CAPACIDAD ANTIINFLAMATORIA E

INMUNOMODULADORA DE LA ISOFORMA REGULADORA

DEL COMPLEMENTO C4BP(β-): HACIA LA PREVENCIÓN DE

LA PÉRDIDA DEL INJERTO EN TRASPLANTE DE ÓRGANOS

Josep M. Aran

Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge

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1. Resumen del proyecto

El rechazo agudo del aloinjerto, junto con los efectos secundarios de los regímenes

inmunosupresores, sigue siendo un inconveniente clínico muy importante en el

trasplante de órganos sólidos. Los fármacos inmunosupresores inducen un estado de

tolerancia que suele desaparecer después de su retirada, con la consiguiente pérdida

del injerto. Sin embargo, incluso con supresión inmunológica sostenida, una alta

cantidad de aloinjertos se vuelven progresivamente no funcionales debido al rechazo

crónico. Un objetivo principal en el trasplante es tener tratamientos de

acondicionamiento cortos, ya sea antes o después del trasplante, induciendo una

aceptación permanente del injerto sin supresión inmunológica a largo plazo.

El trasplante renal es el mejor tratamiento posible para muchos pacientes con

insuficiencia renal terminal, pero la disfunción progresiva y la eventual pérdida de

aloinjertos con el retorno a la diálisis se asocia con un aumento de la mortalidad y la

morbilidad. La lesión inmunitaria por rechazo agudo o crónico y por causas no

inmunes, como la nefrotoxicidad de los inhibidores de la calcineurina, y la lesión por

isquemia-reperfusión (IRI) son amenazas potenciales. Por lo tanto, existe necesidad de

regímenes de inmunosupresión simplificados desprovistos de toxicidad y capaces de

inducir una mejora en la supervivencia a largo plazo.

La disfunción del injerto renal en el período inmediatamente posterior al trasplante es

atribuible principalmente a IRI. Su manifestación más grave es la función retrasada del

injerto (DGF), que aumenta el riesgo de rechazo renal posterior y reduce la longevidad

del trasplante. Por otra parte, hallazgos recientes sugieren que una respuesta aloimune

humoral aguda, el rechazo mediado por anticuerpos (AMR), desencadenado por la

unión de aloanticuerpos específicos de donante y la activación del complemento, se

reconoce cada vez más como una contribución significativa a la pérdida del injerto. Por

lo tanto, un control estricto de la inducción del proceso inmunoinflamatorio recurrente

es primordial en el trasplante renal y, en general, en el trasplante de órganos sólidos.

Tanto la inmunidad innata como la inmunidad adaptativa parecen estar implicadas en

el desarrollo y la progresión de IRI y el rechazo del aloinjerto, aunque sus mecanismos

fisiopatológicos detallados de acción todavía están lejos de ser resueltos. Por lo tanto,

el desarrollo de nuevas terapias es necesario para superar estos inconvenientes. La

inhibición del complemento representa una estrategia terapéutica emergente que evita

el rechazo mediado por anticuerpos. En estudios piloto demostramos que, además de

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modular la activación del complemento, la isoforma menor de C4BP(β-) presenta

propiedades antiinflamatorias y es capaz de inducir un estado tolerogénico en las

células dendríticas (DC). Por lo tanto, podría desarrollarse un tratamiento seguro y

eficaz para IRI y/o rechazo del aloinjerto dirigido a la inmunidad innata y adaptativa a

través de la isoforma C4BP(β-).

El objetivo del presente estudio es identificar las vías moleculares por las que C4BP(β-)

suprime la inflamación e induce un estado tolerogénico en las DC. Por otra parte, se

pretende evaluar la eficacia in vivo de C4BP(β-) en la prevención de IRI y

alorreactividad inmune, dirigida a mejorar a largo plazo la supervivencia del injerto en

modelos de alotrasplante renal experimental.

Objetivos específicos:

1- Caracterizar de forma exhaustiva el mecanismo molecular mediante el cual la

isoforma C4BP(β-) del modulador del complemento suprime la generación de una firma

proinflamatoria en DCs humanas.

- Determinación de la capacidad tolerogénica de C4BP(β-) en los dos subtipos

principales de DC (convencionales y plasmacitoides) aislados de sangre periférica.

- Determinación del receptor de superficie involucrado en la inducción de vías de

señalización intracelular que conducen a la tolerogénesis en DC.

- Análisis de transcriptomas, evaluando los mecanismos moleculares de la señalización

de C4BP(β-) en DC usando la tecnología de microarrays de ADN.

2- Evaluar el potencial de C4BP(β-) para preservar la función renal y prevenir tanto IRI

como rechazo agudo en modelos experimentales de alotransplante renal.

Por tanto, al explorar los mecanismos mediante los cuales los inhibidores solubles del

complemento, como C4BP(β-) inducen un estado semimaduro y tolerogénico en DC,

obtendremos una visión de su importante función moduladora tanto en la inmunidad

innata como en la inmunidad adaptativa. Este conocimiento debe aplicarse a

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estrategias preventivas o curativas más seguras y eficaces contra el proceso

inmunoinflamatorio inducido por IRI y rechazo del injerto renal.

2. Resultados

- Determinación de la capacidad tolerogénica de C4BP(β-) en DC aisladas de

sangre periférica

La isoforma C4BP(β-) parece modular selectivamente las propiedades tolerogénicas en

DC mieloides (cDC), pero no en DC plasmacitoides (pDC). De hecho, C4BP(β-), de

manera análoga a la descrita anteriormente para las DC derivadas de monocitos (Mo-

DC), parece regular las propiedades tolerogénicas en las cDC, pero en mucho menor

grado que para Mo-DC (analizando la expresión de moléculas coestimuladoras [CD40,

CD86] y marcadores de maduración [CD83] mediante citometría de flujo). En

contraste, no se observan efectos inmunomoduladores inducidos por C4BP(β-) en pDC,

un subconjunto de DC propenso a favorecer la tolerancia en condiciones de estado

estacionario o durante una respuesta inmune.

- Determinación de la capacidad tolerogénica de factor H en DC humanas

derivadas de monocitos

FH, análogamente a C4BP(β-), es también capaz de promover un perfil tolerogénico y

antiinflamatorio distintivo en Mo-DC activadas por un estímulo proinflamatorio. Por

consiguiente, Mo-DC tratadas con FH se caracterizan por una citoarquitectura alterada,

que se asemeja a las DC inmaduras (iDC); presentan una menor expresión del

marcador de maduración CD83 y de las moléculas coestimuladoras CD40, CD80 y

CD86; una reducida producción de citocinas Th1 proinflamatorias (IL-12, TNF-α, IFN-γ,

IL-6, IL-8), y producción preferencial de mediadores inmunomoduladores (IL-10, TGF-

β). Además, las Mo-DC tratadas con FH muestran una expresión reducida de CCR7,

baja captación de antígeno y capacidad de migración, aloproliferación reducida de

células T CD4+, inhibición de la secreción de IFN-γ por las células T aloestimuladas e

inducción de células T reguladoras (CD4+CD127low/negativeCD25highFoxp3+). También

hemos determinado que la región de unión a superficie C-terminal (CCP19-CCP20) de

FH, pero no su región reguladora del complemento N-terminal, incluida en FHL1 (CCP1-

7), impulsa la actividad tolerogénica sobre Mo-DC. Hemos obtenido evidencias

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adicionales que apoyan el papel fundamental de los dominios C-terminales de FH

(CCP19-CCP20) en la inducción del fenotipo tolerogénico en Mo-DC.

De este modo, este nuevo papel no canónico de FH como "freno inmunológico" capaz

de afectar directamente a la función de las DC, análogamente a C4BP(β-), puede

presentar potencial terapéutico en hipersensibilidad, trasplante y autoinmunidad.

