Α ÿ Η Α ΩΕ Η ΑΑΗ ΗΑ ÿ Ε ΑΑ Η ΕΑ, Ε BACTROCERA OLEAE, Ε...
Transcript of Α ÿ Η Α ΩΕ Η ΑΑΗ ΗΑ ÿ Ε ΑΑ Η ΕΑ, Ε BACTROCERA OLEAE, Ε...
ΤΡΑΝΣΚΡΙΠΤΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ
ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΟΥ
ΠΑΡΑΣΙΤΟΥ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ, ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ
BACTROCERA OLEAE, ΜΕ ΕΜΦΑΣΗ ΣΤΑ
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΦΥΛΟΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΚΑΙ
ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΑ ΕΝΤΟΜΟΚΤΟΝΑ
Σαγρή Χ.Ευθυμία
Υπ. Διδάκτωρ Παν/μιου Θεσσαλίας
Τμήμα: Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας
Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Γονιδιωματικής
Επιβλέπων καθηγητής: Ματθιόπουλος Κων/νος
Department of Biochemistry and Biotechnology
University of Thessaly
Laboratory of Molecular Biology and Genomics
Η ΕΛΙΑ
• Ελαιόλαδο
Βασικό στοιχείο της Μεσογειακής δίαιτας
• Συνολικά 97 εκατομμύρια στρέμματα!
ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ
Το 98% της παγκόσμιας παραγωγής βρίσκεται στη λεκάνη της Μεσογείου
ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ ΠΟΣΟΣΤΑ ΕΛΑΙΟΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
Σειρά1 42% 25% 15% 3% 1% 0,20% 0,10% 0,40% 0,04%
Ισπανία Ιταλία Ελλάδα Τουρκία Πορτογαλία Γαλλία Κύπρος Αργεντινή USA
3η χώρα
παγκοσμία
στην
παραγωγή
ελαιόλαδου
Ο ΔΑΚΟΣ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ
Τάξη: Diptera
Οικογένεια: Tephritidae
Γένος: Bactrocera
Μονοφάγο είδος
Η ζημία είναι: ποσοτική και ποιοτική
Οι απώλειες είναι δυνατό να υπερβούν το 30% της ολικής παραγωγής
Οικονομικές ζημιές της τάξεως των 800.000.000 $ παγκοσμίως
ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Bactrocera oleae
ΈΛΕΓΧΟΣ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΤΟΥ B. oleae
Οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα
Πυρεθρίνες
Spinosad
Κίνδυνοι:
Οικολογικές διαταραχές
Δημιουργία και εξάπλωση ανθεκτικότητας
Επιβλαβείς τοξικολογικές επιδράσεις
Συνέπειες στην υγεία του ανθρώπου
SIT (Sterile Insect Technique), τεχνική του στείρου εντόμου
SIT
Απαραίτητη
προϋπόθεση αποτελεσματικής εφαρμογής της SIT αποτελεί ο διαχωρισμός των δύο φύλων, ώστε να εξαπολύονται μόνο αρσενικά
Γενετικός μετασχηματισμός
Επιτυχής SIT στη Μεσογειακή μύγα (Tephritidae) λόγω
ανάπτυξης μοριακών και γενετικών εργαλείων
ενώ
Στον δάκο μεγάλη έλλειψη μοριακών και γενετικών εργαλείων
Αρχές του ’70 αποτυχία της μεθόδου
χαμηλή ανταγωνιστικότητα εργαστηριακών αρσενικών
εντόμων σε σχέση με τα άγρια
SIT
ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ SIT
ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΤΟΠΩΝ
ΦΥΛΟΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ
ΚΑΤΑΝΟΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ
ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ
ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ
ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ
ΣΚΟΠΟΣ
Διερεύνηση διαφορικής έκφρασης τρανσκριπτόματος και πρωτεόματος σε:
Αρσενικά και θηλυκά άτομα δάκου με εντοπισμό και απομόνωση
γονιδίων που εμπλέκονται σε μονοπάτια φυλοδιαχωρισμού
Ευαίσθητα και ανθεκτικά στο εντομοκτόνο spinosad άτομα με σκοπό την
αποκάλυψη μηχανισμών ανθεκτικότητας
1. ΤΡΑΝΣΚΡΙΠΤΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ
• Ανάλυση του συνόλου της γονιδιακής έκφρασης
• Εξετάζει το επίπεδο έκφρασης ΟΛΩΝ των mRNAs σε ένα
δεδομένο κυτταρικό πληθυσμό
RNA Extraction
RNA-sequencing
mRNA selection
Library preparation
Sequencing Data analysis
Complete SOLiD4 system
ΣΥΝΑΡΜΟΛΟΓΗΣΗ
• Contig: μικρά διαβάσματα της αλληλουχίας με επικαλύψεις ώστε να
συναρμολογούνται σε ένα μεγαλύτερο μετάγραφο
ΕΝΤΟΜΑ
1. Αρσενικά
♂
2. Θηλυκά
♀
όργανα αναπαραγωγής
(testis)
3. Ευαίσθητα 4. Ανθεκτικά στο
spinosad
(sp, acg)
κεφάλια
Συνολικά κατασκευάστηκαν 4 βιβλιοθήκες…
ΙΣΤΟΙ
Εντοπισμός γονιδίων που υπερεκφράζονται
RESISTANT-SENSITIVE
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
• Στατιστικά σημαντικά διαφορετικής έκφρασης γονίδια (MA-plot)
• Διαφορές έκφρασης μεταξύ ευαίσθητων και ανθεκτικών εντόμων
ποσοστό % ποσοστό %
2. ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ
• Νέα προσέγγιση μελέτης των βιολογικών συστημάτων
• Ασχολείται με την ανάλυση του πρωτεόματος:
του συνόλου των πρωτεϊνών ενός οργανισμού και ιδιαίτερα με τις
δομές και τις λειτουργίες τους
Η πρωτεΐνη έλκεται κάτω δεξιά ή αριστερά ανάλογα με το μοριακό βάρος της
2D GEL-PROTEOMICS
Συλλογή ♂ και ♀ κεφαλιών δάκου και διαχωρισμός πρωτεϊνών με 2D
Ταυτοποίηση πρωτεϊνών μέσω βάσης δεδομένων της Drosophila melanogaster
Διαφορές αρσενικών-θηλυκών εντόμων σε 2D-PAGE
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Table1. Proteins Identified by Mass Spectrometry after Separation by 2D-PAGE
Spot
no
Protein name Accession no. Mw(kDa) pI Length
(aa)
2 ArgK-PB FBpp0076271 47.9 6.04 432
2 IDH(Isocitrate
Dehydrogenase)
Q9VWH4 40.8 7.36 377
3 14-3-3ε FBpp0082989 29.2 4.84 256
3 14-3-3ζ FBpp0087500 28.3 4.93 248
3 Snap25 FBpp0110435 23.7 4.61 212
4 Ranbp21 FBpp0074528 139.1 6.86 1241
6 Act87E FBpp0082253 41.8 5.48 376
6 Act5C FBpp0070788 41.8 5.48 376
6 CG30325-PA FBpp0086000 86.5 9.96 750
6 GstD1-PA FBpp0082077 23.9 7.23 209
6 GstD9-PA FBpp0082078 25.4 5.34 218
7 Jafrac 1-PB
(Peroxiredoxin)
FBpp0073594 21.7 5.34 194
H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση
(Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του
Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του
Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) – Ερευνητικό
Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ . Επένδυση στην κοινωνία της
γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου.