Acta histochem. 67, 234-246 (1980)

Pathologisches Insitut (Direktor: Prof. Dr. sc. med. A. HECHT)

des Bereiches Medizin der Karl-Marx- tTniversitiit Lei!Jzig

Zur Histotopochemie Prostaglandin F 2,,-abbauender Enzyme der Ra ttenniere

On the histotopochemistry of prostaglandin F 2" metabolizing enzymes in rat kidney

Von FRANK WOHLRAB und ALEXANDER FEUSTEL

Mit 5 Abbildungen

(Eingegangen am 21. Marz 1980)

Zusammenfassung

In den Nieren juveniler und adulter Ratten beiderlei Geschlechts wurde die Aktivitiit der N AD-15-Hydroxyprostaglandindehydrogenase und der N ADP -15-Hydroxyprostaglandindehydro­

genase unter Verwendung von PGF2" als Substrat mit histochemischer Technik untersucht. U nte l' histochemischen Bedingungen ist del' Nachweis del' liislichen PGDH in nativen Gewebsschnitten

in adaquater Aktivitatsh6he unter Anwendung del' Membraninkubationstechnik m6glich. Die Effektoren PMS und KCN zeigen einen hemmenden Einfluf;\ auf die Enzymaktivitat. Die NAD­PGDH ist in del' Hattenniere vorwiegend in del' inneren Rinde sowie in den Tubuli del' Markstrah­len lokalisiert. Die NADP-PGDH ist eben fa lls in nephronalen Strukturen del' Rinde n achweis­bar, jedoch ist del' Reaktionsausfall ungleichma13ig, und die Lokalisation des R eaktionsprodukts

ist diffus. Die Ergebnisse werden in Zusammenhang mit del' Spezifitiit des R eaktionsausfalles be­

sprochen.

Summary

Using PGF2" as substrtLte we htLve investiga ted the demonstration and localization of NAD­

and NADP-15-hydroxyprostaglandin dehydrogentLse in the kidney of developing and adult rat

kindney. Under histochemical conditions an adequate demonstrtLtion of the solu ble PG DB: in n a ti ve

sections is possible by membrane incubating technic in presen ce of specific coenzymes. The effec­tors PMS a nd KCN showed a decreasing effect on the enzyme act ivity. In the developing and adult

rat kidney the activity of NAD-PGDH was localized predominantly to medullary rays and inne r

cortex. "Ve h a ve found the reaction product in the following kidney substructures: Pars recta tubuli, distal convoluted tubule, ascending limb of HENLE, collecting tubule and lower in proximal convoluted tubule and in the glomerular cells. The NADp·PGDH was localized only in the

cortex structures, but the reaction was uneven and the localization of the reaction product was diffuse. The results are disc l1~sed in connection with the speci fity of the reaction.

Zur Histotopochemie Prostaglandin F 2c< abbauender Enzyme 235

Einleitung

Nach den Ergebnissen biochemischer Untersuchungen (PACE-AsCIAK und MILLER 1974, PACE-AsCIAK 1975a, b; HOULT und MOORE 1977) sind am enzymatischen Abbau von PGF2c< zu PGE in der Rattenniere 3 Enzyme beteiligt. Der Prostaglandin­abbau wird eingeleitet von der 15-Hydroxy-Prostaglandindehydrogenase (15-PGDH), wobei die C15-Hydroxylgruppe des PG-Molekuls von dem NAD-abhangigen Enzym (E. C. 1.1.1.141) zur Ketogruppe oxidiert wird [(ANGGARD 1971, HANSEN 1976); (vgl. Abb. 1, I)]. Das hieraus resultierende 15-Keto-PGF2c< (15-K) wird von der Prostaglandin-L1-13-Reductase (,1-13 R) zu 13,14-Dihydro-15-Keto-PGF2c< (13,14,15-F) reduziert (Abb. 1, II). D2,mit ist zugleich das Substrat gegeben fur die 9-Hydroxy­Prostaglandindehydrogenase (9-PGDH), die das 13,14,15-F zu 13, 14-Dihydro-15-Keto-PGE2 (13,14,15-E) oxidiert (Abb. 1, III). Hieran schlieBt sich dann der weitere

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I ,

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... (NAD+jNADP+)

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Hammelaboll~

Abb.1. Erlauterungen im Text!

