Post on 17-Nov-2015
description
4Fluorescenza in stato
stazionario
Condizioni fotostazionarie
N0+hN0+h
N1N0
kAkr
knr
===
=+
=
+=
=+=
rst
stArstrst
Anrr
A
st
st
stnrrstA
nrrA
kFkkkF
kkk
kkkk
kkkdt
d
cost.]N[]N[)(]N[
]N[]N)[(]N[
0]N)[(]N[]N[
01
0
1
10
101
Si raggiunge (in pochi ns) una condizione di equilibrio, in cui eccitata una frazione costante di fluorofori.Con le normali intensit delle lampade, questa frazione sempre prossima a 0 (kA dipende dal flusso di fotoni)Lintensit di fluorescenza costante e proporzionale alla resa quantica.Nota: lespressione delleccitazione come kA[N0] approssimata (vedi dopo)
]N[ 0Ak
Il fluorimetroLampada
Monocromatore di eccitazione
Beam splitter
Lente
Lente
Monocromatore di emissione
ecc.
em.
Campione
PMTsegnale
PMTriferimento
Computer
Osservabili: intensitDipende da:
Concentrazione di fluoroforoEfficienza dellassorbimento di radiazione ()Efficienza dellemissione radiativa (resa quantica)
assorbiti fotoniemessi fotoni
=)101(')10''()''(
assorbiti) (fotoni=emessi fotoni'
0'
000AA IIIII
F ===
=
per A '
Filtro interno
0
5
10
15
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Fluo
resc
ence
(a.u
.)
A
Filtro interno
Campione diluito Campione concentrato
F I(centro cella ) I010 A (ecc . )
2
A(ecc. ) 0.03 10 0.03
2 = 0.97 0
10
20
30
40
50
0 0.5 1 1.5 2 2.5
MeasuredInner-filter corrected
Fluo
resc
ence
(a.u
.)
A
Ecc. Ecc.
)101(10)101(' '20'
0A
AA IIF
=
Filtro interno in emissione
Attenzione!
Assorbanza
Inoltre: lassorbimento un processo istantaneo, la fluorescenza nosensibilit molto maggiore allambiente del cromoforo (processi non radiativi)Sensibilit alla dinamica.
Intensit: applicazioni Misure di concentrazione
(fino a nM, ma anche singola molecola) Ambiente ed interazioni molecolari del
fluoroforo, tramite
lCF
300 320 340 360
Fluo
resc
ence
inte
nsity
(a.u
.)
Wavelength (nm)
Lipidconcentration
Partizione acqua membranaKP
Stella et al., Biophys . J. 2004 86: 936945.
0
0.5
1
F10 1.1 M
F10 11 M
F10 30 M
0 0.001Lipid (mM)
Appa
rent
mem
bran
e-bo
und
pept
ide
fract
ion
400 450 500 550 600
BSA boundFree
Fluo
resc
ence
(arb
itrar
y un
its)
(nm)
Processi di associazione
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 10-6 4 10-6 6 10-6 8 10-6 1 10-5 1,2 10-5 1,4 10-5
Curva di associazione dell'ANS alla BSA
Cf (M)
pH
Chem. Commun., 2011, 47, 994-996
ESICT=excited state intramolecular charge transferESIPT=excited state intramolecularproton transfer
Variazioni dellambiente del fluoroforo
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
300 320 340 360 380 400 420 440 460
lambda (nm)
BSABSA+GCL
BSA Nativa
BSA Denaturata
Altri esempi quando parleremo del quenching
Osservabili: intensit e resa quanticaLintensit di fluorescenza una misura relativa, perch dipende anche da:
Intensit della lampadaEfficienza dei monocromatoriBanda passante utilizzataSensibilit del tubo fotomoltiplicatore
Ossia dipende dallo strumento con cui stata determinata
Al contrario,lassorbanza una misura assoluta [A=log(I0/I)]la resa quantica una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]
Osservabili: resa quanticamisura diretta
Bisogna raccogliere i fotoni emessi in tutte le direzioni
Sfera integratrice Materiale altamente riflettente
(es. teflon)
Alternativa: misura calorimetrica
Osservabili: resa quanticamisure per confronto
AFS
AF
AF
=
st
st
st
stst
st
stst
FA
AF
AFSAFS
AFS
==
=
AA
FF stst
st =
S dipende da exc e em: standard e campione devono avere spettri simili.
Osservabili: resa quanticamisure per confronto
Osservabili: resa quanticamisure per confronto
Se standard e campione sono in solventi differenti:2
=
st
st
stst n
nA
AFF
La frazione di luce raccolta dal rivelatore dipende dagli n i
o
Angolo solido in coordinate sferiche
2rA
=
==
==
0
2
0
22
sin
sin
sin1
dd
ddd
drrdrr
dAd
Lintero angolo solido 4
2
2
2
0
0
0
0
0
2
0
0
2
0
2
2
sin2
sin2
sin
sin
====
o
i
o
i
o
io
i
o
i
o
i
d
d
d
d
dd
dd
i
o
A causa del diverso indice di rifrazione tra cuvetta ed esterno viene rivelata una frazione della luce pari a
Legge di Snell
o
i
o
i
i
o
nn
=sinsin
2
221
ii
o
o
i
o
i
nnn
=
=
AFnS
AFS 2'==
2
=
st
st
stst n
nA
AFF
Indice di rifrazione a 500 nmAria: 1Acqua: 1.337Metanolo: 1.345Etanolo: 1.365Cicloesano: 1.431
N.B.:dipendono da !
refractiveindex.info
Per acqua-cicloesano, il fattore di correzione (1.431/1.337)2=1.14
In realt gli spettri di standard e campione non sono identici
Per tenere conto di tutti i fotoni emessi (come prevede la definizione di resa quantica) si usa lintegrale spettrale e non lintensit ad una sola lunghezza donda
Lintegrale va calcolato in !
dF
0
)(
Diapositiva numero 1Condizioni fotostazionarieDiapositiva numero 3Il fluorimetroOsservabili: intensitFiltro internoFiltro internoDiapositiva numero 8Filtro interno in emissioneAttenzione!Diapositiva numero 11Intensit: applicazioniDiapositiva numero 13Diapositiva numero 14Diapositiva numero 15Diapositiva numero 16Diapositiva numero 17Diapositiva numero 18Diapositiva numero 19Diapositiva numero 20Altri esempi quando parleremo del quenchingOsservabili: intensit e resa quanticaDiapositiva numero 23Diapositiva numero 24Diapositiva numero 25Diapositiva numero 26Diapositiva numero 27Diapositiva numero 28Legge di SnellDiapositiva numero 30Diapositiva numero 31