- Determinación del receptor de superficie de C4BP(β-) implicado en la

inducción de DC tolerogénicas

En colaboración con el Dr. Bernd Wollscheid (Instituto de Biología de Sistemas

Moleculares, ETH de Zúrich) hemos optimizado una nueva estrategia sistemática para

descubrir y caracterizar el receptor de C4BP(β-) responsable de la inducción de la

actividad tolerogénica en DC, basado en la identificación directa de las interacciones

ligando-receptor en las células vivas. La característica principal de esta tecnología es el

uso de un reactivo químico, denominado TRICEPS (reactivo quimioproteómico

trifuncional), que permite estabilizar la interacción ligando-receptor, facilitando la

posterior identificación del receptor específico implicado. TRICEPS incorpora tres

funcionalidades, que facilitan: 1) acoplamiento de TRICEPS a C4BP(β-) a través de su

extremo N-terminal; 2) captura del receptor correspondiente en la superficie de las DC

intactas, y 3) purificación del complejo molecular C4BP(β-) –receptor DC estabilizado–

utilizando un grupo biotinilado para un posterior análisis por espectrometría de masas

cuantitativa.

Los resultados preliminares obtenidos aplicando esta metodología revelaron un

candidato como receptor inmunomodulador para C4BP (β-): FcγRI. Ahora estamos

replicando el ensayo TRICEPS para confirmar si este gen candidato es verdaderamente

el receptor inmunomodulador para el ligando C4BP(β-) en DC derivadas de monocitos

inflamatorios. Los siguientes pasos caracterizarán el receptor putativo a través de

estudios de expresión gen-proteína (bajo condiciones basales y proinflamatorias...) y

ensayos funcionales (usando RNAi, anticuerpos bloqueantes contra el receptor...).

- Perfil transcripcional para averiguar los mecanismos moleculares de la

señalización de C4BP(β-) en DC

Para determinar el efecto del tratamiento con las isoformas C4BP(β+) y C4BP(β-) en

los perfiles globales de expresión génica de DC, en estado estacionario o activadas

mediante el estímulo proinflamatorio LPS, se ha empleado la tecnología de

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microarrays, permitiendo la cuantificación relativa de la expresión de miles de genes

simultáneamente. Así, hemos creado los siguientes grupos:

a) iDC (DC inmaduras)

b) mDC (DC maduras inducidas por LPS)

c) iDC + C4BP(β+)

d) iDC + C4BP(β-)

e) mCD + C4BP(β+)

f) mDC + C4BP(β-)

Hemos aislado solo las células viables de cada grupo a las 4 h y 16 h después de la

inducción de LPS, hemos purificado el RNA total y comprobado su calidad y pureza

mediante nanoelectroforesis a través de Bioanalyzer.

Los RNA aislados se interrogaron utilizando la placa array de Genoma Humano U219

(Affymetrix), que incluye más de 530.000 sondas que cubren más de 36.000

transcritos y variantes, que a su vez representan más de 20.000 genes mapeados a

través de UniGene o mediante la anotación RefSeq. Hemos obtenido listas de genes

regulados diferencialmente después de comparar los perfiles de expresión de los

diferentes grupos, y hemos analizado si los genes regulados significativamente

comparten una función biológica similar a través de FatiGO, dentro del software

Babelomics 4.2 [http: //babelomics.bioinfo.cipf.es/functional.html].

Estamos evaluando las principales vías de señalización y los genes pertinentes

responsables de la inducción del fenotipo tolerogénico en las DC mediadas por C4BP(b-

) y FH utilizando principalmente dos herramientas bioinformáticas de análisis: Gene Set

Enrichment Analysis (GSEA) e Ingenuity Pathway Análisis (IPA). Ambos son poderosos

enfoques basados en el conocimiento para interpretar los perfiles de expresión de todo

el genoma. Por otra parte, para validar los resultados de microarrays, se utilizaron una

serie de placas TaqMan para analizar por RT-qPCR los niveles de expresión de 14 genes

relevantes incluidos en las listas de genes sobreexpresados e infraexpresados

obtenidas a partir de las condiciones especificadas anteriormente. Entre estos genes se

encuentran tanto moléculas proinflamatorias (IRF8, IL12A, IL12B, CXCL9, CXCL11,

PYCARD, MSR1, MMP9, CSF1R), como moléculas antiinflamatorias (NDRG2, CLEC10A,

IL1R2, SOCS3, ROBO1). Como gen de referencia para la normalización se utilizó

ciclofilina A (PPIA). Se halló una correlación de la expresión génica significativa y lineal