236 F. WOHLRAB und A. FF;USTEL

Abbau durch fl- bzw. w-Oxidation des Molekiils zu harnpflichtigen Metaboliten an (Abb. 1, IV).

Nach diesem Reaktionsablauf erfolgt in der Saugetierniere eine Interkonversion von PGF zu PGE, wobei besonders dem PGE2 hinsichtlich seiner Wirksamkeit auf verschiedene renale Funktionen Bedeutung zukommt. Samtliche an der PGF/PGE­Interkonversion beteiligten Enzyme sind in der cytoplasmatischen Grundsubstanz lokalisiert (ANGG1RD und SAMUELSSON 1967, ANGG1RD et d. 1971, HANSEN 1976) und daher als leicht diffusible ("li:isliche") Enzyme einem ortsgerechten histochemischen Nachweis nur schwer zuganglich. Hinzu kommt, daB die 15-PGDH entsprechend einer unterschiedlichen Koenzym&.bhangigkeit (NAD bzw. NADP) in der Rattenniere in 2 verschiedenen Typen vorkommt (LEE und LEVINE 1975, KATZEN et al. 1975, HAN­SEN 1976, WRIGHT et al. 1976). Mit histochemischer Technik ist bisher von NISSEN und ANDERSEN (1968, 1969) versucht worden, die NAD-abhangige 15-PGDH in der Rattenniere unter Verwendung von PGE2 &.ls Substmt zu lokalisieren. In letzter Zeit wurde von WRIGHT und CORDER (1979) der Reaktionsausf9.11 beim Nachweis diese" Enzyms in mikrodissezierten Nephronabschnitten der Rattenniere unter Anwendung der "oil-well"-Technik quantifiziert, wobei PGE1 als Substmt verwendet wurde. 1m folgenden solI tiber eigene Untersuchungen zum enzymatischen PGF2,,-Abbau berichtet werden, wozu bereits eine kurze Mitteilung vorliegt (WOHLRAB und FEUSTEL 1978), die jedoch einer methodischen Prazisierung bed:wf.

Material und Methode

Die Untersuchungen wurden an den Nieren juveniler (Alter = 2, 7, 20 Tage) und adulter

(Alter = 7 Monate) Wistarratten beiderlei Geschlechts aus hauseigener Koloniezucht durchge­

fUhrt. Die Tiere erhielten ein standardisiertes Pelletfutter sowie Trinkwasser ad libitam. Nach

Tatung del' Tiere durch N ackenschlag stets 10 h vormittags wurden die so fort entnomrnenen Nieren

in Saccharoseliisung (0,25 molar, 4°C, 20 sec) gesptilt, auf einen Gefriertisch ubertragen und in

einem Kryostaten (System Dittes-Duspiva [Heidelberg]) in 12 bis 16 [lm dicke Schnitte zerlegt.

Die Schnitte kamen sowohl unfixiert als auch nach Vorfixierung (2,5 % Glutaraldehyd, pH =

7,4,4 °C; Formol, pH = 7,4,4 °C, Dauer = 5 min) zur Untersuchung.

Die Inkubation del' entweder auf Deckglaser oder semipermeable Membranen (Dialysemembra­

nen, FabrikateNephrophan®, VEB FilmfabrikWolfen (DDH), und Visking 36/32, Union Carbide

Corporation Chicago, Ill. (USA) aufgezogenen Schnitte erfolgte im waJ3rigen Inkubationsmedium

fUr 30 bis 60 min bei 37°C im dunklen Inkubator.

Reaktionsbtdingungen

Aerobe Inkubation; Pufferung des Inkubationsgemisches unter Verwendung von 0,2 m Tris­

Hel-Puffer bzw. 0,06 m Phosphat puffer auf pH = 7,4 bzw. 9,0.

