Αναλυτική μεθοδολογία στη γενική ούρων

Λεβαντία Δ. ΖαχαριάδουΒιοπαθολόγος

Αναπληρώτρια Διευθύντρια Μικροβιολογικού Εργαστηρίου

Νοσοκομείου Παίδων ” Η Αγία Σοφία “

Σεμινάριο Τεχνολόγων Ιατρικών Εργαστηρίων και ΒΙΒΕ

Αθήνα, 13 Μαρτίου 2010

Σκοπός άριστων συνθηκών συλλογήςκαι μεταφοράς δείγματος ούρων

Αποφυγή ή ελαχιστοποίηση :

Επιμόλυνσης από βακτήρια (καλό πλύσιμο, απομόνωση κόλπου). Ανάπτυξης μικροβίων μετά τη συλλογή. Καταστροφής ή θανάτωσης διαγνωστικά σημαντικών μικροβίων. Αλλοίωσης διαγνωστικά χρήσιμων στοιχείων (πώμα, σκοτάδι).

Απαιτούμενος όγκος δείγματος Γενική ούρων : 3-12 ml. Καλλιέργεια ούρων : 1-3 ml.

Συντήρηση δείγματος

Χημική εξέταση : 24 ώρες στους 4o C

διαύγειας, pH, πρωτεΐνη και νιτρώδη ψευδώς (+)

Μικροσκοπική εξέταση : 1 ώρα στους 20o C

2-4 ώρες στους 4o C

pH 7.0 ή ΕΒ καταστροφή λευκών καταστροφή εμμόρφων

Δείγμα ούρων (Ι)

Πρώτα πρωινά

Λήψη αμέσως μετά την πρωινή έγερση μετά από ολονύκτια κατάκλιση οκτώ ωρών (όχι λιγότερο από 4

ώρες), πριν τη λήψη πρωινού γεύματος ή άλλη δραστηριότητα.

Άριστο δείγμα — συμπύκνωση — οξύτητα — σταθερή σύσταση και Ειδικό Βάρος — εύκολη συλλογή και συντήρηση — γρήγορη μεταφορά

Δείγμα ούρων (ΙΙ)

Δεύτερα πρωινά

Λήψη 2-4 ώρες μετά την πρώτη πρωινή ούρηση με μόνο ένα ποτήρι νερό μετά τις 10μμ της προηγούμενης μέχρι τη λήψη του δείγματος.

Επιδρούν — λήψη υγρών — τροφή — κίνηση

Άριστο δείγμα για εξέταση με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης

(phase contrast).

Δείγμα ούρων (ΙΙΙ)

Τυχαίο δείγμα

Μέρος μιας ούρησης χωρίς διευκρίνιση : — όγκου — ώρας της ημέρας — λεπτομερειών προετοιμασίας του ασθενούς

Αποδεκτό μόνο σε οξείες καταστάσεις γιατί μπορεί

να υπάρξουν ψευδώς (+) και ψευδώς (-) αποτελέσματα.

Βιοχημική ανάλυση

Νεφρική λειτουργία

Φυσικοί χαρακτήρες ούρων

1. Διαύγεια : διαυγή, αμέσως μετά την ούρηση.

2. Χρώμα : κίτρινο, που οφείλεται στο ουρόχρωμα, αλλά και σε μικρά ποσά ουροχολίνης και ουροερυθρίνης.

3. Οσμή : χαρακτηριστική, ασθενής, αρωματική.

4. Ειδικό βάρος : 1022 (1010-1040). Σημαντικός, αλλά αδρόςδείκτης ικανότηταςσυμπύκνωσηςιδιαίτερα στα παιδιά ( ΕΒ βακτηρίων/ml, λευκών κ.ο.π)

Χημικοί χαρακτήρες ούρων

1. Αντίδραση (pH)2. Λεύκωμα3. Γλυκόζη4. Κετόνες5. Αιμοσφαιρίνη6. Χολερυθρίνη7. Ουροχολινογόνο8. Νιτρώδη9. Λευκοκυτταρική εστεράση10. Ασκορβικό

Ανακίνηση

Αντίδραση (pH)

Αντανακλά την ικανότητα του νεφρού να διατηρεί τη φυσιολογική συγκέντρωση Η+ στο πλάσμα και το εξωκυττάριο υγρό,

αποβάλλοντας μεταβολίτες που δεν μπορούν να αποβληθούν από τους πνεύμονες (SO4

2-, PO43-, HCl, πυρουβικό, γαλακτικό, νιτρικό, κετόνες).

Φυσιολογική τιμή 6.0 (4.6-8.0).

Μέθοδοι Ταινίες Multistix : διπλό σύστημα δεικτών (από 5 μέχρι 9).

Ταινίες pH

pHμετρο

• άμεση ανάγνωση• ψυγείο 40 C ή πάγος• αλκαλοποίηση σε παραμονή ( CO2, μικρόβια)

Μεταβολές του pH

Μεταβολική οξέωση Διαβητική οξέωση Αναπνευστική οξέωση Παράδοξη οξυουρία (έμετοι, διουρητικά)

Δίαιτα πλούσια σε φρούτα, εσπεριδοειδή, χορταρικά Αλκαλοποίηση για λιθιάσεις Αλκαλοποίηση σε θεραπεία με αμινογλυκοσίδες, σουλφοναμίδες ή δηλητηρίασης από σαλικυλικά Αμέσως μετά το φαγητό

Μεταβολική αλκάλωση Αναπνευστική αλκάλωση Νεφρική σωληναριακή οξέωση

Φυσιολογικές

Δίαιτα πλούσια σε πρωτεΐνες Οξίνιση για λιθιάσεις Οξίνιση για ασβεστιουρία Κατά τη διάρκεια της νύχτας

Παθολογικές

______________

Φ.Τ.

_____________

4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.0

παιδιά ▪ συχνά αλκαλικά ούρα

Proteus spp, Klebsiella spp, Pseudomonas spp. ▪ διάσπαση ουρίας σε αμμωνία pH 7.0

παιδιά ▪ συχνά αλκαλικά ούρα

Proteus spp, Klebsiella spp, Pseudomonas spp. ▪ διάσπαση ουρίας σε αμμωνία pH 7.0

Λεύκωμα

Αποτελείται από περισσότερες από 200 πρωτεΐνες που προέρχονται από :

α. το πλάσμα (λευκωματίνη, πολλές μικρές σφαιρίνες). β. το ουροποιητικό (πρωτεΐνη Tamm-Horsfall, IgA, πρωτεΐνες και

ένζυμα επιθηλιακών κυττάρων, αποδομημένα κύτταρα και

λευκοκύτταρα).

Φυσιολογικά απεκκρίνεται λεύκωμα από τα ούρα σε ποσότητα μέχρι : α. 50 mg το 24ωρο. β. 10 mg/dl σε τυχαίο δείγμα.

Λευκωματουρία : Η αποβολή λευκώματος > 150 mg/ 24ωρο. Μικρολευκωματινουρία : Η αποβολή λευκώματος 30-300 mg/ 24ωρο.

Μικρολευκωματινουρία

Αποτελεί παράγοντα επικινδυνότητας σε πάσχοντες από σακχαρώδη διαβήτη γιατί ανιχνεύει πρώιμη σπειραματική βλάβη.

Σημαντικό είναι επίσης να ανιχνεύεται σε πάσχοντες από υπέρταση, ερυθηματώδη λύκο και σε αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης χρόνιας

νεφρικής βλάβης.

Πρέπει να γίνονται πολλαπλές μετρήσεις σε ούρα 24ώρου ή και στα πρώτα πρωινά ούρα (3-30 mg/dl).

Σημαντική είναι η σχέση λευκωματίνης/κρεατινίνη ούρων στα πρώτα

πρωινά ούρα : άνδρες > 2,5/mmol παθολογική γυναίκες ≥ 3,5mg/mmol παθολογική

Μέθοδοι ποιοτικού προσδιορισμού λευκώματος

1. Βρασμός : ανιχνεύει > 30 mg/dl (πήξη)

2. Σουλφοσαλικυλικό οξύ : καθίζηση λευκωμάτων (θολερότητα)

3. Σουλφοσαλικυλικό οξύ + βρασμός και ακόλουθη ψύξη : η θολερότητα εξαφανίζεται με το βρασμό και επανεμφανίζεται με την ψύξη στους 40ο C.

4. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός - Ανοσοκαθήλωση

5. Ταινίες : ανιχνεύουν > 5 - 20 mg/dl

λευκωματίνησφαιρίνεςBence-Jones

Bence-Jones

κυρίως λευκωματίνη

Μέθοδοι ποσοτικού προσδιορισμού λευκώματος

1. Ολικά λευκώματα α. Σουλφοσαλικυλικού οξέος : γραμμική από 0.25-150 mg/dl

Θόλωση από λευκωματίνη = 2,4 φορές > σφαιρίνη (+πολυπεπτίδια, γλυκοπεπτίδια, Bence-Jones).ι

β. Διουρίας : παραγωγή ιώδους συμπλόκου από τη σύνδεση λευκωμάτων και πεπτιδίων με Cu++ σε pH > 7.0.

γ. Ερυθρού της πυρογαλλόλης - Μολυβδαινικού Na+ : αντίδραση βασικών αμινοξέων των πρωτεïνών με το σύμπλοκο (γραμμική από 1-200mg/dl).

2. Λευκωματίνη

3. IgG σφαιρίνη

4. Μικρολευκωματίνη

5. β2-μικροσφαιρίνη α. Μικροσωματιδιακή ELISA β. Νεφελομετρία

6. α2-μακροσφαιρίνη α. Ηλεκτροφόρηση β. Νεφελομετρία

α. Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση β. Νεφελομετρία

Καμμία μέθοδος δεν είναι ικανοποιητική

Σύγκριση σφαλμάτων μεθόδων ταινιών και σουλφοσαλικυλικού οξέος

Αίτια Ταινίες Σουλφοσαλικυλικό

οξύΑλκαλικό pH Ψευδώς (+) Ψευδώς (-)

Ειδικό Βάρος » -

Εμποτισμός » -

Χολερυθρίνη » -

Καθαριστικά αμμωνίου » -

Παρουσία αλάτων » -

Σφαιρίνες Ψευδώς (-) Τις ανιχνεύει

Βλεννοπρωτεΐνες » »

Bence-Jones » »

Αντιβιοτικά - Ψευδώς (+)

Αντιφλεγμονώδη - »

Ακτινοσκιερές ουσίες - »

Γλυκόζη

Φυσιολογικά δεν ανιχνεύεται, γιατί επαναρροφάται πλήρως από τα εγγύς εσπειραμένα σωληνάρια.

Παρουσιάζεται στα ούρα όταν το επίπεδό της στο αίμα ξεπερνά τον ουδό του σπειράματος : 180 - 200 mg/dl.

Άλλα σάκχαρα που μπορούν να βρεθούν σε παθολογικές καταστάσεις

στα ούρα είναι : ― λακτόζη ― φρουκτόζη ― γαλακτόζη ― πεντόζη ― σουκρόζη

1. Αντιδραστήριο Benedict : 11-110 mg/dl (ποιοτική - ποσοτική)

αρχή της μεθόδου : αναγωγή ιόντων Cu++ από τα σάκχαρα.

CuSO4 + τρυγικόKN + NaOH + αναγωγικές ουσίες

Cu(OH)2 CuO + K2SCN CuSCN

2. Ταινίες : ανιχνεύουν > 30 mg/dl (θ0 δωματίου) αρχή της μεθόδου : ανίχνευση της γλυκόζης από το διπλό ενζυμικό σύστημα οξειδάσης της γλυκόζης και

υπεροξειδάσης.