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entre los valores de microarrays y los valores de TaqMan individuales obtenidos para el

conjunto de los 14 genes anteriores (R> 0,84) que validó el estudio de microarrays. En

resumen, los estudios de perfiles de expresión global indican la inducción de un

fenotipo inmunomodulador en DC derivadas de monocitos en presencia de C4BP(β-) y

FH, y ambas proteínas inducen vías de señalización comunes e independientes según

sus perfiles de transcripción particulares. Por ejemplo, las DC derivadas de monocitos

tratadas con FH y estimuladas con LPS mostraron vías de señalización inducidas y

factores de transcripción, como GATA1, STAT4, SMAD, TCF4, IRF8, genes HOX, vía RA,

vía Wnt/beta-catenina, vía mTOR, genes de polarización Th1 y Th2, vía NF-Kb, vía

NOTCH, vía TGF-b, inflamasoma...

Respecto a la predicción de las vías de señalización afectadas por el tratamiento con

C4BP(β-) en DC derivadas de monocitos inflamatorios (madurados con LPS), hemos

desvelado la vía de la ceramida como un efector importante de la inmunomodulación

mediada por C4BP(β-). Por lo tanto, el tratamiento con C4BP(β-) y la estimulación

proinflamatoria adicional de DC derivadas de monocitos activaron significativamente la

vía de la ceramida. Estamos diseñando ensayos funcionales para confirmar este

hallazgo.

- Potencial terapéutico de C4BP(β-) en aloinmunidad: aplicación en xeno-

GvHD

El objetivo de este ensayo ha sido evaluar si un tratamiento directo con C4BP(β-)

humana por infusión intraperitoneal es capaz de suprimir o atenuar el proceso

inmunoinflamatorio agudo xenogénico y letal inducido por la infusión de células

mononucleares humanas de sangre periférica (PBMC) en ratones inmunodeficientes

(NOD Scid gamma o NSG). El modelo xeno-GvHD se basa en la inducción de un

proceso inmunoinflamatorio agudo en ratones inmunodeficientes NSG (Jackson),

mediante inyección intravenosa de PBMC humanas (2,5 x 107 células/ratón). Conforme

a nuestros resultados no publicados referentes a la optimización del modelo, se prevé

el inicio de la enfermedad a las 4-6 semanas después de la infusión de PBMC (2,5 x 107

células/ratón).

Se han establecido tres grupos:

• Grupo A: administración de PBS.

• Grupo B: administración de 2,5x107 PBMC resuspendidas en PBS.

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• Grupo P: administración intraperitoneal de C4BP(β-) (1 mg/ratón) resuspendido en

PBS; 24 h después, administración de 2,5 x 107 PBMC por vía intravenosa, y 72 h

después C4BP(β-) intraperitoneal (1 mg/ratón).

Grupo N Tratamiento

-1D 0 +1D +2D

A 6 - PBS - -

B 6 - 2.5·107 PBMC IV - -

P 8 1mg C4BP IP 2,5·107 PBMC IV - 1mg C4BP IP

Grupos B, P: PBMC de tres donantes diferentes.

La gravedad del GvHD se refleja en la pérdida de peso y se asocia con el injerto de

células humanas y la expansión de los leucocitos. El pretratamiento de ratones NSG

con C4BP(β-) atenúa GvHD. El trasplante de 2,5x107 PBMC sin pretratamiento con

C4BP(β-) induce una GvHD grave (0% de supervivencia). En animales que reciben 2,5

x 107 PBMC pretratados con C4BP (β-), el desarrollo de GvHD se reduce y aumenta la

supervivencia. La reconstitución inmune se ha analizado por citometría de flujo y se ha

confirmado para los leucocitos humanos (CD45+), células T citotóxicas CD3+ / CD8+ y

las células T auxiliares CD3+ / CD4+. Estos hallazgos indican que el pretratamiento por

administración intravenosa de C4BP(β-) en ratones NSG humanos trasplantados con

PBMC puede disminuir la frecuencia y gravedad de GvHD tras el trasplante de células

madre hematopoyéticas (HSCT).