Substrat: Prostaglandin F 2",-Tromethaminsalz (THAM), MW 465,6; Wasserlaslichkeit:

> 200 rng/ml Wasser; Stabilitat: 3 Monate bei Haumtemperatur, 7 :s; pH :s; 9. FUr die Unter­

suchungen wurde sowohl PGF2 <x (freie Saure), kristallines PGF2",-THAM (Upjohn) als auch die

therapeutisch verwendbaren Produkte Minprostin® F 2", (Upjohn) und l'rostin F 2", (Upjohn)

getestet. Hierbei ist zu beachten, daJ3 das PGF2<x im Minprostin als THAM-Verbindung in steriler

wal3l'iger Lasung vorliegt, wahrend Prost in F2<X 0,9 % Benzylalkohol als stabilisierenden Zusatz

enthalt. Damit ist jedoch zugleich ein Substrat fUr eine Miterfassung del' Alkoholdehydrogenase

gegeben. Finalkonz. del' getesteten Substrate: 0,3 bis 3,0 mllI.

Zur Histotopochemie Prostaglandin F2<X abbauender Enzyme 237

Indikator: Nitro-BT (Koch-Light)_ Das Grundinkubationsmedium setzte sich aus folgenden

Komponenten zusammen: 2 ml PufferlOsung, 2 ml Indikatorliisung (1 mg Nitro-BTfml)), 1 ml

Aqua dest_ Substrat sowie verschiedene Effektoren wurden tiber eine Variation des Aqua-dest.­

Anteils dem Inkubationsmedium zugesetzt.

Effektoren (Finalkonz.): Coenzyme: NAD (85%ig, AWD Dresden); 0,001 M; NADP (82,5%ig,

AWD Dresden), 0,001 M; Mediator: Phenazinmethosulfat [(PMS); (Koch-Light)], 0,3 mM;

Inhibitoren: KCN, 0,1 mM; Amobarbital, I mM. Kontl'ollreaktionen: Inkubation del' Schnitte

in einem substl'atfl'eien bzw. benzylalkoholhaltigen, PGF2<x-freien Medium sowie thermische In­

aktivierung del' Schnitte (80°C, 20 min). N ach del' Inkubation el'folgte eine kurze Spiilung in

Aqua dest., eine Nachfixiel'ung mit 4 % Formol sowie nach Spiilung ein EinschluE in Glycerin­

gelatine.

Ergebnisse

1. Unfixierte Schnitte, Immersionsinkubatiorr

Substrat: Prostin F 2", THAM-Salz, stabilisiert mit 0,9 % Benzylalkohol. Native Schnitte zeigen nach 30 min Inkubation im wiiBrigen Medium ohne Diffusionsschutz sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart von N AD einen positiven Reaktions­ausfall in der Nierenrinde, wobei in der Topik des Reaktionsproduktes geschlechts­spezifische Unterschiede bestehen (Abb.2a bis d). Da gngenommen werden muB, daB die PGDH entsprechend ihres aus biochemischen Untersuchungen bekannten Vorkommens in der cytoplasmatischen Grundsubstanz unter diesen Inkubationsbe­dingungen histochemisch nicht oder nur in inadaquater Aktivitatsh6he erfaBbar ist, kommt fiir den erzielten Reaktionsausfall in erster Linie der zur PGF2,,-Stabilisation dienende Benzylalkohol in Betracht. Erfolgt die Inkubation bei dergleichen Benzyl­alkoholfinalkonzentrstion (2,2 mM), wie sie beim Einsatz von benzylalkohol-stp.bili­siertem PGF2" vorliegt, so ergibt sich in der Topik des Reaktionsproduktes und in der Reaktionsintensitat nahezu Ubereinstimmung. Fiir den positiven Reaktionsausfall bei Verwendung von benzylalkohol-stabilisiertem PGF 2" ist somit ein alkoholabbauendes Enzymsystem verantwortlich, das durch N AD stimuliert wird.

Subl;trat: Minprostin F 2" (Dinoprost), THAM-S8JZ, bzw. PGF2", freie Saure. Native Schnitte lassen nach 60 min Inkubation praktisch keine Reaktion erkennen; NAD, N ADP bzw. PMS zeigen keinen stimulierenden Effekt.

2. Vorfixierte Schnitte, Immersionsinkubation

Nach kurzzeitiger Vorfixierung der Schnitte mit Formol bzw. Glutaraldehyd ist der Rcaktionsausfall mit allen getesteten Substraten sowie nach Kombination der einzelnen Effektoren negativ.

Abb.2. Ratte, