CAPACIDAD ANTIINFLAMATORIA E
INMUNOMODULADORA DE LA ISOFORMA REGULADORA
DEL COMPLEMENTO C4BP(β-): HACIA LA PREVENCIÓN DE
LA PÉRDIDA DEL INJERTO EN TRASPLANTE DE ÓRGANOS
Josep M. Aran
Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge
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1. Resumen del proyecto
El rechazo agudo del aloinjerto, junto con los efectos secundarios de los regímenes
inmunosupresores, sigue siendo un inconveniente clínico muy importante en el
trasplante de órganos sólidos. Los fármacos inmunosupresores inducen un estado de
tolerancia que suele desaparecer después de su retirada, con la consiguiente pérdida
del injerto. Sin embargo, incluso con supresión inmunológica sostenida, una alta
cantidad de aloinjertos se vuelven progresivamente no funcionales debido al rechazo
crónico. Un objetivo principal en el trasplante es tener tratamientos de
acondicionamiento cortos, ya sea antes o después del trasplante, induciendo una
aceptación permanente del injerto sin supresión inmunológica a largo plazo.
El trasplante renal es el mejor tratamiento posible para muchos pacientes con
insuficiencia renal terminal, pero la disfunción progresiva y la eventual pérdida de
aloinjertos con el retorno a la diálisis se asocia con un aumento de la mortalidad y la
morbilidad. La lesión inmunitaria por rechazo agudo o crónico y por causas no
inmunes, como la nefrotoxicidad de los inhibidores de la calcineurina, y la lesión por
isquemia-reperfusión (IRI) son amenazas potenciales. Por lo tanto, existe necesidad de
regímenes de inmunosupresión simplificados desprovistos de toxicidad y capaces de
inducir una mejora en la supervivencia a largo plazo.
La disfunción del injerto renal en el período inmediatamente posterior al trasplante es
atribuible principalmente a IRI. Su manifestación más grave es la función retrasada del
injerto (DGF), que aumenta el riesgo de rechazo renal posterior y reduce la longevidad
del trasplante. Por otra parte, hallazgos recientes sugieren que una respuesta aloimune
humoral aguda, el rechazo mediado por anticuerpos (AMR), desencadenado por la
unión de aloanticuerpos específicos de donante y la activación del complemento, se
reconoce cada vez más como una contribución significativa a la pérdida del injerto. Por
lo tanto, un control estricto de la inducción del proceso inmunoinflamatorio recurrente
es primordial en el trasplante renal y, en general, en el trasplante de órganos sólidos.
Tanto la inmunidad innata como la inmunidad adaptativa parecen estar implicadas en
el desarrollo y la progresión de IRI y el rechazo del aloinjerto, aunque sus mecanismos
fisiopatológicos detallados de acción todavía están lejos de ser resueltos. Por lo tanto,
el desarrollo de nuevas terapias es necesario para superar estos inconvenientes. La
inhibición del complemento representa una estrategia terapéutica emergente que evita
el rechazo mediado por anticuerpos. En estudios piloto demostramos que, además de
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modular la activación del complemento, la isoforma menor de C4BP(β-) presenta
propiedades antiinflamatorias y es capaz de inducir un estado tolerogénico en las
células dendríticas (DC). Por lo tanto, podría desarrollarse un tratamiento seguro y
eficaz para IRI y/o rechazo del aloinjerto dirigido a la inmunidad innata y adaptativa a
través de la isoforma C4BP(β-).
El objetivo del presente estudio es identificar las vías moleculares por las que C4BP(β-)
suprime la inflamación e induce un estado tolerogénico en las DC. Por otra parte, se
pretende evaluar la eficacia in vivo de C4BP(β-) en la prevención de IRI y
alorreactividad inmune, dirigida a mejorar a largo plazo la supervivencia del injerto en
modelos de alotrasplante renal experimental.
Objetivos específicos:
1- Caracterizar de forma exhaustiva el mecanismo molecular mediante el cual la
isoforma C4BP(β-) del modulador del complemento suprime la generación de una firma
proinflamatoria en DCs humanas.
