Post on 07-Aug-2020
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I PADA VENTRIKEL KANAN
TIKUS MODEL HIPERTENSI ARTERI PULMONAL YANG MENDAPAT
EKSTRAK BUAH DELIMA
Penelitian Karya Ilmiah Akhir
Untuk Memenuhi Persyaratan Dalam Menyelesaikan
Program Pendidikan Dokter Spesialis I
Ilmu Kesehatan Anak
Oleh:
Ilham Bondan Pramudiawan, dr.
Pembimbing:
Prof. Dr.Teddy Ontoseno, dr., SpA (K), SpJP, FIHA
Dr. Mahrus A Rahman, dr., SpA (K)
I Ketut Alit Utamayasa, dr., SpA(K)
Taufiq Hidayat, dr., SpA
Budiono, dr., M. Kes
DEPARTEMEN/SMF ILMU KESEHATAN ANAK
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
RSUD DR. SOETOMO SURABAYA
2016
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
i KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
KATA PENGANTAR
Pasien penyakit jantung bawaan (PJB) idealnya mendapatkan terapi
definitif sejak dini. Namun di negara kita hal ini sering tertunda akibat
keterbatasan sarana dan prasarana. Penyakit jantung bawaan pirau kiri ke kanan
yang tidak terkoreksi dapat berkembang menjadi hipertensi arteri pulmonal (HAP)
progresif, menyebabkan fibrosis ventrikel kanan dan berujung gagal jantung serta
kematian. Terapi medikamentosa selama menunggu terapi definitif diperlukan
untuk menurunkan morbiditas dan mortalitas.
Transforming Growth Factor - merupakan sitokin profibrogenik utama
dan akumulasi kolagen terutama kolagen tipe I pada matriks ekstraseluler
merupakan definisi dari fibrosis. Peningkatan jumlah sel yang mengekspresi
TGF- dan kolagen tipe I dapat digunakan sebagai penanda progresifitas fibrosis
akibat HAP. Ekstrak buah delima memiliki kelebihan dibanding terapi HAP
konvensional, yakni memiliki titik kerja yang lebih banyak dan tanpa efek
samping. Penurunan jumlah sel yang mengekspresi TGF- dan kolagen tipe I
pada tikus model HAP yang mendapat ekstrak buah delima (EBD) dapat
mencerminkan adanya hambatan terhadap proses fibrosis.
Hasil penelitian ini nantinya dapat dipertimbangkan sebagai dasar
pemberian EBD pada anak dengan PJB pirau kiri ke kanan yang memiliki
kecenderungan menjadi HAP. Hal ini diharapkan dapat memperlambat
progresifitas HAP, menurunkan morbiditas dan mortalitas terkait PJB.
Dengan mengucapkan rasa syukur, sebagai pemula dalam bidang ini, kami
menyadari adanya kekurangan dalam karya ilmiah akhir ini. Kami menerima
secara terbuka setiap saran, asupan, kritik, dan bimbingan demi perbaikan
penulisan penelitian ini. Akhir kata, semoga penelitian karya ilmiah akhir ini
dapat memberikan manfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan dan memberikan
masukan bagi kita semua. Aamiin.
Surabaya, Agustus 2016
Penulis
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
ii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
UCAPAN TERIMA KASIH
Alhamdulillahi robbil´alamin, dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat
Allah SWT, atas segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga saya dapat
menyelesaikan laporan penelitian karya ilmiah akhir ini sebagai salah satu
persyaratan untuk mendapatkan gelar dokter spesialis anak. Salam dan sholawat
kami ucapkan kepada Rasulullah Muhammad SAW selaku panutan kami.
Pada kesempatan kali ini perkenankanlah saya dengan segala kerendahan
hati menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus dan penghargaan yang
setinggi-tingginya kepada yang terhormat Prof. DR.Teddy Ontoseno, dr., SpA
(K), SpJP, FIHA; I Ketut Alit Utamayasa, dr., SpA(K); Taufiq Hidayat, dr.,
SpA, selaku pembimbing dan Dr. Mahrus A Rahman, dr., SpA (K), selaku
pembimbing sekaligus Ketua Program Studi, dan mantan Koordinator Litbang
Departemen/SMF Ilmu Kesehatan Anak FK UNAIR/RSUD Dr.Soetomo yang
telah memberikan ide, saran, arahan, serta bimbingan sejak awal penelitian,
penyusunan kerangka konsep, hingga pada penyelesaian karya ilmiah akhir ini.
Rasa hormat dan terima kasih yang sebesar-besarnya jugasaya ucapkan
kepada yang terhormat :
Prof. Dr. Soetojo, dr., SpU (K) dan Prof. Dr. Agung Pranoto, dr.,
SpPD (K) selaku Dekan dan mantan Dekan Fakultas Kedokteran
Universitas Airlanga.
Harsono, dr., dan H. Dodo Anondo, dr., MPH, selaku Direktur dan
mantan Direktur RSUD Dr. Soetomo Surabaya
iii ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
M Faizi, dr., SpA (K) dan Sjamsul Arief, dr.,SpA (K), MARS selaku
Kepala dan mantan Kepala Departemen Ilmu Kesehatan Anak FK
UNAIR/RSUD Dr. Soetomo yang telah berkenan memberi kesempatan
kepada saya untuk memperdalam pengetahuan di bidang Ilmu
Kesehatan Anak serta atas bimbingan dan arahannya selama saya
mengikuti pendidikan keahlian.
Dr. I Dewa Gede Ugrasena, dr., SpA (K) selaku mantan Ketua
Program Studi. Juga kepada Dwiyanti Puspitasari, dr., SpA (K),
DTMH, MCMTM dan Siti Nurul Hidayati, dr. M. Kes., SpA (K)
selaku Sekretaris dan mantan Sekretaris Program Studi, atas segala
bimbingan, dorongan, dan petunjuk yang senantiasa diberikan kepada
saya selama mengikuti pendidikan keahlian.
Dr. Irwanto, dr., SpA(K) selaku Koordinator Litbang
Departemen/SMF Ilmu Kesehatan Anak FK UNAIR/RSUD Dr.Soetomo
sekaligus penguji atas segala arahan, bimbingan, dan kesempatan yang
diberikan kepada saya sehingga penelitian ini dapat terselesaikan.
Prof.Dr. Subijanto M.S , dr., SpA(K); Prof. Ariyanto
Harsono, dr., SpA(K); M Faizi, dr., SpA(K); Retno Asih, dr.,
SpA(K); selaku tim penguji atas asupan konstruktif yang sangat
berharga untuk perbaikan karya ilmiah akhir ini.
Budiono, dr., M. Kes selaku konsultan biostatistik dari fakultas
Kesehatan Masyarakat UNAIR atas segala pengarahan dan bimbingan,
iv ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
khususnya dalam hal metodologi penelitian dan analisis hasil penelitian
ini.
Wibi Riawan, Drs., SSi selaku staf dan karyawan Laboratorium
Biomedik Fakultas Brawijaya Malang.
Seluruh staf dan karyawan Departemen Patologi Anatomi Fakultas
Kedokteran Universitas Airlanga/RSUD Dr. Soetomo Surabaya.
Seluruh staf pengajar Departemen/SMF Ilmu Kesehatan Anak RSUD
Dr. Soetomo Surabaya yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu atas
bimbingan, dorongan, dan nasehat yang telah saya terima selama saya
mengenyam pendidikan keahlian.
Rekan-rekan satu tim penelitian: Agus Sunandar, dr., Rafiqa Rais
Akbar, dr., Gina Nur Djalilah, dr., Citra Ganesha Putri, dr., yang
telah sukarela dalam suka dan duka bersama-sama ngopeni, meramut,
memberi perlakuan hingga membunuh tikus-tikus coba. Semoga
kematian mereka tidak sia-sia ...
Rekan-rekan seangkatan, teman seperjuangan sejak MKDU : Rina
Pandjaitan, dr., SpA, Putu Dian Saraswati, dr., SpA, Berlian
Beatrix, dr., SpA, Shinta Kamaya, dr.,SpA, Hakimah Maimunah,
dr., SpA, Natalia Kristanti, dr., Heru Setiawan, dr., Siti Nurazizah,
dr., Septria Erlitarini, dr., Devi Emawanti, dr., Kristina Natalia
Marbun, dr., Luty Dyah Prahmani, dr. Semoga persahabatan ini
berlangsung terus dan senantiasa membawa kebaikan.
v ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Seluruh teman sejawat PPDS I Departemen/SMF Ilmu Kesehatan
Anak FK UNAIR/RSUD Dr. Soetomo Surabaya yang dengan peranya
masing-masing telah banyak membantu kelancaran tugas, memberi
semangat dan asupan serta mewarnai hari hari saya selama mengikuti
pendidikan keahlian ini.
Seluruh paramedis di IRNA dan IRJ serta IRD Anak RSUD Dr.
Soetomo Surabaya yang telah membantu saya selama masa pendidikan
ini.
Seluruh pasien yang pernah saya rawat selama masa pendidikan di
RSUD Dr. Soetomo Surabaya, RSUD Balong Jember, RSUD SOE Nusa
Tenggara Timur, RSAL Ramelan Surabaya yang merupakan guru saya
yang sejati dalam menyelesaikan studi spesialis anak.
Saya ucapkan terima kasih dan syukur Alhamdulillah memiliki
keluarga yang begitu luar biasa, yang selalu mendukung dan
memberikana semangat serta kesempatan kepada saya untuk
mewujudkan cita-cita saya. Saya sampaikan rasa hormat, rasa sayang,
dan terima kasih kepada:
Orang tua saya H. Ario Rishandoko, SH dan Hj. Sri Gunarti, Dra.,
yang telah mendidik, membimbing, mengayomi, mendoakan, memberi
dukungan cinta, kasih sayang serta dorongan semangat agar dapat
menyelesaikan pendidikan keahlian ini.
Kepada mertua saya: H. Rosyidi Hanafi, Ir., dan Hj. Agustina atas
segala doa restu dalam menyelesaikan pendidikan keahlian ini.
vi ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Istri dan anak-anak tercinta, Rosa Afriani, dr. SpAn., Anindya Aulia
Ilham, Allysha Aulia Ilham atas segala cinta kasih dan kasih sayang
selama ini. Senyum, tawa canda, dan peluk kalian adalah obat yang
mampu menghilangkan lelah jiwa raga.
Adik kandung saya: Anisa Dian Ariyani, SE., Nurul tria Indriani,
SE., atas segala kebersamaan, serta doa restunya. Melihat anak-anak
kita... serasa baru kemarin kita seusia mereka.
Terima kasih kepada semua pihak yang tidak bisa saya sebutkan satu
persatu, yang telah memberi dukungan dan bantuan baik moril maupun
materiil hingga selesainya penyusunan karya ilmiah akhir ini.
Semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi kita semua dan memberi
sumbangan bagi ilmu kedokteran. Semoga Allah SWT senantiasa memberi
rahmat dan hidayah-Nya kepada kita semua. Aamiin
Penulis
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
vii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ..................................................................................... i
UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................... ii
Daftar Isi .......................................................................................................... vii
Daftar Tabel ..................................................................................................... xii
Daftar Gambar ................................................................................................. xiii
Daftar Lampiran .............................................................................................. xiv
Daftar Singkatan .............................................................................................. xv
Abstrak ............................................................................................................. xviii
Ringkasan ........................................................................................................ xx
BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1
1.1 Latar Belakang ........................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ...................................................................................... 5
1.3 Tujuan Penelitian ....................................................................................... 5
1.3.1 Tujuan Umum ......................................................................................... 5
1.3.2 Tujuan Khusus ........................................................................................ 5
1.4 Manfaat Penelitian ..................................................................................... 6
1.4.1 Manfaat Teori ......................................................................................... 6
1.4.2 Manfaat Praktis ....................................................................................... 6
BAB II TINJAUAN KEPUSTAKAAN ........................................................ 7
2.1 Definisi dan Klasifikasi Hipertensi Arteri Pulmonal ................................. 7
2.1.1 Definisi ................................................................................................... 7
viii ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.1.2 Klasifikasi dan Derajat Hipertensi Arteri Pulmonal ............................... 8
2.2 Efek Hipertensi Arteri Pulmonal pada Jantung ......................................... 10
2.2.1 Ventrikel Kanan Normal ........................................................................ 10
2.2.2 Matriks Ekstraseluler Normal pada Otot Jantung ................................... 13
2.2.3 Ventrikel Kanan pada Hipertensi Arteri Pulmonal ................................. 14
2.2.4 Fibrosis Otot Jantung pada Hipertensi Arteri Pulmonal ......................... 17
2.2.4.1 Pengaruh Stimulus Hemodinamik dan Sistem Renin-Angiotensin
dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung .....................................................
19
2.2.4.2 Peran Inflamasi dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ............... 21
2.2.4.2.1 Peran TGF-βs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ............... 21
2.2.4.2.2 Peran PDGFs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ............... 23
2.2.4.2.3 Peran IFN dan TFNs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung... 24
2.2.4.2.4. Peran ILs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung .................... 25
2.2.4.2.5 Peran Makrofag dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ........... 26
2.2.4.3 Peran Spesies Oksigen Reaktif dalam Pembentukan Fibrosis Otot
Jantung ............................................................................................................
27
2.2.4.4 Peran Kolagen dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ................. 29
2.2.4.5 Peran Kolagenase dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung ........... 31
2.3 Terapi Hipertensi Arteri Pulmonal dan Fibrosis otot Jantung ................... 33
2.3.1 Calcium Channel Blocker ....................................................................... 33
2.3.2 Analog Prostasiklin ................................................................................. 35
2.3.3 Antagonis Endothelin ............................................................................. 36
2.3.4 Penghambat Phospodiesterase-5 ............................................................. 37
ix ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.3.5 Ekstrak Buah Delima Sebagai Terapi Alternatif .................................... 37
2.4 Tikus sebagai Hewan Model Hipertensi Arteri Pulmonal ......................... 43
2.5 Monokrotalin sebagai Obat Pembuatan Hewan Model Hipertensi Arteri
Pulmonal ..........................................................................................................
45
2.6. Kerangka Teori ......................................................................................... 46
2.6.1 Penjelasan Kerangka Teori .................................................................... 47
BAB III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS
PENELITIAN ................................................................................................
49
3.1 Kerangka Konsep....................................................................................... 49
3.2 Penjelasan Kerangka Konsep..................................................................... 50
3.3 Hipotesis Penelitian ................................................................................... 51
BAB IV METODE PENELITIAN ............................................................... 52
4.1 Desain Penelitian ....................................................................................... 52
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................................... 54
4.2.1 Tempat Penelitian ................................................................................... 54
4.2.2 Waktu Penelitian ..................................................................................... 54
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian ................................................................. 55
4.3.1 Populasi................................................................................................... 55
4.3.2 Sampel Penelitian ................................................................................... 55
4.3.3 Penghitungan Besar Sampel ................................................................... 56
4.4 Variabel Penelitian .................................................................................... 57
4.4.1 Variabel Bebas ........................................................................................ 57
4.4.2 Variabel Tergantung ............................................................................... 57
x ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4.4.3 Variabel Antara ....................................................................................... 57
4.4.4 Variabel Kendali ..................................................................................... 57
4.5 Definisi Operasional .................................................................................. 57
4.6 Bahan dan Alat Penelitian ......................................................................... 60
4.6.1 Bahan Penelitian ..................................................................................... 60
4.6.1.1 Ekstrak Buah Delima ........................................................................... 60
4.6.1.2 Bahan Pembuatan Hewan Model ........................................................ 60
4.6.1.3 Bahan Pemeriksaan Laboratorium ....................................................... 60
4.6.2 Alat Penelitian......................................................................................... 61
4.6.2.1 Alat untuk Pembuatan Hewan Model .................................................. 61
4.6.2.2 Alat Untuk Perlakuan Hewan Model ................................................... 61
4.6.2.3 Alat Untuk Pengukuran Tekanan Arteri Pulmonalis dan Pemeriksaan
Laboratorium....................................................................................................
61
4.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data ........................................ 62
4.8 Cara Pengolahan dan Analisis Data............................................................ 63
4.9 Alur Penelitian ........................................................................................... 65
4.10 Pelaksanaan Penelitian ........................................................................... 66
4.10.1 Persiapan Penelitian............................................................................... 66
4.10.2 Pembuatan Hewan Model HAP ............................................................ 68
4.10.3 Perlakuan Terhadap Hewan Coba ........................................................ 68
4.10.4 Pengambilan Jaringan Jantung ........................................................... 69
4.10.5 Perlakuan Terhadap Sampel ................................................................ 69
xi ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
BAB V HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS ........................................ 73
5.1 Karakteristik Subjek Penelitian ................................................................. 73
5.2 Gambaran Histopatologi Otot Jantung Ventrikel Kanan ........................... 77
5.2.1 Ekspresi TGF-β1 dan Kolagen Tipe I .................................................... 77
5.3 Analisis Hasil Penelitian ............................................................................ 79
5.3.1 Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen Tipe I ................ 79
BAB VI PEMBAHASAN .............................................................................. 83
6.1 Karakteristik Tikus Model Hipertensi Arteri Pulmonal ............................ 83
6.2 Efek Pemberian EBD Terhadap Ekspresi TGF-β1 pada Otot Jantung
Ventrikel Kanan ...............................................................................................
86
6.3 Efek Pemberian EBD Terhadap Ekspresi Kolagen Tipe I pada Otot
Jantung Ventrikel Kanan .................................................................................
90
BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 95
KEPUSTAKAAN ........................................................................................... 96
LAMPIRAN ................................................................................................... 116
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
xii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Skema 10 Kategori Dasar Hipertensi Arteri Pulmonal pada Anak ... 8
Tabel 2. Derajat Hipertensi Pulmonal ............................................................. 9
Tabel 3. Tipe Kolagen ..................................................................................... 30
Tabel 4. Kandungan Fitokimia Tanaman Buah Delima .................................
Tabel 5. Kandungan Nutrisi Tanaman Buah Delima ......................................
39
40
Tabel 6. Berat Badan Tikus Model ................................................................. 74
Tabel 7. Rerata Tekanan Sistolik dan Diastolik Arteri Pulmonalis ................ 77
Tabel 8. Rerata Tekanan Arteri Pulmonalis (mPAP =Mean Artery Preasure) 76
Tabel 9. Rerata Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen tipe I
pada Tikus Model HAP....................................................................................
80
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
xiii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Potongan Melintang Ventrikel Normal ......................................... 10
Gambar 2. Pembuluh Darah Jantung .............................................................. 11
Gambar 3. Tampak Dalam Suplai Darah Ventrikel Kanan ............................. 12
Gambar 4. Perkembangan Hipertensi Arteri Pulmonal ................................... 16
Gambar 5. Efek Selular TGF-Β Pada Fibrosis Otot Jantung ......................... 23
Gambar 6. Hubungan Antara Fibrosis, Inflamasi , Dinding Pembuluh Darah,
dan Hipertrofi Otot Jantung..............................................................................
27
Gambar 7. Jalur Regulasi Fibrosis Otot Jantung Terkait Angiotensin dan
Stres Oksidatif ...............................................................................................
29
Gambar 8. Efek Bioaktif Kandungan Buah Delima ........................................ 38
Gambar 9. Kapasitas Antioksidan Jus Buah Delima dibandingkan Wine, Teh
Hijau, dan Ekstrak Kulit Delima .....................................................................
42
Gambar 10. Bagan Rancangan Penelitian ....................................................... 52
Gambar 11. Alur Penelitian ............................................................................. 65
Gambar 12. Berat Badan Tikus Model ........................................................... 73
Gambar 13. Rerata Tekanan Sistolik dan Diastolik Arteri Pulmonalis ........... 75
Gambar 14. Rerata Tekanan Arteri Pulmonalis .............................................. 78
Gambar 15. Ekspresi TGF-β1 pada Otot Jantung Tikus Model....................... 79
Gambar 16. Ekspresi Kolagen Tipe I pada Otot Jantung Tikus Model............ 80
Gambar 17. Rerata Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen
tipe I .................................................................................................................
81
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
xiv KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Pemberian Wewenang Penelitian ...................................... 109
Lampiran 2. Surat Keterangan Kelaikan Etik Penelitian .................................
Lampiran 3. Sertifikat Ekstrak Buah Delima ..................................................
110
111
Lampiran 4. Hasil Pengolahan Data ................................................................ 114
Lampiran 5. Gambar Tikus Sprague Dawley .................................................. 127
Lampiran 6. Gambar Alat Monitor Dash 5000 ................................................ 128
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
xv KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
DAFTAR SINGKATAN
AA : Asam Arakidonat
AE : Asam Ellagic
ABTS : 2,2’-Azinobis(3-Ethylbenzothiazoline)-6-Sulfonic Acid
ACE : Angiotensin Converting Enzyme
APC : Antigen Presenting Cells
ASC : Apoptosis Associated Speck-Like Protein
AV : Atrio Ventricular
cGMP : cyclic Guanosine Monophosphate
CMR : Cardiac Magnetic Resonance
COX-2 : Cyclooxygenase-2
CTGF : Connective Tissue Growth Factor
DAP : Duktus Arteriosus Persisten
DMDP : Dimethyl-p-Phenylenediamine
DPPH : α-α Diphenyl-β-Pycrylhydrazyl
DSV : Defek Septum Ventrikel
EBD : Ekstrak Buah Delima
ERK : Extracellular-Signal-Regulated Kinases
FDA : Food and Drugs Administration
FGF : Fibroblast GrowthFfactor
FRAP : Ferric Reducing Ability of Plasma
GPI : Glycosylphophatidylinositol
xvi ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
HAP : Hipertensi Arteri Pulmonal
IFN : Interferon
IL : Interleukin
LDL : Low-Density Lipoprotein
LOX : Lipoxygenase
LV : Left Ventricle
MAP : Mean Artery Pressure
MCP-1 : Monocyte Chemoattractant Protein -1
MCTP : Monocrotaline Pyrrole
MHC : Major Histocompatibility Complex
MMP-1 : Matrix Metalloproteinase-1
mPAP : Mean Pulmonary Arterial Pressure
MT-MMP : Membran Type MMP
NADPH : Nikotinamida Adenosin Dinukleotida Hidrogen
NK : Natural Killer
NLR : NOD Like Receptor
NLRP3 : NOD-Like Receptor Family, Pyrin Domain Containing 3
NO : Nitric Oxide
NOS : Nitric Oxide Synthase
OF-1 : Oncins Frans -1
PDGF AA : Platelet Derived Growth Factor AA
PDGF BB : Platelet Derived Growth Factor BB
PG : Prostatglandin
xvii ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
PGI2 : Prostasiklin
PGD2 : Prostatglandin D2
PGF2α ; Prostatglandin F2α
PJB : Penyakit Jantung Bawaan
RA : Renin Angiotensin
RV : Right Ventricle
SERTs : Serotonin Reuptake Transporter SMAD : Mothers Against Decapentaplegic Homolog
SMAD2 : Mothers Against Decapentaplegic Homolog 2
SOR : Spesies Oksigen Reaktif
SRAA : Sistem Renin-Angiotensin-Aldosteron
TGF-β1 : Transforming Growth Factor Beta 1
TIMP-1 : Tissue Inhibitor Matrix Metalloprotease-1
TNF : Tumor Necrosing Factor
TVP : Tahanan Vaskuler Paru
TXA2 : Tromboxane A2
Vka : Ventrikel kanan
Vki : Ventrikel kiri
α-SMA : α-Smooth Muscle Actin
5-HT : 5-hydroxytryptamine
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I PADA VENTRIKEL KANAN TIKUS MODEL HIPERTENSI ARTERI PULMONAL YANG MENDAPAT EKSTRAK BUAH DELIMA
Ilham Bondan Pramudiawan, Taufiq Hidayat1, I Ketut Alit Utamayasa1,
Mahrus A Rahman1, Teddy Ontoseno1, Budiono2
1Divisi Kardiologi Departemen Ilmu Kesehatan Anak, Fakultas Kedokteran,
2Fakultas Ilmu Kesehatan Masyarakat Universitas Airlangga/RSUD dr. Soetomo
Surabaya
ABSTRAK
Latar Belakang: Hipertensi arteri pulmonal (HAP) terkait penyakit jantung bawaan sering berkembang menjadi progresif dan menyebabkan fibrosis otot jantung yang berujung gagal jantung dan kematian. Terapi definitif terhadap defek anatomis seringkali tertunda akibat keterbatasan sarana dan prasarana. Terapi medikamentosa diperlukan untuk menurunkan morbiditas dan mortalitas selama menunggu terapi definitif. Ekstrak buah delima (EBD) memiliki aktifitas antifibrotik melalui mekanisme anti inflamasi, ACE inhibitor, dan antioksidan. Efek antifibrotik ini dapat dievaluasi melalui penurunan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada otot jantung ventrikel kanan. Tujuan: Membuktikan bahwa pemberian ekstrak buah delima dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal. Metode: Penelitian randomized post-test only control group ini dilakukan terhadap 24 tikus jantan Sprague Dawley yang diinduksi HAP menggunakan monokrotalin 60 mg/kg berat badan. Jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan dievaluasi pada minggu ke 2 dan ke 4. Seluruh subjek diikutkan dalam analisis, termasuk tikus yang mati selama penelitian. Hasil: Dua tikus kontrol mati pada hari ke 7 dan ke 11 penelitian. Tidak didapatkan perbedaan rerata berat badan antar kelompok. Tikus yang mendapat EBD memiliki rerata tekanan arteri pulmonalis lebih rendah dibanding kontrol. Rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada kelompok perlakuan 2 dan 4 minggu lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol. Tidak didapatkan perbedaan bermakna rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada kelompok perlakuan 2 minggu dan 4 minggu. Kesimpulan: Pemberian ekstrak buah delima dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal. Kata Kunci: Hipertensi Arteri Pulmonal, Tikus Model HAP, Ekstrak Buah Delima, TGF-β1, Kolagen Tipe I, Ventrikel Kanan.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
TGF-β1 AND COLLAGEN TYPE I EXPRESSION ON RIGHT VENTRICLE PULMONARY ARTERIAL HYPERTENSION
RAT MODEL RECEIVING POMEGRANATE EXTRACT
Ilham Bondan Pramudiawan, Taufiq Hidayat1, I Ketut Alit Utamayasa1, Mahrus A Rahman1, Teddy Ontoseno1, Budiono2
1Cardiology Division Department of Child Health, Medical School,
2Faculty of public Health Airlangga University/RSUD dr. Soetomo
Surabaya
ABSTRACT
Background: Congenital heart disease’s related pulmonary arterial hypertension (PAH) frequently develop into progressive, causing myocardial fibrosis and ending with heart failure and death. Definitive theraphy on anatomical deffect often delayed due to facilities and infrastructure. Medical theraphy is needed to decrease morbidity and mortality during awaiting definitive theraphy. Pomegranate extract has antifibrotic activity through antiinflamation, ACE inhibitor, and antioxidant mechanism. The antifibrotic effect can be evaluated by the decreasement of cells expressing TGF-β1 and collagen type I on right ventricle myocardium. Purpose: Proving that pomegranate extract decrease cells expressing TGF-β1 and collagen type I on right ventricle myocardium pulmonary arterial hypertension rat models. Metode: This randomized post-test only control group carried out on 24 monocrotaline induced male Sprague Dawley rats. The monocrotaline dose is 60 mg/kg body weight. The amount of cells expressing TGF-β1 and collagen tipe I on right ventricle myocardium evaluated on week 2 and week 4. All subjects included in analysis, including the death rats. Result: Two control rats died on day 7 dan day 11. There are no differnce on body weight among groups. Rats receiving pomegranate extract having a lower mean pulmonary arterial pressure than control groups. Mean of cells expressing TGF-β1 and collagen tipe I on right ventricle myocardium lower than control groups. There are no significant difference on cells expressing TGF-β1 and collagen type I on right ventricle myocardium between 2 weeks treatment group and 4 weeks treatment group. Conclussion: Pomegranate extract decrease cells expressing TGF-β1 and collagen type I on right ventricle myocardium on pulmonary arterial hypertension rat models. Keyword: Pulmonary Arterial Hypertension, PAH rat model, Pomegranate extract, TGF-β1, Collagen Tipe I, Right Ventricle.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
xx KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
RINGKASAN
Hipertensi arteri pulmonal yang progresif sebagian besar terkait penyakit
jantung bawaan. Koreksi terhadap defek anatomis merupakan terapi definitif,
namun seringkali tertunda akibat keterbatasan sarana dan prasarana. Hipertensi
arteri pulmonal yang progresif dapat meyebabkan terjadinya fibrosis ventrikel
kanan yang dapat berujung gagal jantung dan kematian. Terapi medikamentosa
diperlukan untuk menurunkan morbiditas dan mortalitas. Terapi yang ada saat ini
tidak ada yang bersifat menyembuhkan dan memiliki efek samping yang banyak.
