

C. norvegensis

C. lusitaniae

C. multigemmis

C. tropicalis

C. utilis

C. g.

C. p

.

C. l.

C. k.

C. n.

C. li

.

C. m

.

C. t.

C. u.

Microarray

Macroarray

Development and

optimisation of a

Novel Multiplex

Assay for Identifying

Candida Species

• The MycArray Yeast ID

has been optimised to

identify 18 clinically

relevant yeast species

from agar plates and

positive blood culture

bottles

• The array process can be

completed in 4 hrs

X.Cui et al. TIMM 2009

Μοριακές τεχνικές και αντοχές

Antifungal drug resistance: do molecular methods provide

a way forward? David S. Perlin Curr Opin Infect Dis 2009; 22:568–573

Direct detection of triazole resistance in A. fumigatus

from airway secretions (Park S et al., 2011 ECCMID)

High-frequency triazole resistance found In nonculturable

Aspergillus fumigatus from lungs of patients with chronic

fungal disease (Denning DW et al., 2011 CID;52:1123

Μοριακή διάγνωση σε επιφανειακές μυκητιάσεις

New molecular tools in the diagnosis of superficial

fungal infections

RJ Hay et al., Clinics in Dermatology 2010;28:190–196

Brillowska-Dabrowska A et al., JCM 2007

ΙV. Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά

Εμφάνιση αντοχών π.χ. Αζόλες

C. albicans από HIV(+) και ΜΜΟ ασθενείς C. neoformans από ασθενείς με AIDS C. glabrata (3o αίτιο μυκηταιμίας) [αντοχή

σε κετοκοναζόλη, φλουκοναζόλη] Α. fumigatus σε ασθενείς υπό θεραπεία με

ιντρακοναζόλη Αμφοτερικίνη Β

σε ασθενείς με καρκίνο C. lusitaniae και στελέχη C. albicans

C. tropicalis: αντοχή στη 5-φλουροκυτοσίνη

Απομόνωση από αίμα στείρα υγρά παρακεντήσεων και ιστούς ασθενείς με επαναλαμβανόμενες μυκ. λοιμ.

Γιατί ??

Πότε ??

ΑΜΒ Κ F I V C

Aspergillus +++ 0 0 ++ +++ ++

C. neoformans +++ + +++ ++ +++ 0

Candida

C. albicans C. glabrata C. guilliermondii C. krusei C. lusitaniae C. parapsilosis C. tropicalis

+++

++

++

++

++

+++

+++

++

+

+

+

++

++

++

+++

++

+++

0

+++

+++

+++

+++

++

+++

++

+++

+++

+++

+++

++

+++

++

+++

+++

+++

+++

+++

++

+++

+++

++

+++

Fusarium ++ 0 0 + ++ 0

Mucor, Rhizopus άλλοι ζυγομύκητες

+++ 0 0 0 0 +

Φάσμα δράσης διαφόρων συστηματικά χορηγούμενων αντιμυκητιακών

Προσαρμογή από Manual of Clinical Microbiology, 9th ed.

Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά

Ζυμομύκητες: μικρο- και μακρο μέθοδοι αραιώσεων σε ζωμό οδηγίες CLSI M27-A2 για Candida spp., C. neoformans οδηγίες EUCAST (CMI 2008; 14: 398-405) για

ζυμομύκητες που ζυμώνουν τη γλυκόζη (Candida spp.) [όχι Cryptococcus, δίμορφους]

Εναλλακτικά: Χρωματομετρική μέθοδος: εμπορικές (FUNGITEST, Sensititre

YeastOne), μη εμπορικές (tetrazolium salt μέθοδος) Σπεκτρο-φωτομετρική μέθοδος Μέθοδος κυτταρομετρίας ροής

μέθοδος διάχυσης δίσκων: fluconazole / voriconazole οδηγίες CLSI Μ44-Α για Candida spp. E-test

Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά

Υφομύκητες

μικρο- και μακρο μέθοδοι αραιώσεων σε ζωμό

οδηγίες CLSI M38-A (προτεινόμενες - proposed)

Εναλλακτικά: Χρωματομετρική μέθοδος

Μέθοδος διάχυσης δίσκων

Πιστοποιημένη για caspofungin και voriconazole

Έλεγχος επαναληψιμότητας

Ε-test

Συμφωνία με μέθοδο σε ζωμό >90% για τριαζόλες (F, I, V), αλλά >80% για αμφοτερικίνη Β

Ο λοιμωξιολόγος

Ο κλινικός Ο Βιοπαθολόγος

Φαρμακοβιομήχανος

Ο Παθολογοανατόμος

?!