- Determinación de la capacidad tolerogénica de C4BP(β-) en los dos subtipos
principales de DC (convencionales y plasmacitoides) aislados de sangre periférica.
- Determinación del receptor de superficie involucrado en la inducción de vías de
señalización intracelular que conducen a la tolerogénesis en DC.
- Análisis de transcriptomas, evaluando los mecanismos moleculares de la señalización
de C4BP(β-) en DC usando la tecnología de microarrays de ADN.
2- Evaluar el potencial de C4BP(β-) para preservar la función renal y prevenir tanto IRI
como rechazo agudo en modelos experimentales de alotransplante renal.
Por tanto, al explorar los mecanismos mediante los cuales los inhibidores solubles del
complemento, como C4BP(β-) inducen un estado semimaduro y tolerogénico en DC,
obtendremos una visión de su importante función moduladora tanto en la inmunidad
innata como en la inmunidad adaptativa. Este conocimiento debe aplicarse a
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estrategias preventivas o curativas más seguras y eficaces contra el proceso
inmunoinflamatorio inducido por IRI y rechazo del injerto renal.
2. Resultados
- Determinación de la capacidad tolerogénica de C4BP(β-) en DC aisladas de
sangre periférica
La isoforma C4BP(β-) parece modular selectivamente las propiedades tolerogénicas en
DC mieloides (cDC), pero no en DC plasmacitoides (pDC). De hecho, C4BP(β-), de
manera análoga a la descrita anteriormente para las DC derivadas de monocitos (Mo-
DC), parece regular las propiedades tolerogénicas en las cDC, pero en mucho menor
grado que para Mo-DC (analizando la expresión de moléculas coestimuladoras [CD40,
CD86] y marcadores de maduración [CD83] mediante citometría de flujo). En
contraste, no se observan efectos inmunomoduladores inducidos por C4BP(β-) en pDC,
un subconjunto de DC propenso a favorecer la tolerancia en condiciones de estado
estacionario o durante una respuesta inmune.
- Determinación de la capacidad tolerogénica de factor H en DC humanas
derivadas de monocitos
FH, análogamente a C4BP(β-), es también capaz de promover un perfil tolerogénico y
antiinflamatorio distintivo en Mo-DC activadas por un estímulo proinflamatorio. Por
consiguiente, Mo-DC tratadas con FH se caracterizan por una citoarquitectura alterada,
que se asemeja a las DC inmaduras (iDC); presentan una menor expresión del
marcador de maduración CD83 y de las moléculas coestimuladoras CD40, CD80 y
CD86; una reducida producción de citocinas Th1 proinflamatorias (IL-12, TNF-α, IFN-γ,
IL-6, IL-8), y producción preferencial de mediadores inmunomoduladores (IL-10, TGF-
β). Además, las Mo-DC tratadas con FH muestran una expresión reducida de CCR7,
baja captación de antígeno y capacidad de migración, aloproliferación reducida de
células T CD4+, inhibición de la secreción de IFN-γ por las células T aloestimuladas e
inducción de células T reguladoras (CD4+CD127low/negativeCD25highFoxp3+). También
hemos determinado que la región de unión a superficie C-terminal (CCP19-CCP20) de
FH, pero no su región reguladora del complemento N-terminal, incluida en FHL1 (CCP1-
7), impulsa la actividad tolerogénica sobre Mo-DC. Hemos obtenido evidencias
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adicionales que apoyan el papel fundamental de los dominios C-terminales de FH
(CCP19-CCP20) en la inducción del fenotipo tolerogénico en Mo-DC.
De este modo, este nuevo papel no canónico de FH como "freno inmunológico" capaz
de afectar directamente a la función de las DC, análogamente a C4BP(β-), puede
presentar potencial terapéutico en hipersensibilidad, trasplante y autoinmunidad.