Ekstrak buah delima (EBD) memiliki mampu menurunkan rerata tekanan arteri
pulmonalis dan memiliki aktifitas antifibrotik melalui mekanisme anti inflamasi,
ACE inhibitor, dan antioksidan. Ekstrak buah delima juga terbukti aman
dikonsumsi dalam dosis besar dan dalam jangka waktu lama.
Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan bahwa pemberian ekstrak
buah delima dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan
kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal.
Penelitian laboratoris eksperimental ini menggunakan rancangan randomized
post-test control group dengan 24 tikus putih jantan strain Sprague Dawley
berumur 3 bulan yang diinjeksi monokrotalin dengan dosis 60 mg/kg berat badan
secara subkutan sebagai subjek penelitian. Subjek terbagi menjadi 4 kelompok
yakni kelompok tikus yang mendapat ekstrak buah delima dan carboxy methyl
cellulose (CMC) selama 2 minggu (E1) dan 4 minggu (E2), serta kelompok
kontrol tikus yang hanya mendapat CMC selama 2 minggu (K1) dan 4 minggu
xxi ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
xxi KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
(K2). Berat badan, rerata tekanan arteri pulmonalis, dan rerata jumlah sel yang
mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan dievaluasi pada
minggu ke 2 dan ke 4. Semua subjek diikutsertakan dalam analisis, termasuk tikus
yang mati saat penelitian.
Dua ekor tikus didapatkan mati yakni masing masing pada hari ke 7 dan
ke 11. Kedua tikus itu masing masing merupakan kelompok K1 dan K2. Tidak
didapatkan perbedaan bermakna pada rerata berat badan antar kelompok pada saat
awal penelitian maupun akhir penelitian. Rerata tekanan arteri pulmonalis diukur
menggunakan monitor DASH 5000 dengan sebelumnya dilakukan anestesi
menggunakan ketamine 0,5 mg/kg dan midazolam 0,5mg/kg intramuskuler pada
paha,serta intubasi. Pengambilan organ jantung dilakukan setelah dilakukan
terminasi dengan tehnik eksanguinasi. Sampel organ kemudian dikirim ke bagian
patologi anatomi untuk dibuat blok jaringan dan slide dan seterusnya dikirim ke
Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Brawijaya Malang untuk evaluasi
jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada ventrikel kanan.
Hasil penelitian menunjukkan tidak adanya perbedaan bermakna pada
berat badan tikus model antar kelompok baik pada awal maupun akhir penelitian.
Rerata tekanan arteri pulmonalis kelompok kontrol (K1 dan K2) lebih tinggi
dibanding elompok yang mendapatkan EBD (E1 dan E2). Kelompok K2 memiliki
rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I lebih tinggi dari
pada kelompok K1 dan bermakna secara statistik. Rerata jumlah sel yang
mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada kelompok E1 dan E2 lebih rendah
daripada Kelompok K1 dan K2 dan bermakna secara statistik. Tidak didapatkan
xxii ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
xxii KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
perbedaan bermakna secara statistik rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-
β1dan kolagen tipe I pada kelompok E1 dan E2.
Efektifitas EBD dalam menurunkan kadar TGF-β1 dan kolagen tipe I pada
2 minggu dan 4 minggu ini menunjukkan bahwa EBD dapat menghambat proses
awal fibrogenesis sekaligus meningkatkan resolusi fibrosis. Dalam praktek klinis
ini berarti bahwa EBD diharapkan dapat mencegah fibrosis dan mengurangi
derajat fibrosis yang sudah terjadi. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi
pertimbangan penggunaan EBD sebagai terapi tambahan, mendampingi terapi
baku yang sudah ada sehingga dapat menurunkan morbiditas dan mortalitas
terkait HAP.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
1 KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Hipertensi arteri pulmonal (HAP) merupakan suatu kondisi peningkatan
rerata tekanan arteri pulmonal saat istirahat melebihi 25 mmHg. (Wardle dan
Tulloh, 2012). Kondisi ini terjadi akibat remodeling arteri pulmonal berupa
hilangnya sel endotel arteri pulmonalis serta peningkatan aktivitas jalur
proliferatif dan apoptosis, penebalan sel otot polos, peningkatan pertumbuhan sel
endotel dan perubahan homeostasis bahan vasoaktif yang berakibat vasokonstriksi
arteri pulmonalis (Humbert dkk., 2004). Hipertensi arteri pulmonal juga
menyebabkan remodeling otot jantung terutama ventrikel kanan (Vka) berupa
hipertrofi miosit, aktivasi dan hiperplasia fibroblast serta deposisi kolagen
ekstraseluler yang disebut sebagai fibrosis. Fibrosis miokardium menyebabkan
kekakuan miokardium sehingga mengganggu fungsi sistol dan diastol yang dapat
memicu gagal jantung dan kematian (Nicoletti dan Michel, 1999; Fan dkk., 2012).
Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) dan kolagen tipe I merupakan penanda
penting dalam proses remodeling fibrosis miokardium sehingga evaluasi kadar
TGF-β1 dan kolagen tipe I dapat dijadikan dasar petunjuk terjadinya proses
fibrosis miokardium (Lez dkk., 2004; Fan dkk., 2012). Terapi HAP
menitikberatkan pada vasodilatasi arteri pulmonalis. Terapi ini meliputi calcium
channel blocker, prostanoid, antagonis endotelin dan penghambat
posphodiesterase 5 (Raja dan Raja, 2011). Terapi tersebut tidak ada yang bersifat
2 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
menyembuhkan, dan memiliki efek samping yang cukup banyak sehingga
pencarian strategi terapi baru terus dilakukan (Ghofrani dkk., 2009; Duarte dkk.,
2013). Pengembangan strategi baru ini lebih ditujukan untuk mencegah perubahan
seluler dan molekuler secara lebih dini dengan efek samping seminimal mungkin
(Durmowicz dkk., 1993).
Insiden HAP di Belanda mencapai 63,7 kasus per seribu anak (Ivy dkk.,
2013; Loon dkk., 2011). Etiologi HAP pada anak bervariasi, 57% merupakan
idiopatik dan herediter, 36% merupakan HAP dapatan terkait penyakit jantung
bawaan (PJB), dan 7% merupakan HAP terkait kelainan saluran pernapasan dan
sebab lain seperti tromboembolik (Berger dkk., 2012). Diperkirakan di seluruh
dunia terdapat 600.000 bayi lahir setiap tahun dengan PJB dan 50% atau lebih
akan meninggal karena infeksi dan gagal jantung (Adatia dkk., 2010). Tujuh
puluh lima persen HAP yang progresif merupakan HAP terkait PJB (Levy dkk.,
2013). Hipertensi arteri pulmonal dapat ditemukan pada anak dengan PJB non
sianotik dengan pirau kiri ke kanan seperti defek septum ventrikel (DSV), duktus
arteriosus persisten (DAP) dan defek septum atrium (DSA) yang tidak terkoreksi
(Loon dkk., 2009). Delapan puluh persen populasi PJB tinggal di negara
berkembang, dan diperkirakan hanya 2-15% pasien yang mendapat penanganan
kuratif. Sebagian besar pasien dengan pirau kiri ke kanan yang besar akan
mengalami HAP stadium lanjut dan ireversibel pada usia 1 tahun pertama. Dua
puluh persen anak dengan PJB non sianotik tidak dapat dioperasi karena
mengalami HAP stadium lanjut (Loon dkk., 2009). Angka rerata kesintasan HAP
pada anak yang tidak mendapat terapi lebih rendah dibanding pada dewasa yakni
3 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
0,8 dibanding 2,8 tahun (D'Alonzo dkk., 1991). Sedangkan angka kesintasan 5
tahun HAP pada anak yang mendapat terapi dapat mencapai 74 6% (Barst dkk.,
2012). Di Indonesia, sarana dan prasarana masih sangat terbatas, tindakan kuratif
terhadap defek anatomis seringkali tertunda. Pada beberapa kasus bahkan tidak
lagi operabel karena pasien sudah jatuh ke kondisi yang lebih berat karena telah
terjadi HAP stadium lanjut yang menyebabkan remodeling miokardium dan
berujung kegagalan jantung. Untuk itu upaya perlambatan progresifitas HAP
secara medikamentosa selama menunggu terapi definitif sangat diperlukan untuk
menurunkan morbiditas dan mortalitas.
Terapi alternatif bahan alami telah menjadi trending topic dalam penanganan
penyakit kronis, termasuk HAP. Salah satu terapi menggunakan bahan alami
yakni menggunakan ekstrak buah delima (EBD). Dibandingkan dengan calcium
channel blocker, prostanoid, antagonis endotelin dan penghambat
phospodiesterase yang masing-masing memiliki titik terapi yang berbeda, ekstrak
buah delima memiliki beberapa kelebihan. Ekstrak buah delima memiliki potensi
menghambat sel kanker dengan menginduksi apoptosis. Ekstrak buah delima juga
memiliki efek anti bakteri, anti virus, antioksidan, anti tumor, efek ekstrogenik,
efektif dalam mengurangi risiko penyakit jantung, termasuk low-density
lipoprotein (LDL) oksidasi, memulihkan pengerasan pada dinding arteri,
mengurangi tekanan darah sistolik dengan menghambat serum angiotensin–
converting enzyme (ACE) (Ignarro dkk., 2007; Jurenka, 2008; Kholifah, 2010;
Haber dkk., 2011). Kandungan dalam EBD juga dapat berfungsi sebagai anti
proliferasi dan anti inflamasi pada penyakit kardiovaskular, serta anti fibrotik hati
4 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
pada tikus model (Seeram dkk., 2005; Yuniarti dkk., 2013; Javanmard dan Rafiee,
2015; Haber dkk., 2011). Terapi obat–obatan yang mempengaruhi penanda
inflamasi dan proliferasi seperti TGF-β, endotelin-1, Connective Tissue Growth
Factor (CTGF), angiotensin II dan Platelet derived growth factors (PDGF) telah
dimengerti sebagai anti fibrotik (Leask, 2010). Selain itu pada studi yang telah
dilakukan, buah delima dikatakan tidak memili efek samping sehingga aman
digunakan sebagai terapi alternatif (Vidal dkk., 2003; Jurenka, 2008). Oleh
karena itu penelitian ini dilakukan untuk melihat efektifitas ekstrak buah delima
terhadap proses fibrosis akibat HAP khususnya pada miokardium Vka.
Penelitian ini tergolong invasif oleh karenanya diperlukan hewan mdel
sebagai subjek penelitian. Hewan model yang paling sering digunakan secara luas
untuk memelajari HAP yakni tikus yang diinduksi hipoksia kronis dan tikus yang
diinduksi monokrotalin (Kolettis dkk., 2007) Penelitian ini menggunakan tikus
yang diinduksi monokrotalin sebagai model hipertensi arteri pulmonal. Cara ini
dianggap lebih mudah dibandingkan membuat hipoksia menggunakan ruangan
hipobarik (Voelkel dan Tuder, 2000).
5 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
1.2 Rumusan Masalah
a. Apakah pemberian EBD dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi
TGF-β1 pada ventrikel kanan tikus model hipertensi ateri pulmonal.
b. Apakah pemberian EBD dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi
kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal.
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Tujuan Umum
Membuktikan bahwa fibrosis ventrikel kanan akibat HAP dapat dihambat
dengan pemberian ekstrak buah delima.
1.3.2 Tujuan Khusus
a. Membuktikan bahwa pemberian ekstrak buah delima dapat
menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada ventrikel kanan
tikus model hipertensi ateri pulmonal.
b. Membuktikan bahwa pemberian ekstrak buah delima menurunkan
jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model
hipertensi arteri pulmonal.
6 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
1.4 Manfaat Penelitian
1.4.1 Manfaat Teori
Memperoleh bukti bahwa ekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada
ventrikel kanan akibat HAP dapat dihambat dengan pemberian ekstrak
buah delima.
1.4.2 Manfaat Praktis
Memberikan sumbangan pustaka tentang efek pemberian ekstrak buah
delima terhadap TGF-β1 dan kolagen tipe I pada otot jantung hewan
model HAP.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
7 KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN
2.1 Definisi dan Klasifikasi Hipertensi Arteri Pulmonal
2.1.1 Definisi
Hipertensi arteri pulmonal didefinisikan sebagai rerata tekanan arteri
pulmonal (pPA) saat istirahat melebihi 25 mmHg (Wardle dan Tulloh, 2012).
Definisi konvensional dari HAP grup 1 Dana Classification mencantumkan
systemic mean artery pressure (MAP) melebihi 25 mmHg. Meskipun batas nilai
tahanan vaskuler paru tidak termasuk dalam definisi HAP dewasa, inklusi
tahanan vaskuler paru (TVP) > 3 Wood units x m2 penting dimasukkan pada HAP
anak dengan kelainan jantung kongenital. Anak dengan defek septum ventrikel
(DSV) memiliki tekanan arteri pulmonal yang tinggi dengan aliran yang
bervariasi (Takatsuki dan Dunbar, 2013). Pada anak dengan sirkulasi biventrikuler
definisi HAP sama dengan definisi konvensional. Klasifikasi Panama
menyertakan anak dengan single ventricle dan cavopulmonary anastomosis. Pada
kasus tersebut terjadi peningkatan TVP anastomosis cavopulmonary tanpa
peningkatan tekanan arteri melebihi 25 mm Hg dan pada kasus ini tekanan arteri
melebihi 20 mm Hg sudah membahayakan pasien. Pada kasus tersebut HAP
didefinisikan jika indeks TVP > 3 wood unit x m2 atau gradien transpulmonal > 6
mm Hg. Hipertensi arteri pulmonal juga terlihat dari laju regurgitan melalui katup
trikuspid melebihi 2,8 m/det pada ekokardiografi Doppler. Pada pediatri MAP
bisa mencapai 50 mmHg dan hal ini normal. Oleh karena itu HAP juga dikenali
8 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
jika rasio tekanan sistolik arteri pulmonal dibanding tekanan sistolik sistemik
melebihi 0,5 (Takatsuki dan Dunbar, 2013).
2.1.2 Klasifikasi dan Derajat Hipertensi Arteri Pulmonal
Klasifikasi HAP terbaru dikembangkan oleh Pediatric Taskforce of the
Pulmonary Vascular Research Institute pada tahun 2011 di Panama. Klasifikasi
ini mengenali konsep kontribusi kelainan pertumbuhan paru dan perkembangan
HAP pada anak dan menggarisbawahi penyebab multifaktorial seperti kelainan
jantung bawaan, kelainan kromosom, aspirasi kronis,dan kontribusi prenatal
terhadap penyakit paru postnatal. Pada klasifikasi ini HAP terbagi menjadi 10
kategori dari neonatus sampai dewasa. Klasifikasi ini menyediakan klasifikasi
yang lebih komprehensif dari hampir semua penyebab HAP pada anak (Cerro
dkk., 2011).
Tabel 1. Skema 10 Kategori Dasar Hipertensi Arteri Pulmonal pada Anak
Kategori Deskripsi 1 Penyakit vaskuler hipertensi pulmonal prenatal atau perkembangan 2 Maladaptasi vaskuler pulmonal perinatal 3 Penyakit kardiovaskuler pediatrik 4 Bronchopulmonary displasia 5 Penyakit vaskuler hipertensi pulmonal pediatrik terisolasi 6 Penyakit vaskuler hipertensi pulmonal multifaktorial pada sindroma malformasi
kongenital 7 Penyakit paru pediatrik 8 Penyakit tromboembolik pediatrik 9 Paparan hipoksik hiperbarik pediatrik 10 Penyakit vaskuler hipertensi pulmonal pediatrik berhubungan dengan kelainan
sistem lainya Sumber : Cerro M, Abman S, Diaz G, Freudenthal A, Freudenthal F, dan Harikrishnan, 2011. A Consensus Approach to the Classification of Pediatric Pulmonary Hypertensive Vascular Disease: Report from the Pvri Pediatric Taskforce, Panama 2011. Pulm Cir., 1, 286-98.
9 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Derajat keparahan HAP ditinjau dari keterbatasan aktivitas terkait gejala
kegagalan sirkulasi. New York Heart Association dan World Health Organization
masing-masing menetapkan 4 derajat keparahan seperti pada tabel di bawah ini.
Tabel 2. Derajat Hipertensi Pulmonal
A. Klasifikasi Fungsional New York Heart Association
Kelas 1. Tanpa gejala saat aktivitas sehari hari
Kelas 2. Gejala muncul saat aktivitas sehari – hari.
Kelas 3. Gejala muncul dengan aktivitas yang lebih ringan dari aktivitas sehari – hari. Aktivitas tampak jelas terbatas
Kelas 4. Gejala muncul dengan aktivitas apapun bahkan saat istirahat B. Klasifikasi World Health Organization
Kelas I. Pasien dengan hipertensi pulmonal namun tanpa keterbatasan aktivitas. Aktivitas sehari hari tidak menyebabkan sesak, kelelahan, nyeri dada, maupun hampir pingsan.
Kelas II. Pasien dengan hipertensi pulmonal dengan sedikit keterbatasan aktivitas. Mereka merasa nyaman saat istirahat. Aktivitas sehari hari menyebabkan sesak, kelelahan, nyeri dada, maupun hampir pingsan.
Kelas III. Pasien dengan hipertensi pulmonal dengan keterbatasan aktivitas yang nyata. Mereka merasa nyaman saat istirahat. Aktivitas lebih ringan daripada aktivitas sehari hari menyebabkan sesak, kelelahan, nyeri dada, maupun hampir pingsan.
Kelas IV. Pasien dengan hipertensi pulmonal dengan ketidak mampuan untuk melakukan aktivitas apapun . Pasien ini menunjukkan gejala gagal jantung kanan. Sesak maupun kelelahan dapat muncul saat istirahat. Rasa ketidaknyamanan bertambah dengan aktivitas apapun.
Sumber : Lewis, dan Rubin, 2004. Diagnosis and Management of Pulmonary Arterial Hypertension: Accp Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. Chest, 126, 7S–10S.
2.2 Efek Hipertensi Arteri Pulmonal pada Jantung
2.2.1 Ventrikel Kanan Normal
Ventrikel kanan memompa darah dengan stroke volume yang sama dengan
ventrikel kiri, namun dengan upaya 25% lebih rendah dikarenakan rendahnya
10 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
tahanan vaskuler paru. Ini sebabnya dinding otot ventrikel kanan lebih tipis
dibanding ventrikel kiri (Vki) (Franco, 2012; Voelkel dkk., 2006).
Gambar 1. Potongan Melintang Ventrikel Normal. RV : Right Ventricle (Ventrikel kanan), LV : Left Ventricle (Ventrikle kiri). Pada potongan melintang, ventrikel kiri tampak elips sedangkan ventrikel kanan tampak menyerupai bulan sabit.
Sumber : Chin K, Hs N, Kim, dan Rubin L, 2005. The Right Ventricle in Pulmonary Hypertension. Coron Artery Dis, 16, 13–18.
Karakteristik kontraksi ventrikel kanan tergantung pada kondisi loading.
Pemendekan longitudinal saat kontraksi lebih berperan dibanding pemendekan
sirkumferensial (aksis pendek). Ventrikel kanan berkaitan dengan ventrikel kiri
melalui septum, serat epikardial yang melingkari keduanya, dan berbagi ruang
perikardial, Baik septum maupun dinding bebas masing-masing berkontribusi
sama terhadap kontraksi (Franco, 2012; Voelkel dkk., 2006).
Suplai darah ventrikel kanan terutama berasal dari arteri koroner kanan,
dan menerima aliran darah dalam jumlah sama pada sistol maupun diastol. Arteri
koroner anterior kiri desenden mensuplai 2/3 bagian septum anterior, dan arteri
desenden posterior mensuplai 1/3 inferoposterior (Chin dkk., 2005).
11 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Gambar 2. Pembuluh Darah Jantung. 1. Aorta asendens, 2. Bulbus aorta, 3. Aurikula kanan, 4. Arteri koronaria kanan, 5. Atrium kanan, 6. Sulkus koronarius, 7. Ventrikel kanan, 8. Aurikula kiri, 9. Trunkus pulmonalis, 10. Ramus sirkumfleksus arteri koroner, 11. Arteri koronaria kiri, 12. Ramus diagonalis arteri koroner kiri. 13. Vena kardiaka magna, 14. Arteri interventrikularis anterior, 15. Sulkus interventrikularis anterior, 16. Ventrikel kiri, 17. Apeks kordis, 18. Vena lupmonalis kanan, 19. Atrium kiri, 20. Vena pulmonalis kiri, 21. Vena oblikua atrium kiri, 22. Sinus koronarius, 23. Vena kardiaka magna, 24. Sulkus koronarius, 25. Vena posterior ventrikel kiri, 26. Vena kardiaka media, 27. Arteri pulmonalis kiri, 28. Vena cava inferior, 29. Atrium kanan, 30. Ramus interventrikularis posterior arteri koronaria kanan, 31. Sulkus interventrikularis posterior, 32. Vena cava superior , 33. Ramus marginalis kanan arteri koronaria kanan, 34. Ramus nodi sinuatrialis arteri koroner kanan, 35. Vena kardiaka minimi, 36. Vena kardiaka parva. Sumber : Rohen J, Yokochi C, dan Lutjen-Drecol E 2010. Atlas Anatomi Manusia, Jakarta, Penerbit Buku Kedokteran EGC, 262.
12 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Gambar 3. Tampak Dalam Suplai Darah Ventrikel Kanan. RCA : Right coronary artery, RM : Right marginal branch, PD : Posterior descending coronary artery, LMA : Left main coronary artery, LAD : Left anterior descending coronary artery, LCX : Left circumflex coronary artery, OM : Obtuse marginal of the circumflex coronary artery, D : Diagonal branch of the left anterior descending coronary artery, LAD : Left anterior : Descending coronary artery, RV : Right ventricle, AS : Antero septal, A : Anterior, AL : Antero lateral, PL : Postero lateral, P : posterior, PS : Postero septal. Tampak bahwa sebagian besar ventrikel kanan di suplai oleh arteri koroner kanan dan cabangnya. Arteri koroner anterior kiri desenden mensuplai 2/3 bagian septum anterior, dan arteri desenden posterior mensuplai 1/3 inferoposterior. Sumber : Malouf J, Edwards W, Tajik A, dan Seward J 2011. Functional Anatomy of the Heart dalam: Fuster, V., Walsh, R., dan Harrington, R. (eds.) Hurt's the Heart. 13 ed. New York: Mc Graw Hill Medical, 88.
Perubahan kecil pada tekanan di dalam pleura mengakibatkan peningkatan
signifikan venous return dan preload Vka. Hal ini mengakibatkan septum
terdorong ke arah Vki saat diastol. Volume akhir diastolik dari Vki tetap ataupun
berkurang. Peningkatan tekanan pengisian ini berhubungan dengan penurunan
perubahan volume yang disebabkan kemampuan distensi Vki. Oleh karena itu
interaksi diastolik selalu ada, dan interaksi ini cukup besar pengaruhnya pada
patofisiologi (Voelkel dkk., 2006).
13 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.2.2. Matriks Ekstraseluler Normal Pada Otot Jantung
Pada jantung mamalia dewasa miosit ventrikel tersusun berlapis-lapis oleh
pasangan kardiomiosit. Lapisan yang saling berdekatan dipisahkan oleh celah.
Arsitektur laminar miokardium tampak sebagai jaringan protein matriks
ekstraselular yang rumit, terdiri terutama kolagen fibril. Berdasarkan karakteristik
morfologi, jaringan matriks jantung dapat dibagi lagi menjadi tiga konstituen:
epi- , peri-, dan endomisium. Epimisium ini terletak di permukaan endokardial
dan epikardial memberikan dukungan untuk endotel dan sel mesotelial.
Perimisium mengelilingi serat otot, dan helai perimisial menghubungkan
kelompok serat otot. Endomisium muncul dari perimisium dan mengelilingi serat
otot individu. Penopang endomisial mengikat serat otot bersama-sama dan
berfungsi untuk microvasculature nutrisi mereka dan sebagai tempat koneksi ke
protein sitoskeletal kardiomiosit melintasi membran plasma. Jaringan matriks
jantung berbasis kolagen berfungsi sebagai scaffold komponen seluler dan juga
penting untuk transmisi kekuatan kontraktil. Sekitar 85% dari total kolagen
miokard adalah tipe I, terutama terkait dengan serat tebal yang memberi kekuatan
menarik. Kolagen tipe III mewakili 11% dari total protein kolagen dalam jantung,
biasanya membentuk serat tipis, dan mempertahankan elastisitas jaringan matriks.
Selain kolagen, matriks ekstraselular jantung juga mengandung glikosaminoglikan
(seperti Hyaluronan), glikoprotein, dan proteoglikan. Tempat penyimpanan utama
faktor pertumbuhan laten dan protease juga terdapat dalam matriks ekstraselular
jantung. Jejas menyebabkan faktor pertumbuhan ini aktif dan memicu respons
fibrosis (Kong dkk., 2014).
14 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Fibroblast jantung berada pada endomisial dan merupakan jumlah sel
yang banyak pada otot jantung mamalia. Pada jantung yang sedang berkembang,
fibroblast meregulasi proliferasi kardiomiosit melalui jalur fibronektin. Pada otot
jantung dewasa muda, fibroblast jantung tidak berperan signifikan terhadap
aktifitas proliferasi (Kong dkk., 2014).
Pembuluh darah juga banyak terdapat di intersisium otot jantung.
Sedangkan sel mast dan makrofag terdapat dalam jumlah yang kecil (Kong dkk.,
2014).
2.2.3 Ventrikel Kanan pada Hipertensi Arteri Pulmonal
Hipertensi arteri pulmonal ditandai dengan tingginya tahanan vaskuler
paru dan remodeling vaskuler yang menyebabkan peningkatan afterload Vka dan
gagal jantung kanan (Galie` dkk., 2009). Pada keadaan normal, Vka dapat
mengatasi peningkatan tahanan vaskuler paru. Ventrikel kanan yang normal
tanpa hipertrofi tidak dapat menyebabkan tekanan sistolik arteri pulmonal
melebihi 50 sampai 60 mmHg atau tekanan rata-rata melebihi 40 mmHg. Oleh
karenanya Vka harus hipertrofi untuk dapat mengatasi HAP (Franco, 2012).
Hipertrofi dinyatakan sebagai ketebalan dinding Vka melebihi 7 mm atau massa
Vka melebihi 56 g (Marrone dkk., 2010).
Respons adaptasi inisial hipertrofi miokard meliputi respons maladaptif
dan disfungsi kontraktil yang progresif. Ventrikel kanan menampung darah lebih
untuk kompensasi preload dan mempertahankan stroke volume disamping
pengurangan fraksi pemendekan. Hal ini menyebabkan dilatasi ruang jantung
ventrikel kanan (Franco, 2012). Lemahnya kontraktilitas yang terus berlanjut
15 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
dapat menyebabkan gagal jantung kanan yang ditandai dengan peningkatan
tekanan pengisian, disfungsi diastolik, berkurangnya cardiac output, dan semakin
beratnya regurgitasi trikuspid karena dilatasi anular dan jeleknya leaflet
coaptation (Voelkel dkk., 2006). Peningkatan TVP menyebabkan dilatasi arteri
pulmonalis yang progresif. Pembesaran arteri pulmonalis ada HAP biasanya
simetris. Diameter arteri pulmonalis melebihi 40 mm dapat menyebabkan
kompresi arteri koroner utama kiri. Kompresi arteri koroner kanan oleh hipertrofi
miokard juga penyebab lain dari iskemia, yang berhubungan langsung dengan
masa Vka (Franco, 2012).
Dissinkroni ventrikular juga ditemukan pada gagal jantung yang dipicu
HAP (Marrone dkk., 2010). Dissinkroni interventrikular mekanis dapat dikenali
secara klinis dari bulging paradoksal septum ke Vki. Hal ini berhubungan dengan
fungsi sistolik Vka. Dancing septum dan bowing ventrikel ke kiri (D-shaped Vki)
menunjukkan semakin jeleknya prognosis HAP (Franco, 2012). Onset relaksasi
yang terlambat pada Vka relatif dengan Vki disebut dissinkroni dan ini
menyebabkan gangguan sistolik Vki melalui bulging septum (Marcus dkk., 2008).