Μέθοδοι προσδιορισμού σακχάρων

γλυκόζη

φελίγγειο υγρόθ0

θ0 θ0

πράσινο κίτρινο κεραμιδί λευκό ίζημα

όλα τα σάκχαρα

Σύγκριση μεθόδων προσδιορισμού σακχάρων

Ουσία Benedict Ταινίες

γλυκόζη + +

λακτόζη + -

φρουκτόζη + -

γαλακτόζη + -

μαλτόζη + -

πεντόζη + -

σουκρόζη - -

pH < 4.0 - ψευδώς (+)

Ειδικό βάρος - ψευδώς (-)

κετόνες - ίσως ψευδώς (-)

ασκορβικό ± ψευδώς (-)

κρεατινίνη, ουρικό ± -

αντιβιοτικά + -

H2O2 ίσως ψευδώς (-) +

L-dopa - ψευδώς (-)

Σύγκριση μεθόδων προσδιορισμού σακχάρων

Ουσία Benedict Ταινίες

γλυκόζη + +

λακτόζη + +

φρουκτόζη + +

γαλακτόζη + +

μαλτόζη + +

πεντόζη + +

σουκρόζη - -

pH < 4.0 - ψευδώς (+)

Ειδικό βάρος - ψευδώς (-)

κετόνες - ίσως ψευδώς (-)

ασκορβικό ± ψευδώς (-)

κρεατινίνη, ουρικό ± -

αντιβιοτικά + -

H2O2 ίσως ψευδώς (-) +

L-dopa - ψευδώς (-)

Χρωματογραφία

Σύγκριση μεθόδων προσδιορισμού σακχάρων

Ουσία Benedict Ταινίες

γλυκόζη + +

λακτόζη + +

φρουκτόζη + +

γαλακτόζη + +

μαλτόζη + +

πεντόζη + +

σουκρόζη - -

pH < 4.0 - ψευδώς (+)

Ειδικό βάρος - ψευδώς (-)

κετόνες - ίσως ψευδώς (-)

ασκορβικό ± ψευδώς (-)

κρεατινίνη, ουρικό ± -

αντιβιοτικά + -

H2O2 ίσως ψευδώς (-) +

L-dopa - ψευδώς (-)

Χρωματογραφία

Κετόνες

Προïόντα ατελούς μεταβολισμού των λιπών (δίαιτα, διαβήτης).

Η παρουσία τους στα ούρα είναι ενδεικτική οξέωσης.

Στην κετονουρία βρίσκουμε τρία κετονικά σώματα :

ακετοξεικό οξύ ακετόνη 3-ΟΗ-βουτυρικό- CO2 + H+

- H+

20% 2% 78%

πτητικό

Προβλήματα

Ψευδώς (+) Ψευδώς (-)

Ειδικό βάρος Μετατροπή

ακετοξεικού σε

ακετόνη (βακτήρια)

Έγχρωμες ουσίες (L-dopa, φθαλεΐνες, ακετυλοκυστεΐνη)

Αιμοσφαιρίνη

Φυσιολογικά δεν ανιχνεύεται (~ 1.000 ερυθρά/ml ούρων).

Σε μεγάλη παραγωγή (αιμόλυση), η ελεύθερη αιμοσφαιρίνη (ΜΒ: 32.000) απεκκρίνεται από τα ούρα.

Διακρίνουμε: ― Αιματουρία ▪ Παρουσία ερυθρών στα ούρα, απότοκη νόσου ή

τραύματος σε οποιοδήποτε σημείο του ουροποιητικού. ▪ Oξεία κυστίτιδα 40-60%.

― Αιμοσφαιρινουρία ▪ Παρουσία Hb στα ούρα σαν συνέπεια ενδοαγγειακής αιμόλυσης.