- Determinación del receptor de superficie de C4BP(β-) implicado en la
inducción de DC tolerogénicas
En colaboración con el Dr. Bernd Wollscheid (Instituto de Biología de Sistemas
Moleculares, ETH de Zúrich) hemos optimizado una nueva estrategia sistemática para
descubrir y caracterizar el receptor de C4BP(β-) responsable de la inducción de la
actividad tolerogénica en DC, basado en la identificación directa de las interacciones
ligando-receptor en las células vivas. La característica principal de esta tecnología es el
uso de un reactivo químico, denominado TRICEPS (reactivo quimioproteómico
trifuncional), que permite estabilizar la interacción ligando-receptor, facilitando la
posterior identificación del receptor específico implicado. TRICEPS incorpora tres
funcionalidades, que facilitan: 1) acoplamiento de TRICEPS a C4BP(β-) a través de su
extremo N-terminal; 2) captura del receptor correspondiente en la superficie de las DC
intactas, y 3) purificación del complejo molecular C4BP(β-) –receptor DC estabilizado–
utilizando un grupo biotinilado para un posterior análisis por espectrometría de masas
cuantitativa.
Los resultados preliminares obtenidos aplicando esta metodología revelaron un
candidato como receptor inmunomodulador para C4BP (β-): FcγRI. Ahora estamos
replicando el ensayo TRICEPS para confirmar si este gen candidato es verdaderamente
el receptor inmunomodulador para el ligando C4BP(β-) en DC derivadas de monocitos
inflamatorios. Los siguientes pasos caracterizarán el receptor putativo a través de
estudios de expresión gen-proteína (bajo condiciones basales y proinflamatorias...) y
ensayos funcionales (usando RNAi, anticuerpos bloqueantes contra el receptor...).
- Perfil transcripcional para averiguar los mecanismos moleculares de la
señalización de C4BP(β-) en DC
Para determinar el efecto del tratamiento con las isoformas C4BP(β+) y C4BP(β-) en
los perfiles globales de expresión génica de DC, en estado estacionario o activadas
mediante el estímulo proinflamatorio LPS, se ha empleado la tecnología de
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microarrays, permitiendo la cuantificación relativa de la expresión de miles de genes
simultáneamente. Así, hemos creado los siguientes grupos:
a) iDC (DC inmaduras)
b) mDC (DC maduras inducidas por LPS)
c) iDC + C4BP(β+)
d) iDC + C4BP(β-)
e) mCD + C4BP(β+)
f) mDC + C4BP(β-)
Hemos aislado solo las células viables de cada grupo a las 4 h y 16 h después de la
inducción de LPS, hemos purificado el RNA total y comprobado su calidad y pureza
mediante nanoelectroforesis a través de Bioanalyzer.
Los RNA aislados se interrogaron utilizando la placa array de Genoma Humano U219
(Affymetrix), que incluye más de 530.000 sondas que cubren más de 36.000
transcritos y variantes, que a su vez representan más de 20.000 genes mapeados a
través de UniGene o mediante la anotación RefSeq. Hemos obtenido listas de genes
regulados diferencialmente después de comparar los perfiles de expresión de los
diferentes grupos, y hemos analizado si los genes regulados significativamente
comparten una función biológica similar a través de FatiGO, dentro del software
Babelomics 4.2 [http: //babelomics.bioinfo.cipf.es/functional.html].
Estamos evaluando las principales vías de señalización y los genes pertinentes
responsables de la inducción del fenotipo tolerogénico en las DC mediadas por C4BP(b-
) y FH utilizando principalmente dos herramientas bioinformáticas de análisis: Gene Set
Enrichment Analysis (GSEA) e Ingenuity Pathway Análisis (IPA). Ambos son poderosos
enfoques basados en el conocimiento para interpretar los perfiles de expresión de todo
el genoma. Por otra parte, para validar los resultados de microarrays, se utilizaron una
serie de placas TaqMan para analizar por RT-qPCR los niveles de expresión de 14 genes
relevantes incluidos en las listas de genes sobreexpresados e infraexpresados
obtenidas a partir de las condiciones especificadas anteriormente. Entre estos genes se
encuentran tanto moléculas proinflamatorias (IRF8, IL12A, IL12B, CXCL9, CXCL11,
PYCARD, MSR1, MMP9, CSF1R), como moléculas antiinflamatorias (NDRG2, CLEC10A,
IL1R2, SOCS3, ROBO1). Como gen de referencia para la normalización se utilizó
ciclofilina A (PPIA). Se halló una correlación de la expresión génica significativa y lineal
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entre los valores de microarrays y los valores de TaqMan individuales obtenidos para el
conjunto de los 14 genes anteriores (R> 0,84) que validó el estudio de microarrays. En
resumen, los estudios de perfiles de expresión global indican la inducción de un
fenotipo inmunomodulador en DC derivadas de monocitos en presencia de C4BP(β-) y
FH, y ambas proteínas inducen vías de señalización comunes e independientes según
sus perfiles de transcripción particulares. Por ejemplo, las DC derivadas de monocitos
tratadas con FH y estimuladas con LPS mostraron vías de señalización inducidas y
factores de transcripción, como GATA1, STAT4, SMAD, TCF4, IRF8, genes HOX, vía RA,
vía Wnt/beta-catenina, vía mTOR, genes de polarización Th1 y Th2, vía NF-Kb, vía
NOTCH, vía TGF-b, inflamasoma...
Respecto a la predicción de las vías de señalización afectadas por el tratamiento con
C4BP(β-) en DC derivadas de monocitos inflamatorios (madurados con LPS), hemos
desvelado la vía de la ceramida como un efector importante de la inmunomodulación
mediada por C4BP(β-). Por lo tanto, el tratamiento con C4BP(β-) y la estimulación
proinflamatoria adicional de DC derivadas de monocitos activaron significativamente la
vía de la ceramida. Estamos diseñando ensayos funcionales para confirmar este
hallazgo.
- Potencial terapéutico de C4BP(β-) en aloinmunidad: aplicación en xeno-
GvHD
El objetivo de este ensayo ha sido evaluar si un tratamiento directo con C4BP(β-)
humana por infusión intraperitoneal es capaz de suprimir o atenuar el proceso
inmunoinflamatorio agudo xenogénico y letal inducido por la infusión de células
mononucleares humanas de sangre periférica (PBMC) en ratones inmunodeficientes
(NOD Scid gamma o NSG). El modelo xeno-GvHD se basa en la inducción de un
proceso inmunoinflamatorio agudo en ratones inmunodeficientes NSG (Jackson),
mediante inyección intravenosa de PBMC humanas (2,5 x 107 células/ratón). Conforme
a nuestros resultados no publicados referentes a la optimización del modelo, se prevé
el inicio de la enfermedad a las 4-6 semanas después de la infusión de PBMC (2,5 x 107
células/ratón).
Se han establecido tres grupos:
• Grupo A: administración de PBS.
• Grupo B: administración de 2,5x107 PBMC resuspendidas en PBS.
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• Grupo P: administración intraperitoneal de C4BP(β-) (1 mg/ratón) resuspendido en
PBS; 24 h después, administración de 2,5 x 107 PBMC por vía intravenosa, y 72 h
después C4BP(β-) intraperitoneal (1 mg/ratón).
Grupo N Tratamiento
-1D 0 +1D +2D
A 6 - PBS - -
B 6 - 2.5·107 PBMC IV - -
P 8 1mg C4BP IP 2,5·107 PBMC IV - 1mg C4BP IP
Grupos B, P: PBMC de tres donantes diferentes.
La gravedad del GvHD se refleja en la pérdida de peso y se asocia con el injerto de
células humanas y la expansión de los leucocitos. El pretratamiento de ratones NSG
con C4BP(β-) atenúa GvHD. El trasplante de 2,5x107 PBMC sin pretratamiento con
C4BP(β-) induce una GvHD grave (0% de supervivencia). En animales que reciben 2,5
x 107 PBMC pretratados con C4BP (β-), el desarrollo de GvHD se reduce y aumenta la
supervivencia. La reconstitución inmune se ha analizado por citometría de flujo y se ha
confirmado para los leucocitos humanos (CD45+), células T citotóxicas CD3+ / CD8+ y
las células T auxiliares CD3+ / CD4+. Estos hallazgos indican que el pretratamiento por
administración intravenosa de C4BP(β-) en ratones NSG humanos trasplantados con
PBMC puede disminuir la frecuencia y gravedad de GvHD tras el trasplante de células
madre hematopoyéticas (HSCT).
- Potencial terapéutico de C4BP(β-) en un modelo experimental de lesión por
isquemia-reperfusión (IRI) y rechazo de alotrasplante renal
Teniendo en cuenta los resultados del modelo anterior de aloinmunidad xeno-GvHD, así
como el comportamiento de C4BP(β-) en modelos animales de autoinmunidad, se
pretende evaluar el potencial terapéutico de la administración de C4BP(β-) humana en
el modelo de IRI fría más alotrasplante. Por ello, y de acuerdo con la experiencia previa
del equipo de investigación en este modelo (Ripoll et al. [2011] Gene Ther. 18: 945-
52), hemos diseñado e iniciado el siguiente protocolo de trasplante:
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Transplante renal alogénico de ratas Wistar (250 g de peso corporal) en ratas Lewis
macho consanguíneas anéfricas (250 g de peso corporal) después de someter el injerto
renal a un período de isquemia fría de dos horas y media antes del trasplante, en un
intento de reproducir la secuencia de almacenamiento en frío y lesión por reperfusión
comúnmente visto en el trasplante renal humano.
Un número adecuado de animales receptores (6-8 ratas/grupo) han sido asignados a
uno de los cuatro grupos de tratamiento siguientes: 1) sin tratamiento, 2) C4BP(β-)
(0,5 mg/inoculación [subcutánea]: 2 administraciones a día -5 y -2 pretrasplante, 1
administración el día del trasplante y 3 administraciones a intervalos de 5 días después
del trasplante); 3) Rapamicina (0,5 mg/kg diariamente por vía oral) durante los
primeros 15 días tras el trasplante.
Los injertos renales se conservan en la solución EuroCollins, mientras que el animal
receptor se prepara para el trasplante. La técnica quirúrgica ha sido previamente
optimizada por nuestro grupo, por lo que las ratas receptoras son nefrectomizadas
bilateralmente en el momento del trasplante. La creatinina sérica (SCR) se mide cada 2
días a partir del día después de la cirugía de trasplante. La supervivencia de los
animales se registra durante un máximo de 100 días, después de lo cual se considera
alcanzada la supervivencia indefinida.
Análisis del aloinjerto:
Los injertos renales se extirpan en el momento del sacrificio y procesados para análisis
histológico (análisis inmunohistoquímico de deposición C3, C4d y C9...) y estudios
moleculares (cuantificación de ARNm de mediadores de fibrosis intersticial, estrés
oxidativo, inflamación...).
Los efectos beneficiosos relevantes del tratamiento con C4BP(β-), en comparación con
otros grupos de tratamiento y control, serán: 1) supervivencia animal mejorada (como
una indicación general de supervivencia funcional del injerto); 2) función renal
preservada durante los períodos posteriores al trasplante, y 3) ausencia o reducción de
marcadores de activación del sistema inmune y rechazo de órganos.
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3. Relevancia y posibles implicaciones
Mientras que en los últimos años se han alcanzado importantes avances para dilucidar
la fisiopatología del rechazo de órganos después del trasplante, el tratamiento se basa
todavía en la supresión generalizada de la respuesta inmunoinflamatoria subyacente.
Estos regímenes de tratamiento tienen efectos secundarios significativos y los efectos a
largo plazo se desconocen. Por lo tanto, la disponibilidad de nuevos agentes
terapéuticos, mejor tolerados y capaces de modular eficazmente las etapas críticas
para minimizar la lesión del órgano mediada por el sistema inmune y evitar el rechazo
constituiría una futura ventaja significativa para los pacientes de trasplante alogénico
de órganos sólidos.