Keterlambatan pencapaian puncak pemendekan dinding bebas Vka relatif
terhadap Vki dapat dilihat dengan cardiac magnetic resonance (CMR) (Marcus
dkk., 2008). Ventrikel kanan terus berkontraksi sampai hampir 100 milidetik
setelah akhir dari sistolik Vki sampai awal waktu pengisian Vki. Ketidakefisienan
sistol Vka ini mempengaruhi pengisian Vki dengan menggeser septum ke arah
kiri. Perubahan volume Vki dengan bowing dari septum ke kiri mengganggu
16 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
pengisian dari Vki dengan mencegah masuknya aliran mitral yang seharusnya
pada saat itu dan berakibat rendahnya cardiac output. (Franco, 2012)
Gambar 4. Perkembangan Hipertensi Arteri Pulmonal. Ventrikel kanan ditandai oleh bentuk bulan sabit dan memiliki diameter yang lebih kecil dibanding Vki. Pada HAP, terjadi peningkatan volume end-systolic dan hipertrofi Vka. Kemudian terjadi perubahan konformasi dari Vka normal menjadi spheric (berbentuk bola) dengan area yang lebih besar disbanding Vki. Bentuk Vka yang lebih spheric menghasilkan fungsi septal yang abnormal dan juga berpengaruh pada performa.
Sumber : Franco V, 2012. Right Ventricular Remodeling in Pulmonary Hypertension. Heart Failure Clin ,8, 403–12.
Meskipun dalam 2 dekade terakhir terdapat kemajuan dalam pemahaman
patologi penyakit vaskular paru dan percobaan terapeutik klinis HAP, namun
ventrikel kanan masih sedikit dipelajari. Mekanisme spesifik yang mendasari
gagal Vka akibat HAP masih belum jelas (Voelkel dkk., 2006). Beberapa hal
yang masih belum jelas antara lain mengapa pada beberapa pasien berkembang
menjadi iskemia miokardial Vka, adanya disfungsi sel endotelial mikrovaskuler,
maupun mekanisme perbaikan Vka yang dilatasi end-staged setelah transplantasi
(Franco, 2012; Ritchie dkk., 1993).
17 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.2.4 Fibrosis Otot Jantung pada Hipertensi Arteri Pulmonal
Jaringan jantung disusun oleh komponen seluler dan ekstraseluler.
Kompartemen seluler utama yakni kardiomiosit yang bertanggung jawab pada
kontraktilitas jantung. Kompartemen ekstraseluler meliputi sel endotelial kapiler,
fibroblast, sel monositik dan sel-sel pembuluh darah dari arteri dan vena koroner.
Fibroblast mensintesis komponen matriks ekstraseluler utama yakni kolagen I dan
II. Gangguan regulasi dari seintesis dan atau degradasi matriks seluler dapat
menyebabkan disfungsi jantung dan gagal jantung (Nicoletti dan Michel, 1999).
Fibrosis didefinisikan sebagai peningkatan konsentrasi kolagen pada organ
dan terutama didominasi oleh kolagen I dan III (Lez dkk., 2004). Fibrosis
merupakan respons patofisiologis dari jaringan akibat jejas kronis. Remodeling
jaringan merupakan mekanisme protektif untuk menghadapi stres dan jejas
dengan tujuan untuk memelihara integritas fungsional organ dan sistem. Namun
deregulasi dari proses penyemuhan dan berlanjutnya paparan terhadap jejas kronis
menyebabkan fibrosis jaringan, penumpukan matriks ekstraseluler, pembentukan
scar, dan gagal organ (Kisseleva dan Brenner, 2008; Fan dkk., 2012).
Pada remodeling miokard akibat volume overload seperti pada hipertensi
arteri pulmonal terjadi hipertrofi miosit, aktivasi dan hiperplasia fibroblast serta
deposisi kolagen ekstraseluler, terutama kolagen tipe I (Nicoletti dan Michel,
1999). Selama kondisi ini matriks ekstraseluler berekspansi karena reaktif dan
reparatif fibrosis (Brilla dan Weber, 1992). Kolagen I dan III awalnya
berakumulasi di sekitar arteri koroner dan fibrosis meluas diantara kardiomiosit.
Proses ini dikenal sebagai reaktif fibrosis perivaskuler dan intersisial (Nicoletti
18 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
dan Michel, 1999; Kai dkk., 2005). Penebalan matriks ekstraseluler ini
menurunkan suplai energi sementara otot jantung bekerja lebih berat untuk
melawan hipertensi. Ketidakseimbangan suplai dan kebutuhan ini menyebabkan
kematian sel baik melalui nekrosis maupun apoptosis. Fibroblast di sekitar sel
yang mati akan mensintesis matriks baru untuk mengganti sel yang mati dan
membentuk mikroscar maupun scar tergantung ukuranya. Proses ini disebut
fibrosis reparatif (Nicoletti dan Michel, 1999). Remodeling matriks ekstraselular
merupakan komponen kunci. Gangguan struktur matriks ekstraselular
menyebabkan gangguan hubungan sel miokardial dan pembuluh darah sehingga
mempengaruhi integritas struktural dan fungsi jantung. Ekses produksi dan
akumulasi matriks ekstraselular terutama kolagen disebut fibrosis dan hal ini
meningkatkan kekakuan miokardium serta menghalangi kontraksi dan relaksasi
ventrikel. Hal ini menyebabkan gangguan fungsi sistol dan diastol yang memicu
gagal jantung dan kematian (Fan dkk., 2012). Penumpukan kolagen terutama
kolagen tipe I pada matriks ekstraselular menandai adanya proses fibrosis (Lez
dkk., 2004). Proses ini didahului dengan produksi kolagen berlebihan akibat
aktivasi dan proliferasi miofibroblast. Deferensiasi fibroblast menjadi
miofibroblast dipromotori oleh TGF-β (Fan dkk., 2012). Transforming Growth
Factor -β1 (TGF-β1) merupakan isoform utama dalam proses fibrosis (Border
dan Noble, 1994). Transforming growth factor -β1 dan kolagen tipe I merupakan
penanda penting dalam proses remodeling ventrikel kanan. Evaluasi kadar TGF-
β1 dan kolagen tipe I dapat dijadikan dasar petunjuk terjadinya proses fibrosis di
jaringan.
19 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Terdapat tiga mekanisme awal yang mempengaruhi terjadinya fibrosis
kardiak pada hipertensi arteri pulmonal (Nicoletti dan Michel, 1999) :
1. Stimulus hemodinamik
2. Sistem Renin-angiotensin-aldosteron
3. Inflamasi
2.2.4.1 Pengaruh Stimulus Hemodinamik dan Sistem Renin-Angiotensin
dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung
Hipertensi arteri pulmonal memiliki karekter remodeling pembuluh darah
yang menyebabkan peningkatan tekanan darah di sistem arteri pulmonal dan
jantung kanan. Sebagai konsekuensinya pasien dengan HAP sering memiliki
cardiac output yang rendah (Handoko dkk., 2010). Pada keadaan ini sistem renin-
angiotensin-aldosteron (SRAA) dan sistem saraf simpatis menjadi aktif untuk
mempertahankan tekanan darah (Man dkk., 2012; Pacurari dkk., 2014). Selain itu,
volume overload pada ventrikel kanan secara langsung menyebabkan makrofag
dan fibroblast yang berinfiltrasi di jantung memproduksi renin dan angiotensin-
converting enzyme (ACE) secara lokal yang merupakan stimulan yang poten
untuk fibroblast baik secara langsung maupun melalui efek perantara TGF-β1
(Kong dkk., 2014).
Renin adalah sebuah enzim proteolitik yang aktif yang awalnya disintesis
sebagai bentuk prephorohormon inaktif (prorenin) (Pimenta dan Oparil, 2009).
Reseptor pro renin berada pada sel mesangeal, otak, jantung, hati, pankreas,
ginjal, paru, otot rangka, plasenta, retina, pembuluh darah, dan kardiomiosit
(Campbell, 2008). Pada bentuk aktifnya, renin akan mengkatalisa pembentukan
20 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
angiotensinogen menjadi angiotensin I. Selanjutnya angiotensin I akan diubah
menjadi angiotensin II oleh ACE (Pimenta dan Oparil, 2009). Angiotensin II
diproduksi oleh makrofag dan fibroblast yang teraktivasi dan akan
menginduksi aktifitas Nikotinamida Adenosin Dinukleotida Hidrogen (NADPH)
oksidase, menstimulasi TGF-β1 dan memicu proliferasi fibroblast dan
deferensiasi menjadi collagen – secreting myofibroblasts (Rosenkranz, 2004;
Wynn, 2008). Angiotensin II juga meningkatkan sinyal TGF-β1 dengan
meningkatkan kadar mothers against decapentaplegic homolog 2 (SMAD2) dan
memperbesar translokasi dari SMAD3 terfosforilasi (Wynn, 2008). Transforming
growth factor -β1 kemudian akan memperbesar produksi kolagen intersisial,
fibronektin, dan proteoglikan oleh miofibroblast kardiak (Tomasek dkk., 2002).
Transforming growth factor -β1 juga menstimulasi produksinya sendiri di
miofibroblast, dan dengan demikian menetapkan siklus autokrin dari diferensiasi
dan aktvasinya. Studi menunjukkan bahwa ekspresi berlebih dari TGF-β1 pada
tikus dapat memicu terjadinya hipertrofi yang mempunyai ciri fibrosis intersisial
dan hipertrofi miosit jantung (Rosenkranz dkk., 2002).
Aldosterone berperan dalam pembentukan fibrosis ventrikel kanan dengan
memicu efek pro inflamasi pada sel vaskuler sehingga menghasilkan sitokin dan
kemokin. Aldosteron juga mengendalikan makrofag menjadi fenotip fibrogenik,
dan juga mengaktifkan sinyal fibrogenik pada kardiomiosit. Aldosteron juga
memiliki efek langsung terhadap aktivasi dan proliferasi fibroblast (Kong dkk.,
2014).
21 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.2.4.2 Peran Inflamasi dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung
Reaksi Inflamasi terbukti terjadi pada jantung yang mengalami overload
(Nicoletti dkk., 1996 ). Dalam proses inflamasi ini makrofag dan sel T
mengeluarkan sitokin–sitokin yang dapat beraksi pada sel otot jantung.
Metabolisme dan proliferasi fibroblast serta miosit seperti pada perubahan
matriks ekstraseluler merupakan target dari molekul-molekul ini. Namun sitokin
ini juga memperkuat atau menghambat respons inflamasi melalui feedback
melalui agen kemoatraktif maupun agen anti inflamasi. Sitokin-sitokin tersebut
antara lain TGF-βs, PDGFs, Tumor Necrosing Factors (TNFs), Interferones
(IFNs), Interleukins (ILs) .(Nicoletti dan Michel, 1999)
2.2.4.2.1 Peran TGF-βs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung
Transforming growth factor β merupakan suatu agen profibrotik juga
mediator imunomodulasi (Nicoletti dan Michel, 1999; Blanchette dkk., 1997;
Zhao dkk., 2008 ). Transforming growth factor β terdiri dari 5 molekul yakni
TGF-β1 sampai TGF-β5 membentuk dimer 25 kilodalton (kDa). Molekul-molekul
ini dilepaskan dalam bentuk inaktif laten. Pada matriks ekstraseluler ia berikatan
dengan dekorin. Ia harus dipecah untuk menjadi bentuk yang aktif (Nicoletti dan
Michel, 1999). TGF-β juga meregulasi sendiri ekspresi converting enzyme-nya
yakni furin (Blanchette dkk., 1997).
Transforming growth factor β dapat disintesis oleh otot polos, makrofag,
limfosit B dan T. Pada neonatus dan orang dewasa TGF-βs disintesis di
kardiomiosit dan memiliki aksi autokrin dan parakrin (Nicoletti dan Michel,
22 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
1999). Pada kasus hipertrofi otot jantung karena stenosis aorta, terbukti juga
bahwa TGF-βs juga dipengaruhi kadar peningkatanya oleh fibroblast.
Transforming growth factor-β dapat menghambat respons proliferatif
koloni yang dipengaruhi faktor stimulus sel hematopoitik. Namun TGF-βs juga
mempunyai efek inhibisi terhadap proliferasi sel B dan T dan menurunkan
immunoglobulin M dan G oleh limfosit B yang teraktivasi. Efek hambatan pada
sel T adalah pada autokrin maupun parakrin. Transforming growth factor β
menghambat respons proliferatif dan diferensiasi sel imunokompeten (Nicoletti
dan Michel, 1999; Zhao dkk., 2008 ). Beberapa studi menunjukkan bahwa TGF-
βs memiliki efek proinflamasi dan kemoatraktif terutama terhadap monosit.
Transforming growth factor β dapat menginduksi produksi IL-1, PDGFs, FGFs,
dan TNFs melalui monosit. Transforming growth factor β juga dapat menginduksi
matriks ekstraseluler dan menurunkan aktifitas enzim protease, menstimulasi
ekspresi fibronektin dan kolagen (Ignotzand dan Massague, 1986; Nicoletti dan
Michel, 1999). Transforming growth factor β juga menginduksi sintesis inhibitor
jaringan terhadap metaloprotease prokolagenase (Nicoletti dan Michel, 1999;
Edwards dkk., 1987). Transforming growth factor β merupakan isoform paling
penting dalam proses pembentukan fibrosis (Border dan Noble, 1994).
23 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Gambar 5. Efek Selular TGF-Β Pada Fibrosis Otot Jantung. Transforming growth factor β dapat menstimulasi hipertrofi kardiomiosit, memproduksi mediator fibrogenik, aktivasi dan proliferasi fibroblast, serta mengaktifkan makrofag dan limfosit. Sumber : Kong P, Christia P, G N, dan Frangogiannis, 2014. The Pathogenesis of Cardiac Fibrosis. Cell. Mol. Life Sci, 71, 549–74. 2.2.4.2.2 Peran PDGFs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung
Platelet derived grow factors merupakan protein sebesar 30 kDa yang
pertama dimurnikan dari platelet α-granules. Platelet derived grow factors
tersusun dari 2 subunit, A dan B, membentuk homodimer atau heterodimer : AA,
BB atau AB. Ia disintesis oleh fibroblast, sel endotelial, otot polos pembuluh
darah, dan makrofag. Fungsi utamanya yakni untuk menstimulasi proliferasi sel
dan migrasi. Efek dari faktor pertumbuhan ini masih sedikit dipelajari. Platelet
derived grow factor-BB merubah profil limfokin yang dihasilkan oleh sel T yang
teraktivasi . Platelet derived grow factor-BB dapat menginduksi fibroblast dan
mitosis miosit dan PDGF-AA merupakan mitogen poten terhadap fibroblast
jantung. (Nicoletti dan Michel, 1999).
24 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.2.4.2.3 Peran IFN dan TNFs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung
Interferon merupakan sitokin pleiotropic yang memiliki aktivitas sebagai
anti virus dan anti tumor, menghambat proliferasi sel, stimulasi ekspresi antigen
membran (reseptor untuk immunoglobulin, Major Histocompatibility Complex
(MHC)), dan menstimulasi fungsi sitotoksik dari makrofag dan limfosit.
Interferon terdiri dari 4 anggota yakni tipe I diwakili oleh IFN-α, -β,-ω, dan tipe II
oleh IFN-γ. Interferon -β diproduksi oleh fibroblast, sedang IFN- α dan IFN -ω
oleh limfosit. Interferon - α juga disintesis oleh monosit (Nicoletti dan Michel,
1999). Interferon -γ juga berfungsi untuk menurunkan sintesis matriks
ekstraseluler dan meningkatkan sintesis metalloproteinase pada fibroblast manusia
(Clark dkk., 1989; Sciavolinol dkk., 1994; Nicoletti dan Michel, 1999).
Tumor Necrosing Factors (TNFs) terdiri dari 2 yakni TNF-α dan TNF-β
(limfotoksin). Tumor Necrosing Factor-α diproduksi oleh sel radang, fibroblast,
sel otot polos dan sel endotelial. Faktor ini disebut faktor proinflamasi dan dapat
menginduksi beberapa mediator seperti IL-1, IL-6, MCP-1, PDGF, TGF–β, dan
Nitric Oxide Synthase (NOS). Pada fibroblast, TNFs dapat menginduksi
kolagenase dan menurunkan produksi kolagen dan fibronektin. Tumor Necrosing
Factors dapat menginduksi produksi Nitric Oxide (NO) dan ekspresi MHC klas I
yang pada akhirnya akan menurunkan permeabilitas endotel (Nicoletti dan
Michel, 1999).
Pada kondisi gagal jantung TNFs terkspresi sebagai respons terhadap
overload hemodinamik. Tumor Necrosing Factors dapat memicu respons
pertumbuhan hipertrofi pada miosit jantung (Yokoyama dkk., 1997). Tumor
25 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Necrosing Factors juga dapat menginduksi infiltrasi sel imun ke miokardium
selama hipertensi dikarenakan TNFs merupakan stimulator sistem imun yang
poten (Nicoletti dan Michel, 1999). Tumor Necrosing Factors juga menginduksi
apoptosis kardiomiosit. Hal ini diduga sebagai sebab anti TNF antibodi
meningkatkan pemulihan miokard setelah iskemia dan reperfusi (Gurevitch dkk.,
1997).
2.2.4.2.4 Peran ILs dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung
Interleukin -1 merupakan sitokin yang memiliki ciri khusus yakni
disimpan di dalam sel. Sel inflamasi dan fibroblast memiliki kapasitas untuk
memproduksi IL-I. Beberapa faktor yang dapat menstimulasi produksi IL-1 yakni
IFNs, TNFs, IL-2, komponen komplemen, MHC klas I dan IL-1 itu sendiri.
Interleukin -1 dapat mengatur respons imun spesifik dan dapat menginduksi atau
menghambat replikasi sel. Pada beberapa proses fibrosis, IL-1 diproduksi secara
berlebihan (Nicoletti dan Michel, 1999).
Interleukin -6 merupakan glikoprotein sebesar 26 kDa yang disekresi oleh
sel yang teraktivasi seperti makrofag, limfosit T dan B, natural killer cell (NK
cell), fibroblast, sel endotelial, dan otot polos pembuluh darah. Pelepasan IL-6
dipengaruhi oleh sitokin lain seperti IL-1 atau TNFs. Interleukin -6 dapat beraksi
pada sel yang berbeda. Contohnya yakni IL-6 meningkatkan sintesis
imunoglobulin dari sel B teraktivasi. Interleukin -6 dapat mengaktivasi fibroblast
dan menginduksi hipertrofi otot polos pembuluh darah (Nicoletti dan Michel,
1999). Interleukin -6 juga menstimulasi sintesis PDGF pada otot polos pembuluh
darah. Pada makrofag, sintesis IL-6 dihambat oleh TGF-βs, IL-4 dan IL-10. Kadar
26 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
IL-6 meningkat selama infeksi, infark miokard dan pembedahan. Peningkatan
kadar TNF dan IL-6 telah terbukti berhubungan dengan gagal jantung
(MacGowan dkk., 1997; Nicoletti dan Michel, 1999).
2.2.4.2.5 Peran Makrofag dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung
Pada proses fibrosis otot jantung terjadi infiltrasi sel-sel radang
yang spesifik terhadap antigen. Makrofag yang merupakan antigen presenting
cells (APC) mengekspresi molekul MHC klas II pada area perivaskuler. Molekul
ini terekspresi apabila sebuah antigen diproses. Peptida di dalam antigen dipilih
dan komplek MHC klas II dipresentasikan di permukaan APC. Kompleks ini
kemudian dikenali oleh sel T. Setelah pengenalan, sel T akan berplofireasi dan
memproduksi sitokin, dan mempunyai potensi untuk terjadi fibrogenesis
(Nicoletti dan Michel, 1999).
27 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Gambar 6. Hubungan Antara Fibrosis, Inflamasi , Dinding Pembuluh Darah, dan Hipertrofi Otot Jantung. Anak panah menandakan efek positif sitokin - sitokin utama yang berpengaruh terhadap fibrosis dan inflamasi dan sel - sel yang berpotensi dan garis berakhir dengan tanda minus menunjukkan efek negatif. Sel inflamasi memiliki potensi untuk meregulasi sel residen. Sel residen juga tidak tinggal diam, mereka juga berkomunikasi dengan sel inflamasi dan mengirim sinyal untuk menarik sel inflamasi ke jantung sebagai respons terhadap stres hemodinamik, hormon dan peptida-peptida. Sumber : Nicoletti A, dan Michel J-B, 1999. Cardiac Fibrosis and Inflamation: Interaction with Hemodynamic and Hormonal Factors. Cardiovasc Research, 41, 532-43.
2.2.4.3 Peran Spesies Oksigen Reaktif dalam Pembentukan Fibrosis Otot
Jantung
Selain ketiga mekanisme awal diatas, stres oksidatif juga terlibat dalam
patogenesis fibrosis jantung melalui aksi langsung dan melalui keterlibatan
sitokin dan sinyal faktor pertumbuhan. Spesies oksigen reaktif (SOR) juga
merupakan mediator kunci efek induksi sitokin dan angiotensin-II pada fibroblast
(Cheng dkk., 2003; Kong dkk., 2014). Pada tikus dewasa, produksi kolagen yang
dstimulasi angiotensin II dimediasi melalui generasi SOR (Kong dkk., 2014).
Pada penelitian menggunakan tikus yang diberikan infus angiotensin II, penanda
berperannya superoksidan dalam pembentukan fibrosis jantung yakni dengan
28 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
ditemukanya gp91phox (suatu subunit NADPH oksidase) pada ruang perivaskuler
secara mikroskopik pada jejas/fibrosis ventrikel. Hal ini menunjukkan bahwa
SOR diregulasi di jantung. Produksi angiotensin II juga meningkat di daerah
jantung yang mengalami fibrosis, membuktikan bahwa angiotensin II juga
berperan dalam stres oksidatif jantung. Angiotensin II terbukti menstimulasi
NADPH oksidase (Zhao dkk., 2008 ). Sebaliknya SOR akan mengaktifkan sistem
renin angiotensin aldosterone (Tanaka dan Shimizu, 2012). Efek dari angiotensin
tergantung pada SOR. Angiotensin II mengaktifkan down stream kinase sensitif
SOR yang sangat penting dalam mediasi remodeling fibrosis jantung (Ohtsu dkk.,
2005; Kong dkk., 2014). Spesies oksigen reaktif langsung mengatur kuantitas dan
kualitas matriks ekstraselular interstitial dengan memodulasi ekspresi protein
matriks dan metabolisme, baik berupa efek matrix-preserving maupun matrix-
degrading. Peningkatan stres oksidatif mengaktifkan matriks metalloproteinase
(MMPs) dan mengurangi sintesis kolagen fibril di fibroblast jantung (Siwk dkk.,
2001; Kong dkk., 2014). Transforming growth factors -β juga diaktifkan oleh
SOR dan dapat meningkatkan deposisi matriks ekstraselular dalam interstitium
jantung.(Zhao dkk., 2008 )
29 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Gambar 7. Jalur Regulasi Fibrosis Otot Jantung Terkait Angiotensin dan Stres Oksidatif . Peningkatan sirkulasi angiotensin II memicu terjadinya stres oksidatif. Stres oksidatif akan meningkatkan sintesis TGF-β1 sehingga memicu proliferasi miofibroblast sintesis kolagen dan menurunkan menghambat degradasi kolagen sehingga terjadi penumpukan kolagen yang disebut sebagai keadaan fibrosis otot jantung.
Sumber : Zhao W, Zhao T, Chen Y, Ahokas R, dan Sun Y, 2008 Oxidative Stress Mediates Cardiac Fibrosis by Enhancing Transforming Growth Factor-Beta1 in Hypertensive Rats. Mol Cell Biochem 317, 43–50. 2.2.4.4 Peran Kolagen dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung
Kolagen merupakan jaringan penghubung (connective tissue) yang
bertanggung-jawab pada struktur dan fungsi miokard. Pada otot jantung, kolagen
disintesis oleh fibroblast yang teraktivasi menjadi secreting myofibroblast (Fan
dkk., 2012). Sintesis kolagen berkurang seiring bertambahnya umur (Raghu dkk.,
1989). Terdapat 3 kelompok besar kolagen yakni fibrillar collagens, fibril-
associated collagens, dan sheet-forming collagens yang masing masing memiliki
fitur struktural dan jaringan representatif sendiri seperti tampak pada gambar 8
(Kuhn, 1987). Pada proses fibrosis ventrikel kanan akibat HAP terjadi
penumpukan kolagen terutama kolagen tipe I dan III dan hal ini meningkatkan
30 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
kekakuan miokardium serta menghalangi kontraksi dan relaksasi ventrikel. Hal ini
menyebabkan gangguan fungsi sistol dan diastol yang memicu gagal jantung dan
kematian (Fan dkk., 2012)
Tabel 3. Tipe Kolagen
Terdapat 3 kelompok besar kolagen. Kolagen tipe I dan III merupakan fibrilar kolagen dan banyak ditemukan pada matriks ekstraseluler otot jantung yang mengalami fibrosis. Sumber : K Kuhn, 1987, in R Mayne and R Burgeson, eds., Structure and Function of Collagen Types, Academic Press, 2; M van der Rest and R Garrone, 1991, FASEB J 5:2814.
Tipe Komposisi Molekul Fitur Struktural Jaringan Representatif
Fibrilar Collagens I [α1(I)]2[α2(I)] 300-nm-long fibrils Kulit,tendon, tulang,
ligamen, dentin, jaringan interstitial
II [α1(II)]3 300-nm-long fibrils Kartilage, vitreous humor
III [α1(III)]3 300-nm-long fibrils; sering bersama tipe I
Kulit, otot, pembuluh darah
V [α1(V)]3 390-nm-long fibrils with globular N-terminal domain; sering bersama tipe I
Sama dengan tipe I ; juga pada kultur sel, jaringan fetus
Fibril-Associated Collagens VI [α1(VI)][α2(VI)] Asosiasi Lateral dengan tipe I ;
periodic globular domains Kebanyakan jaringan interstitial
IX [α1(IX)][α2(IX)][α3(IX)]
Asosiasi Lateral dengan tipe II; N-terminal lobular domain; bound glycosaminoglycan
Cartilage, vitreous humor
Sheet-Forming Collagens IV [α1(IV)]2[α2(IV)] Two-dimensional network Lamina basalis
31 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.2.4.5 Peran Kolagenase dalam Pembentukan Fibrosis Otot Jantung
Pembentukan fibrosis melibatkan dua proses penting yakni sintesis dan
degradasi matriks ekstraseluler. Pada keadaan normal terjadi keseimbangan antara
keduanya, dan pada keadaan abnormal terjadi ketidakseimbagan sehingga
menghasilkan penumpukan matriks ekstraseluler yang disebut fibrosis. Kedua
proses tersebut melibatkan kolagenase yakni MMPs dan tissue inhibitor of
metalloproteinase (TIMPs) sebagai inhibitornya (Fan dkk., 2012). Matriks
metalloprotease juga disebut matriksin, merupakan proteinase utama dalam
degradasi matriks ekstraseluler (Nagase dkk., 2006). Terdapat 5 golongan besar
MMPs, yaitu (Nagase dkk., 2006) :
1. Kolagenase ; Terdiri dari kolagenase intersisial atau kolagenase 1
(MMP-1), kolagenase netrofil atau kolagenase 2 (MMP-8), kolagenase
3 (MMP-13), kolagenase 4 atau xenopus MMP-18). Kolagenase
memecah kolagen intersisial I, II, dan III menjadi ¾ dan ¼ bagian
namun mereka dapat mencerna molekul matriks ekstraseluler lain dan
protein yang larut.
2. Gelatinase ; Terdiri dari gelatinase A (MMP-2) dan gelatinase B
(MMP-9). Ia mencerna gelatin dengan bantuan fibronektin tipe II yang
terikat gelatin atau kolagen
3. Stromelisin ; Stromelisin 1 (MMP-3), stromelisin 2 (MMP-10).
Fungsinya hampir sama dengan kolagenase namun tidak memecah
kolagen intersisial.
32 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4. Matrilisin ; Matrilisin 1 (MMP-7), matrilisin 2 (MMP-26), Stromelisin
3 (MMP-11). Matrilisin 1 disintesis di sel epitel dan disekresi melalui
apexnya. Matrilisin 2 diekspresi pada sel normal seperti endometium
dan beberapa karsinoma.
5. Membran-type MMPs ;
a. Tipe transmembran ; MT1-MMP (MMP-14), MT2-MMP
(MMP-15), MT3-MMP (MMP-16), MT5-MMP (MMP-24).
Semua selain MMP-17 dapat mengaktivasi proMMP-2, dan
MMP-14 memiliki aktifitas kolegenolitik terhadap kolagen I,
II, dan III.
b. GPI (glycosylphophatidylinositol) –anchored ; MT4-MMP
(MMP17), MT6-MMP (MMP-25)
6. Lainya ; Machrophage etalase (MMP-12, MMP-19), Enamelisin
(MMP-20, MMP-21), CA-MMP (MMP-23, MMP-27), Epilisin
(MMP-28). Machrophage etalase mencerna elastin. Enamelistin
mencerna amelogenin, dan epilisin terekspresi pada paru, plasenta,
jantung, saluran gastrointestinal, dan testis.
Tissue inhibitor of metalloproteinase merupakan kelompok protein
sekretori yang mampu menghambat aktifitas MMPs melalui ikatan kovalen pada
ruang ekstraseluler. Terdapat 4 sub famili yang telah diidentifikasi pada
vertebrata, yakni TIMP-1, -2, -3, dan -4. Protein ini diekspresikan oleh berbagai
33 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
jaringan pengaturannya terjadi saat terjadi proses fibrosis dan remodeling jaringan
(Iradale, 2001).
2.3 Terapi Hipertensi Arteri Pulmonal dan Fibrosis Otot Jantung
Terapi farmakologis HAP saat ini mentargetkan jalur prostasiklin,
endotelin, dan phosphodiesterase-5. Titik akhir kelas terapi ini adalah vasodilatasi
arteri pulmonalis (Raja dan Raja, 2011). Obat golongan ini meliputi Calcium
channel blocker (CCB), prostanoid, antagonis endotelin dan penghambat
posphodesterase 5. Semua terapi ini memiliki efek vasodilatasi arteri pulmonal.
Calcium chanel blocker juga memiliki efek antiproliferatif (Chin dan Rubin,
2008). Studi 30 tahun terakhir menunjukkan bahwa peningkatan sirkulasi hormon
angiotensin II dan endotelin-1 , serta sitokin fibrogenik seperti TGF-β, faktor
pertumbuhan jaringan CTGF dan PDGF merupakan kunci menuju fibrosis.
Hormon dan sitokin ini mengaktifkan sel mesenkimal fibroblast pada jaringan.
Fibroblast yang aktif dinamakan miofibroblast karena mengekspresikan protein
kontraktil α-smooth muscle actin (α-SMA). Hambatan terhadap kinerja hormon
dan sitokin tersebut menjadi kunci hambatan berkembangnya fibrosis jaringan
(Leask, 2010).
2.3.1 Calcium Channel Blocker
Calcium channel blocker merupakan terapi pilihan pada HAP yang
respons terhadap vasodilator. Pada pasien dengan tekanan arteri pulmonal lebih
dari 40 mmHg tidak dipertimbangkan sebagai terapi jangka panjang meski
didapatkan penurunan tekanan arteri pulmonal sekitar 20% karena seringnya
terjadi kegagalan terapi (Chin dan Rubin, 2008).
34 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Calcium channel blocker menurunkan kejadian fibrosis otot jantung terkait
hambatannya terhadap masuknya Ca2+ melalui kanal kalsium tipe L yang sensitif
voltase menuju fibroblast dan memodulasi sintesis kolagen (Sandmann dkk.,
2001). Calcium channel blocker juga memodulasi efek faktor mitogenik seperti
endotelin dan aldosterone pada fibroblast yang berakhir pada berkurangnya
produksi kolagen I dan II (Sandmann dkk., 2001) Pelepasan angiotensin II juga
diregulasi oleh mekanisme kanal kalsium tipe T (Nuisson dkk., 1995) Hal ini
menjelaskan bahwa hambatan fibrosis perivaskuler oleh CCB dijelaskan melalui
pencegahan angiotensin II atau proliferasi yang diinduksi endotelin. Hambatan
terhadap kinerja hormon dan sitokin tersebut menjadi kunci hambatan
berkembangnya fibrosis jaringan (Sandmann dkk., 2001).
Efek samping CCB meliputi vasodilatasi, inotropik negatif, gangguan
konduksi, gangguan gastrointestinal, gangguan metabolik, dan interaksi obat.
Gejala vasodilatasi umumnya yakni pusing, palpitasi, edema perifer, sering
muncul pada penggunaan nifedipine. Efek Inotropik negatif berturut-turut mulai
yang terbesar adalah pada penggunaan verapamil, diltiazem, dan nifedipine. Obat
obat ini juga kontraindikasi pada penyakit dengan AV blok derajat II dan III,
sindroma sick sinus, dan gagal jantung yang berat. Verapamil dan diltiazem
memiliki efek signifikan pada sistem konduksi jantung. Mual dan konstipasi
sering ditemukan pada penggunaan verapamil. Ketiga obat tersebut pada dosis
tiinggi dapat menghambat pelepasan insulin (Russell, 1988).
35 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.3.2 Analog Prostasiklin
Prostasiklin merupakan produk dari asam arakidonat yang mempromotori
vasodilatasi dan menghambat proliferasi vaskuler dan agregasi platelet (Chin dan
Rubin, 2008). Pasien HAP mengalami kekurangan produksi prostasiklin (PGI2)
(Christman dkk., 1992). Epoprosterenol merupakan sintetik prostasiklin yang
pertama disetujui Food and Drug Administration. Epoprosterenol merupakan
terapi pilihan pada pasien yang membutuhkan peningkatan kapasitas latihan,
hemodinamik, dan kualitas hidup dan meningkatkan angka kesintasan pada
sebuah studi (Barst dkk., 1996). Analog prostasiklin tersedia dalam bentuk
intravena, inhalasi,dan oral (Chin dan Rubin, 2008).
Pada studi in vitro, analog prostasiklin menunjukkan supresi ekspresi
kolagen pada fibroblast jantung (Yu dkk., 1997). Pada penelitian menggunakan
tikus model defisit reseptor prostasiklin, fibrosis jantung akibat overload juga
meningkat akibat tidak adanya sinyal reseptor prostasiklin (Francois dkk., 2005).
Pada fibroblast kulit, aktivasi reseptor prostasiklin menghambat ekspresi kolagen
dengan berfungsi sebagai antagonis TGF-β yang terinduksi extracellular signal–
regulated kinase (ERK) (Stratton dkk., 2002). Namun mekanisme pastinya pada
fibroblast jantung masih belum jelas (Chan dkk., 2010)
Efek samping prostasiklin terutama terkait efek vasodilatasi seperti
hipotensi, nyeri kepala, mual, flushing, dan pusing. Obat golongan ini juga dapat
menyebabkan trombositopenia (Duarte dkk., 2013).
36 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.3.3 Antagonis Endotelin
Endotelin-1 merupakan vasokonstriktor dan mitogen pada vaskuler paru
dan sistemik (Chin dan Rubin, 2008). Endotelin meningkatkan sintesis kolagen I
dan III serta fibronektin (Rizvi dkk., 1996; Marini dkk., 1996). Endotelin juga
menginduksi ekspresi faktor pertumbuhan jaringan (Shi-wen dkk., 2004).
Meskipun diproduksi secara lokal , kadar endotelin-1 sistemik meningkat pada
HAP dan berkorelasi dengan derajat keparahan (Giaid dkk., 1993). Dua antagonis
endotelin yaitu bonsetan dan ambrisentan telah disetujui oleh FDA di Amerika
Serikat, sedangkan sitaxsentan telah disetujui di Eropa. Bonsetan memblok
reseptor endotelin-A dan B, sedang sitaxetan dan ambrisentan spesifik untuk
endotelin-A. Ketiganya tersedia dalam bentuk oral (Chin dan Rubin, 2008).
Bonsetan menurunkan sintesis kolagen I dan III, meningkakan supresi
kolagenase dan menghambat deposisi matriks ekstraseluler (Shi-wen dkk., 2001).
Bonsetan menunjukkan efek anti fibrosis pada beberapa model fibrosis jantung
(Clozel dan Salloukh, 2005).
Efek samping bonsetan antara lain nyeri kepala, flushing, edema periferal,
hidung buntu, sinusitis, dan peningkatan enzim hati. Efek lebih serius meliputi
anemia, gagal jantung, kelainan janin dan hepatotoksisitas. Bonsetan dan
ambrisetan termasuk dalam obat kategori X untuk ibu hamil menurut FDA
(Duarte dkk., 2013).
37 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.3.4 Penghambat Phospodisterase-5
Sildenafil merupakan penghambat phospodiesterase-5 yang dapat
meningkatkan produksi NO dengan cara memecah second messenger dari NO
yakni cyclic guanosine monophosphate (cGMP), menyebabkan vasodilatasi
pulmoner dan hambatan pertumbuhan sel (Chin dan Rubin, 2008; Gong dkk.,
2014). Sebuah studi menunjukkan bahwa penggunaan sildenafil dapat
menghambat hipertrofi dan gagal jantung, serta mencegah fibrosis jantung pada
tikus yang diinduksi transverse aortic constriction (Gong dkk., 2014).
Efek samping yang paling sering penggunaan obat ini antara lain sakit
kepala, dispepsia, flushing, gangguan penglihatan dan hidung buntu. Efek sering
yang lebih berat namun jarang terjadi yakni penyakit vaskular retina, infark
miokard dan neuropati optik iskemik nonarteritik (Duarte dkk., 2013).
2.3.5 Ekstrak Buah Delima Sebagai Terapi Alternatif
Buah delima atau pomegranate (Punica granatum L, Punicaceae) adalah
jenis buah yang berasal dari persia dan dapat tumbuh dan dikonsumsi di seluruh
dunia dan banyak digunakan dalam bidang kesehatan (Haber dkk., 2011).
Ketertarikan terhadap buah delima ini sehubungan dengan manfaatnya dalam
pencegahan kanker prostat, mencegah oksidasi LDL, high density lipoprotein
(HDL),dan kolestrol, penurunan tekanan darah , artritis, anemia, diare, inflamasi,
penyakit ginekologis, perkembangan arterosklerosis, stimulasi fungsi sel –T, dan
produksi sitokin, penyakit Alzeimer, dan peningkatan kualitas sperma. Efek
manfaat ini terkait banyaknya kandungan fitokimia dalam buah delima. Senyawa
fitokimia ini terutama merupakan campuran senyawa fenolik seperti polifenol
38 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
tanin yang mengandung gula dan antosianin, termasuk ellagitannin, antosianin
dan polofenol lain yang mudah dihidrolisa (Akpinar-Bayizit dkk., 2012). Toklu
dan kawan-kawan membuktikan bahwa pemberian ekstrak buah delima memberi
perlindungan terhadap fibrosis hati pada tikus yang diinduksi obstruksi kandung
empedu (Toklu dkk., 2007). Hemmati dan kawan-kawan menemukan bahwa
pemberian ekstrak buah delima dapat mencegah akumulasi kolagen pada paru
tikus model fibrosis paru (Hemmati dkk., 2013).
Gambar 8. Efek Bioaktif Kandungan Buah Delima. Kandungan fitokimia buah delima memiliki efek membersihkan radikal bebas dengan menghambat enzim oksidan dan menginduksi enzim antioksidan. Ia juga memiliki efek anti inflamasi yakni dengan menghambat Cyclooxygenase-2 (COX-2) dan Lipoxygenase (LOX). Ia juga memiliki efek perlindungan stres oksidatif dan aterogenesis dengan menginduksi aktivitas paraoxonase 1 dan 2. Ia juga memiliki efek anti proliferasi yakni dengan menurunkan p21 dan p27 yang berujung pada penurunan cyclins dan cyclins kinase. Ia juga memilik efek antikarsinogenik dengan menginaktivasi faktor NF-Bsehingga menurunkan invasi, angiogenesis dan metastasis, menurunkan sitokrom P450 dengan mengaktivasi prokarsinogen dan menghambat inisiasi tumor, hambatan terhadap zat mirip enzim carbonic anhydrase dan ornithin dekarboksilase yang aktif pada pertumbuhan sel kanker.
Sumber : Akpinar-Bayizit A, Ozcan T, dan Yilmaz-Ersan L 2012. Cancer Prevention - from Mechanisms to Translational Benefits. In: Georgakilas, A. (ed.) The therapeutic potential of pomegranate and Its products for prevention of cancer. Rijeka: In Tech, 331-72
39 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Tanaman delima mengandung alkaloid, mannite, asam ellagic dan asam
galat. Kulit kayu dan kulit buahnya mengandung tanin. Kandungan parapolifenol
dalam buah delima diyakini memberikan aktivitas antioksidan dan melindungi
LDL terhadap oksidasi yang dimediasi sel langsung dengan interaksi dengan
lipoprotein dan secara tidak langsung oleh akumulasi dalam makrofag arteri. Kulit
buah bagian dalam dan luar mengandung lebih banyak polifenol dibanding biji.
Jus delima komersial telah ditemukan memiliki kandungan kulit dan efek
antioksidan yang lebih kuat dibanding jus olahan tangan. Selain itu jus delima
memiliki efek antihipertensi dengan mengurangi aktivitas angiotensin-converting
enzyme (Haber dkk., 2011).
Tabel 4. Kandungan Fitokimia Tanaman Buah Delima
Komponen Tanaman Kandungan
Jus buah delima Anthocyanins; glukosa;asam ascorbat, elemen mineral ; asam amino , ; phenol seperti : Asam ellagic,asam galat,asam kaffeik, katechin, epigallocatechin gallate (EGCG), quercetin, rutin.
Minyak biji delima Asam Punicic; Asam ellagic ; Asam lemak; sterol
Kulit buah delima Komponen Phenolik seperti : punicalagins, asam galat,catechin, EGCG, quercetin, rutin, anthocyanidins, flavonoid lainya
Daun buah delima Ellagitannins (punicalin and punicafolin); flavonol seperti luteolin dan apgenin
Bunga buah delima Asam Gallat, triterpenoid seperti ursolic,maslinic dan asam asiatik
Kulit kayu dan akar buah delima Ellagitannins; alkaloid piperidine Sumber : Jurenka J, 2008. Therapeutic Applications of Pomegranate (Punica Granatum L.):A Review. Altern Med Rev, 13, 129-44.
40 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Tabel 5. Kandungan Nutrisi Tanaman Buah Delima
Kandungan
Moisture 72.6-86.4%
Lemak 0.05-1.6%
Elemen mineral 0.01-0.9%
Serat 0.36-0.73%
Karbohidrat 15.4-19.6%
Kalsium 3.0-12.0 mg
Fosfor 8.0-37.0 mg
Besi 0.3-1.2 mg
Sodium 3.0 mg
Magnesium 9.0 mg
Asam askorbat (Vitamin C) 4.0-14.0 mg
Thiamin (Vitamin B1) 0.01 mg
Riboflavin (Vitamin B2) 0.012-0.03 mg
Niasin 0.18-0.3 mg
Sumber : Akpinar-Bayizit A, Ozcan T, dan Yilmaz-Ersan L 2012. Cancer Prevention - from Mechanisms to Translational Benefits. In: Georgakilas, A. (ed.) The therapeutic potential of pomegranate and Its products for prevention of cancer. Rijeka: In Tech, 331-72.
Sebuah studi pada orang sehat 20-30 tahun yang diberi 50 ml jus
pomegranate (setara 1,5 mmol polifenol) setiap hari selama 2 minggu
menunjukkan peningkatan aktivitas antioksidan dan kenaikan serum paraoxonase
signifikan yakni 9% (p<0,05) dan (p<0,01). Aviram dkk juga mengevaluasi efek
pomegranate pada ketebalan intima media, tekanan darah, dan oksidasi LDL pada
pasien atheroskelrosis selama 3 tahun. Pada tahun pertama didapatkan penurunan
35% dari ketebalan intima dan peningkatan 9% pada plasebo (p<0,01), penurunan
tekanan darah sistolik sebesar 12% sedang pada plasebo tidak didapatkan
41 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
perubahan (p<0,01), dan konsentrasi antibodi anti LDL teroksidasi turun 19%
pada grup pomegranat pada 3 bulan (p<0,01) (Aviram dkk., 2004 ).
Sitokin proinflamasi interleukin-1beta (IL-1β) terlibat dalam proses
berlangsungnya HAP. Inflamasome NLRP3 yang terdiri dari protein NLR
NLRP3, adaptor ASC, dan pro-caspase 1, merupakan pusat aktivasi IL-1β dan
memainkan peran kunci dalam imunitas bawaan dan cedera paru (Dolinay dkk.,
2012; Tang dkk., 2015; Jianbo dkk., 2013). Generasi spesies oksigen reaktif
(SOR) adalah elemen sentral mengatur aktivasi NLRP3 (Martinon, 2010 ;
Tschopp dan Schroder, 2010 ). Beberapa studi melibatkan stres oksidatif (SO)
dalam pengembangan HAP (Suzuki dkk., 2013; Villegas dkk., 2013; Afolayan
dkk., 2012). Stres oksidatif dikaitkan dengan perubahan dalam SOR dan jalur
sinyal nitrat oksida. Disregulasi keseimbangan oksidan / antioksidan mengganggu
tonus pembuluh darah dan berkontribusi terhadap aktivasi patologis jalur anti
apoptosis dan mitogenik, yang menyebabkan proliferasi sel dan obliterasi
pembuluh darah (Tabima dkk., 2012) Intervensi antioksidan menunjukkan efek
protektif dalam eksperimen HAP (Villegas dkk., 2013). Namun, mekanisme yang
mendasari tidak sepenuhnya dipahami. Sebagai polifenol yang aktivitas biologi
senyawa, asam ellagic (AE) memiliki beberapa aktifitas biologis seperti sebagai
pembersih radikal (Xu dkk., 2003), antioksidan dan anti proliferasi (Tang dkk.,
2015).
42 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Gambar 9. Kapasitas Antioksidan Jus Buah Delima dibandingkan Wine, Teh Hijau, dan Ekstrak Kulit Delima. Evaluasi menggunakan metode ABTS (2,2’-Azinobis(3-Ethylbenzothiazoline)-6-Sulfonic Acid, DPPH (α,α-Diphenyl-β-Pycrylhydrazyl, FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma), DMDP (Dimethyl-p-Phenylenediamine). Nilai Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) , dan Ascorbic Acid Equivalent Antioxidant Capacity (AEAC) kandungan antioksidan Jus delima lebih tinggi dibandingkan wine.
Sumber : Gil M, Tomas-Barberan F, Hess-Pierce B, Holcroft D, dan Kedar A, 2000. Antioxidant Activity of Pomegranate Juice and Its Relationship with Phenolic Composition and Processing. J Agric Food Chem, 10, 4581–9.
Asam ellagic dapat memperbaiki hemodinamik, hipertrofi ventrikel kanan,
dan remodeling pembuluh darah paru pada tikus yang diinduksi monokrotalin.
Monokrotalin dapat merangsang terjadinya stres oksidatif, aktfnya jalur sinyal
NLRP3 dan meningkatnya aktifitas inflamasi di paru dan serum. Patofisiologi
perbaikan dengan AE berhubungan dengan downregulation dari jalur NLRP3
43 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
(Tang dkk., 2015). Asam ellagic juga memiliki efek sebagai penghambat ACE
yang berperan dalam hambatan konversi angiotensin I menjadi angiotesin II pada
jalur RAA (Haber dkk., 2011). Efek antioksidan, anti proliferasi anti inflamasi
dan penghambat ACE yang dimiliki senyawa aktif dalam buah delima inilah yang
akan dicoba dimanfaatkan untuk terapi alternatif HAP.
Beberapa studi studi tentang penggunaan komponen yang berbeda dari
buah delima tidak menunjukkan efek samping pada dosis yang diberikan. Studi
histopatologis dari kedua jenis kelamin tikus Oncins Frans -1 (OF-1)
membuktikan efek non toksik antioksidan polifenol punicalagin. Penelitian pada
binatang dengan dosis yang umum digunakan pada manusia tidak menunjukkan
efek toksik (Cerda dkk., 2003). Pada studi terhadap 86 orang yang menerima 1420
mg/hari tablet EBD selama 28 hari menunjukkan tidak ada efek samping atau
perubahan pada urin dan darah (Vidal dkk., 2003; Jurenka, 2008). Hal ini
menunjukkan bahwa penggunaan EBD cukup aman dengan tidak ada efek
samping yang merugikan sehingga dapat digunakan sebagai terapi alternatif
HAP.
2.4 Tikus sebagai Hewan Model Hipertensi Arteri Pulmonal
Beberapa model binatang coba telah digunakan untuk mempelajari
mekanisme patobiologi dan strategi terapi hipertensi pulmonal antara lain babi,
primata, kelinci, tikus, (Roehl dkk., 2009; Kolettis dkk., 2007; Wang dkk., 2009;
George dkk., 2012). Tikus (Rattus Norvegicus) merupakan hewan model yang
paling sering digunakan. Keunggulan tikus dibanding binatang coba yang lain
yakni dalam harganya yang relatif lebih murah, dan mudah dikembang biakan.
44 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Subjek penelitian ini menggunakan tikus Sprague Dawley, jenis outbred tikus
albino serbaguna yang digunakan secara luas dalam riset medis. Kelebihan tikus
strain ini yakni ketenangan dan kemudahan penanganannya. Tikus jenis ini
pertama kali dikembangkan oleh RW Dawley pada tahun 1925. Kemudian
dikembangkan oleh peternakan Sprague Dawley (kemudian menjadi perusahaan
Animal Sprague Dawley di Madison, Wisconsin. Fasilitas penangkaran dibeli
pertama kali oleh Gibco dan kemudian oleh Harlan (sekarang Harlan Sprague
Dawley) pada bulan januari 1980. Rerata ukuran berat lahir tikus ini adalah 10,5
gram. Berat badan dewasa adalah 250-300 gram bagi betina, dan 450-520 gram
untuk jantan. Kisaran usianya adalah 2,5 sampai 3,5 tahun. Tikus ini juga berguna
dalam penelitian pembedahan eksperimental, penelitian general, metabolisme,
nutrisi, neurologi, onkologi, farmakologi, fisiologi, ageing, teratologi, dan
toksikologi (Hamid, 2015).
Terdapat 2 cara yang lazim digunakan dalam pembuatan tikus model
hipertensi arteri pulmonal. Cara pertama yakni dengan membuat kondisi hipoksia
dengan menempatkan tikus pada ruang hipobarik. Cara kedua yakni dengan
penyuntikan monokrotalin (Voelkel dan Tuder, 2000; Gomez-Arroyo dkk., 2012).
45 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.5 Monokrotalin sebagai Obat Pembuatan Hewan Model Hipertensi Arteri
Pulmonal
Monokrotalin merupakan anggota dari 11 alkaloid pyrolizidin makrosiklik
yang dapat menyebabkan sindrom vaskular paru pada tikus dengan ciri-ciri
vaskulitis pulmonal proliferatif, hipertensi pulmonal dan kor pulmonale.
Monokrotalin telah banyak digunakan secara luas untuk mempelajari patogenesis
hipertensi pulmonal pada manusia, namun mekanisme toksisitasnya masih belum
jelas dan masih sedikit diteliti (Rabinovitch, 2005; Gomez-Arroyo dkk., 2012).
Beberapa hipotesis mekanisme diantaranya (Wilson dkk., 1992) :
1. Monokrotalin diaktivasi menjadi metabolit reaktif di hati.
2. Monokrotalin selektif untuk paru, tidak seperti alkaloid pyrolizidin lain
yang toksik untuk hati. Hal ini menunjukkan monokrotalin
metabolisme yang berbeda dari monokrotalin.
3. Metabolit yang diduga reaktif adalah dehydrogenation produk
dehidrogenasi monocrotaline pyrrole (MCTP).
4. Metabolisme monokrotalin yakni melalui konjugasi glutation yang
mewakili reaksi detoksifikasi.
5. Metabolit reaktif hepatik terakumulasi di sel darah merah, dan
distabilisasi selama transport ke paru.
6. Jejas pulmonal atau respons awal tergantung respons inflamasi yang
dipengaruhi kuat oleh aktivasi platelet.
7. Metabolit hepatik reaktif menyebabkan jejas endotelial non sitotoksik
namun ireversibel.
46 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
KERANGKA TEORI
2.6 Kerangka Teori
c
HAP
Volume overload Cardiac output ↓ Inflamasi
RAA system (active)
Angiotensinogen
Angiotensin I
Angiotensin II
NADPH oksidase
TGFβ1
Aktifasi &Proliferasi fibroblast miokardiak
Collagen secreting myofibroblast
↑kolagen intersisial
pe 1,Tipe 3)
Fibrosis Miokard
Hipertrofi miosit jantung
Sel T Makrofag
TGFβs
1 TNFs ILs IFNs
monosit
FGFs PDGFs
PDGF AA PDGF BB PDGF AB
Mitomiosis
Kolagenase
RA kardiak
↑ Produksi fibronektin ↑ Produksi proteoglikan
IL1 IL2 IL6 ↑ SMAD 2
↑ translokasi SMAD 3
terfosforilasi
47 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2.6.1 Penjelasan Kerangka Teori
Pada HAP terjadi volume overload dan memiliki ciri remodeling
pembuluh darah yang menyebabkan peningkatan tekanan darah di sistem arteri
pulmonal dan ventrikel kanan. Sebagai konsekwensi penderita sering mengalami
cardiac output yang rendah. Pada keadaan ini sistem RAA menjadi aktif untuk
mempertahankan tekanan darah. Renin akan mengkatalisa pembentukan
angiotensinogen menjadi angiotensin I, kemudian ACE akan mengubahnya
menjadi angiotensin II. Selanjutnya angiotensin II akan menginduksi NADPH
oksidase, menstimulasi TGFβ1 dan memicu proliferasi fibroblast dan deferensiasi
menjadi collagen-secreting myofibroblasts. Selanjutnya akan memperbesar
produksi kolagen intersisial (terutama kolagen tipe 1 dan 3), fibronektin, dan
proteoglikan oleh miofibroblast kardiak. Angiotensin II juga akan meningkatkan
sinyal TGFβ1 dengan meningkatkan kadar SMAD2 dan memperbesar translokasi
SMAD3 terfosforilasi.
Stres oksidatif dan inflamasi akan merangsang sel T dan makrofag untuk
memproduksi sitokin-sitokin diantaranya TGFβs, IFNs, TNFs,dan ILs. TGFβs
yang terdiri dari TGFβ1 sampai TGFβ5 memiliki efek kemoatraktif terhadap
monosit. Melalui monosit, TGFβs dapat menginduksi IL-1, PDGFs,FGFs dan
TNFs. PDGFs memiliki 3 bentuk yakni PDGF AA, PDGF BB dan PDGF AB.
PDGF AA dan BB akan menstimulasi proliferasi fibroblast miokardiak dengan
hasil akhir yakni peningkatan kolagen intersisial, fibronektin dan proteoglikan.
PDGF BB juga memiliki aktifitas mitomiosis sehingga dapat memicu terjadinya
hipertrofi miosit otot jantung.
48 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Monosit dan IFNs serta TNFs akan menginduksi ILs. IL-2 akan
menginduksi pelepasan IL-1 , dan IL-1 akan menginduksi pelepasan IL-6 untuk
selanjutnya mengaktifasi fibroblast yang pada akhirnya juga akan meningkatkan
produksi kolagen intersisial, fibronektin dan proteoglikan. Hal ini akan
menyebabkan fibrosis intersisial miokard. Sebagai regulator, TFs akan
menginduksi enzim kolagenase (MMPs beserta inhibitornya) yang akan
menurunkan sistesis kolagen pada intersisial.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
49 KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
BAB III
KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Konsep
HAP
Volume overload Cardiac output ↓
RA sistemik
Angiotensinogen
Angiotensin I
Angiotensin II
TGF-β1
Fibroblast
Aktivasi &Proliferasi
Collagen secreting myofibroblast
↑ kolagen tipe I
Inflamasi
Makrofag
Monosit
PDGF BB PDGF AA
RA kardiak Sel T
Fibrosis Miokard
Keterangan : = diteliti = tidak diteliti
EBD
50 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
3.2 Penjelasan Kerangka Konsep
Pada HAP terjadi volume overload dan memiliki ciri remodeling
pembuluh darah yang menyebabkan peningkatan tekanan darah di sistem arteri
pulmonal dan ventrikel kanan. Volume overload pada ventrikel kanan secara
langsung menyebabkan makrofag dan fibroblast yang berinfiltrasi di jantung
memproduksi renin dan angiotensin-converting enzyme (ACE) secara lokal yang
merupakan stimulan yang poten untuk fibroblast baik secara langsung maupun
melalui efek perantara TGF-β. Pada stres kronis dimana volume overload terjadi
terus menerus, dan TVP tinggi, jantung akan kesulitan memompa darah ke
paru,mengakibatkan rendahnya pula pengisian ke atrium kiri selanjutnya ke
ventrikel kiri. Sebagai konsekwensi penderita sering mengalami cardiac output
yang rendah. Pada keadaan ini sistem RAA sistemik menjadi aktif untuk
mempertahankan tekanan darah. Renin akan mengkatalisa pembentukan
angiotensinogen menjadi angiotensin I, kemudian ACE akan mengubahnya
menjadi angiotensin II. Selanjutnya angiotensin II akan menginduksi NADPH
oksidase, menstimulasi TGF-β1 dan memicu proliferasi fibroblast dan
deferensiasi menjadi collagen-secreting miofibroblasts. Selanjutnya akan
memperbesar produksi kolagen intersisial (terutama kolagen tipe I).
