Replicación del ADN

DNA marcado con 15N y 14N separado por un gradiente de densidad

(a)

(b)

Experimento de Meselson y Stahl: Resultados esperados para cada uno de los tres posibles modelos de replicación de ADN

Replicación de un cromosoma circular

Burbuja de replicaciónOrigen de replicación2 horquillas de replicaciónAutoradiografía de

plásmido de E. coli replicando

Replicación theta (θ)

Demostración experimental de que la replicación es bidireccional(B. subtilis)

Demostración experimental de que la replicación es bidireccional (Drosophila)

Autoradiografía de ADN replicando de Triturus vulgaris. La forma y el tamaño constante del ADN marcado sugiere que la replicación en todos los replicones comienza al mismo tiempo

Otros modelos de replicación en ADN circular

Representación esquemática de la replicación en círculo rodante(replicación unidireccional)

Mapa del ADN mitocondrial humano

Representación esquemática de dos modelos de replicación del ADN mitocondrial

Modelo de replicación asimétrica Modelo de replicación simétrica

Representación esquemática de dos modelos de replicación del ADN mitocondrial

Modelo de replicación asimétrica Modelo de replicación simétrica

DNA polimerasa cataliza la síntesis del DNA

- Usa un sitio activo para catalizar la adición de cualquiera de los 4 deoxinucleótidos trifosfatos.

- Se aprovecha de la idéntica geometría de los pares de base A:T y G:C.

- Sólo cuando se aparean las bases, el grupo 3`OH y -fosfato se encuentran en posición óptima.

- Diferencia entre ribo y deoxiribonucleótido.

Desoxinucleótido trifosfato

Empalme primer:plantilla.

• La cadena se extiende en el extremo 3`.

• El enlace fosfodiester es formado por una reacción donde el grupo hidroxilo del extremo 3`se fija al grupo fosfato del nucleótido trifosfato.

Extensión del extremo 3`del primer:

DNA Polimerasa Subunidades Act. exonucleasa Función

Pol I 1 3-5 5-3 Remoción de cebadores de ARNPresenta una exonucleasa 5`Reparación del ADN.Procesividad baja. (No es nece

saria para la replicación)

Pol III (Core) 3 3-5 Realiza la mayor parte de laPol III (Holoenzima) 9 replicación de los cromosomas

DNA polimerasas en E. coli que participan en la replicación

Aislamiento de diferentes formas de actividad Pol III

25,000

10,000 130,000

(polC) - Síntesis de DNA (dnaQ) - Corrección 3'5' - ensamblaje?

Centro catalítico Masa = 165,000

Pol III* Masa = 470,000

Masa = 750,000

Masa = 900,000

Pol III'

Holoenzima

Consiste de 2 centros + 2 (dnaX) provoca la dimerización

Incrementa la procesividad

Sintesis de DNA

Consiste de Pol II* + complejo

El complejose une al molde

Consiste de Pol III' + la subunidad (dnaN)

Sintetiza las hebras lider y rezagada

III*

DNA Polimerasa Subunidades Funcióna(Pol I en lev) 4 Síntesis cebador durante duplica

ción de ADN. No posee actividad 3’ 5’ exo (corrección de prueba)

Baja procesividad

d(Pol III en lev) 2 a 3 Duplicación del ADN. Enlongación después del inicio. Cadena contínua Reparación por excisión de

nucleótidos y de bases. Actividad 3´-5´exonucleasa.

e(Pol II en lev) 4 Enlongación de la cadena retrasada

g (también g en lev) 3 Duplicación y reparación de ADN mitocondrial.

DNA Polimerasas en eucariotas

b (también b en lev) 3 Reparación de ADN (procesividad nula)

La replicación del ADN requiere de un gran número de enzimas y proteínas

Iniciación. Involucra el reconocimiento de la posición en dónde empieza la replicación de una molécula de DNA.Desenrollamiento: La cadena doble debe desenrollarse porque se requiere de un molde de cadena simple.Elongación: Eventos de la horquilla de replicación en dónde es sintetizada una hebra complementaria.Terminación.

Iniciación: primasa y cebador, proteínas de unión a hebras sencillas, helicasa, topoisomerasa.

Elongación: DNA polimerasa, horquilla de replicación

Terminación, maduración y unión de los fragmentos de Okazaki

¿Quiénes intervienen en cada etapa?

Iniciación

• No es un proceso al azar.• Empieza en una secuencia conocida como origen

de replicación (replicón)• Un genoma circular bacteriano presenta un solo

origen de replicación.• En eucariontes hay múltiples orígenes para cada

cromosoma. (levadura ~300).

Origen de replicación• Las secuencias replicadoras, presentan dos características

comunes– Sitios de unión → Maquinaria de replicación– Regiones ricas en AT → Fácil desenrollamiento

245 pb

13 13 13 9 9 9 9

OriC (E. coli)

SV40

EP EP P P P P

65 pb

9-mers (nonámerosecuencia consenso: TTATCCACA. Sitio de unión de DnaA.3 Dominios de 13 nucleótidos

• Dna A se une a los nonámeros. Esto facilita la unión de Dna B, produciendo la separación de las hebras en los tridecámeros. Se forma así el complejo abierto.

• Finalmente la primasa se une a este complejo y forma el primosoma que sintetiza los cebadores de ARN.

Orígenes de replicación en levadura

• Se les llama ARSs (autonomously replicating sequences)

• 200 pb• Presenta regiones discretas o subdominios• ORS (secuencia de reconocimiento del origen), 40 pb

que es reconocida por un grupo de 6 proteínas, el ORC (complejo de reconocimiento del origen).

• No es precisamente un complejo de iniciación pues sigue unido después de iniciada la replicación.

Estructura del origen de replicación de levadura

Origen de replicación en eucariontes superiores

• No se ha podido encontrar secuencias ni homólogas ni análogas a orígenes de replicación en eucariontes superiores.

• Podría ser que la replicación se iniciara en estructuras proteínicas que tienen posiciones específicas en el núcleo.

• Se describió por Aladjem et al., (1998) una región de 8 kb que conservó su potencialidad de iniciar la replicación a alta frecuencia al clonarla en genoma de chimpancés

• Proteínas con secuencias homólogas a ARSs se han encontrado también.

La síntesis de ADN tiene lugar una sola vez en cada

origen de replicación durante la fase S

Estructura de la helicasa

DNA helicasa desenrolla la doble hélice:

DNA Helicasa: Proteínas hexaméricas en forma de anillo, que catalizan la separación de las dos cadenas de DNA.

Se mueve a lo largo del DNA en una dirección fija (POLARIDAD). Requiere la energía suministrada por la hidrólisis del ATP.

Proteínas SSBsProteínas SSBs

- Estabilizan las cadenas separadas.

- Interacciones electrostáticas con la columna de fosfato.

- Interacciones de apilamiento con las bases del DNA.

-Presentan unión cooperativa.

-En humanos podría tener una función de ssb la proteína RF-A

Cebadores de ARN

Para iniciar la replicación se requieren primers de RNA, que son sintetizados por una RNA polimerasa PRIMASA.

-Cadena continua: Necesita un solo primer.

- Cadena rezagada: Necesita varios primers.

Proteínas enganchadoras o cargadoras

Cataliza la abertura y ubicación de la abrazadera deslizante sobre el DNA.

El proceso es acoplado a la unión de ATP y a la hidrólisis.

Procariotas Complejo

Eucariotas Factor de replicación (RFC).

25,000

10,000 130,000

(polC) - Síntesis de DNA (dnaQ) - Corrección 3'5' - ensamblaje?

Centro catalítico Masa = 165,000

Pol III* Masa = 470,000

Masa = 750,000

Masa = 900,000

Pol III'

Holoenzima

Consiste de 2 centros + 2 (dnaX) provoca la dimerización

Incrementa la procesividad

Sintesis de DNA

Consiste de Pol II* + complejo

El complejose une al molde

Consiste de Pol III' + la subunidad (dnaN)

Sintetiza las hebras lider y rezagada

Topoisomeras

El DNA sufre superenrollamiento positivo a medida que la DNA helicasa rompe los puentes de hidrógeno.

Las topoisomeras genera un superenrollamiento negativo, con la disociación local de las dos cadenas.

Superenrollamiento positivo

Superenrollamiento negativo

Actividad de topoisomerasas

• Las DNA topoisomerasas no desenrollan la doble hélice.

• Lo que hacen es resolver el problema topológico contratacando el sobre-enrollamiento que de otra manera tendría la molécula por la progresión de la horquilla de replicación.

• El resultado es que la hélice puede ser “unzipped” poniendo las dos hebras aparte sin que la molécula tenga que rotar.

Topoisomerasas tipo I y II

Síntesis semi-discontinua del DNA

Elongación o alargamiento

• Dificultades– Las dos hebras tienen que ser copiadas al mismo

tiempo y la polimerasa solo copia de 5’--> 3’ – La hebra retardada debe copiarse de manera

discontinua produciendo fragmentos cortos.– La DNA polimerasa necesita cebadores que

proporcionen extremos 3’ • DNA polimerasas• Sintetizan polinucleótidos en sentido 5’-->3’• Tienen actividad de exonucleasa 3’-->5’ (excepto DNA

polimerasa a)

HORQUILLA DE REPLICACIÓN

-CADENA CONTINUA: Se sintetiza de forma continua.

-CADENA REZAGADA: Se sintetiza por medio de fragmentos de OKAZAKI

CADENA RESAGADA

CADENA ADELANTADA

Fragmentos de Okazaki

3`

5`

Síntesis del DNA en la horquilla de replicación

• En la horquilla de replicación se sintetizan a la vez las cadenas adelantada y retrazada.

• Procariotes Complejo multimérico = Holoenzima DNA Pol III

Abrazaderas deslizantes

Aumentan la procesividad de la DNA polimerasa.

Compuesta por múltiples subunidades idénticas que se ensamblan en forma de anillo rodeando al ADN.

En eucariotas: PCNA; incrementa la procesividad de las DNA polimerasas e y .d

Interacción entre las proteínasDNA helicasa – Holoenzima DNA Pol III: Previene que la helicasa se aleje de la DNA Pol III.

DNA helicasa – Primasa: Interacciones débiles que regulan la longitud de los fragmentos de Okazaki.

• Eucariotas no se conocen que proteínas se reclutan, mantienen y coordinan la acción de las tres polimerasas.

Modelo de síntesis simultanea de ambas cadenas de ADN

Modelo que representa el ensamblaje de la Pol III de E. coli

Modelo de síntesis simultanea de ambas cadenas de ADN

Cómo se completa la replicación de la cadena rezagada en eucariotas

(Los cebadores de ARN deben ser removidos)

Topología de la terminación en cromosomas circulares.

Secuencias de terminación en E. coli

Terminación de la replicación en cromosomas lineales

Terminación de la replicación en cromosomas lineales

• La terminación de la replicación de los cromosomas eucariotas ocurre en los telómeros.

Organismos secuencia repetida en los telómeros Molde de ARN de la Telomerasa

Human 5’-TTAGGG-3’ 5’-CUAACCCUAAC-3’Oxytricha 5’-TTTTGGGG-3’ 5’-CAAAACCCCAAAACC-3’Tetrahymena 5’-TTGGGG-3’ 5’-CAACCCCAA-3’

Oxytricha y Tetrahymena son protozoos particularmente útiles para estudios de la telomerasa debido a que en ciertos estadios del desarrollo, los cromosomas se rompen en pequeños fragmentos, cada uno de ellos poseen telómeros; por tanto tienen muchos telómeros por célula (Greider, 1996).

¿Qué son los telómeros?

• Están localizados en los extremos de los cromosomas• Sin los telómeros, los cromosomas son inestables y

pueden combinarse con otros cromosomas para formar cromosomas dicéntricos o anillos

• Protegen al cromosoma de la degradación• Permiten la replicación completa de cada cromosoma• Posicionan a los cromosomas dentro del núcleo• Sus secuencias tienen estructura y función propias• Tienen unas 6-10 kilobases, y consisten de unas 250 –

1.500 repeticiones de una secuencia rica en G, en los vertebrados es TTAGGG

Acortamiento de los telómeros

• En las células somáticas, con cada división se acortan los telómeros

• El mecanismo de replicación de la hebra retardada del ADN incluye el uso de iniciadores de ARN en el sentido 5´ - 3´, los cuales deben ser eliminados después

• Cuando el último iniciador es eliminado de la hebra retardada, no puede ser reparado porque no existe más molécula, lo que produce un acortamiento de 50-200 bases de la hebra en cada replicación

• Va quedando un segmento de hebra que “cuelga” en la punta 3´de la molécula

• FISH de los telómeros, hibridación de los

cromosomas con sondas conteniendo la secuencia TTAGGG

Acortamiento de telómeros

Telomerasa

• Ribonucleoproteína específica de los telómeros

• Tiene actividad transcriptasa reversa

• Añade unidades sencillas de la repetición a los extremos de los telómeros

previniendo el acortamiento de los cromosomas

• Contiene un molde de ARN que sirve para sintetizar el ADN (RT), y la

subunidad catalítica que actúa como transcriptasa reversa .

• Las mayoría de las células somáticas normales del ser humano son

TELOMERASA-NEGATIVAS. La actividad telomerasa disminuye cuando la

célula se especializa y dejan de dividirse.

• Las células que se dividen activamente en procesos normales tienen

actividad de telomerasa.

Mantenimiento de los extremos de una molécula de ADN lineal

Mantenimiento de los extremos de una molécula de ADN lineal

Mantenimiento de los extremos de una molécula de ADN lineal

TRF1 unida al telómero SSB de E. Coli unida al extremo 3´ libre