Expositor : Ana María Rincón G.

P.R.O Connell

ENDOGLIN NEGATIVELY REGULATES

TRANSFORMING GROWTH FACTOR β1-INDUCED

PROFIBROTIC RESPONSES IN INTESTINAL FIBROBLASTS

INTRODUCTION

INTRODUCTION

TRANSFORMING GROWTH FACTOR

β1:• Transforming growth factor

beta 1 or TGF-β1 is a polypeptide member of the transforming growth factor beta superfamily of cytokines. It is a secreted protein that performs many cellular functions, including the control of cell growth, cell proliferation, cell differentiation and apoptosis.

INTRODUCTION

• In humans, TGF-β1 is encoded by the TGFB1 gene.

• Fibroblasts from fibrotic

tissues for example show an increased expression of TGF-β1, which mediates process such as the excessive production of collagen as well as its regular contraction.

INTRODUCTION

ENDOGLINS:• Endoglin is a type I membrane

glycoprotein located on cell surfaces and is part of the TGF beta receptor complex. It is specifically the type III TGF-β receptor that negatively regulates certain aspects of cellular responsiveness to TGF-β1.

INTRODUCTION

• The protein consists of a homodimer of 180 kDA with disulfide links. It has been found on endothelial cells, activated macrophages, fibroblasts, and smooth muscle cells.

INTRODUCTION

CROHN ¨S DISEASE (CD):

• Disease that results from a complex interplay between genetic, immunological and microbial factors.

• It is characterized by segmental transmural chronic inflammation of the intestine, sometimes granulomatous.

INTRODUCTION

• In the course of the disease may occur also extraintestinal lesions: uveitis, sclerosing cholangitis and amyloidosis.

• Crisis evolves by diarrhea, fever and abdominal pain.

INTRODUCTION

RELAY BETWEEN TRANSFORMING GROWTH FACTOR β1, ENDOGLING

AND CD:• Crohn disease is characterized by a

recurrent intestinal strictures formation. The cytokine, transforming growth factor (TGF-β1) is critical to this process, because it is overexpressed in the intestinal fibroblasts and produces excess collagen and improves the ability to contract and reorganized collagen.

INTRODUCTION

• Endoglin is a TGF-β1 receptor and it is over expressed too and normally cause a negatively regulation on certain aspects of cellular responsiveness to TGF-β1, therefore the control role of regulation the fibrosis process is decreased so there is the strictures formation.

GENERAL OBJECTIVE

The aim of this study was characterize endoglin expression in fibroblasts present in areas of strictured bowel in patients with CD and to explore the function of endoglin on TGF-β1 –mediated intestinal fibroblast activation by using plasmid-mediated overexpression and interference RNA-based approaches.

MATERIALES Y METODOS

MATERIALES Y METODOS

CULTIVO:• Los cultivos de fibroblastos intestinales fueron

establecidos usando una técnica primaria de explante en 18 pacientes con Enfermedad de

Crohn y en pacientes control.• La biopsia fue tomada de sitios estenoticos y

de otros sitios adyacentes macroscópicamente normales.

• Las células confluentes fueron caracterizadas por sus características morfológicas y propiedades inmunohistoquimicas de tinción.

MATERIALES Y METODOS

EXPRESION DE PROTEINAS: Una vez confluentes los fibroblastos

fueron aislados por tripsinizacion y la expresión de endoglina fue evaluada usando la técnica de citometría de flujo, utilizando como marcador un anticuerpo anti-endoglina.

MATERIALES Y METODOS

WESTERN BLOT:

• Es una técnica mediante la cual las proteínas procedentes de extractos celulares son separadas por electroforesis en gel según su tamaño, utilizando SDS previamente para su disolución.

MATERIALES Y METODOS

• Tras la electroforesis las proteinas se transfieren a un filtro q se incuba con anticuerpos que reaccionan con la proteina de interes, permitiendo esto la identificacion de la proteina buscada.

MATERIALES Y METODOS

CRISTAL VIOLETA:• Fibroblastos de control intestinal se

cultivaron en placas de 24 a 70% de confluencia, se privaron de suero por 24 horas y luego se incubaron con TGF-β1por 24 horas.

• Se lavaron posteriormente y se incubaron con cristal violeta, se solubilizaron y se analizo su absorbancia.

MATERIALES Y METODOS

MICROSCOPIA CONFOCAL:

La microscopia confocal es una técnica de imagen óptica utilizada para aumentar la resolución óptica y el contraste de una micrografía utilizando una iluminación de punto y un agujero espacial para eliminar de foco de luz en los especímenes que son más gruesas que el plano focal .

MATERIALES Y METODOS

LUCIFERASA:• Celulas CCD-18Co.• El promotor-reportero del elemento de

fijacion a SMAD fue transfectado.• La luciferasa-reportero fue

cotransfectada para corregir la variacion por la transefeccion.

• Las celulas fueron tratadas con TGF-β1.

MATERIALES Y METODOS

TRANSFECCION:La transfección consiste en la introducción de material

genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos u otras herramientas

para la transferencia.Utilización de si ARN y plásmido para el análisis de la

expresión de endoglina.• El si ARN disminuye la expresión de endoglina.

• El plásmido hace una mediación de up regulation en la expresión de endoglina

• Celulas CCD18Co tratadas con ADN plasmidico.

MATERIALES Y METODOS

COLAGENO:

• La adición de colágena tipo I a los fibroblastos flotantes libres permite observar el efecto del plásmido y el SBE en la función del TGF-β1, el cual normalmente aumenta la contracción del gel de colágena mediada por fibroblastos.

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

DISCUSSION

AUTOR OPINION SI NO

Leask A et al ¨A number of reports have identified a

negative regulatory role for endoglin in TGF-β1

signalling¨

Perez-Gomez E et al ¨Knock of endoglin in keratinocytes enhances

smad-2 and smad-3 phosphorilation¨

CONCLUSION

• This kind of estudies are so important to detect which factores worse the condition of specific disease.

• Determinating the molecules that interfere positively in crisis process of diseases, the molecular biology could look for a way to stimulate specific molecules for a new treatment.

CONCLUSION

• Inhibiting the role or harmful molecules in some process, science could avoid many traumatic effects implicated in specific diseases.

• Molecular biology methods are so importants and useful in the detection of key steps in the pathophysiology of many diseases.