Θολά, νεφελώδη, ροζ, κόκκινα, καφέ

Διαυγή, κόκκινα έως καφέ

Προβλήματα

Ψευδώς (+) Ψευδώς (-)

Ισχυρά οξειδωτικά Ειδικό βάρος

Οξειδάση μικροβίων Λεύκωμα

Νιτρώδη (καθυστέρηση)

Ασκορβικό

Φορμόλη

Ευαισθησία 70-80%

Χολερυθρίνη

σφαιρίνη αιμοσφαιρίνη Fe2+

χολοπρασίνη

χολερυθρίνη

αναγωγή

+ λευκωματίνη

ΑΙΜΑ

+ γλυκουρονικό

ΗΠΑΡΧΟΛΗάμεση

χολερυθρίνη

Καφεκίτρινα ή πρασινοκίτρινα

Κίτρινος αφρός

έμμεση χολερυθρίνη

υδατοδιαλυτή, περνάει στα ΟΥΡΑ σε: — απόφραξη, — ενδοηπατική χολόσταση, — ηπατίτιδα από φάρμακα απέκκρισης σε pH > 7.0

Μέθοδοι προσδιορισμού χολερυθρίνης

1. Αντίδραση διαζωσώματος

αρχή της μεθόδου : σύνδεση σουλφανυλικού οξέος 1% + ΝαΝΟ3 0,5% με χολερυθρίνη σε όξινο περιβάλλον (+ χρωμογόνο) πολύ ειδική : 0,05-0,1 mg/dl Multistix : από 0,8 mg/dl δεν επηρεάζεται από την παρουσία ουροχολινογόνου ή σαλικυλικών

2. Αντίδραση τριχλωριούχου σιδήρου

αρχή της μεθόδου : οξείδωση της χολερυθρίνης από τον FeCl3 και παραγωγή

χολοπρασίνης

(τα ούρα φυγοκεντρούνται με ίσο όγκο BaCl2 5% και χρησιμοποιούμε το ίζημα)

Προβλήματα

Ψευδώς (+) Ψευδώς (-)

Έγχρωμες ουσίες (ριφαμπικίνη) Ασκορβικό οξύ

Μεταβολίτες θειαζινών Νιτρώδη

Ινδικάνη

Ουροχολινογόνο

έμμεση χολερυθρίνη

Η ανίχνευσή του είναι καλύτερα να γίνεται σε ούρα δύο ωρών μετά το γεύμα με καλή ενυδάτωση (τρία δείγματα).

Φυσιολογική τιμή : ≤ 1 unit/ml.

αναγωγή

ΟΥΡΑ

ΚΟΠΡΑΝΑουροχολινογόνομεσοχολινογόνο

κοπροχολινογόνο

ουροχολίνημεσοχολίνηκοπροχολίν

η

ΗΠΑΡ ΧΟΛΗ

οξείδωσηΕΝΤΕΡΟ

95%

5%

80%

20%

άχρω

μα

έγχρω

μα

Πορτοκαλοκόκκινα ή πορτοκαλοκαφέ

Προβλήματα

Ψευδώς (+) Ψευδώς (-)

Πορφοχολινογόνο Έκθεση σε φως (ουροχολίνη)

Σουλφοναμίδες, μεθυλ-dopa Φορμόλη

Έγχρωμες ουσίες (χολερυθρίνη, PAS) Νιτρώδη

Θερμοκρασία

Νιτρώδη

Φυσιολογικά δεν ανιχνεύονται στα ούρα.

Εμφανίζονται σε ουρολοιμώξεις από βακτήρια που ανάγουν τα νιτρικά σε νιτρώδη.

Ωρισμένα από αυτά τα βακτήρια δεν παράγουν νιτρώδη

μέσα στην κύστη, γιατί μετατρέπουν τα νιτρικά σε ΝΗ3

και άλλα παράγωγα.

Απαιτούνται ούρα που έχουν μείνει στην κύστη για τουλάχιστον τέσσερις ώρες.

Προβλήματα

Ψευδώς (+) Ψευδώς (-)

Επιμόλυνση, κακή συντήρηση Ειδικό βάρος

Έγχρωμα ούρα Ασκορβικό

Ουροχολινογόνο

pH ‹ 6.0

Καθετήρες, τυχαίο δείγμα, διουρητικά

Ευαισθησία 35-80% Ειδικότητα 92-100%

Λευκοκυτταρική εστεράση

Βρίσκεται στα αζουρόφιλα κοκκία των ουδετεροφίλων.

Ανιχνεύει κατεστραμμένα και ακέραια ουδετερόφιλα, όχι λεμφοκύτταρα.

Το ποσό της εστεράσης στα ούρα σχετίζεται με τον αριθμό των ουδετερόφιλων σ’ αυτά.

Ο Addis το 1912 έδειξε ότι οι υγιείς αποβάλλουν μέχρι 10 κύτταρα αίματος/μl (cut off μεθόδου).

Προβλήματα

Ψευδώς (+) Ψευδώς (-)

Τριχομονάδες Ειδικό βάρος + pH

Ηωσινόφιλα Ασκορβικό

Οξειδωτικά, φορμόλη Γλυκόζη › 500 mg/dl

Νιτροφουραντοΐνη Λευκωματίνη › 300 mg/dl

Έγχρωμα ούρα Οξαλικά

Κεφαλοσπορίνες, γενταμυκίνη, τετρακυκλίνες

Ασκορβικό οξύ

Φυσιολογικά βρίσκεται στα ούρα σε ποσότητα 2-10 mg/dl.

Αναγωγική ουσία που όταν βρίσκεται στα ούρα σε ποσότητα › 25 mg/dl παρεμβαίνει στα αποτελέσματα άλλων

παραμέτρων : ▪ γλυκόζη ▪ αιμοσφαιρίνη ▪ χολερυθρίνη ▪ νιτρώδη ▪ λευκοκυτταρική εστεράση

Φαινόμενο " μάσκας "

Ψευδώς (+)

pH κετόνες χολερυθρίνη ουροχολινογόνο νιτρώδη εστεράση

Όργανα ανάγνωσης ταινιών και αναγνώρισης έμμορφων στοιχείων

Αυτόματα, και ημιαυτόματα

Επιτραπέζια, φορητά

Μέθοδοι : ανακλαστική φωτομετρία (ταινίες) διαθλασιμετρία, ταλαντωσιμετρία (Ειδικό

Βάρος)

νεφελομετρία (διαύγεια-θολερότητα)

κυτταρομετρία ροής και χρώση (έμμορφα στοιχεία)

Ταχύτητα αποτελέσματος : 10-90 sec

Μικροσκοπική ιζήματος

Ερυθροκύτταρα φυσιολογικής μορφολογίας

Ακανθοκύτταρα (G1 κύτταρα)

Πολυμορφοπύρηνα καλά συντηρημένα με κυτταροπλασματικά κοκκία και λοβωτούς πυρήνες

Ερυθρά κενά αιμοσφαιρίνης

Ωοειδή μεταβατικά επιθήλια

Στρογγυλά μεταβατικά επιθήλια

Ωοειδές λιπώδες σωμάτιο

Βλαστομύκητες και πλακώδη επιθήλια

Ελεύθεροι πυρήνες και πλακώδη επιθήλια

Κύλινδροι

Κυλινδροειδές Υαλώδης Κοκκώδης Ερυθροκυτταρικός

Πυώδης

Αιμοσφαιρινικός

Επιθηλιακός Κηρώδης

Κρύσταλλοι

Όξινα ούρα Αλκαλικά ούρα

Παθολογικοί

Προσοχή !

Συλλογή Μεταφορά Συντήρηση Θερμοκρασία Ανακίνηση Εμποτισμός ταινίας Χρόνος ανάγνωσης ταινίας Εξουδετέρωση φαινόμενου μάσκας και

‘carryover’ Μικροσκόπηση

Δείγματος

Ευχαριστώ