ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΓΕΝΙΚΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ

ΘΕΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΣΤΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΚΛΑΔΟΣ ΙΙΙ ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

«Προσδιορισμός υπολειμμάτων των φυτοπροστατευτικών προϊόντων σε αγροτικά

προϊόντα με πολύ-υπολειμματικές μεθόδους και την τεχνική HRMS»

Μαργαρίτα ΔήμαΓεωπόνος

Αθήνα 2014

Εισαγωγή• Τρόφιμα και σύγχρονοι μέθοδοι παραγωγής τους.

• Υπολείμματα των φ.π. στα τρόφιμα.

• Παγκοσμίως χρησιμοποιούνται πάνω από 800 δραστικές και πολλαπλάσια εμπορικά σκευάσματα.

• Διάφορες Χημικές ομάδες → Φυσικοχημικές ιδιότητες

• Μέθοδοι αναλύσεις → Πολύ-υπολειμματικές

Υπολείμματα Φυτοπροστατευτικών Προϊόντων

• Μέγιστο Όριο Υπολειμμάτων (Maximum Residue Level-MRL) – η μέγιστη επιτρεπόμενη συγκέντρωση υπολειμμάτων φ.π. και των τοξικών μεταβολιτών τους, η οποία επιτρέπεται να παραμείνει σε ένα προϊόν φυτικής προέλευσης (Το MRL εκφράζεται σε mg ουσίας ανά kg βάρους φυτικού προϊόντος ή ppm ).

• Ανάλυση υπολειμμάτων – η ανίχνευση και ο προσδιορισμός των φ.π. σε φυτικά δείγματα, έτσι ώστε να μπορεί να πραγματοποιηθεί η αξιολόγησή τους, όσον αφορά την ασφάλεια του καταναλωτή και την τήρηση της νομοθεσίας.

Μέθοδοι ανάλυσης υπολειμμάτων Πολύ-υπολειμματικές μέθοδοι (Multi-Residues Methods,

MRMs) – επιτρέπεται ο προσδιορισμός πολλαπλών υπολειμμάτων φ.π., διαφορετικών χημικών ομάδων με κοινό στάδιο επεξεργασίας δείγματος και προσδιορισμού.

Οι MRMs, περιλαμβάνουν αρχικά ένα στάδιο εκχύλισης των αναλυτών στόχων με οργανικό δ/τη ή μίγμα δ/των και στη συνέχεια ένα στάδιο καθαρισμού του εκχυλίσματος από τις ουσίες του υποστρώματος.

Οι πιο διαδομένες αναλυτικές τεχνικές για τον προσδιορισμό των αναλυτών-στόχων, είναι η αέρια χρωματογραφία (GC), και η υγρή χρωματογραφία (LC) με εκλεκτικούς ανιχνευτές (π.χ. αζώτου φωσφόρου, σύλληψης ηλεκτρονίων, ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων) ή φασματομετρία μάζας .

Στόχοι της παρούσας διατριβής

Ανάπτυξη και επικύρωση μιας νέας μεθόδου προσδιορισμού φ.π. η οποία βασίζεται:

1. Πολύ-υπολειμματική μέθοδος επεξεργασίας δείγματος.

2. Σύστημα φασματομετρίας μάζας υψηλής ευκρίνειας (LC-TOF).

QuEChERS

LC-TOF/MSΣύστημα LC: Agilent Series 1200Σύστημα MS: Agilent 6220

ΔιαχωρισμόςΒαθμιδωτό Πρόγραμμαέκλουσης 2 δ/των (A&B)Α: H2O , 5mM HCΟONH4, 0,1%HCOOHB: MeOH, 5mM HCΟONH4, 0,1%HCOOH

Στήλες:Polaris C-18, (50 x 2.1 mm, 5mm μέγεθος σωματιδίων)

Τρόπος ιονισμούHλεκτροδιάχυσης (ΕSΙ+)

Φασματομετρίας Μάζας Χρόνου Πτήσης Ιόντων Μοριακό ιόν + 1 θραύσμα

Βαθμονόμηση Μαζών

Διάλυμα Αναφοράς

Διάλυμα Ελέγχου Καταλληλότητας

m(amu)

Χρόνοι πτήσης

(μs)

118.0863 20.79841

322.0481 33.53829

622.029 46.12659

922.0098 55.88826

1521.971 71.45158

2121.933 84.14302

2721.895 95.13425Ιόν m/z Ακριβής

μάζα

ψευδομοριακό ιόν [ΜΗ+]

C8H15ClN5+ 216,110

Θραύσμα C5H9ClN5+ 174,0541

Positive Ion (m/z) Empirical Formula

121.050873 C5H5N4

922.009798 C18H19O6N3P3F24

Έλεγχος καταλληλότητας συστήματος

2o )( ttAm m

Διαδικασία επικύρωσης της μεθόδου

Εκτίμηση της ορθότητας

Εκτίμηση της πιστότητας

Μελέτη της γραμμικότητας

Εκτίμηση επίδρασης του Υποστρώματος

Ορισμός ορίου ποσοτικοποίησης (LOQ)

Εκτίμηση ορθότητας και πιστότητας (1/2)

Εμβολιασμός σε 2 επίπεδα

1ο επίπεδο: 0,01 mg/kg (ώστε να καλύπτει τα ισχύοντα MRL)

2ο επίπεδο: το δεκαπλάσιο του MRL

Εκτίμηση ορθότητας και πιστότητας (2/2)

