ΤΡΑΝΣΚΡΙΠΤΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ

ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΟΥ

ΠΑΡΑΣΙΤΟΥ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ, ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ

BACTROCERA OLEAE, ΜΕ ΕΜΦΑΣΗ ΣΤΑ

ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΦΥΛΟΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΚΑΙ

ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΑ ΕΝΤΟΜΟΚΤΟΝΑ

Σαγρή Χ.Ευθυμία

Υπ. Διδάκτωρ Παν/μιου Θεσσαλίας

Τμήμα: Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας

Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Γονιδιωματικής

Επιβλέπων καθηγητής: Ματθιόπουλος Κων/νος

Department of Biochemistry and Biotechnology

University of Thessaly

Laboratory of Molecular Biology and Genomics

Η ΕΛΙΑ

• Ελαιόλαδο

Βασικό στοιχείο της Μεσογειακής δίαιτας

• Συνολικά 97 εκατομμύρια στρέμματα!

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ

Το 98% της παγκόσμιας παραγωγής βρίσκεται στη λεκάνη της Μεσογείου

ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ ΠΟΣΟΣΤΑ ΕΛΑΙΟΠΑΡΑΓΩΓΗΣ

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

Σειρά1 42% 25% 15% 3% 1% 0,20% 0,10% 0,40% 0,04%

Ισπανία Ιταλία Ελλάδα Τουρκία Πορτογαλία Γαλλία Κύπρος Αργεντινή USA

3η χώρα

παγκοσμία

στην

παραγωγή

ελαιόλαδου

Ο ΔΑΚΟΣ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ

Τάξη: Diptera

Οικογένεια: Tephritidae

Γένος: Bactrocera

Μονοφάγο είδος

Η ζημία είναι: ποσοτική και ποιοτική

Οι απώλειες είναι δυνατό να υπερβούν το 30% της ολικής παραγωγής

Οικονομικές ζημιές της τάξεως των 800.000.000 $ παγκοσμίως

ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Bactrocera oleae

ΈΛΕΓΧΟΣ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΤΟΥ B. oleae

Οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα

Πυρεθρίνες

Spinosad

Κίνδυνοι:

Οικολογικές διαταραχές

Δημιουργία και εξάπλωση ανθεκτικότητας

Επιβλαβείς τοξικολογικές επιδράσεις

Συνέπειες στην υγεία του ανθρώπου

SIT (Sterile Insect Technique), τεχνική του στείρου εντόμου

SIT

Απαραίτητη

προϋπόθεση αποτελεσματικής εφαρμογής της SIT αποτελεί ο διαχωρισμός των δύο φύλων, ώστε να εξαπολύονται μόνο αρσενικά

Γενετικός μετασχηματισμός

Επιτυχής SIT στη Μεσογειακή μύγα (Tephritidae) λόγω

ανάπτυξης μοριακών και γενετικών εργαλείων

ενώ

Στον δάκο μεγάλη έλλειψη μοριακών και γενετικών εργαλείων

Αρχές του ’70 αποτυχία της μεθόδου

χαμηλή ανταγωνιστικότητα εργαστηριακών αρσενικών

εντόμων σε σχέση με τα άγρια

SIT

ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ SIT

ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΤΟΠΩΝ

ΦΥΛΟΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ

ΚΑΤΑΝΟΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ

ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ

ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ

ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ

ΣΚΟΠΟΣ

Διερεύνηση διαφορικής έκφρασης τρανσκριπτόματος και πρωτεόματος σε:

Αρσενικά και θηλυκά άτομα δάκου με εντοπισμό και απομόνωση

γονιδίων που εμπλέκονται σε μονοπάτια φυλοδιαχωρισμού

Ευαίσθητα και ανθεκτικά στο εντομοκτόνο spinosad άτομα με σκοπό την

αποκάλυψη μηχανισμών ανθεκτικότητας

1. ΤΡΑΝΣΚΡΙΠΤΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

• Ανάλυση του συνόλου της γονιδιακής έκφρασης

• Εξετάζει το επίπεδο έκφρασης ΟΛΩΝ των mRNAs σε ένα

δεδομένο κυτταρικό πληθυσμό

RNA Extraction

RNA-sequencing

mRNA selection

Library preparation

Sequencing Data analysis

Complete SOLiD4 system

ΣΥΝΑΡΜΟΛΟΓΗΣΗ

• Contig: μικρά διαβάσματα της αλληλουχίας με επικαλύψεις ώστε να

συναρμολογούνται σε ένα μεγαλύτερο μετάγραφο

ΕΝΤΟΜΑ

1. Αρσενικά

♂

2. Θηλυκά

♀

όργανα αναπαραγωγής

(testis)

3. Ευαίσθητα 4. Ανθεκτικά στο

spinosad

(sp, acg)

κεφάλια

Συνολικά κατασκευάστηκαν 4 βιβλιοθήκες…

ΙΣΤΟΙ

Εντοπισμός γονιδίων που υπερεκφράζονται

RESISTANT-SENSITIVE

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

• Στατιστικά σημαντικά διαφορετικής έκφρασης γονίδια (MA-plot)

• Διαφορές έκφρασης μεταξύ ευαίσθητων και ανθεκτικών εντόμων

ποσοστό % ποσοστό %

2. ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

• Νέα προσέγγιση μελέτης των βιολογικών συστημάτων

• Ασχολείται με την ανάλυση του πρωτεόματος:

του συνόλου των πρωτεϊνών ενός οργανισμού και ιδιαίτερα με τις

δομές και τις λειτουργίες τους

Η πρωτεΐνη έλκεται κάτω δεξιά ή αριστερά ανάλογα με το μοριακό βάρος της

2D GEL-PROTEOMICS

Συλλογή ♂ και ♀ κεφαλιών δάκου και διαχωρισμός πρωτεϊνών με 2D

Ταυτοποίηση πρωτεϊνών μέσω βάσης δεδομένων της Drosophila melanogaster

Διαφορές αρσενικών-θηλυκών εντόμων σε 2D-PAGE

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Table1. Proteins Identified by Mass Spectrometry after Separation by 2D-PAGE

Spot

no

Protein name Accession no. Mw(kDa) pI Length

(aa)

2 ArgK-PB FBpp0076271 47.9 6.04 432

2 IDH(Isocitrate

Dehydrogenase)

Q9VWH4 40.8 7.36 377

3 14-3-3ε FBpp0082989 29.2 4.84 256

3 14-3-3ζ FBpp0087500 28.3 4.93 248

3 Snap25 FBpp0110435 23.7 4.61 212

4 Ranbp21 FBpp0074528 139.1 6.86 1241

6 Act87E FBpp0082253 41.8 5.48 376

6 Act5C FBpp0070788 41.8 5.48 376

6 CG30325-PA FBpp0086000 86.5 9.96 750

6 GstD1-PA FBpp0082077 23.9 7.23 209

6 GstD9-PA FBpp0082078 25.4 5.34 218

7 Jafrac 1-PB

(Peroxiredoxin)

FBpp0073594 21.7 5.34 194

H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση

(Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του

Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του

Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) – Ερευνητικό

Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ . Επένδυση στην κοινωνία της

γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου.