4Fluorescenza in stato

stazionario

Condizioni fotostazionarie

N0+hN0+h

N1N0

kAkr

knr

===

=+

=

+=

=+=

rst

stArstrst

Anrr

A

st

st

stnrrstA

nrrA

kFkkkF

kkk

kkkk

kkkdt

d

cost.]N[]N[)(]N[

]N[]N)[(]N[

0]N)[(]N[]N[

01

0

1

10

101

Si raggiunge (in pochi ns) una condizione di equilibrio, in cui eccitata una frazione costante di fluorofori.Con le normali intensit delle lampade, questa frazione sempre prossima a 0 (kA dipende dal flusso di fotoni)Lintensit di fluorescenza costante e proporzionale alla resa quantica.Nota: lespressione delleccitazione come kA[N0] approssimata (vedi dopo)

]N[ 0Ak

Il fluorimetroLampada

Monocromatore di eccitazione

Beam splitter

Lente

Lente

Monocromatore di emissione

ecc.

em.

Campione

PMTsegnale

PMTriferimento

Computer

Osservabili: intensitDipende da:

Concentrazione di fluoroforoEfficienza dellassorbimento di radiazione ()Efficienza dellemissione radiativa (resa quantica)

assorbiti fotoniemessi fotoni

=)101(')10''()''(

assorbiti) (fotoni=emessi fotoni'

0'

000AA IIIII

F ===

=

per A '

Filtro interno

0

5

10

15

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Fluo

resc

ence

(a.u

.)

A

Filtro interno

Campione diluito Campione concentrato

F I(centro cella ) I010 A (ecc . )

2

A(ecc. ) 0.03 10 0.03

2 = 0.97 0

10

20

30

40

50

0 0.5 1 1.5 2 2.5

MeasuredInner-filter corrected

Fluo

resc

ence

(a.u

.)

A

Ecc. Ecc.

)101(10)101(' '20'

0A

AA IIF

=

Filtro interno in emissione

Attenzione!

Assorbanza

Inoltre: lassorbimento un processo istantaneo, la fluorescenza nosensibilit molto maggiore allambiente del cromoforo (processi non radiativi)Sensibilit alla dinamica.

Intensit: applicazioni Misure di concentrazione

(fino a nM, ma anche singola molecola) Ambiente ed interazioni molecolari del

fluoroforo, tramite

lCF

300 320 340 360

Fluo

resc

ence

inte

nsity

(a.u

.)

Wavelength (nm)

Lipidconcentration

Partizione acqua membranaKP

Stella et al., Biophys . J. 2004 86: 936945.

0

0.5

1

F10 1.1 M

F10 11 M

F10 30 M

0 0.001Lipid (mM)

Appa

rent

mem

bran

e-bo

und

pept

ide

fract

ion

400 450 500 550 600

BSA boundFree

Fluo

resc

ence

(arb

itrar

y un

its)

(nm)

Processi di associazione

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 10-6 4 10-6 6 10-6 8 10-6 1 10-5 1,2 10-5 1,4 10-5

Curva di associazione dell'ANS alla BSA

Cf (M)

pH

Chem. Commun., 2011, 47, 994-996

ESICT=excited state intramolecular charge transferESIPT=excited state intramolecularproton transfer

Variazioni dellambiente del fluoroforo

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

300 320 340 360 380 400 420 440 460

lambda (nm)

BSABSA+GCL

BSA Nativa

BSA Denaturata

Altri esempi quando parleremo del quenching

Osservabili: intensit e resa quanticaLintensit di fluorescenza una misura relativa, perch dipende anche da:

Intensit della lampadaEfficienza dei monocromatoriBanda passante utilizzataSensibilit del tubo fotomoltiplicatore

Ossia dipende dallo strumento con cui stata determinata

Al contrario,lassorbanza una misura assoluta [A=log(I0/I)]la resa quantica una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]

Osservabili: resa quanticamisura diretta

Bisogna raccogliere i fotoni emessi in tutte le direzioni

Sfera integratrice Materiale altamente riflettente

(es. teflon)

Alternativa: misura calorimetrica

Osservabili: resa quanticamisure per confronto

AFS

AF

AF

=

st

st

st

stst

st

stst

FA

AF

AFSAFS

AFS

==

=

AA

FF stst

st =

S dipende da exc e em: standard e campione devono avere spettri simili.

Osservabili: resa quanticamisure per confronto

Osservabili: resa quanticamisure per confronto

Se standard e campione sono in solventi differenti:2

=

st

st

stst n

nA

AFF

La frazione di luce raccolta dal rivelatore dipende dagli n i

o

Angolo solido in coordinate sferiche

2rA

=

==

==

0

2

0

22

sin

sin

sin1

dd

ddd

drrdrr

dAd

Lintero angolo solido 4

2

2

2

0

0

0

0

0

2

0

0

2

0

2

2

sin2

sin2

sin

sin

====

o

i

o

i

o

io

i

o

i

o

i

d

d

d

d

dd

dd

i

o

A causa del diverso indice di rifrazione tra cuvetta ed esterno viene rivelata una frazione della luce pari a

Legge di Snell

o

i

o

i

i

o

nn

=sinsin

2

221

ii

o

o

i

o

i

nnn

=

=

AFnS

AFS 2'==

2

=

st

st

stst n

nA

AFF

Indice di rifrazione a 500 nmAria: 1Acqua: 1.337Metanolo: 1.345Etanolo: 1.365Cicloesano: 1.431

N.B.:dipendono da !

refractiveindex.info

Per acqua-cicloesano, il fattore di correzione (1.431/1.337)2=1.14

In realt gli spettri di standard e campione non sono identici

Per tenere conto di tutti i fotoni emessi (come prevede la definizione di resa quantica) si usa lintegrale spettrale e non lintensit ad una sola lunghezza donda

Lintegrale va calcolato in !

dF

0

)(

Diapositiva numero 1Condizioni fotostazionarieDiapositiva numero 3Il fluorimetroOsservabili: intensitFiltro internoFiltro internoDiapositiva numero 8Filtro interno in emissioneAttenzione!Diapositiva numero 11Intensit: applicazioniDiapositiva numero 13Diapositiva numero 14Diapositiva numero 15Diapositiva numero 16Diapositiva numero 17Diapositiva numero 18Diapositiva numero 19Diapositiva numero 20Altri esempi quando parleremo del quenchingOsservabili: intensit e resa quanticaDiapositiva numero 23Diapositiva numero 24Diapositiva numero 25Diapositiva numero 26Diapositiva numero 27Diapositiva numero 28Legge di SnellDiapositiva numero 30Diapositiva numero 31