Inflamasi juga akan merangsang sel T dan makrofag untuk memproduksi
sitokin-sitokin diantaranya TGF-β1 yang memiliki efek kemoatraktif terhadap
monosit. Melalui monosit, TGF-βs dapat menginduksi IL-1, PDGFs, FGFs dan
TNFs. PDGFs memiliki 3 bentuk yakni PDGF AA, PDGF BB dan PDGF AB.
PDGF AA dan BB akan menstimulasi proliferasi fibroblast miokardiak dengan
51 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
hasil akhir yakni peningkatan kolagen intersisial, fibronektin dan proteoglikan.
PDGF BB juga memiliki aktifitas mitomiosis sehingga dapat memicu terjadinya
hipertrofi miosit otot jantung.
Ekstrak buah delima memiliki kandungan bahan aktif asam ellagic yang
memiliki efek anti inflamasi, anti proliferasi antioksidan. Asam ellagic dalam
ekstrak buah delima juga memiliki efek sebagai penghambat ACE . Pemberian
ekstrak buah delima pada kasus HAP diharapkan dapat menurunkan kejadian
fibrosis ventrikel kanan yang diamati dari penurunan jumal sel yang mengekspresi
TGF-β1 dan kolagen tipe I.
3.3 Hipotesis Penelitian
a. Pemberian EBD akan menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-
β1 pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal
b. Pemberian EBD akan menurunkan jumlah sel yang mengekspresi
kolagen tipe I pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
52 KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Desain Penelitian
Penelitian ini menggunakan desain laboratoris eksperimental dengan
rancangan randomized post-test only control group. Dengan pertimbangan
kelompok penelitian berasal dari satu populasi, berumur dan berjenis kelamin
sama, serta berasal dari varian yang sama. Sampel dikelompokkan secara acak,
diberikan perlakuan bersama kelompok kontrol. Variabel diukur pada akhir
pengamatan selama kurun waktu tertentu. Pengelompokan sampel dilakukan
secara random seperti pada gambar di bawah ini.
Gambar 10. Bagan Rancangan Penelitian
S
Monokrotalin
RA
K2 O3
O1K1 2 Minggu
E1
E2 O4
O22 Minggu
4 Minggu
4 Minggu
53 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Keterangan :
S : Sampel, tikus putih.
RA : Random Allocation.
CMC : Carboxy methyl cellulose
EBD : Ekstrak buah delima
K1 : Kelompok tikus model sebagai kelompok kontrol yang
hanya mendapatkan CMC selama 2 minggu.
K2 : Kelompok tikus model sebagai kelompok kontrol yang
hanya mendapatkan CMC selama 4 minggu
E1 : Kelompok tikus model HAP sebagai kelompok
eksperimen/perlakuan yang mendapatkan CMC dan ekstrak buah
delima selama 2 minggu.
E2 : Kelompok tikus model HAP sebagai kelompok
eksperimen/perlakuan yang mendapatkan CMC dan ekstrak buah
delima selama 4 minggu.
O1 : Observasi pada kelompok K1
O2 : Observasi pada kelompok E1
O3 : Observasi pada kelompok K2
O4 : Observasi pada kelompok E2
Monokrotalin diinjeksikan kepada tikus di kelompok K1, K2, E1 dan E2 untuk
menginduksi terjadinya hipertensi arteri pulmonal. Ekstrak buah delima diberikan
pada kelompok E1 dan E2. Pada kelompok kontrol dan perlakuan, semua
54 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
mendapatkan CMC. Pengamatan luaran dilakukan pada hari ke-14 pada kelompok
K1 dan E1 serta pada hari ke-28 pada kelompok K2 dan E2.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
4.2.1 Tempat Penelitian
1. Inkubasi dan perlakuan tikus dilakukan pada laboratorium Biokimia Fakultas
Kedokteran Universitas Airlangga.
2. Pembuatan slide dan pemulasan Hematoxilen-Eosin dan pengecatan Trichrome
Masson dilakukan pada Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran
Universitas Airlangga.
3. Pemulasan Imunohistokimia dan digital imaging dilakukan pada
Laboratorium Biokimia-Biomolekuler Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya.
4.2.2 Waktu penelitian
Penelitian akan dilaksanakan sesuai dengan jadwal sebagai berikut:
Kegiatan Bulan ke-
1 2 3 4 5 6 7
1. Perbaikan proposal √
2. Pemesanan bahan penelitian √ √
3. Penelitian √
4. Penyusunan laporan penelitian √ √
5. Presentasi hasil penelitian √
55 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4.3 Populasi dan sampel penelitian
4.3.1 Populasi
Populasi pada penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) strain
Sprague Dewley berkelamin jantan berumur 3 bulan dengan berat badan 300-500
gram. Usia tikus 3 bulan setara dengan usia manusia 7,5 tahun (Andreollo dkk.,
2012). Pemilihan usia tikus 3 bulan berdasarkan pertimbangan bahwa :
1. Tikus masih dalam kategori anak bila dikonversikan pada usia
manusia.
2. Tikus cukup besar sehingga lebih memudahkan proses pengukuran
tekanan areri pulmonalis.
3. Memiliki daya tahan / survival yang cukup baik sehingga tidak mati
sebelum masa perlakuan selesai.
Tikus didapatkan di Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan, Universitas
Gajah Mada, Yogyakarta. Tikus dipelihara dan diadaptasi di Laboratorium
Biokimia, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, Surabaya.
4.3.2 Sampel Penelitian
Sampel pada penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) strain
Sprague Dewley jantan berumur 3 bulan dengan berat badan 300-500 gram yang
telah disapih dari induknya dan diadaptasi sejak 1 minggu sebelum dilakukan
randomisasi. Model tikus yang digunakan adalah tikus yang diperkirakan
mengalami hipertensi arteri pulmonal setelah mendapat suntikan monokrotalin
pada tikus kelompok K1, K2, E1 dan E2.
56 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4.3.3 Penghitungan Besar Sampel
Besar sampel ditentukan berdasarkan jumlah ulangan atau replikasi dengan
menggunakan rumus Steel R & Tavia,1980, Higgins & Kleinbaum 1987 sebagai
berikut :
Keterangan :
n : Replikasi
Zα : 1,645 (Bila α = 0,05)
Zβ : 0,842 (Bila β = 0,20)
σ : Simpangan baku kelompok kontrol (6,78)
d : Selisih nilai rerata kolagen kelompok kontrol dan perlakuan
(20,16 – 8,93) (Lopez-Reyes dkk., 2008).
f : Jumlah hewan coba yang drop out sebesar 20%
Berdasarkan hasil penghitungan, jumlah replikasi untuk setiap kelompok
perlakuan minimal 5 ekor. Bila diperhitungkan dengan faktor koreksi maka
jumlah replikasi untuk masing-masing kelompok perlakuan adalah 6 ekor tikus
1
1 - f x
2σ2(Z1-α/2 + Z1-β)2
d2 n ≥
57 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
putih. Bila terdapat 4 kelompok perlakuan, maka dibutuhkan sebanyak 24 ekor
tikus putih.
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1. Variabel Bebas
Pemberian ekstrak buah delima
4.4.2 Variabel Tergantung
Hambatan terjadinya fibrosis ventrikel kanan
4.4.3 Variabel Antara
1. Jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1
2. Jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I
4.4.4 Variabel Kendali
1. Jenis kelamin, strain dan umur
2. Tatalaksana pemeliharaan
3. Metode dan alat pemeriksaan
4. Dosis dan cara pemberian perlakuan
4.5 Definisi Operasional :
1. Tikus putih adalah tikus putih jenis Sprague Dawley jenis kelamin
jantan, berumur sekitar 3 bulan dengan berat badan 300 – 500 gram yang
diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan Universitas Gajah Mada,
Yogyakarta.
58 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
2. Hewan model adalah tikus putih yang telah di induksi
monokrotalin.
3. Monokrotalin adalah suatu alkaloid pyrrolizidine berasal dari
Crotalaria spectabilis. Monokrotalin dapat menyebabkan sindrom vaskular paru
pada tikus yang ditandai dengan terjadinya proliferasi vaskulitis paru, hipertensi
arteri paru dan kor pulmonal. Dosis yang diperlukan untuk membuat tikus model
HAP yakni 60 mg/kg disuntik secara subkutan, (Miyauchi dkk., 1993; Kay dkk.,
1982). Berdasarkan penelitian pendahuluan, HAP mulai terjadi setelah hari ke 3
pemberian monokrotalin.
4. Ekstrak buah delima adalah hasil ekstraksi seluruh bagian buah
delima (Punica granatum L) dalam bentuk serbuk dan telah terstandarisasi
mengandung 40% ellagic acid. Dosis ekstrak buah delima adalah jumlah ekstrak
buah delima yang diberikan kepada subjek penelitian, yaitu sebesar 150 mg/kg
BB/hari sesuai dengan dosis AE sebesar 60 mg/kg BB/po/hari (Devipriya dkk.,
2007).
5. Lama pemberian ekstrak buah delima adalah lamanya waktu
pemberian ekstrak buah delima pada hewan model , yaitu selama 2 dan 4 minggu.
Pemberian ekstrak buah delima dilakukan 3 hari setelah tikus disuntik
monokrotalin subkutan.
6. Ekspresi TGF-β1 adalah penilaian positif pemeriksaan preparat
menggunakan teknik imunohistokimia antibodi monoklonal anti TGF-β1.
Penilaian dilakukan secara kuantitatif visual dengan mikroskop cahaya dengan
pembesaran 400 kali terhadap sel penyusun otot jantung ventrikel kanan yang
59 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
mengekspresikan TGF-β1. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang
imunoreaktif yang terwarnai coklat pada membran sel atau sitoplasma. Jumlah
seluruh sel imunoreaktif dimasukkan sebagai data. Skala data untuk TGF-β1
adalah ratio. Evaluasi ekspresi TGF-β1 dilakukan oleh tenaga terlatih di
Laboratorium Biologi Molekuler, Universitas Brawijaya
7. Ekspresi Kolagen tipe I adalah penilaian positif pemeriksaan
preparat dengan teknik imunohistokimia menggunakan antibodi monoklonal anti
kolagen tipe I. Penilaian dilakukan secara kuantitatif visual dengan mikroskop
cahaya dengan pembesaran 400 kali terhadap sel fibroblast yang yang
mengekspresikan kolagen tipe I. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang
imunoreaktif yang terwarnai coklat pada membran sel atau sitoplasma. Jumlah
seluruh sel imunoreaktif dimasukkan sebagai data. Hasil dinyatakan positif
apabila terdapat warna coklat pada sitoplasma sel otot ventrikel kanan. Evaluasi
ekspresi kolagen tipe I dilakukan oleh tenaga terlatih di Laboratorium Biologi
Molekuler, Universitas Brawijaya, Malang.
8. Hambatan fibrosis ventrikel kanan adalah hambatan terjadinya
fibrosis ventrikel kanan tikus model HAP yang ditandai dengan menurunnya TGF
–β1 sebagai sitokin profibrogenik utama, dan kolagen tipe I sebagai komponen
utama penyusun jaringan fibrotik pada matriks ekstraseluler.
60 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4.6 Bahan dan Alat Penelitian
4.6.1 Bahan Penelitian
4.6.1.1 Ekstrak Buah Delima
Ekstrak buah delima pada penelitian ini adalah Ekstrak buah delima yang
terstandar dengan kandungan ellagic acid 40 % . Ekstrak buah delima diproduksi
oleh Xi’an Biof Bio-Technology Co., Ltd. (Room 1-1111, High-tech Venture
Park, No. 69 Jinye Road, Gaoxin Distric of Xi’an, People Republic of China).
4.6.1.2 Bahan Pembuatan Hewan Model
Bahan penelitian yang diperlukan dalam penelitian ini adalah tikus putih
Sprague Dawley, kandang yang memenuhi standar (1 kandang untuk 1 tikus),
pakan dan air minum standar, obat untuk pembiusan yaitu ketalar, diazepam, obat
untuk desinfeksi yaitu alkohol 70%, betadine solution. Obat untuk membuat
hipertensi arteri pulmonalis pada hewan model yang digunakan dalam penelitian
ini adalah: monokrotalin dari Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd No.11
Building, No.388 Rongtaidadao CNSTP Wenjiang Zone, Chengdu, Sichuan,
611130 China.
4.6.1.3 Bahan Pemeriksaan Laboratorium
Bahan yang digunakan dalam penlitian ini adalah: monokrotalin, ddH2O,
NaCl (Merck) untuk menginduksi HAP pada hewan model. Bahan untuk
pembuatan preparat pada penelitian ini yang nantinya akan diperiksa dengan
teknik imunohistokimia adalah jaringan otot jantung ventrikel kanan, antibodi
monoklonal terhadap TGF-β1 dan antibodi spesifik terhadap kolagen tipe I,
61 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
hematoksilin eosin, aseton, xylol, alkohol 100%, alkohol 90%, alkohol 80%,
alkohol 70%, aquadestilata, phosphate buffer saline (PBS), streptavidin biotin
peroxidase, H2O2 0,5%, tripsin 3% dan substrat.
4.6.2 Alat Penelitian
4.6.2.1 Alat untuk Pembuatan Hewan Model
Meja operasi, spuit 3 ml.
4.6.2.2 Alat untuk Perlakuan Hewan Model
Alat yang digunakan untuk perlakuan terhadap hewan model yakni alat
untuk memasukkan bahan yaitu sonde lambung no 10 F, spuit 10 cc, dan mortar
untuk mencampur bahan serta air steril, tabung ukur (10, 50 100 dan 1000 mL).
4.6.2.3 Alat Untuk Pengukuran Tekanan Arteri Pulmonalis dan
Pemeriksaan Laboratorium
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: hand-scoon steril,
masker, spuit disposibel 1 cc (tuberculin), 5 cc, 10 cc merk Syringe, pipet plastik
sekali pakai, alat bedah minor,spreader kecil, kassa steril, intravenous catheter
16G,20G, selang oksigen, tabung oksigen beserta manometernya, 1 set monitor
merk DASH 5000, timbangan digital merk OHAUS (AR 140), mikropipet (1-
10µL, 20-100µL, 200-1000µL, 50-5000µL), hood steril, sentrifugasi dingin 4oC,
sentifugasi biasa, tabung 1,5 mL. Alat yang diperlukan untuk mengamati ekspresi
TGF-β1 dan ekspresi kolagen tipe 1 adalah gelas objek, mikropipet, inkubator dan
mikroskop cahaya Sony Nex7 digital imaging for mikroskop, mikrometer objektif,
mikrometer okuler.
62 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data
Data hasil penelitian yang dikumpulkan merupakan data primer. Penelitian
dilakukan di laboratorium yang standar, mempunyai peralatan lengkap dan
pengalaman yang memadai dalam pembuatan dan pemeliharaan hewan coba agar
reliabilitas dan validitas hasil terjamin.
Reliabilitas dan validitas penelitian akan dicapai melalui langkah-langkah
sebagai berikut:
1. Peneliti menggunakan tenaga peneliti atau tenaga laboratorium
yang sama untuk menjamin reliabilitas pada evaluasi obyek pengamatan yang
sama.
2. Dipilih alat dan bahan uji yang mempunyai sensitivitas dan
spesifitas yang tinggi, konsisten dan dapat dipertanggungjawabkan untuk
menjamin validitas pada penilaian variabel penelitian,
3. Peneliti mengelola, mengawasi dan memantau berbagai tahap
pelaksanaan penelitian meliputi pengadaan hewan coba, perlakuan pada hewan
coba, penilaian gejala, pengambilan spesimen, pengadaan bahan, pemakaian dan
pemeliharaan bahan dan alat, pemeriksaan spesimen dan pengumpulan data
penelitian.
4. Penelitian ini adalah bagian dari penelitian utama oleh Rahman
yang berjudul “Mekanisme Kerja Buah Delima Dalam Menghambat Fibrosis
Tunika Adventisia Arteri Pilmonalis Melalui Ekspresi TGF –β1, Rasio MMP-
1/TIMP-1, Kolagen Tipe I dan Tebal Fibrosis Pada Tikus Sprague Dawley Yang
Mengalami Hipertensi Arteri Pulmonalis”. Penelitian dilaksanakan setelah
63 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
proposal penelitian utama telah mendapatkan kelayakan etik dari komisi etik
penelitian.
4.8 Cara Pengolahan dan Analisis Data
Pengumpulan data dilakukan dalam lingkungan yang terkontrol dan
terkendali dengan pertimbangan semua kondisi diusahakan sama dan dapat
dikendalikan. Urutan analisis data:
a. Uji Normalitas menggunakan Saphiro Wilk pertama kali dilakukan
untuk menguji bahwa variabel yang diperiksa dalam penelitian ini
berdistribusi normal.
b. Apabila data berdistribusi normal maka dilanjutkan dengan Uji
Levene untuk menguji homogenitas
c. Apabila data berdistribusi normal dan homogen, maka akan
diteruskan dengan Uji Analisis of Varians (ANOVA). Uji ini
digunakan untuk melihat adakah perbedaan rerata Ekspresi TGF-β1
maupun Kolagen tipe I pada keseluruhan kelompok.
d. Uji Komparasi Ganda atau Least Significans Difference (LSD)
dilakukan setelah ANOVA. Uji ini digunakan untuk
membandingkan rerata Ekspresi TGF-β1 maupun Kolagen tipe I
pada antara kelompok satu dengan kelompok yang lain
e. Apabila pada uji normalitas data berdistribusi tidak normal, maka
dilanjutkan d engan Uji Kruskal Wallis untuk melihat adakah
perbedaan rerata Ekspresi TGF-β1 maupun Kolagen tipe I pada
keseluruhan kelompok.
64 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
f. Uji Mann Whitney selanjutnya digunakan untuk membandingkan
rerata Ekspresi TGF-β1 maupun Kolagen tipe I pada antara
kelompok satu dengan kelompok yang lain.
Tingkat kemaknaan uji statistik yang dipergunakan dalam penelitian ini sebesar
0,05. Data yang telah dikumpulkan diolah secara manual dan menggunakan
perangkat lunak program komputer.
65 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4.9 Alur Penelitian
Gambar 11. Alur Penelitian
Terminasi
Pengukuran tekanan arteri pulmonalis pada
minggu ke 2
Injeksi monokrotalin
Tikus putih Sprague Dawley
Analisis Data
Evaluasi Ekspresi TGF-β1, Kolagen tipe I
Pembuatan Slide
Pengambilan organ
Randomisasi
Kelompok K1
Kelompok E1
Kelompok K2
Kelompok E2
Pengukuran tekanan arteri pulmonalis pada
minggu ke 4
66 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4.10 Pelaksanaan Penelitian
4.10.1 Persiapan Penelitian
a. Ekstrak buah delima terstandar mengandung 40% asam ellagic
Standarisasi Ekstrak Buah Delima
Ekstrak buah delima terstandart yang mengandung 40 % ellagic acid
diproduksi oleh Xi’an Biof Bio-Technology Co., Ltd. (Room 1-1111, High-tech
Venture Park, No. 69 Jinye Road, Gaoxin Distric of Xi’an, People Republic of
China).
Persiapan Sediaan Uji
Ekstrak buah delima terstandar yang akan diberikan pada hewan coba
disuspensikan dengan sodium carboxy methyl cellulose (CMC) 0,3% di dalam
mortar agar homogenitas larutan terjaga. Sediaan selalu dibuat baru sebelum
diberikan. Pembuatan sodium CMC 0,3% dilakukan dengan cara menaburkan
sodium CMC sebanyak 0,3 gram dalam aquades panas 100 ml dan diaduk dengan
bantuan magnet stirrer sampai larut.
Berdasarkan dosis EA sebesar 60 mg/kgBB/po/hari (Devipriya dkk., 2007),
maka dosis ekstrak buah delima terstandart yang mengandung 40% EA adalah :
40/100 = 60/a
40a = 6000
a = 150 mg/kgBB/po/hari
67 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Pembuatan sediaan untuk 12 ekor tikus yang mendapatkan perlakuan
ekstrak buah delima, dibuat sediaan baru setiap hari dengan cara sebagai berikut :
sebanyak 300 mg ekstrak buah delima disuspensikan dalam sodium CMC 0,3%
sebanyak 20 ml, sehingga diperoleh kadar ekstrak 15 mg/ml. Untuk tikus dengan
berat badan 300 gram, dengan dosis ekstrak 150 mg/kg BB, diperlukan 45 mg
ekstrak atau 3 ml suspensi ekstrak buah delima terstandart. Pemberian sodium
CMC dilakukan dengan volume yang sama. Volume pemberian = berat badan
tikus/1000 x dosis ekstrak
b. Persiapan Hewan Coba
Tikus putih sebagai hewan coba diadaptasikan selama 1 minggu,
diperlakukan dan dibagi berdasarkan kelompoknya seperti yang tertera dalam
rancangan percobaan. Dalam penelitian ini terdapat 4 kelompok perlakuan yang
masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus.
4.10.2 Pembuatan Hewan Model HAP
Pada penelitian ini digunakan 24 ekor tikus putih Sprague Dawley jantan,
berumur sekitar 3 bulan yang memiliki berat antara 300-500 gram. Tikus- tikus
tersebut disiapkan sebagai hewan model hipertensi arteri pulmonalis dengan
diberikan suntikan larutan monorotalin subkutan 60 mg/kg berat badan
(Biopurify Chengdu China).
68 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4.10.3 Perlakuan Terhadap Hewan Coba
a. Pemberian CMC dan EBD
Hewan coba dikelompokkan secara random ke dalam 2 kelompok
perlakuan yaitu 12 ekor tikus kelompok kontrol (CMC) dan 12 ekor tikus
kelompok eksktrak buah delima (CMC+EBD). Masing-masing kelompok diberi
perlakuan setelah 3x24 jam suntikan monokrotalin kemudian diamati setelah 2
minggu dan 4 minggu. Semua tikus diberi anestesi ketamin 50 mg/kg dan
dormicum 0,5 mg/kg subkutan sebelum pengukuran tekanan arteri pulmonalis dan
kemudian dikorbankan dengan melakukan exanguinasi.
a. Pengukuran Tekanan Arteri Pulmonalis
Pengukuran tekanan arteri pulmonalis dilakukan setelah 14 hari dan 28 hari
penyuntikan monokrotalin subkutan pada masing-masing kelompok. Langkah
pertama yakni pembiusan tikus model menggunakan ketamin dosis 0,5 mg/kg BB
dan midazolam 0,5 mg/kg BB secara intramuskular pada otot paha. Kemudian
peneliti melakukan intubasi dengan kateter intravena nomor 16 dengan cara
trakeostomi, kemudian dihubungkan dengan threeway dan selang oksigen aliran
0,5 liter/menit dan diberikan tekanan positif periodik. Selanjutnya dilakukan
torakotomi lateral kiri setinggi sela iga 3-4,diperlebar dengan spreader,tampak
jantung. IV catheter 20G ditusukkan ke jantung setinggi jalan keluar ventrikel
kanan dibawah katup arteri pulmonalis,dimasukkan sampai arteri pulmonalis
utama. Selanjutnya dihubungkan dengan selang monitor pengukur tekanan Dash
5000. Pada layar monitor akan tampak gelombang tekanan arteri pulmonalis fase
69 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
sistolik dan diastolik. Pencatatan tekanan arteri pulmonalis dilakukan minimal 3
kali, dipilih gambaran tekanan terbaik dan dihitung reratanya.
4.10.4 Pengambilan Jaringan Jantung
Pengambilan jaringan jantung dilakukan setelah hewan coba dieutanasia
dengan eksanguinasi. Organ jantung dibersihkan dari sisa darah,
ditimbang,kemudian dimasukkan ke dalam wadah berisi formalin buffered 10%.
Jaringan jantung disiapkan sebagai bahan pemeriksaan terhadap eksprpesi, TGF-
β1 dan kolagen tipe I dengan teknik imunohistokimia.
4.10.5 Perlakuan Terhadap Sampel
Jantung tikus putih difiksasi untuk pemeriksaan histologi dengan
memasukkan formalin buffered 10% (pH 7,2) dengan tekanan konstan kemudian
diligasi dan dibiarkan 1 jam untuk mempertahankan inflasi. Kemudian jantung
dieksisi dan difiksasi lagi dengan formalin buffered netral 10% selama 24 jam.
a. Pembuatan Sediaan Histologi Ventrikel Kanan
Pembuatan sediaan histologi jaringan jantung menurut teknik pembuatan
sediaan. Jantung yang telah direndam dalam buffer formalin 10 % selama 24 jam,
dipotong-potong dengan tebal kira-kira 0,5 mm. Potongan-potongan tersebut
dimasukkan ke dalam kantong strimin. Untuk identitas sampel, masing-masing
kantong diberi nomor sampel, tanggal dan lain-lain. Masing-masing kantong
selanjutnya dimasukkan kedalam larutan berikut secara berurutan dan dalam
waktu yang sudah ditentukan. Proses ini meliputi tahap dehidrasi, clearing,
impregnasi dan embedding.
70 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Pada tahap dehidrasi, potongan organ jantung dimasukkan ke dalam alkohol
70% selama 1 jam, kemudian dipindah ke dalam alkohol 80 % selama 1 jam,
selanjutnya dimasukkan ke dalam alkohol 95% selama 2 jam, lalu dimasukkan ke
dalam alkohol 95% selama 1 jam, dan untuk 3 jam berikutnya masing masing
dimasukkan ke dalam alkohol 100% selama @1 jam.
Pada proses clearing, potongan organ jantung yang sudah melewati proses
dehidrasi dimasukkan ke dalam cairan xylol selama 1 jam, kemudian diulang lagi
dimasukkan xylol selama 1 jam, lalu dimasukkan ke dalam xylol lagi selama 2
jam.
Pada proses impregnasi, potongan organ jantung yang sudah melewati
proses clearing dimasukan ke dalam parafin (56-58oC) selama 2 jam. Proses ini
diulang hingga 3 kali.
Proses terakhir yakni embedding. Pada proses ini potongan organ jantung
diblok ke dalam parafin dan dibiarkan sampai dingin. Dipotong dengan ketebalan
5 µm dengan mikrotom, kemudian dimasukkan ke dalam waterbath 50°C dan
ditempelkan pada gelas objek. Selanjutnya dipanaskan lagi untuk mencairkan
parafin, kemudian dilakukan pewarnaan.
b. Pembuatan Preparat Imunohistokimia
Untuk pembuatan preparat dengan metode imunohistokimia, jaringan
jantung difiksasi dengan buffer formalin 10% selama 24 jam. Selanjutnya jaringan
dipotong dan dilakukan embeding dengan parafin untuk selanjutnya dipotong
dengan ketebalan 5 µm dan difiksasi pada gelas objek sebagai slides.
K1 E1 K2 E2
71 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Teknik pewarnaan imunohistokimia yang digunakan adalah teknik biotin
streptavidin dengan langkah-langkah sebagai berikut :
1. Dewax slide dalam xilol dan alkohol absolut selama 5 menit
2. Mencuci dengan air mengalir
3. Menempatkan slides dalam phosphate buffer saline (PBS) dan
meletakkannya dalam waterbath pada suhu 37ºC selama 5 menit.
4. Slides diletakkan pada protease 0,01% dalam PBS pada suhu 37ºC.
5. Memindahkan slides secepatnya ke dalam air dingin.
6. Mencuci slides sebanyak 2 kali dengan PBS selama 5 menit.
7. Menginkubasi jaringan dengan H2O2 0,5% 100 µl selama 5 menit.
8. Menandai lokasi jaringan pada preparat dan mencucinya dengan PBS
selama 5 menit.