Αριθμός επαναλήψεων: 5 σε κάθε επίπεδο

Ως αποδεκτές μέσες εκατοστιαίες ανακτήσεις θεωρούνται αυτές στην περιοχή 70-120% για όλες τις προσδιοριζόμενες ενώσεις, με σχετική τυπική απόκλιση (SDR) ≤ 20%

Μελέτη Ορθότητας Μεθόδου (Κουνουπίδι)

Μελέτη Πιστότητας Μεθόδου (Κουνουπίδι)

Μελέτη Ορθότητας Μεθόδου (Μανταρίνι)

Μελέτη Πιστότητας Μεθόδου (Μανταρίνι)

Μελέτη Ορθότητας Μεθόδου (Ροδάκινο)

Μελέτη Πιστότητας Μεθόδου (Ροδάκινο)

Εκτίμηση της γραμμικότητας

Εκτιμήθηκε με την εξέταση του διαγράμματος της απόκρισης του ανιχνευτή ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του αναλύτη

Εκτιμήθηκαν οι παράμετροι:b : κλίσης της γραμμής παλινδρόμησης Sb : εκτιμούμενο τυπικό σφάλμα της κλίσης b της γραμμής

παλινδρόμησης a : τεταγμένη επί την αρχή της γραμμής παλινδρόμησηςSa : εκτιμούμενο τυπικό σφάλμα της τεταγμένης επί την αρχή a της

γραμμής παλινδρόμησης r : συντελεστής συσχέτισηςr2 : τετράγωνο συντελεστή συσχέτισης Su: αβεβαιότητα που προκύπτει από την γραμμή παλινδρόμησης

Εκτίμηση της γραμμικότητας

Εκτίμηση της επίδρασης του υποστρώματος

Σύγκριση κλίσεων καμπύλων αναφοράς σε ΥπόστρωμαΔ/τη

22

21

21

bb

calSS

bbt

Αποδεκτή η μηδενική υπόθεση → Η επίδραση του υποστρώματος δεν είναι σημαντική

Εκτίμηση του Υποστρώματος (κουνουπίδι)

Εκτίμηση του Υποστρώματος (Μανταρίνι)

Εκτίμηση του Υποστρώματος (Ροδάκινο)

Υπολογισμός του ορίου ποσοτικοποίησης (LOQ)

Προσδιορίζεται ως το ελάχιστο επίπεδο συγκέντρωσης, στο οποίο ο αναλύτης μπορεί να προσδιοριστεί αξιόπιστα.

Στο LOQ πρέπει να ισχύει S/N ≥10

LOQ=0,01 mg/kg

Χρωματογράφημα πλήρους φάσματος εμβολιασμένου δείγματος κουνουπιδιού σε συγκέντρωση 0,01 mg/kg σε

σύστημα LC-ESI(+)-TOF

Ανακατασκευή χρωματογραφήματος για την ουσία chlorpyriphos methyl σε δείγμα κουνουπίδι, σε συγκέντρωση

0,01 mg/kg σε σύστημα LC-ESI(+)-TOF

Φάσμα μαζών της χρωματογραφικής κορυφής της ουσίας chlorpyriphos methyl σε δείγμα κουνουπίδι

Χρωματογράφημα πλήρους φάσματος εμβολιασμένου δείγματος μανταρινιού σε συγκέντρωση 0,01 mg/kg σε

σύστημα LC-ESI(+)-TOF

Ανακατασκευή χρωματογραφήματος για την ουσία chlorpyriphos methyl σε δείγμα μανταρίνι, σε συγκέντρωση 0,01

mg/kg σε σύστημα LC-ESI(+)-TOF

Φάσμα μαζών της χρωματογραφικής κορυφής της ουσίας chlorpyriphos ethyl σε δείγμα μανταρίνι

Χρωματογράφημα πλήρους φάσματος εμβολιασμένου δείγματος ροδάκινου σε συγκέντρωση 0,01 mg/kg σε

σύστημα LC-ESI(+)-TOF

Ανακατασκευή χρωματογραφήματος για την ουσία chlorpyriphos methyl σε δείγμα ροδάκινο, σε συγκέντρωση

0,01 mg/kg σε σύστημα LC-ESI(+)-TOF

Φάσμα μαζών της χρωματογραφικής κορυφής της ουσίας chlorpyriphos methyl σε δείγμα ροδακινο

Συμπεράσματα (1/2)Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε και

επικυρώθηκε μια μέθοδος προσδιορισμού φ.π. η οποία βασίζεται στην μέθοδο εκχύλισης QuEChERS.

Η ταυτοποίηση και η ποσοτικοποίηση των αναλυτών πραγματοποιήθηκε με την τεχνική LC-TOF, μία σχετικά νέα τεχνική στον τομέα προσδιορισμού υπολειμμάτων φ.π. που μέχρι πρότινος χρησιμοποιούνταν ως τεχνική σάρωσης.

Συμπεράσματα (2/2)

Η μέθοδος επικυρώθηκε επιτυχώς για την αξιοπιστία της σε κουνουπίδι, μανταρίνι και ροδάκινο.

Από τα στοιχεία επικύρωσης προκύπτει ότι η μέθοδος για την πλειονότητα των αναλυτών παρουσιάζει:

αποδεκτή γραμμικότητα με r ≥ 0,99, αποδεκτή ορθότητα με ποσοστά ανάκτησης 70-120% ,

αποδεκτή πιστότητα με SDR ≤ 20%.

LOQ=0,01 mg/kg

Σας Ευχαριστώ πολύ για τη προσοχή σας.