- Potencial terapéutico de C4BP(β-) en un modelo experimental de lesión por

isquemia-reperfusión (IRI) y rechazo de alotrasplante renal

Teniendo en cuenta los resultados del modelo anterior de aloinmunidad xeno-GvHD, así

como el comportamiento de C4BP(β-) en modelos animales de autoinmunidad, se

pretende evaluar el potencial terapéutico de la administración de C4BP(β-) humana en

el modelo de IRI fría más alotrasplante. Por ello, y de acuerdo con la experiencia previa

del equipo de investigación en este modelo (Ripoll et al. [2011] Gene Ther. 18: 945-

52), hemos diseñado e iniciado el siguiente protocolo de trasplante:

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Transplante renal alogénico de ratas Wistar (250 g de peso corporal) en ratas Lewis

macho consanguíneas anéfricas (250 g de peso corporal) después de someter el injerto

renal a un período de isquemia fría de dos horas y media antes del trasplante, en un

intento de reproducir la secuencia de almacenamiento en frío y lesión por reperfusión

comúnmente visto en el trasplante renal humano.

Un número adecuado de animales receptores (6-8 ratas/grupo) han sido asignados a

uno de los cuatro grupos de tratamiento siguientes: 1) sin tratamiento, 2) C4BP(β-)

(0,5 mg/inoculación [subcutánea]: 2 administraciones a día -5 y -2 pretrasplante, 1

administración el día del trasplante y 3 administraciones a intervalos de 5 días después

del trasplante); 3) Rapamicina (0,5 mg/kg diariamente por vía oral) durante los

primeros 15 días tras el trasplante.

Los injertos renales se conservan en la solución EuroCollins, mientras que el animal

receptor se prepara para el trasplante. La técnica quirúrgica ha sido previamente

optimizada por nuestro grupo, por lo que las ratas receptoras son nefrectomizadas

bilateralmente en el momento del trasplante. La creatinina sérica (SCR) se mide cada 2

días a partir del día después de la cirugía de trasplante. La supervivencia de los

animales se registra durante un máximo de 100 días, después de lo cual se considera

alcanzada la supervivencia indefinida.

Análisis del aloinjerto:

Los injertos renales se extirpan en el momento del sacrificio y procesados para análisis

histológico (análisis inmunohistoquímico de deposición C3, C4d y C9...) y estudios

moleculares (cuantificación de ARNm de mediadores de fibrosis intersticial, estrés

oxidativo, inflamación...).

Los efectos beneficiosos relevantes del tratamiento con C4BP(β-), en comparación con

otros grupos de tratamiento y control, serán: 1) supervivencia animal mejorada (como

una indicación general de supervivencia funcional del injerto); 2) función renal

preservada durante los períodos posteriores al trasplante, y 3) ausencia o reducción de

marcadores de activación del sistema inmune y rechazo de órganos.

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3. Relevancia y posibles implicaciones

Mientras que en los últimos años se han alcanzado importantes avances para dilucidar

la fisiopatología del rechazo de órganos después del trasplante, el tratamiento se basa

todavía en la supresión generalizada de la respuesta inmunoinflamatoria subyacente.

Estos regímenes de tratamiento tienen efectos secundarios significativos y los efectos a

largo plazo se desconocen. Por lo tanto, la disponibilidad de nuevos agentes

terapéuticos, mejor tolerados y capaces de modular eficazmente las etapas críticas

para minimizar la lesión del órgano mediada por el sistema inmune y evitar el rechazo

constituiría una futura ventaja significativa para los pacientes de trasplante alogénico

de órganos sólidos.

Por lo tanto, nuestro objetivo principal en el presente proyecto ha sido la identificación

y caracterización de nuevos agentes biológicos antiinflamatorios e inmunomoduladores

seguros y eficaces basados en la isoforma clásica del inhibidor del complemento

C4BP(β-) (Olivar et al., [2013] J. Immunol., 190: 2857-72) y en el inhibidor de la vía

alternativa del complemento FH (Olivar et al., [2016] J. Immunol., 196: 4274-90),

para el tratamiento de afecciones aloinmunes y autoinmunes y, particularmente, el

trasplante de órganos, sin aumentar el riesgo de infección o inmunosupresión. Por otra

parte, los estudios en curso y el conocimiento adquirido en el descubrimiento y la

caracterización de los receptores de superficie específicos para C4BP(β-) y FH en

células dendríticas inflamatorias, además de proporcionar una visión mecanística sobre

el modo de acción de la inmunomodulación mediada por C4BP(β-) y FH a nivel

molecular, también puede proporcionar nuevas dianas para la intervención terapéutica

en el trasplante de órganos sólidos. En este sentido, nuestro grupo de investigación

junto a una empresa biotecnológica han iniciado una colaboración científica para

avanzar hacia el desarrollo de agentes inmunomoduladores seguros y eficaces basados

en C4BP(β-) y FH. Así, los esfuerzos en curso se dirigen hacia el desarrollo de un nuevo

agente inmunomodulador biológico basado en C4BP(β-) que la compañía está

produciendo, establecido a partir de nuestros estudios. Próximamente realizaremos

ensayos preclínicos de trasplante renal alogénico en modelos animales en preparación

para posibles ensayos clínicos futuros.

El trasplante renal es el mejor tratamiento posible para muchos pacientes con

insuficiencia renal terminal, pero la disfunción progresiva y la eventual pérdida del

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aloinjerto con el retorno a la diálisis se asocia con un aumento de la mortalidad y la

morbilidad. Las lesiones inmunes por rechazo agudo o crónico y las causas no inmunes,

como la nefrotoxicidad de los inhibidores de la calcineurina y la lesión por isquemia-

reperfusión, son las principales amenazas. Las intervenciones específicas dirigidas a la

causa fisiopatológica de la disfunción incluyen el fortalecimiento de la inmunosupresión

para el rechazo crónico, o la minimización, sustitución o eliminación de los inhibidores

de la calcineurina si domina la nefrotoxicidad.

Por lo tanto, las estrategias para mantener la función del trasplante y mejorar la

supervivencia a largo plazo del injerto son objetivos importantes de investigación

traslacional.

4. Publicaciones

La experimentación en curso de nuestro grupo de investigación relacionada con el

presente proyecto generará próximamente varios manuscritos que someteremos a

revistas internacionales. En cada uno de estos manuscritos, reconoceremos la

aportación de fondos de La Marató de TV3 y se remitirá una copia de la publicación

correspondiente a la Fundació La Marató de TV3.

Artículos hasta el momento

R. Olivar, A. Luque, M. Naranjo-Gómez, J. Quer, P. García de Frutos, F.E. Borras, S.

Rodriguez de Cordoba, A.M. Blom and J.M. Aran (2013)

The a7b0 isoform of the complement regulator C4b-binding protein induces a

semimature, anti-inflammatory state in dendritic cells.

J. Immunol. 190: 2857-2872.

R. Olivar, A. Luque, S. Cárdenas-Brito, M. Naranjo-Gómez, A.M. Blom, F.E. Borràs, S.

Rodriguez de Córdoba, P. Zipfel and J.M. Aran (2016)

The complement inhibitor factor H generates an anti-inflammatory and tolerogenic

state in monocyte-derived dendritic cells.

J. Immunol. 196: 4274-90.

12

A. Luque and J.M. Aran (2017)

Beyond complement inhibition: non-canonical immunomodulatory activity of C4BP(b-)

and FH over dendritic cells.

Semin. Cell Dev. Biol. (En preparación.)