9. Menginkubasi jaringan dengan antibodi primer terhadap TGF-β1, dan
kolagen tipe I selama 10 menit.
10. Mencuci jaringan dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit.
11. Menambahkan biotinylated link (anti mouse horseradish peroxidase
lebelled) selama 10 menit.
12. Mencuci jaringan dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit.
13. Menginkubasi jaringan dengan streptavidin horseradish peroxidase selama
10 menit.
14. Mencuci jaringan dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit.
15. Menambahkan 1 tetes deaminobenzydine (DAB) yang mengandung
kromogen dalam 2 ml substrat. Meneteskan campuran tersebut pada
72 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
jaringan dan membiarkannya selama 5 menit, kemudian mencucinya
dengan distiled water selama 5 menit.
16. Mewarnai jaringan dengan Mayer’s haematoxylin selama 2 – 5 menit.
17. Mencuci jaringan dengan air mengalir.
18. Menutup jaringan dengan kaca penutup (deck glass) dan dilem.
19. Ekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I yang positif akan terlihat berwarna
coklat di bawah mikroskop cahaya.
20. Dari setiap pelaksanaan pewarnaan dibuat kontrol positif dan negatif.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
73 KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
BAB V
HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS
5.1 Karakteristik Subjek Penelitian
Dua ekor tikus didapatkan mati pada hari pengamatan ke 7 dan ke 11 dan
keduanya termasuk kelompok kontrol pengamatan masing masing 2 minggu dan 4
minggu. Organ jantung kedua tikus tersebut tetap diambil dan diamati. Berat
badan tikus ditimbang saaat awal sebelum perlakuan dan berat akhir ditimbang
pada akhir pengamatan 2 dan 4 minggu.
Gambar 12. Berat Badan Tikus Model. Penurunan berat badan lebih terlihat pada kelompok yang dilakukan terminasi pada minggu ke 4.
K 1
K 2
E 1
E 2
Waktu Pengukuran
BB awal BB akhir
Ber
at B
adan
(g)
74 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Tabel 6. Berat Badan Tikus Model
Kelompok BB Awal BB Akhir
P Mean ± SD (Min-Maks)
Mean ± SD (Min-Maks)
K 1 303.83 ± 37.46 (265-355)
294.00 ± 39.81 (236-351)
0.457
E 1 312.50 ± 62.40 (262-433)
318.50 ± 66.46 (254-311)
0.172
K 2 319.00 ± 26.57 (285-351)
294.40 ± 53.23 (220-357)
0.453
E 2 300.33 ± 18.55 (280-327)
275.33 ± 33.57 (220-311)
0.064
P 0.663 0.531
Penurunan berat badan terlihat pada kelompok yang dilakukan terminasi
pada minggu ke 4 namun tidak berbeda bermakna secara statistik. Tidak
didapatkan perbedaan berat badan bermakna antara kelompok K1, E1, K2,
maupun E2 pada awal maupun akhir penelitian, dan juga tidak didapatkan
perbedaan bermakna antara berat badan awal dengan akhir pada tiap-tiap
kelompok.
Pengukuran tekanan arteri pulmonalis dilakukan seperti cara yang telah
dijelaskan pada metode penelitian. Rerata tekanan sistolik dan diastolik arteri
pulmonalis pada kelompok tikus model yang mendapat terapi EBD lebih rendah
dibandingkan rerata tekanan sistolik dan diastolik arteri pulmonalis kelompok
tikus model kontrol dan berbeda bermakna (p = 0,002), baik pada pengamatan 2
minggu maupun pada pengamatan 4 minggu, begitu pula rerata tekanan arteri
pulmonalisnya (MAP = Mean Arterial Pressure), seperti yang tertera pada tabel
dan gambar berikut.
75 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Tabel 7. Rerata Tekanan Sistolik dan Diastolik Arteri Pulmonalis
Kelompok
TD sistolik TD diastolik Mean ± SD (Min-Maks)
Mean ± SD (Min-Maks)
K 1 66,64 ± 11,07a
(45,9 - 79,1) 37,90 ± 4,26a
(30,9 - 42,8)
E 1 41,47 ± 13,47b (20,5 - 57,4)
20,62 ± 7,25b
(10,7 - 32,6)
K 2 65,03 ± 5,50a (59,5 - 71,4)
37,28 ± 7,99a
(26,9 - 44,1)
E 2 44,73 ± 12,66b
(26,0 - 60,6) 26,28 ± 9,15b
(13,7 - 38,2)
p 0,002 0,002 Keterangan : absuperscript yang berbeda menunjukkan ada perbedaan bermakna antar kelompok berdasarkan uji komparasi ganda LSD (p < 0,05). Rerata tekanan sistolik dan diastolik antara kelompok E1 dan E2 lebih
rendah daripada kelompok kontrol K1 dan K2. Tidak didapatkan perbedaan
bermakna rerata tekanan sistolik dan diastolik antar kelompok kontrol K1 dengan
K2 dan antar kelompok perlakuan E1 dengan E2.
Gambar 13. Rerata Tekanan Sistolik dan Diastolik Arteri Pulmonalis. Rerata tekanan arteri pulmonalis tikus model yang mendapat ekstrak buah delima lebih rendah dibandingkan kontrol.
Kelompok
Tek
anan
Dar
ah (m
mH
g)
K1 E1 K2 E2
76 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Tabel 8. Rerata Tekanan Arteri Pulmonalis (mPAP =Mean Artery Preasure)
Kelompok
mPAP Mean ± SD (Min-Maks)
K 1 47,8 ± 5,58a
(39,03 - 53,63)
E 1 27,57 ± 9,17b (13,97 - 40,87)
K 2 46,53 ± 5,53a (40,50 - 53,20)
E 2 32,43 ± 9,64b
(20,47 - 41,67)
p 0,0001 Keterangan: * signifikan pada α=0,05absuperscript yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan antar kelompok berdasarkan uji komparasi ganda LSD (p < 0,05). Rerata tekanan arteri pulmonalis antara kelompok E1 dan E2 lebih rendah
daripada kelompok kontrol K1 dan K2. Tidak didapatkan perbedaan bermakna
rerata tekanan arteri pulmonalis antar kelompok kontrol K1 dengan K2 dan antar
kelompok perlakuan E1 dengan E2.
Gambar 14. Rerata Tekanan Arteri Pulmonalis. Rerata tekanan arteri pulmonalis tikus model yang mendapat ekstrak buah delima lebih rendah dibandingkan kontrol
0
10
20
30
40
50
60
K1 E1 K2 E2
mPAP
Kelompok
Tek
anan
Dar
ah (m
mH
g)
77 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Rerata tekanan arteri pulmonalis (Mean Pulmonary Arterial Pressure =
mPAP) dihitung dengan rumus 1x tekanan sistolik + 2x tekanan diastolik, di bagi
3. Rerata tekanan arteri pulmonalis kelompok yang mendapat EBD yakni E1 dan
E2 lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol K1 dan K2 dan lebih kecil
dibandingkan tikus model HAP pada penelitian Shen tahun 2011. Tikus Sprague
Dawley memiliki rerata tekanan arteri pulmonalis 22.6 ± 2.4 mmHg pada keadaan
normal, dan meningkat menjadi 40.4 ± 5.0 mmHg pada saat terjadi HAP akibat
monokrotalin (Shen dkk., 2011).
5.2 Gambaran Histopatologi Otot Jantung Ventrikel Kanan
5.2.1 Ekspresi TGF-β1 dan Kolagen Tipe I
Teknik imunohistokimia digunakan untuk memeriksa ekspresi TGF-β1
dan kolagen tipe I pada otot jantung ventrikel kanan. Identifikasi ekspresi TGF-β1
dan kolagen tipe I bertujuan untuk mengamati proses inflamasi yang disertai
fibrogenesis pada jaringan otot jantung ventrikel kanan pada kelompok kontrol
maupun perlakuan.
Gambaran imunohistokimia menunjukkan sel yang mengekspresikan
protein yang diperiksa berwarna coklat, sedangkan sel yang tidak
mengekspresikan protein yang diperiksa tidak berwarna coklat (transparan).
Warna coklat disebabkan karena reaksi protein yang diperiksa dengan antibodi
spesifiknya. Perhitungan sel dilakukan pada 10 lapang pandang besar preparat
dengan menggunakan pembesaran 400x dan disajikan reratanya. Hasil
pemeriksaan preparat dengan teknik imunohistokimia menunjukkan bahwa pada
78 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
hewan model HAP yang mendapat ekstrak buah delima memiliki ekspresi TGF-
β1 dan kolagen tipe I yang lebih sedikit dibandingkan kelompok kontrol.
Gambar 15. Ekspresi TGF-β1 pada Otot Jantung Tikus Model. Masing–masing merupakan kelompok K1 (A), E1 (B), K2 (C), dan E2 (D) pada pembesaran 400x. Anak panah menunjukkan sel yang mengekspresi TGF-β1 pada otot jantung ventrikel kanan. Ekspresi kuat terjadi pada kelompok K1 dan K2 dan terlihat lebih sedikit pada kelompok yang mendapat ekstrak buah delima E1 dan E2.
D
B
C
A A
79 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Gambar 16. Ekspresi Kolagen Tipe I pada Otot Jantung Tikus Model. Masing-masing merupakan kelompok K1 (A), E1 (B), K2 (C), dan E2 (D) pada pembesaran 400x. Anak panah menunjukkan sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada otot jantung ventrikel kanan. Ekspresi kuat terjadi pada kelompok K1 dan K2 dan terlihat lebih sedikit pada kelompok yang mendapat ekstrak buah delima E1 dan E2.
5.3 Analisis Hasil Penelitian
5.3.1 Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen Tipe I
Uji normalitas data jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen
tipe I pada setiap kelompok dengan menggunakan Saphiro-Wilk menunjukkan
bahwa data yang diperoleh berdistribusi normal. Kemudian dilanjutkan dengan uji
homogenitas Levene dan hasilnya menunjukkan bahwa data homogen. Karena
data berdistribusi normal dan homogen, selanjutnya dilakukan uji ANOVA dan
LSD.
A
D
B
C
80 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Tabel 9. Rerata Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen tipe I pada Tikus Model HAP
Kelompok
TGF-β1 Kolagen tipe I Mean ± SD (Min-Maks) Mean ± SD (Min-Maks)
K 1 9,17 ± 0,53a
(8,64 – 9,7) 10,83 ± 0,477a
(10,353 – 11,307)
E 1 6,33 ± 0,422b (5,908 – 6,752)
8,00 ± 0,447b
(7,553 – 8,447)
K 2 12,83 ± 1,302c (11,528 – 14,132)
14,17 ± 0,910c
(13,26 – 15,08)
E 2 6,33 ± 1,085b
(5,245 – 7,415) 6,67 ± 0,615b
(6,055 – 7,285)
p <0,0001 <0,0001 Keterangan : abcsuperscript yang berbeda menunjukkan ada perbedaan bermakna antar kelompok berdasarkan uji komparasi ganda LSD (p < 0,05). Kelompok K2 memiliki rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan
kolagen tipe I lebih tinggi dari pada kelompok K1 dan bermakna secara statistik.
Rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I pada kelompok
E1 dan E2 lebih rendah daripada Kelompok K1 dan K2 dan bermakna secara
statistik. Tidak didapatkan perbedaan bermakna secara statistik rerata jumlah sel
yang mengekspresi TGF-β1dan kolagen tipe I pada kelompok E1 dan E2.
81 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Gambar 17. Rerata Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1 dan Kolagen tipe I. Kelompok yang mendapat ekstrak buah delima memiliki rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dan kolagen tipe I lebih rendah dibanding kontrol.
a. Jumlah Sel yang Mengekspresi TGF-β1
Rerata jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 dari pada kelompok K2
lebih tinggi dibanding kelompok K1 dan bermakna secara statistik. Rerata jumlah
sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok E1 lebih sedikit dibandingkan
kelompok K1 serta K2 dan bermakna secara statistik. Rerata jumlah sel yang
mengekspresi TGF-β1 pada kelompok E2 lebih sedikit dibanding kelompok K1
serta K2 dan bermakna secara statistik. Rerata jumlah sel yang mengekspresi
TGF-β1 pada kelompok E1 tidak berbeda bermakna dengan kelompok E2. Rerata
jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok K1,E1,K2,dan E2 tampak
pada tabel 9 dan gambar 17.
02468
10121416
K1 E1 K2 E2
TGF-β1
Kolagentipe I
Kelompok
Jum
lah
Sel
82 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
b. Jumlah Sel yang Mengekspresi Kolagen Tipe I
Rerata jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok E1
lebih sedikit dibandingkan kelompok K1 serta K2 dan berbeda bermakna secara
statistik. Rerata jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok E2
lebih sedikit dibanding kelompok K1 serta K2 dan bermakna secara statistik.
Rerata jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok E1 tidak
berbeda bermakna dengan kelompok E2. Rerata jumlah sel yang mengekspresi
kolagen tipe I pada kelompok K1,E1,K2,dan E2 tampak pada tabel 9 dan gambar
17.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
83 KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
BAB VI
PEMBAHASAN
6.1 Karakteristik Tikus Model Hipertensi Arteri Pulmonal
Berat badan tikus kontrol menurun pada pengamatan 2 minggu dan 4
minggu namun tidak berbeda bermakna secara statistik. Berat badan tikus yang
mendapat perlakuan EBD tampak meningkat pada pengamatan 2 minggu dan
tampak menurun pada pengamatan 4 minggu namun tidak bermakna secara
statistik. Penurunan berat badan pada kelompok kontrol maupun perlakuan 4
minggu ini diperkirakan akibat tikus mengalami distres akibat kondisi HAP
progresif yang terjadi akibat penyuntikan monokrotalin sehingga mempengaruhi
nafsu makan dan asupan nutrisi ke jaringan. Tikus kontrol tampak lebih lemah,
dan napas lebih cepat, sedangkan tikus yang mendapat EBD tampak relatif lebih
sehat.
Pemilihan waktu evaluasi dan terminasi tikus coba dilakukan pada minggu
ke 2 dan minggu ke 4 berdasarkan (Gomez-Arroyo dkk., 2012; Lai dkk., 1991):
1. Pada penelitian pendahuluan didapatkan HAP sudah terjadi pada hari ke 3
setelah penyuntikan monokrotalin.
2. Peningkatan tahanan paru dan peningkatan ketebalan dinding alveoli
terjadi pada 1 minggu setelah penyuntikan monokrotalin.
3. Hipertrofi ventrikel kanan terjadi setelah minggu ke 3 penyuntikan
monokrotalin
84 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4. Tidak ada perubahan yang bermakna pada tekanan arteri pulmonalis,
ketebalan dinding arteri pulmonalis dan hipertrofi ventrikel kanan setelah
minggu ke empat pemberian monokrotalin.
Sehingga 2 minggu dapat mewakili proses awal fibrogenesis dan 4 minggu
mewakili proses degradasi fibrosis.
Hasil uji rerata tekanan arteri pulmonalis pada ke empat kelompok
menunjukkan rerata tekanan arteri pulmonalis kelompok yang mendapat EBD
yakni E1 dan E2 lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol K1 dan K2 dan
lebih rendah dibandingkan tikus model HAP. Hal ini menunjukkan pemberian
EBD dapat menghambat progresifitas HAP. Hal ini sesuai dengan penelitian oleh
Hanif di India pada tikus model HAP yang diinduksi monokrotalin bahwa pada
tikus yang diberi EBD memiliki tekanan arteri pulmonalis yang lebih rendah
dibandingkan kontrol (Hanif dan Dikshit, 2010).
Pada HAP terjadi perubahan pada pembuluh darah arteri pulmonalis yakni
hipertrofi medial, proliferasi dan fibrosis intima, trombosis in situ dan penebalan
adventitia (Okada dkk., 1998; Shen dkk., 2011). Kandungan bahan aktif asam
ellagic pada ekstrak buah delima memiliki kemampuan menghambat COX
(Corbett dkk., 2010). Hambatan pada COX menyebabkan hambatan rilis serotonin
(5-HT = 5-hydroxytryptamine). Serotonin menstimulasi proliferasi sel otot polos
arteri pulmonal, vasokonstriksi arteri pulmonal, dan mikrotrombosis lokal melalui
reseptor 5-HT dan serotonin reuptake transporter (SERT ) (Shen dkk., 2011).
Hambatan pada serotonin berarti hambatan proliferasi sel otot polos arteri
pulmonal, vasokonstriksi arteri pulmonal dan mikrotrombosis yang akhirnya
85 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
dapat menurunkan tekanan arteri pulmonalis. Hal ini juga didukung penelitian
Hironakaa dan Guignabert bahwa hambatan pada 5-HT dan SERTs dapat
menghambat perkembangan HAP pada tikus model monokrotalin (Hironakaa
dkk., 2003 ; Guignabert dkk., 2005).
Pada HAP terjadi peningkatan ekspresi ACE pada endotel dan neointima
dibanding pada tikus normal (Okada dkk., 1998). Ekstrak buah delima memiliki
efek hambatan pada ACE, menurunkan kadar angiotensin II dan menurunkan
tekanan darah pada tikus model hipertensi (Aviram dan Dornfeld, 2001). Mohan
menemukan bahwa jus buah delima mampu menurunkan kadar angiotensin II
pada tikus Wistar model diabetes (Mohan dkk., 2010). Penelitian Waghulde
mendapatkan hasil bahwa buah delima menurunkan kadar angiotensin II pada
tikus Wistar model hipertensi (Waghulde dkk., 2010). Hambatan terhadap ACE
dapat menghambat hipertrofi medial dan pembentukan neointima sehingga dapat
menurunkan tekanan arteripulmonal (Okada dkk., 1998). Mekanisme pasti cara
kerja buah delima menurunkan kadar angiotensin II masih belum jelas. Penurunan
tersebut diduga merupakan efek antioksidan pada tanin dari buah delima (Gil
dkk., 2000; Aviram dan Dornfeld, 2001).
Pada tikus yang mengalami HAP terjadi peningkatan stres oksidatif dan
peningkatan regulasi sistem enzim oksidase kritikal. Vaskular oksidase seperti
xantin oksidase, NADPH oksidase dan pembentukan SOR di mitokondria
mengatur tonus pembuluh darah, proliferasi intima maladaptatif, proliferasi otot
polos serta memodulasi adaptasi ventrikelkanan terhadap stres akibat peningkatan
afterload yang kronis (Suzuki dkk., 2013). Studi menunjukkan bahwa NADPH
86 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
oksidase memiliki peran penting dalam vasokokonstriksi dan aspek remodeling
pada HAP (Norton dkk., 2013; Wedgwood dkk., 2013). Ekstrak buah delima
memiliki kadar antioksidan yang tinggi melebihi teh dan minuman anggur (Gil
dkk., 2000). Intervensi antioksidan menunjukkan efek protektif dalam eksperimen
HAP (Villegas dkk., 2013). Kandungan efek anti radikal bebas dan antioksidan
polifenol yang tinggi pada EBD terutama asam ellagic ini dapat menghambat
aktifitas NADPH oksidase sehingga menghambat vasokonstriksi pembuluh darah
arteri pulmonalis dan menjaga stabilitas tekanan darah arteri pulmonalis (Lee
dkk., 2010)(Xu dkk., 2003; Tang dkk., 2015).
6.2 Efek Pemberian EBD Terhadap Ekspresi TGF-β1 pada Otot Jantung
Ventrikel Kanan
Pada penelitian ini didapatkan hasil bahwa terdapat lebih banyak jumlah
sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok kontrol 4 minggu (K2) dibanding
kelompok kontrol 2 minggu (K1) yang berbeda bermakna secara statistik, dan
didapatkan lebih sedikit jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok
yang mendapatkan EBD (E1,E2) dibandingkan kontrol (K1,K2) yang berbeda
bermakna secara statistik, namun tidak didapatkan perbedaan bermakna antara
jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada kelompok EBD 2 minggu (E1) dan 4
minggu (E2). Hasil tersebut menunjukkan bahwa :
1. Pemberian monokrotalin pada tikus coba menyebabkan peningkatan TGF-
β1 pada otot jantung.
2. Jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 pada tikus model HAP meningkat
seiring dengan waktu, menunjukkan bahwa HAP bersifat progresif.
87 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
3. Pemberian EBD dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-
β1.
4. Pemberian EBD selama 2 minggu tidak berbeda bermakna dengan
pemberian EBD 4 minggu. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian EBD
dapat menghambat progresifitas HAP, namun masih diperlukan waktu
penelitian yang lebih panjang untuk mengevaluasi efektifitas penggunaan
jangka panjang EBD terhadap progresifitas HAP.
Transforming Growth Factor – β1 telah diketahui memiliki peran dalam
pembentukan HAP. Berkembangnya HAP dipengaruhi oleh ketidakseimbangan
sinyal TGF-β1 pada sel pembuluh darah paru. Kadar TGF-β1 terbukti meningkat
pada HAP (Zaiman dkk., 2008). Transforming Growth Factor – β1 merupakan
sitokin profibrogenik utama dan ekspresi TGF-β1 berlebih berhubungan dengan
progresifitas fibrosis (Wei dkk., 2015).
Fibrosis disebabkan oleh serangkaian peristiwa yang dipicu oleh jejas
kronis, meliputi:
1. Kerusakan epitel / endotel
2. Rilis TGF-β1
3. Rekrutmen sel inflamasi
4. Induksi spesies oksigen reaktif
5. Aktivasi sel penghasil kolagen
6. Aktivasi matriks fibroblast
7. Reversal fibrosis
88 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Kesemua diatas memiliki peran penting dalam pembentukan fibrosis, namun rilis
TGF-β1 merupakan peristiwa kunci dalam patofisiologi fibrosis (Kisseleva dan
Brenner, 2008).
Ekstrak buah delima menghambat fibrosis melalui jalur regulasi sitokin
dengan aktivitas antioksidan, menurunkan kadar TGF-β1 dan menghambat
sintesis kolagen (Wei dkk., 2015). Hambatan sinyal TGF-β1 oleh EBD dapat
dijadikan penanda hambatan terjadinya fibrosis ventrikel kanan akibat HAP. Pada
penelitian ini didapatkan hasil bahwa terdapat lebih sedikit jumlah sel yang
mengekspresi TGF-β1 pada ventrikel kanan tikus model HAP yang mendapat
EBD dibandingkan kontrol. Penurunan kadar TGF-β1 oleh EBD juga ditemukan
oleh Wei dan Yuniarti (Wei dkk., 2015; Yuniarti, 2012). Penelitian Saputro
menunjukkan penurunan ekspresi TGF-β1 pada tikus model luka bakar yang
mendapat EBD (Saputro, 2013). Asam ellagic dan antocyanin merupakan
polifenol terbanyak dalam buah delima (Colombo dkk., 2013). Kandungan asam
ellagic dalam ekstrak buah delima menghambat sinyal TGF-β1 melalui jalur
inflamasi dan jalur angiotensin. Pada jejas jaringan yang timbul pada HAP akibat
monokrotalin maupun shear stress akan memicu inflamasi melalui kaskade
pemecahan asam arakidonat dari membran fosfolipid oleh enzim fosfolipase A2.
Asam arakidonat kemudian diubah oleh enzim cyclooxygenase melalui reaksi
oksidasi untuk memproduksi prostatglandin (Corbett dkk., 2010). Prostatglandin
dan tromboxane A2 (TXA2) keduanya disebut prostanoid dan dibentuk saat asam
arakidonat (AA) dilepaskan oleh pospolipase dan dimetabolisme oleh
prostatglanin G/H sintetase dan COX. Terdapat 4 prostatglandin bioaktif penting
89 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
yakni prostatglanin (PG) E2 (PGE2), prostacyclin (PGI2), prostatglandin D2
(PGD2), dan prostatglandin F2α (PGF2α) yang kadarnya meningkat drastis pada
inflamasi sebelum rekruitmen lekosit dan infiltrasi sel imun. (Ricciotti dan
FitzGerald, 2011). Kadar PGE2 yang tinggi memicu sekresi TGF-β1 dan sintesis
reseptor TGF-β1 lebih banyak (Ramirez-Yanez dkk., 2006). Asam ellagic
menghambat inflamasi melalui hambatan pada COX-2 (Corbett dkk., 2010).
Dengan demikian hambatan pada COX oleh EBD dapat menghambat produksi
PGE2 sehingga menghambat sekresi TGF-β1.
Ekstrak buah delima juga menghambat ekspresi TGF-β1 melalui
hambatan pada jalur angiotensin. Pada HAP, volume overload dan menurunnya
cardiac output akan memicu aktifnya RA kardiak maupun sistemik (Handoko
dkk., 2010; Man dkk., 2012; Pacurari dkk., 2014; Kong dkk., 2014). Tujuh dari 10
penelitian pada pasien hipertensi menunjukkan penurunan serum ACE sebesar
36% setelah 2 minggu mengkonsumsi jus delima (Aviram dan Dornfeld, 2001).
Komponen sistem renin angiotensin yang meliputi angiotensinogen, prorenin,
renin, ACE, dan reseptor angiotensin tidak hanya berada pada sirkulasi namun
juga berada pada jaringan seperti jantung, ginjal dan otak (Bader dkk., 2001).
Efek angiotensin diketahui dimediasi oleh produksi SOR (Touyz, 2005).
Angiotensin II menstimulasi aktivitas NADPH oksidase meningkatkan ekspresi
subunit NADPH oksidase, dan menginduksi produksi SOR pada sel endotelial,
fibroblast adventitia, dan arteri intak, namun sebaliknya SOR akan mengaktifkan
sistem RAA (Chamseddine dan Miller, 2003; Zhao dkk., 2008 ; Tanaka dan
Shimizu, 2012). Spesies oksigen reaktif yang terdiri dari superoksid anion
90 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
superoksid (O2-), hydroxyl radicals (·OH), dan peroxy radicals (ROO·)
merupakan mediator kunci efek induksi sitokin dan angiotensin-II pada fibroblast
(Cheng dkk., 2003; Kong dkk., 2014; Touyz, 2005). Spesies oksigen reaktif akan
mengaktifkan TGF-β1 dan meningkatkan deposisi matriks ekstraseluler dan
intersisium jantung. Transforming growth factor -β1 yang aktif ini juga akan
meningkatkan produksi TGF-β1 itu sendiri di miofibroblast sehingga kadar TGF-
β1 semakin meningkat (Zhao dkk., 2008 ).
6.3 Efek Pemberian EBD Terhadap Ekspresi Kolagen Tipe I pada Otot
Jantung Ventrikel Kanan
Pada penelitian ini didapatkan hasil bahwa terdapat lebih banyak jumlah
sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok kontrol 4 minggu (K2)
dibanding kelompok kontrol 2 minggu (K1) yang berbeda bermakna secara
statistik, dan didapatkan lebih sedikit jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe
I pada kelompok yang mendapatkan ekstrak buah delima dibandingkan kontrol
yang berbeda bermakna secara statistik, namun tidak didapatkan perbedaan
bermakna antara jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada kelompok
EBD 2 minggu (E1) dan 4 minggu (E2). Hasil tersebut menunjukkan bahwa :
1. Pemberian monokrotalin pada tikus coba menyebabkan peningkatan
kolagen tipe I pada otot jantung.
2. Jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I pada tikus model HAP
meningkat seiring dengan waktu, menunjukkan HAP bersifat progresif.
3. Pemberian EBD dapat menurunkan jumlah sel yang mengekspresi kolagen
tipe I.
91 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
4. Pemberian EBD selama 2 minggu tidak berbeda bermakna dengan
pemberian EBD 4 minggu . Hal ini menunjukkan bahwa pemberian EBD
dapat menghambat progresifitas HAP, namun masih diperlukan waktu
penelitian yang lebih panjang untuk mengevaluasi efektifitas penggunaan
jangka panjang EBD terhadap progresifitas HAP.