Por lo tanto, nuestro objetivo principal en el presente proyecto ha sido la identificación
y caracterización de nuevos agentes biológicos antiinflamatorios e inmunomoduladores
seguros y eficaces basados en la isoforma clásica del inhibidor del complemento
C4BP(β-) (Olivar et al., [2013] J. Immunol., 190: 2857-72) y en el inhibidor de la vía
alternativa del complemento FH (Olivar et al., [2016] J. Immunol., 196: 4274-90),
para el tratamiento de afecciones aloinmunes y autoinmunes y, particularmente, el
trasplante de órganos, sin aumentar el riesgo de infección o inmunosupresión. Por otra
parte, los estudios en curso y el conocimiento adquirido en el descubrimiento y la
caracterización de los receptores de superficie específicos para C4BP(β-) y FH en
células dendríticas inflamatorias, además de proporcionar una visión mecanística sobre
el modo de acción de la inmunomodulación mediada por C4BP(β-) y FH a nivel
molecular, también puede proporcionar nuevas dianas para la intervención terapéutica
en el trasplante de órganos sólidos. En este sentido, nuestro grupo de investigación
junto a una empresa biotecnológica han iniciado una colaboración científica para
avanzar hacia el desarrollo de agentes inmunomoduladores seguros y eficaces basados
en C4BP(β-) y FH. Así, los esfuerzos en curso se dirigen hacia el desarrollo de un nuevo
agente inmunomodulador biológico basado en C4BP(β-) que la compañía está
produciendo, establecido a partir de nuestros estudios. Próximamente realizaremos
ensayos preclínicos de trasplante renal alogénico en modelos animales en preparación
para posibles ensayos clínicos futuros.
El trasplante renal es el mejor tratamiento posible para muchos pacientes con
insuficiencia renal terminal, pero la disfunción progresiva y la eventual pérdida del
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aloinjerto con el retorno a la diálisis se asocia con un aumento de la mortalidad y la
morbilidad. Las lesiones inmunes por rechazo agudo o crónico y las causas no inmunes,
como la nefrotoxicidad de los inhibidores de la calcineurina y la lesión por isquemia-
reperfusión, son las principales amenazas. Las intervenciones específicas dirigidas a la
causa fisiopatológica de la disfunción incluyen el fortalecimiento de la inmunosupresión
para el rechazo crónico, o la minimización, sustitución o eliminación de los inhibidores
de la calcineurina si domina la nefrotoxicidad.
Por lo tanto, las estrategias para mantener la función del trasplante y mejorar la
supervivencia a largo plazo del injerto son objetivos importantes de investigación
traslacional.
4. Publicaciones
La experimentación en curso de nuestro grupo de investigación relacionada con el
presente proyecto generará próximamente varios manuscritos que someteremos a
revistas internacionales. En cada uno de estos manuscritos, reconoceremos la
aportación de fondos de La Marató de TV3 y se remitirá una copia de la publicación
correspondiente a la Fundació La Marató de TV3.
Artículos hasta el momento
R. Olivar, A. Luque, M. Naranjo-Gómez, J. Quer, P. García de Frutos, F.E. Borras, S.
Rodriguez de Cordoba, A.M. Blom and J.M. Aran (2013)
The a7b0 isoform of the complement regulator C4b-binding protein induces a
semimature, anti-inflammatory state in dendritic cells.
J. Immunol. 190: 2857-2872.
R. Olivar, A. Luque, S. Cárdenas-Brito, M. Naranjo-Gómez, A.M. Blom, F.E. Borràs, S.
Rodriguez de Córdoba, P. Zipfel and J.M. Aran (2016)
The complement inhibitor factor H generates an anti-inflammatory and tolerogenic
state in monocyte-derived dendritic cells.
J. Immunol. 196: 4274-90.
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A. Luque and J.M. Aran (2017)
Beyond complement inhibition: non-canonical immunomodulatory activity of C4BP(b-)
and FH over dendritic cells.
Semin. Cell Dev. Biol. (En preparación.)
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