Fibrosis didefinisikan sebagai peningkatan konsentrasi kolagen pada organ
dan terutama didominasi oleh kolagen tipe I (Lez dkk., 2004; Nicoletti dan
Michel, 1999). Peningkatan kadar kolagen tipe I dalam matriks ekstraselurer dapat
diketahui melalui jumlah sel yang mengekspresikanya. Cara lain yang dapat
dilakukan untuk mengukur kadar kolagen yakni dengan pengukuran kadar serum
Carboxy-terminal propeptide of procollagen type I (PIP) yakni penanda sintesis
kolagen tipe I dan pengukuran kadar serum carboxy-terminal telopeptide of
collagen type I (CITP). Peningkatan kadar kolagen tipe I ini sebagai akibat
meningkatnya sintesis dan berkurangnya degradasi (Liu dkk., 2015). Hasil
penelitian ini menunjukkan hasil yang serupa dengan penelitian Yuniarti yang
mendapatkan hasil penurunan ekspresi kolagen tipe I pada tikus model fibrosis
hati yang mendapat EBD (Yuniarti, 2012). Penelitian ini juga mendapat hasil
yang serupa dengan penelitian oleh Saputro yang mendapatkan hasil penurunan
ekspresi kolagen tipe I pada tikus model luka bakar yang mendapat terapi EBD
(Saputro, 2013). Hasil penelitian ini juga selaras dengan penelitian Rahman yang
mendapatkan hasil penurunan jumlah sel yang megekspresi kolagen tipe I pada
pembuluh darah paru tikus model HAP yang diinduksi monokrotalin yang
mendapat EBD (Rahman, 2016). Efek penurunan kadar kolagen tipe I ini terkait
92 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
dengan bahan aktif asam ellagic dan polifenol yang terkandung dalam EBD
seperti juga terbukti pada penelitian Bae mampu menurunkan kadar kolagen tipe I
pada kulit yang terpapar inflamasi oleh ultraviolet-B (Bae dkk., 2010).
Penurunan kadar kolagen tipe I pada tikus coba model HAP yang
mendapat EBD ini terkait dengan menurunnya kadar TGF-β1, yakni dengan
berkurangnya jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1 maka akan lebih sedikit pula
jumlah fibroblast yang mengalami aktivasi dan proliferasi menjadi collagen
secreting myofibroblast dengan hasil akhir penumpukan kolagen terutama kolagen
tipe I dan III pada matriks ekstraseluler otot jantung. Terdapat korelasi positif
antara TGF-β1 dan kolagen tipe I yakni semakin tinggi kadar TGF-β1 maka akan
semakin tinggi pula kadar kolagen tipe I (Yuniarti, 2012). Hal ini juga selaras
dengan penelitian Wei dkk bahwa EBD mempunyai kemampuan menurunkan
kadar TGF-β1 dan menghambat sintesis kolagen fibrosis hati yg diinduksi CCl4
(Wei dkk., 2015).
Ekstrak buah delima juga menghambat aktifitas IL-1 sehingga terjadi
hambatan pula dalam pengaktifan IL-6 dan lebih lanjut akan menghambat
stimulus terhadap aktivasi dan proliferasi fibroblast (Zarfeshany dkk., 2014).
Ekstrak buah delima memiliki kemampuan untuk menurunkan ekspresi IL-6 pada
hewan model fibrosis hati, penyakit periodontal, dan pada penderita adjunctive
periodontal (Yuniarti, 2012; Jurenka, 2008; Satravaha dkk., 2005).
Jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I juga dipengaruhi oleh
aktivitas kolagenase seperti matrix metalloprotease (MMPs) terutama MMP-1 dan
tissue inhibitor matrix metalloprotease (TIMPs) terutama TIMP-1. Matrix
93 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
metalloprotease disebut juga matriksin bertanggung jawab terhadap degradasi
matriks ekstraseluler. Manusia memiliki 23 gen matriksin (Nagase dkk., 2006).
Matrix metalloprotease-1 bertanggung jawab terhadap degradasi kolagen tipe I.
Aktivitas matriksin sangat rendah pada jaringan normal, namun meningkat oleh
stimulus sitokin inflamasi, faktor pertumbuhan, hormon, dan interaksi antar sel
matriks (Nagase dan Woessner, 1999). Aktifitas MMP juga dihambat oleh TIMP
namun disisi lain TIMP juga menginduksi fibroblast untuk memproduksi MMP.
Tissue inhibitor matrix metalloprotease terdiri dari 4 homolog yakni TIMP-1
sampai TIMP-4. Keseimbangan MMP-1 – TIMP-1 menjadi penentu
terakumulasinya kolagen tipe I pada matriks ekstraseluler (Nagase dkk., 2006).
Pada penelitian in vitro, EBD meningkatkan ekspresi MMP pada sel kondrosit
manusia melalui hambatan pada Mitogen-activated Protein kinase dan Nuclear
Factor-kappa B (Ahmed dkk., 2005). Pada penetitian fibrosis hati dengan
menggunakan tikus model yang dilakukan ligasi saluran empedu, proses
fibrogenesis masih ditemukan pada hari 21-28 (Tag dkk., 2015). Penelitian
Yuniarti tahun 2012 menunjukkan bahwa pemberian EBD pada tikus model
fibrosis hati menyebabkan penurunan ekspresi MMP-1 pada hari ke 21
dibandingkan kontrol. Yuniarti mengemukakan bahwa menurunnya kadar MMP-1
ini dikarenakan EBD dapat menghambat IL-6 yang berperan dalam aktivasi
hepatic stellate cells untuk mengaktifkan sitokin proinflamasi dan profibrogenik
untuk fibrogenesis (Yuniarti, 2012). Sehingga lebih lanjut dapat disimpulkan
bahwa EBD dapat menghambat fibrogenesis. Aktivitas MMP-1 mengalami
peningkatan pada saat terjadi resolusi fibrosis dan membuktikan bahwa aktivitas
94 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
kolagenase memiliki peran penting pada proses degradasi matriks ekstraseluler.
Aktifitas MMP-1 dihambat oleh TIMPs selama proses fibrogenesis (Iradale,
2001). Pada penelitian Rahman didapatkan peningkatan rasio ekspresi MMP-
1/TIMP-1 pada tikus model HAP pada minggu ke 2 dan ke 4 (Rahman, 2016).
Efektifitas EBD dalam menurunkan kadar TGF-β1 dan kolagen tipe I pada
2 minggu dan 4 minggu ini menunjukkan bahwa EBD dapat menghambat proses
awal fibrogenesis sekaligus meningkatkan resolusi fibrosis. Dalam praktek klinis
ini berarti bahwa EBD diharapkan dapat mencegah fibrosis dan mengurangi
derajat fibrosis yang sudah terjadi. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi
pertimbangan penggunaan EBD sebagai terapi tambahan, mendampingi terapi
baku yang sudah ada sehingga dapat menurunkan morbiditas dan mortalitas
terkait HAP.
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
95 KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
BAB VII
KESIMPULAN DAN SARAN
KESIMPULAN
Berdasarkan analisis hasil penelitian yang dilakukan, dapat ditarik
kesimpulan bahwa ekstrak buah delima terbukti efektif :
1. Menurunkan jumlah sel yang mengekspresi TGF-β1
2. Menurunkan jumlah sel yang mengekspresi kolagen tipe I
pada ventrikel kanan tikus model hipertensi arteri pulmonal.
SARAN
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menilai efek pemberian EBD
terhadap ketebalan fibrosis pada ventrikel kanan.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek jangka
panjang penggunaan EBD terhadap fibrosis ventrikel kanan.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
96 KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
KEPUSTAKAAN
Adatia I, Kothari S, dan Feinstein J, 2010. Pulmonary Hypertension Associated with Congenital Heart Disease. Chest, 137, 52s-61s.
Afolayan A, Eis A, Teng R, Bakhutashvili I, Kaul S, dan Davis J, 2012. Decreases in Manganese Superoxide Dismutase Expression and Activity Contribute to Oxidative Stress in Persistent Pulmonary Hypertension of the Newborn Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 303, L870–9.
Ahmed S, Wang N, Hafeez B, Cheruvu V, dan Haqiqi T, 2005. Punica Granatum Extracts Inhibits Il-1beta-Induced Expressionof Matrix Metalloproteinases by Inhibiting Theactivation of Map Kinases and Nf-Kappab in Human Chondrocytes in Vitro. J Nutr, 135, 2096-102.
Akpinar-Bayizit A, Ozcan T, dan Yilmaz-Ersan L 2012. Cancer Prevention - from Mechanisms to Translational Benefits. dalam: Georgakilas, A. (ed.) The therapeutic potential of pomegranate and Its products for prevention of cancer. Rijeka: In Tech, 331-72.
Andreollo N, Santos ED, Araujo M, dan Lopes L, 2012. Rat’s Age Versus Human’s Age: What Is the Relationship? Arq Bras Cir Dig, 25, 49-51.
Aviram M, dan Dornfeld L, 2001. Pomegranate Juice Consumption Inhibits Serum Angiotensin Converting Enzyme Activity and Reduces Systolic Blood Pressure. Atherosclerosis, 158 195–8.
Aviram M, Rosenblat M, Gaitinib D, Niteckic S, Hoffmanc A, Dornfeldd L, dan Et A, 2004 Pomegranate Juice Consumption for 3 Years by Patients with Carotid Artery Stenosis Reduces Common Carotid Intima-Media Thickness, Blood Pressure and Ldl Oxidation. Clin Nutr 23, 423–33.
Bader M, Peters J, Baltatu O, Muller D, Luft F, dan Ganten D, 2001. Tissue Renin- Angiotensin Systems: New Insights from Experimental Animal Models in Hypertension Research. J Mol Medicine, 79, 76–102.
Bae J-Y, Choi J-S, Kang S-W, Lee Y-J, Park J, dan Kang Y-H, 2010. Dietary Compound Ellagic Acid Alleviates Skin Wrinkle and Inflammation Induced by Uv-B Irradiation. Exp Dermatol, 19, e182–90.
Barst R, Mcgoon M, Elliott G, Foreman A, Miller D, dan Ivy D, 2012. Survival in Childhood Pulmonary Arterial Hypertension Insights from the Registry to
97 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management. Circulation, 125, 113-22.
Barst R, Rubin L, Long W, Mcgoon M, Rich S, dan Badesch D, 1996. A Comparison of Continuous Intravenous Epoprostenol (Prostacyclin) with
Conventional Therapy for Primary Pulmonary Hypertension. N Engl J Med, 334, 296-301.
Berger R, Beghetti M, Humpl T, Raskob G, Ivy D, Jing Z, dan Dkk, 2012. Critical Features of Paediatric Pulmonary Hypertension. Lancet, 379, 537–46.
Blanchette F, Day R, Dong W, Laprise M, dan Dubois C, 1997. Tgfβ1 Regulates Gene Expression of Its Own Converting Enzyme Furin. J Clin Invest, 99, 1974–83.
Border W, dan Noble N, 1994. Transforming Growth Factor Β in Tissue Fibrosis. N Engl J Med, 331, 1286-92.
Brilla C, dan Weber K, 1992. Reactive and Reparative Myocardial Fibrosis in Arterial Hypertension in the Rat. Cardiovasc Res 26, 671 -7.
Campbell D, 2008. Critical Review of Prorenin and (Pro)Renin Receptor Research. Hypertension, 51, 1259-64.
Cerda B, Ceron J, Tomas-Barberan F, dan Espin J, 2003. Repeated Oral Administration of High Doses of the Pomegranate Ellagitannin Punicalagin to Rats for 37 Days Is Not Toxic. J Agric Food Chem, 51, 3493-501.
Cerro M, Abman S, Diaz G, Freudenthal A, Freudenthal F, dan Harikrishnan, 2011. A Consensus Approach to the Classification of Pediatric Pulmonary Hypertensive Vascular Disease: Report from the Pvri Pediatric Taskforce, Panama 2011. Pulm Circ, 1, 286-98.
Chamseddine A, dan Miller F, 2003. Gp91phox Contributes to Nadph Oxidase Activity in Aortic Fibroblasts but Not Smooth Muscle Cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 285, H2284–9.
Chan E, Dusting G, Guo N, Peshavariya H, Taylor C, Dilley R, dkk. , 2010. Prostacyclin Receptor Suppresses Cardiac Fibrosis: Role of Creb Phosphorylation. J Mol Cell Cardiol, 49, 176–85.
Cheng T-H, Cheng P-Y, Shih N-L, Chen I-B, Wang D, dan Chen J-J, 2003. Involvement of Reactive Oxygen Species in Angiotensin Ii-Induced Endothelin-1 Gene Expression in Rat Cardiac Fibroblasts. J Am Coll Cardiol, 42, 1845-54.
98 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Chin K, Nick, Kim, dan Rubin L, 2005. The Right Ventricle in Pulmonary Hypertension. Coron Artery Dis 16, 13–8.
Chin K, dan Rubin L, 2008. Pulmonary Arterial Hypertension. JACC 51, 1527-38.
Christman B, Mcperson C, Newman J, King G, Bernard G, dan Groves B, 1992. An Imbalance between the Excretion of Thromboxane and Prostayclin Metabolites in Pulmonary Hypertension. N Engl J Med, 327, 70-5.
Clark J, Dedon T, Wayner E, dan Carter W, 1989. Effects of Interferon-'Y on Expression of Cell Surface Receptors for Collagen and Deposition of Newly Synthesized Collagen by Cultured Human Lung Fibroblasts. J Clin Invest, 83, 1505-11.
Clozel M, dan Salloukh H, 2005. Role of Endothelin in Fibrosis and Anti-Fibrotic Potential of Bosentan. Ann Med, 37, 2–12.
Colombo E, Sangiovanni E, dan Dell’agli M, 2013. A Review on the Anti-Inflammatory Activity of Pomegranate in the Gastrointestinal Tract. J Evid Based Complementary Altern Med, 2013, 1-11.
Corbett S, Daniel J, Drayton R, Field M, Steinhardt R, dan Garrett N, 2010. Evaluation of the Anti-Inflammatory Effects of Ellagic Acid. J Perianesth Nurs, 25, 214-20.
D'alonzo G, Barst R, Ayres S, Bergofsky E, Brundage B, Detre K, dan Fishman A, 1991. Survival in Patients with Primary Pulmonary Hypertension. Ann Intern Med, 115, 343-34.
Devipriya N, Srinivasan M, Sudheer A, dan Vp VM, 2007. Effect of Elagic Acid, a Natural Polyphenol on Alcohol Induced Prooxidant and Antioxidant Imbalance : A Drug Dose Dependent Study. Singapore Med J 48, 311-8.
Dolinay T, Kim YS, Howrylak J, Hunninghake G, An CH, Fredenburgh L, dan Dkk, 2012. Inflammasome-Regulated Cytokines Are Critical Mediators of Acute Lung Injury. Am J Respir Crit Care Med 185, 1225-34.
Duarte JD, Hanson RL, dan Machado RF, 2013. Pharmacologic Treatments for Pulmonary Hypertension. Future Cardiol, 9, 335-49.
Durmowicz A, Orton E, dan Stenmark K, 1993. Progressive Loss of Vasodilatorresponsive Component of Pulmonary Hypertension in
99 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Neonatalcalves Exposed to 4,570 M. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 265, H2175-83.
Edwards D, Murphy G, Reynolds J, Whitham S, Docherty A, dan Angel P, 1987. Transforming Growth Factor Beta Modulates the Expression of Collagenase and Metalioproteinase Inhibitor. EMBO J 6 1899-904.
Fan D, Tawale A, Lee J, dan Kassiri Z, 2012. Cardiac Fibroblasts, Fibrosis and Extracellular Matrix Remodeling in Heart Disease. Fibrogenesis Tissue Repair 5, 15.
Franco V, 2012. Right Ventricular Remodeling in Pulmonary Hypertension. Heart Failure Clin 8 403–12.
Francois H, Athirakul K, Howell D, Dash R, Mao L, dan Kim H, 2005. Prostacyclin Protects against Elevated Blood Pressure and Cardiac Fibrosis. Cell Metab, 2, 201–7.
Galie` N, Hoeper M, Humbert M, Torbicki A, Vachiery J-L, Barbera JA, dan Et A, 2009. Guidelines for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension. Eur Heart J 30, 2493–537.
George M, Champion H, Simon M, Guyach S, Tarantelli R, Kling H, dkk. , 2012. Physiologic Changes in a Nonhuman Primate Model of Hiv-Associated Pulmonary Arterial Hypertension. Am J Respir Cell mol Biol, 48, 374-81.
Ghofrani H, Barst R, Benza R, Champion H, Fagan K, Grimminger F, dkk. , 2009. Future Perspective for the Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension J Am Coll Cardiol, 54, S108-S17.
Giaid A, Yanagisawa M, Langleben D, Michel R, Levy R, dan Shennib H, 1993. Expresion of Endothelin-1 in the Lungs of Patients with Pulmonary Hypertension. N Engl J Med, 328, 1732–9.
Gomez-Arroyo J, Farkas L, Alhussaini A, Farkas D, Kraskauskas D, Voelkel N, dan Bogaard H, 2012. The Monocrotaline Model of Pulmonary Hypertension in Perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 302, L363-9.
Gong W, Yan M, Chen J, Chaugai S, Chen C, dan Wang D, 2014. Chronic Inhibition of Cyclic Guanosine Monophosphate-Specific Phosphodiesterase 5 Prevented Cardiac Fibrosis through Inhibition
of Transforming Growth Factor Β-Induced Smad Signaling. Front Med 8, 445–55.
100 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Guignabert C, Raffestin B, Benferhat R, Raoul W, Zadigue P, Rideau D, dkk. , 2005. Serotonin Transporter Inhibition Prevents and Reverses Monocrotalineinduced Pulmonary Hypertension in Rats. Circulation, 111, 2812–9.
Gurevitch J, Frolkis I, Yuhas Y, Lifschitz-Mercer B, Berger E, Paz Y, dan Dkk, 1997. Anti–Tumor Necrosis Factor-Alpha Improves Myocardial Recovery after Ischemia and Reperfusion. JACC 30, 1554–61.
Haber SL, Joy JK, dan Largent R, 2011. Antioxidant and Antiatherogenic Effects of Pomegranate. Am J Health Syst Pharm 68, 1302-5.
Hamid I 2015. Pengenalan, Pemeliharaan, Dan Manajemen Pemilihan Hewan Coba. dalam: Suryaningtyas, W., Prasetyo, R., dan Dewi, B. (eds.) Penelitian Dan Teknik Laboratorium Pada Hewan Coba Dan Manusia. Surabaya: Airlangga University Press.
Handoko M, Man FD, Allaart C, Paulus W, Westerhof N, dan Vonk-Noordegraaf A, 2010. Perspectives on Novel Therapeutic Strategies for Right Heart Failure in Pulmonary Arterial Hypertension: Lessons from the Left Heart. Eur Respir Rev, 19, 72–82.
Hanif K, dan Dikshit M 2010. Effect of Aqueous Extract of Punica Granatum (Pomegranate) on Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension in Rats. Recent trends and future perspectives in high aktitude pulmonary research. Leh Ladakh J&K India.
Hemmati A, Rezaie A, dan Darabpour P, 2013. Preventive Effects of Pomegranate Seed Extract on Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Rat. Nat Pharm Prod, 8, 76-80.
Hironakaa E, Hongob M, Sakai A, Mawatarid E, Terasawae F, Okumurae N, dkk. , 2003 Serotonin Receptor Antagonist Inhibits Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension and Prolongs Survival in Rats$. Cardiovasc Res, 60, 692 – 9.
Humbert M, Sitbon O, dan Simonneau G, 2004. Treatment of Pulonary Hypertension. N Engl J Med, 351, 1425-36.
Ignarro LJ, Balestrieri ML, dan Napoli C, 2007. Nutrition, Physical Activity, and Cardiovascular Disease: An Update. Cardiovasc Res, 73, 326-40.
Ignotzand R, dan Massague J, 1986. Transforming Growth Factor-Β Stimulates the Expression of Fibronectin and Collagen and Their Incorporatioin to the Extracellular Matrix. J Biol Chem, 261, 4337-45.
101 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Iradale J, 2001. Stellate Behaviour Cell During Resolution of Liver Injury. Semin Liver Dis, 21, 427-36.
Ivy DD, Abman S, Barst RJ, Berger RMF, Bonnet D, dan Fleming TR, 2013. Pediatric Pulmonary Hypertension. JACC, 62, 117-26.
Javanmard DH, dan Rafiee L, 2015. Antiangiogenic and Antiproliferative Effects of Black Pomegranate Peel Extract on Melanoma Cell Line. RPS, 10, 117-24.
Jianbo, Yan Z, Schwartz DE, Yu J, dan Asrar, 2013. Activation of Nlrp3 Inflammasome in Alveolar Macrophages Contributes to Mechanical Stretch-Induced Lung Inflammation and Injury. J Immunol, 1-10.
Jurenka J, 2008. Therapeutic Applications of Pomegranate (Punica Granatum L): A Review. Altern Med Rev 13, 129-44.
Kai H, Kuwahara F, Tokuda K, dan Imaizumi T, 2005. Diastolic Dysfunction in Hypertensive Hearts: Roles of Perivascular Inflammation and Reactive Myocardial Fibrosis. Hypertens Res, 28, 483–90.
Kay J, Suyama K, dan Keane P, 1982. Failure to Show Decrease in Small Pulmonary Blood Vessels in Rats with Experimental Pulmonary Hypertension. Thorax 32, 927-30.
Kholifah M, 2010. Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Etanol Buah Delima (Punica Granatum Linn.) Terhadap Peningkatan Apoptosis Sel Kanker Lidah Manusia Sp-C1 in Vitro. Biomed., 2, 72-80.
Kisseleva T, dan Brenner D, 2008. Mechanisms of Fibrogenesis. Exp Biol Med, 233, 109–22.
Kolettis T, Vlahos A, Louka M, Hatzistergos K, Baltogiannis G, Agelaki M, dkk. , 2007. Characterisation of a Rat Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Hellenic J Cardiol, 48, 206-10.
Kong P, Christia P, G N, dan Frangogiannis, 2014. The Pathogenesis of Cardiac Fibrosis. Cell Mol Life Sci, 71, 549–74.
Kuhn K, 1987. Structure and Function of Collagen Types. FASEB J, 5, 2814.
Lai Y, Olson J, dan Gillespie M, 1991. Ventilatory Dysfunction Precedes Pulmonary Vascular Changes in Monocrotaline-Treated Rats. J Appl Physiol, 70, 561–6.
102 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Leask A, 2010. Potential Therapeutic Targets for Cardiac Fibrosis Tgf, Angiotensin, Endothelin, Ccn2, and Pdgf, Partners in Fibroblast Activation. Circ Res, 106, 1675-80.
Lee W-J, Ou H-C, Hsu W-C, Chou M-M, Tseng J-J, Hsu S-L, dkk. , 2010. Ellagic Acid Inhibits Oxidized Ldl-Mediated Lox-1 Expression, Ros Generation, and Inflammation in Human Endothelial Cells. J Vasc Surg, 52, 1290-300.
Levy M, Celermajer D, Szezepanski I, Boudjemline Y, dan Bonnet D, 2013. Do Tertiary Paediatric Hospitals Deal with the Same Spectrum of Paediatric Pulmonary Hypertension as Multicentre Registries? Eur Respir J, 41, 236–9.
Lez AG, Pez BaL, dan Dı´Ez J, 2004. Fibrosis in Hypertensive Heart Disease: Role of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. Med Clin N Am 88 83–97.
Liu P, Yan S, Chen M, Chen A, Yao D, Xu X, dkk. , 2015. Effects of Baicalin on Collagen Ι and Collagen Ιιι Expression in Pulmonary Arteries of Rats with Hypoxic Pulmonary Hypertension. Int J Mol Med, 35, 901-8.
Loon RLEV, Roofthooft MTR, Hillege HL, Harkel AT, Osch-Gevers MV, Delhaas T, dkk. , 2011. Pediatric Pulmonary Hypertension in the Netherlands Epidemiology and Characterization During the Period 1991 to 2005. Circulation, 124, 1755-64.
Loon RV, Roofthooft M, dan Berger R, 2009. Pulmonary Arterial Hypertension in Children with Congenital Heart Disease. PVRI rev, 1, 203-7.
Lopez-Reyes A, Arroyo-Curas N, Cano B, Lara-Diaz V, Guajardo-Salinas G, Islas J, dkk. , 2008. Black Bean Extract Ameliorates Liver Fibrosis in Rat with C C14 Induced Injury. Annals of hepatol, 7, 130-5.
Macgowan G, Mann D, Kormos RL, Feldman AM, dan Murali S, 1997. Circulating Interleukin-6 in Severe Heart Failure. Am J Cardiol, 79, 1128-31.
Man FD, Tu L, Rain MHS, Ruiter G, Francois CN, dan Dkk, 2012. Dysregulated Renin–Angiotensin–Aldosterone System Contributes to Pulmonary Arterial Hypertension. Am J Respir Crit Care Med, 186, 780–9.
Marcus J, Ct G, Jj Z, Boonstra A, Alaart C, Jkw M, dkk. , 2008. Interventricular Mechanical Asynchrony in Pulmonary Arterial Hypertension Left-to-Right Delay in Peak Shortening Is Related to Right Ventricular Overload and Left Ventricular Underfilling. J Am Coll Cardiol, 51, 750-7.
103 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Marini M, Carpi S, Bellini A, Patalano F, dan Mattoli S, 1996. Endothelin-1 Induces Increased Fibronectin Expression in Human Bronchial Epithelial Cells. Biochem Biophys Res
Commun, 220, 896–9.
Marrone G, Mamone G, Luca A, Vitulo P, Bertani A, Pilato M, dkk. , 2010. The Role of 1.5t Cardiac Mri in the Diagnosis, Prognosis and Management of Pulmonary Arterial Hypertension. Int J Cardiovasc Imaging, 26, 655-81.
Martinon F, 2010 Signaling by Ros Drives Inflammasome Activation. Eur J Immunol 40, 616–9.
Miyauchi T, Yorikane R, Sakai S, Sakurai T, Okada M, dan Nishikibe M, 1993. Contribution of Endogenous Endothelin-1 to the Progression of Cardiopulmonary Alterations in Rats with Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension. Circ Res, 73.
Mohan M, Waghulde H, dan Kasture S, 2010. Effect of Pomegranate Juice on Angiotensin Ii-Induced Hypertension in Diabetic Wistar Rats. Phytother Res, 24, S196–203.
Nagase H, Visse R, dan Murphy G, 2006. Structure and Function of Matrix Metalloproteinases and Timps. Cardiovasc Res, 69, 562 – 73.
Nagase H, dan Woessner J, 1999. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 274, 21491 – 4.
Nicoletti A, Heudes D, Mandet C, Hinglais N, Bariety J, dan Michel J, 1996 Inflammatory Cells and Myocardial Fibrosis: Spatial and Temporal Distribution in Renovascular Hypertensive Rats. Cardiovasc Res, 32, 1096-107.
Nicoletti A, dan Michel J-B, 1999. Cardiac Fibrosis and Inflamation: Interaction with Hemodynamic and Hormonal Factors. Cardiovasc res, 41, 532-43.
Norton C, Broughton B, Jernigan N, Walker B, dan Resta T, 2013. Enhanced Depolarization-Induced Pulmonary Vasoconstriction Following Chronic Hypoxia Requires Egfr Dependent Activation of Nad(P)H Oxidase 2. Antioxid Redox Signal, 18, 1777–88
Nuisson B, Laflamme L, Bottari S, Gasparof MD, Gallo-Payet N, dan Payet M, 1995. A G Protein Is Involved in the Angiotensin At2 Receptor Inhibition of the T-Type Calcium Current in Non-Differentiated Ng108-15 Cells. J Biol chem, 270, 1670-4.
104 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Ohtsu H, Frank G, Utsunomiya H, dan Eguchi S, 2005. Redox-Dependent Protein Kinase Regulation by Angiotensin Ii: Mechanistic Insights and Its Pathophysiology. Antioxid Redox Signal, 7, 1315-26.
Okada K, Bernstein M, Zhang W, Schuster D, dan Botney M, 1998. Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition Delays Pulmonary Vascular Neointimal Formation. Am J Respir Crit Care Med, 158, 939–50.
Pacurari M, Kafoury R, Tchounwou P, dan Ndebele K, 2014. The Renin-Angiotensin-Aldosterone System in Vascular Inflammation and Remodeling. Int J Inflam, 2014, 1-13.
Pimenta E, dan Oparil S, 2009. Role of Aliskiren in Cardio-Renal Protection and Use in Hypertensives with Multiple Risk Factors. Vasc Health Risk Manag, 5, 453–63.
Rabinovitch M, 2005. Cellular and Molecular Pathobiology of Pulmonary Hypertension Conference Summary. Chest, 128, 642S-6S.
Raghu G, Masta S, Dm D, dan Narayanan S, 1989. Collagen Synthesis by Normal and Fibrotic Human Lung Fibroblasts and the Effect of Transforming Growth Factor-Β. Am Rev Respir Dis, 140, 95-100.
Rahman MA. 2016. Efek Ekstrak Buah Delima Terstandar Elagic Acid 40% Terhadap Hambatan Progresivitas Hipertensi Arteri Pulmonalis Pada Tikus Sprague Dawley Melalui Regulasi Fibrosis Pada Dinding Arteri Pulmonalis. Komunikasi Personal, Universitas Airlangga.
Raja S, dan Raja S, 2011. Treating Pulmonary Arterial Hypertension: Current Treatments and Future Prospects. Ther Adv Chronic Dis, 2, 359–70.
Ramirez-Yanez G, Hamlet S, Jonarta A, Seymour G, dan Symons A, 2006. Prostaglandin E2 Enhances Transforming Growth Factor-Beta 1 and Tgf-Beta Receptors Synthesis: An in Vivo and in Vitro Study. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 74, 183–92.
Ricciotti E, dan Fitzgerald G, 2011. Prostaglandins and Inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 31, 986–1000.
Ritchie M, Alan D, Qaggoner, Victor G, Davila R, Benico B, dkk. , 1993. Echocardiographic Characterization of the Improvement in Right Ventricular Function in Patients with Severe Pulmonary Hypertension after Single-Lung Transplantation. JACC, 22, 1170-4.
105 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Rizvi M, Katwa L, Spadone D, dan Myers P, 1996. The Effects of Endothelin-1 on Collagen Type I and Type Iii Synthesis in Cultured Porcine Coronary Artery Vascular Smooth Muscle Cells. J Mol Cell Cardiol, 28, 243–52.
Roehl A, Steendijk P, Baumert J, Schnoor J, R rossaint, dan Hein M, 2009. Comparison of 3 Methods to Induce Acute pulmonary hypertension in Pigs. Comp Med, 59, 280-6.
Rosenkranz S, 2004. Tgf-H1 and Angiotensin Networking in Cardiac Remodeling. Cardiovas Res, 63 423– 32.
Rosenkranz S, Flesch M, Amann K, Haeuseler C, Kilter H, Seeland U, dan Et A, 2002. Alterations of Β-Adrenergic Signaling and Cardiac Hypertrophy in Transgenic Mice Overexpressing Tgf-Β1. Am J Physiol, 283, 1253-62.
Russell R, 1988. Side Effects of Calcium Channel Blockers. Hypertension, 11, II42-4.
Sandmann S, Claas R, Cleutjens J, Daemen M, dan Unger T, 2001. Calcium Channel Blockade Limits Cardiac Remodeling and Improves Cardiac Function in Myocardial Infarction–Induced Heart Failure in Rats. J Cardiovasc Pharmacol, 37, 64–77
Saputro I. 2013. Regulasi Fibrosis Pada Kulit Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Dengan Luka Bakar Derajat 2 Yang Mendapat Terapi Ekstrak Buah Delima Terstandard Elagic Acid 40% (Studi Eksperimental Laboratorium). Disertasi, Universitas Airlangga.
Satravaha G, Gassman G, Sangtherapitikul P, dan Grimm W, 2005. Adjunctive Periodontal Theraphy with Cantella Asiatica and Punica Granatum Extracts in Supportive Periodontal Theraphy. J Int Acad Periodontol, 7, 70-9.
Sciavolinol P, Lee T, dan Vileek J, 1994. Interferon-P Induces Metalloproteinasme Rna Expression in Human Fibroblasts. J Biol Chem, 269, 21627-34.
Seeram NP, Adams LS, Henning SM, Niu Y, Zhang Y, Nair MG, dan Heber D, 2005. In Vitro Antiproliferative, Apoptotic and Antioxidant Activities of Punicalagin, Ellagic Acid and a Total Pomegranate Tannin Extract Are Enhanced in Combination with Other Polyphenols as Found in Pomegranate Juice. J Nutr Biochem, 16, 360-7.
106 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Shen L, Shen J, Pu J, dan He B, 2011. Aspirin Attenuates Pulmonary Arterial Hypertension in Rats by Reducing Plasma 5-Hydroxytryptamine Levels. Cell Biochem Biophys, 61, 23–3.
Shi-Wen X, Denton C, Dashwood M, Holmes A, Bou-Gharios G, dan Pearson J, 2001. Fibroblast Matrix Gene Expression and Connective Tissue Remodeling: Role of Endothelin-1. J Invest Dermatol, 116, 417–25.
Shi-Wen X, Howat S, Renzoni E, Holmes A, Pearson J, dan Dashwood M, 2004. Endothelin-1 Induces Expression of Matrix-Associated Genes in Lung Fibroblasts through Mek/Erk. J Biol Chem, 279, 23098–103.
Siwk D, Pagano P, dan Colucc W, 2001. Oxidative Stress Regulates Collagen Synthesis and Matrix Metalloproteinase Activity in Cardiac Fibroblasts Am J Physiol Cell Physiol, 280, C53–60.
Stratton R, Rajkumar V, Ponticos M, Nichols B, Shiwen X, dan Cm CB, 2002. Prostacyclin Derivatives Prevent the Fibrotic Response to Tgf-Beta by Inhibiting the Ras/Mek/Erk Pathway. Faseb J 16, 1949–51.
Suzuki Y, Steinhorn R, dan Gladwin M, 2013. Antioxidant Therapy for the Treatment of Pulmonary Hypertension. Antioxid Redox Signal 18 1723–6.
Tabima D, Frizzell S, dan Gladwin M, 2012. Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Pulmonary Hypertension. Free Radic Biol Med 52 1970–86.
Tag CG, Sauer-Lehnen S, Weiskirchen S, Borkham-Kamphorst E, Tolba RH, Tacke F, dan Weiskirchen R, 2015. Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis. J Vis Exp, 9, 1-11.
Takatsuki S, dan Dunbar D, 2013. Current Challenges in Pediatric Pulmonary Hypertension. Semin Respir Crit Care Med 34, 627–44.
Tanaka R, dan Shimizu M, 2012. The Relationship between Reactive Oxygen Species and Cardiac Fibrosis in the Dahl Salt-Sensitive Rat under Acei Administration. Vet Med Int, 2012, 1-6.
Tang B, Chen G-X, Liang M-Y, Yao J-P, dan Wu Z-K, 2015. Ellagic Acid Prevents Monocrotaline-Induced Pulmonary Artery Hypertension Via Inhibiting Nlrp3 Inflammasome Activation in Rats. Int J Cardiol 180, 134–41.
107 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Toklu H, Dumlu M, Sehirli Ö, Ercan F, Gedik N, Gökmen V, dan Sener G, 2007. Pomegranate Peel Extract Prevents Liver Fibrosis in Biliary-Obstructed Rats. JPP 59, 1287–95.
Tomasek J, Gabbiani G, Hinz B, Chaponnier C, dan Brown R, 2002. Myofibroblasts and Mechanoregulation of Connective Tissue Remodelling. Mol Cell Biol, 3, 349-63.
Touyz RM, 2005. Reactive Oxygen Species as Mediators of Calcium Signaling by Angiotensin Ii: Implications in Vascular Physiology and Pathophysiology. Antioxid Redox Signal, 7, 1302-17.
Tschopp J, dan Schroder K, 2010 Nlrp3 Inflammasome Activation:The Convergence of Multiple Signalling Pathways on Ros Production? Nat Rev Immunol, 10 210–215.
Vidal A, Fallarero A, Pena BR, Em M, Gra B, Rivera F, dkk. , 2003. Studies on the Toxicity of Punica Granatum L. (Punicaceae) Whole Fruit Extracts. J Ethnopharmacol, 89, 295-300.
Villegas L, Kluck D, Field C, Oberley-Deegan R, Woods C, dan Yeager M, 2013. Superoxide Dismutasemimetic,Mnte-2-Pyp, Attenuates Chronic Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension, Pulmonary Vascular Remodeling, and Activation of the Nalp3 Inflammasome. Antioxid Redox Signal 18, 1753–64.
Voelkel N, Quaife R, Leinwand L, Barst R, Mcgoon M, Meldrum D, dkk. , 2006. Right Ventricular Function and Failure Report of a National Heart, Lung, and Blood Institute Working Group on Cellular and Molecular Mechanisms of Right Heart Failure. Circulation 114, 1883-91.
Voelkel N, dan Tuder R, 2000. Hypoxia-Induced Pulmonary Vascular Remodeling: A Model for What Human Disease? J Clin Invest, 106, 733-8.
Waghulde H, Mohan M, Kasture S, dan Balaraman R, 2010. Punica Granatum Attenuates Angiotensin-Ii Induced Hypertension in Wistar Rats. Int J PharmTech Res, 2, 60-67.
Wang W, Liu R, Cao G, Zhang F, Zhang Y, Zhang Z, dan Wu S, 2009. A Reliable Rabbit Model for Hyperkinetic Pulmonary Hypertension. Journal Thorac Cardiovasc Surg 140.
Wardle A, dan Tulloh R, 2012. Update on Pulmonary Arterial Hypertension in Children: Management Strategies and Clinical Utility of Sildenafil. Pediatric Health Med Ther, 3, 59–67.
108 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Wedgwood S, Lakshminrusimha S, Czech L, Schumacker P, dan Steinhorn R, 2013. Increased P22phox/Nox4 Expression Is Involved in Remodeling through Hydrogen Peroxide Signaling in Experimental Persistent Pulmonary Hypertension of the Newborn. Antioxid Redox Signal, 18, 1765–76.
Wei X-L, Fang R-T, Yang Y-H, Bi X-Y, Ren G-X, Luo A-L, dkk. , 2015. Protective Effects of Extracts from Pomegranate Peels and Seeds on Liver Fibrosis Induced by Carbon Tetrachloride in Rats. BMC Complementary and Alternative Medicine, 15, 1-9.
Wilson D, Segall H, Pan C, Lame W, dan Morin E, 1992. Mechanisms and Pathology of Monocrotaline Pulmonary Toxicity. Crit Revi in Toxicol, 22, 307-25
Wynn T, 2008. Cellular and Molecular Mechanisms of Fibrosis. J Pathol, 214, 199–210.
Xu Y, Deng J, Ma J, Chen S, Marshall R, dan Jones S, 2003. DNA Damaging Activity of Ellagic Acid Derivatives. Bioorg Med Chem 11, 1593–6.
Yokoyama T, Nakano M, Bedarczyk J, Mcintyre B, Entman M, dan Mann D, 1997. Tumor Necrosis Factor-Alpha Provokes a Hypertrophic Growth Response in Adult Cardiac Myocytes. Circulation, 95, 1247-52.
Yu H, Gallagher A, Garfin P, dan Printz M, 1997. Prostacyclin Release by Rat Cardiac Fibroblasts. Hypertension 30, 1047–53.
Yuniarti W. 2012. Efek Antifibrotik Ekstrak Buah Delima (Punika Granatum L) Pada Fibrosis Hati. Disertasi.
Yuniarti WM, Handajani R, Kusumobroto HO, dan Sudiana K, 2013. Ekstrak Buah Delima Terstandar Menurunkan Derajat Fibrosis Hati Pada Hewan Model Tikus Putih. Veteriner J., 14, 511-8.
Zaiman AL, Podowski M, Medicherla S, Gordy K, Xu F, Zhen L, dkk. , 2008. Role of the Tgf-B/Alk5 Signaling Pathway in Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension. Am J Respir Crit Care Med 177, 896–905.
Zarfeshany A, Asgary S, dan Javanmard SH, 2014. Potent Health Effects of Pomegranate. Adv Biomed Res, 3, 1-8.
Zhao W, Zhao T, Chen Y, Ahokas R, dan Sun Y, 2008 Oxidative Stress Mediates Cardiac Fibrosis by Enhancing Transforming Growth Factor-Beta1 in Hypertensive Rats. Mol Cell Biochem 317, 43–50.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
110 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
111 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Lampiran 3. Sertifikat Ekstrak Buah Delima
112 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
113 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
114 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Lampiran 4. Hasil Pengolahan Data
Kelompok perlakuan Shapiro-Wilk Statistic df Sig.
BBawal
K2 .809 6 .071 K4 .912 4 .492 P2 .785 6 .043 P4 .920 6 .509
BBakhir
K2 .990 6 .989 K4 .963 4 .795 P2 .847 6 .149 P4 .907 6 .417
TDsis
K2 .826 6 .099 K4 .935 4 .622 P2 .963 6 .840 P4 .964 6 .853
TDdias
K2 .960 6 .823 K4 .900 4 .430 P2 .963 6 .845 P4 .962 6 .837
Berat paru
K2 .909 6 .428 K4 .942 4 .666 P2 .842 6 .135 P4 .942 6 .674
NPar Tests Kruskal-Wallis Test
Ranks Kelompok perlakuan N Mean Rank
BBawal
K2 6 11.00 K4 6 15.58 P2 6 11.42 P4 6 12.00 Total 24
Test Statisticsa,b BBawal Chi-Square 1.585 Df 3
115 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Asymp. Sig. .663 a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: Kelompok perlakuan Oneway
Descriptives BBakhir N Mean Std.
Deviation
Std. Error
95% Confidence Interval for Mean
Minimum
Maximum
Lower Bound
Upper Bound
K2 6 294.00 39.805 16.250 252.23 335.77 236 351 K4 5 294.40 53.233 23.807 228.30 360.50 220 357 P2 6 318.50 66.455 27.130 248.76 388.24 254 443 P4 6 275.33 33.566 13.703 240.11 310.56 220 311 Total 23 295.61 48.899 10.196 274.46 316.75 220 443
Test of Homogeneity of Variances BBakhir
Levene Statistic df1 df2 Sig. .391 3 19 .761
ANOVA BBakhir Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 5633.445 3 1877.815 .760 .531 Within Groups 46972.033 19 2472.212 Total 52605.478 22 T-Test Kelompok perlakuan = K2
Paired Samples Statisticsa Mean N Std. Deviation Std. Error Mean
Pair 1 BBawal 303.83 6 37.462 15.294 BBakhir 294.00 6 39.805 16.250
116 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
a. Kelompok perlakuan = K2 Paired Samples Correlationsa
N Correlation Sig. Pair 1 BBawal & BBakhir 6 .701 .120 a. Kelompok perlakuan = K2
Paired Samples Testa Paired Differences t df Sig.
(2-tailed)
Mean Std. Deviati
on
Std. Error Mean
95% Confidence Interval of the
Difference Lower Upper
Pair 1
BBawal – Bbakhir
9.833 29.929 12.219 -21.576 41.242 .805 5 .457
a. Kelompok perlakuan = K2 Kelompok perlakuan = K4
Paired Samples Statisticsa Mean N Std. Deviation Std. Error Mean
Pair 1 BBawal 314.80 5 27.390 12.249 BBakhir 294.40 5 53.233 23.807
a. Kelompok perlakuan = K4
Paired Samples Correlationsa N Correlation Sig. Pair 1 BBawal & BBakhir 5 .192 .757 a. Kelompok perlakuan = K4
Paired Samples Testa Paired Differences t df Sig. (2-
tailed) Mean Std. Deviati
on
Std. Error Mean
95% Confidence Interval of the
Difference Lower Upper
Pair 1
BBawal - BBakhir
20.400
54.985 24.590 -47.872 88.672 .830 4 .453
a. Kelompok perlakuan = K4
117 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Kelompok perlakuan = P4
Paired Samples Statisticsa Mean N Std. Deviation Std. Error Mean
Pair 1 BBawal 300.33 6 18.554 7.575 BBakhir 275.33 6 33.566 13.703
a. Kelompok perlakuan = P4
Paired Samples Correlationsa N Correlation Sig. Pair 1 BBawal & BBakhir 6 .647 .165 a. Kelompok perlakuan = P4
Paired Samples Testa Paired Differences t df Sig. (2-
tailed) Mean Std. Deviatio
n
Std. Error Mean
95% Confidence Interval of the
Difference Lower Upper
Pair 1 BBawal - BBakhir
25.000 25.791 10.529 -2.066 52.066 2.374 5 .064
a. Kelompok perlakuan = P4 NPar Tests Kelompok perlakuan = P2 Wilcoxon Signed Ranks Test
Ranksa N Mean Rank Sum of Ranks
BBakhir - BBawal
Negative Ranks 1b 4.00 4.00 Positive Ranks 5c 3.40 17.00 Ties 0d Total 6
a. Kelompok perlakuan = P2 b. BBakhir < BBawal
118 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
c. BBakhir > BBawal d. BBakhir = BBawal
Test Statisticsa,b BBakhir -
BBawal Z -1.367c Asymp. Sig. (2-tailed) .172 a. Kelompok perlakuan = P2 b. Wilcoxon Signed Ranks Test c. Based on negative ranks. Oneway
Descriptives N Mean Std.
Deviation
Std. Error
95% Confidence Interval for Mean
Minimum
Maximum
Lower Bound
Upper Bound
TDsis
K2 6 66.642 11.0694 4.5191 55.025 78.258 45.9 79.1 K4 4 65.025 5.4999 2.7500 56.273 73.777 59.5 71.4 P2 6 41.467 13.4723 5.5000 27.328 55.605 20.5 57.4 P4 6 44.733 12.6633 5.1698 31.444 58.023 26.0 60.6 Total 22 53.507 15.9017 3.3903 46.456 60.557 20.5 79.1
TDdias
K2 6 37.900 4.2591 1.7388 33.430 42.370 30.9 42.8 K4 4 37.275 7.9943 3.9972 24.554 49.996 26.9 44.1 P2 6 20.617 7.2486 2.9592 13.010 28.224 10.7 32.6 P4 6 26.283 9.1458 3.7338 16.685 35.881 13.7 38.2 Total 22 29.905 10.1430 2.1625 25.407 34.402 10.7 44.1
Test of Homogeneity of Variances
Levene Statistic df1 df2 Sig. TDsis .913 3 18 .454 TDdias .978 3 18 .425
119 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
ANOVA
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
TDsis
Between Groups
2897.455 3 965.818 7.205 .002
Within Groups 2412.716 18 134.040 Total 5310.171 21
TDdias
Between Groups
1197.125 3 399.042 7.456 .002
Within Groups 963.364 18 53.520 Total 2160.490 21
Post Hoc Tests Multiple Comparisons
LSD Dependent Variable
(I) Kelompok perlakuan
(J) Kelompok perlakuan
Mean Difference
(I-J)
Std. Error
Sig. 95% Confidence Interval
Lower Bound
Upper Bound
TDsis
K2 K4 1.6167 7.4733 .831 -14.084 17.317 P2 25.1750* 6.6843 .001 11.132 39.218 P4 21.9083* 6.6843 .004 7.865 35.952
K4 K2 -1.6167 7.4733 .831 -17.317 14.084 P2 23.5583* 7.4733 .006 7.858 39.259 P4 20.2917* 7.4733 .014 4.591 35.992
P2 K2 -25.1750* 6.6843 .001 -39.218 -11.132 K4 -23.5583* 7.4733 .006 -39.259 -7.858 P4 -3.2667 6.6843 .631 -17.310 10.777
P4 K2 -21.9083* 6.6843 .004 -35.952 -7.865 K4 -20.2917* 7.4733 .014 -35.992 -4.591 P2 3.2667 6.6843 .631 -10.777 17.310
TDdias
K2 K4 .6250 4.7223 .896 -9.296 10.546 P2 17.2833* 4.2238 .001 8.410 26.157 P4 11.6167* 4.2238 .013 2.743 20.490
K4 K2 -.6250 4.7223 .896 -10.546 9.296 P2 16.6583* 4.7223 .002 6.737 26.580 P4 10.9917* 4.7223 .032 1.070 20.913
P2 K2 -17.2833* 4.2238 .001 -26.157 -8.410 K4 -16.6583* 4.7223 .002 -26.580 -6.737 P4 -5.6667 4.2238 .196 -14.540 3.207
P4 K2 -11.6167* 4.2238 .013 -20.490 -2.743 K4 -10.9917* 4.7223 .032 -20.913 -1.070 P2 5.6667 4.2238 .196 -3.207 14.540
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
120 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Oneway
Test of Homogeneity of Variances MAP
Levene Statistic df1 df2 Sig. 1.149 3 18 .356
ANOVA MAP Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups
1667.897 3 555.966 8.832 .001
Within Groups 1133.072 18 62.948 Total 2800.970 21 Post Hoc Tests
Multiple Comparisons Dependent Variable: MAP LSD (I) Kelompok perlakuan
(J) Kelompok perlakuan
Mean Difference
(I-J)
Std. Error
Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound
K2 P2 19.91389* 4.58070 .000 10.2902 29.5376 K4 .95556 5.12138 .854 -9.8041 11.7152 P4 15.04722* 4.58070 .004 5.4235 24.6709
P2 K2 -19.91389* 4.58070 .000 -29.5376 -10.2902 K4 -18.95833* 5.12138 .002 -29.7180 -8.1987 P4 -4.86667 4.58070 .302 -14.4904 4.7570
K4 K2 -.95556 5.12138 .854 -11.7152 9.8041 P2 18.95833* 5.12138 .002 8.1987 29.7180 P4 14.09167* 5.12138 .013 3.3320 24.8513
P4 K2 -15.04722* 4.58070 .004 -24.6709 -5.4235 P2 4.86667 4.58070 .302 -4.7570 14.4904 K4 -14.09167* 5.12138 .013 -24.8513 -3.3320
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
121 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Tests of Normality
kelompok
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
TGFB1 minggu 2 (K) .283 6 .143 .921 6 .514
minggu 2 (P) .293 6 .117 .915 6 .473
minggu 4 (K) .312 6 .068 .793 6 .051
minggu 4 (P) .175 6 .200* .923 6 .530
COL1 minggu 2 (K) .223 6 .200* .908 6 .421
minggu 2 (P) .333 6 .036 .814 6 .078
minggu 4 (K) .196 6 .200* .890 6 .316
minggu 4 (P) .254 6 .200* .866 6 .212
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Test of Homogeneity of Variances
Levene Statistic df1 df2 Sig.
TGFB1 1.462 3 20 .255
COL1 .879 3 20 .469
ANOVA
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
TGFB1 Between Groups 171.000 3 57.000 11.362 .000
Within Groups 100.333 20 5.017
Total 271.333 23
COL1 Between Groups 198.833 3 66.278 27.052 .000
Within Groups 49.000 20 2.450
Total 247.833 23
122 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Multiple Comparisons
LSD
Depende
nt
Variable (I) kelompok (J) kelompok
Mean
Difference (I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
TGFB1 minggu 2 (K) minggu 2 (P) 2.833* 1.293 .040 .14 5.53
minggu 4 (K) -3.667* 1.293 .010 -6.36 -.97
minggu 4 (P) 2.833* 1.293 .040 .14 5.53
minggu 2 (P) minggu 2 (K) -2.833* 1.293 .040 -5.53 -.14
minggu 4 (K) -6.500* 1.293 .000 -9.20 -3.80
minggu 4 (P) .000 1.293 1.000 -2.70 2.70
minggu 4 (K) minggu 2 (K) 3.667* 1.293 .010 .97 6.36
minggu 2 (P) 6.500* 1.293 .000 3.80 9.20
minggu 4 (P) 6.500* 1.293 .000 3.80 9.20
minggu 4 (P) minggu 2 (K) -2.833* 1.293 .040 -5.53 -.14
minggu 2 (P) .000 1.293 1.000 -2.70 2.70
minggu 4 (K) -6.500* 1.293 .000 -9.20 -3.80
COL1 minggu 2 (K) minggu 2 (P) 2.833* .904 .005 .95 4.72
minggu 4 (K) -3.333* .904 .001 -5.22 -1.45
minggu 4 (P) 4.167* .904 .000 2.28 6.05
minggu 2 (P) minggu 2 (K) -2.833* .904 .005 -4.72 -.95
minggu 4 (K) -6.167* .904 .000 -8.05 -4.28
minggu 4 (P) 1.333 .904 .156 -.55 3.22
minggu 4 (K) minggu 2 (K) 3.333* .904 .001 1.45 5.22
minggu 2 (P) 6.167* .904 .000 4.28 8.05
minggu 4 (P) 7.500* .904 .000 5.61 9.39
minggu 4 (P) minggu 2 (K) -4.167* .904 .000 -6.05 -2.28
minggu 2 (P) -1.333 .904 .156 -3.22 .55
minggu 4 (K) -7.500* .904 .000 -9.39 -5.61
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
123 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Case Processing Summary
kelompok
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
TGFB1 minggu 2 (K) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%
minggu 2 (P) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%
minggu 4 (K) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%
minggu 4 (P) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%
COL1 minggu 2 (K) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%
minggu 2 (P) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%
minggu 4 (K) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%
minggu 4 (P) 6 100.0% 0 .0% 6 100.0%
Descriptives
kelompok Statistic Std. Error
TGFB1 minggu 2 (K) Mean 9.17 .543
95% Confidence Interval for
Mean
Lower Bound 7.77
Upper Bound 10.56
5% Trimmed Mean 9.19
Median 9.00
Variance 1.767
Std. Deviation 1.329
Minimum 7
Maximum 11
Range 4
Interquartile Range 2
Skewness -.440 .845
Kurtosis 1.335 1.741
minggu 2 (P) Mean 6.33 .422
95% Confidence Interval for Lower Bound 5.25
124 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Mean Upper Bound 7.42
5% Trimmed Mean 6.31
Median 6.00
Variance 1.067
Std. Deviation 1.033
Minimum 5
Maximum 8
Range 3
Interquartile Range 2
Skewness .666 .845
Kurtosis .586 1.741
minggu 4 (K) Mean 12.83 1.302
95% Confidence Interval for
Mean
Lower Bound 9.49
Upper Bound 16.18
5% Trimmed Mean 12.65
Median 12.00
Variance 10.167
Std. Deviation 3.189
Minimum 10
Maximum 19
Range 9
Interquartile Range 4
Skewness 1.892 .845
Kurtosis 4.063 1.741
minggu 4 (P) Mean 6.33 1.085
95% Confidence Interval for
Mean
Lower Bound 3.54
Upper Bound 9.12
5% Trimmed Mean 6.43
Median 6.50
Variance 7.067
125 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Std. Deviation 2.658
Minimum 2
Maximum 9
Range 7
Interquartile Range 5
Skewness -.728 .845
Kurtosis .158 1.741
COL1 minggu 2 (K) Mean 10.83 .477
95% Confidence Interval for
Mean
Lower Bound 9.61
Upper Bound 12.06
5% Trimmed Mean 10.87
Median 11.00
Variance 1.367
Std. Deviation 1.169
Minimum 9
Maximum 12
Range 3
Interquartile Range 2
Skewness -.668 .845
Kurtosis -.446 1.741
minggu 2 (P) Mean 8.00 .447
95% Confidence Interval for
Mean
Lower Bound 6.85
Upper Bound 9.15
5% Trimmed Mean 8.06
Median 8.00
Variance 1.200
Std. Deviation 1.095
Minimum 6
Maximum 9
Range 3
Interquartile Range 2
126 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Skewness -1.369 .845
Kurtosis 2.500 1.741
minggu 4 (K) Mean 14.17 .910
95% Confidence Interval for
Mean
Lower Bound 11.83
Upper Bound 16.51
5% Trimmed Mean 14.07
Median 14.00
Variance 4.967
Std. Deviation 2.229
Minimum 12
Maximum 18
Range 6
Interquartile Range 4
Skewness .991 .845
Kurtosis 1.142 1.741
minggu 4 (P) Mean 6.67 .615
95% Confidence Interval for
Mean
Lower Bound 5.09
Upper Bound 8.25
5% Trimmed Mean 6.63
Median 7.00
Variance 2.267
Std. Deviation 1.506
Minimum 5
Maximum 9
Range 4
Interquartile Range 2
Skewness .313 .845
Kurtosis -.104 1.741
127 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Lampiran 5. Gambar Tikus Sprague Dawley
Tikus Sprague Dawley. (A). Sebelum pembedahan. (B). Setelah pembedahan. (a); IV catheter 16 G sebagai pipa intubasi, (b): Organ jantung.
A
B a b
128 ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
KARYA ILMIAH AKHIR EKSPRESI TGF-β1 DAN KOLAGEN TIPE I... ILHAM BONDAN P
Lampiran 6. Gambar Alat Monitor Dash 5000
Alat Monitor Dash 5000. (A). Sebelum dihubungkan dengan arteri pulmonalis. (B) Sesudah dihubungkan dengan arteri pulmonalis. (a) Gambar gelombang tekanan arteri pulmonal. (b). Tekanan sistol (mmHg), (c). Tekanan diastol (mmHg), (d). Denyut jantung.
A
B
a b c
d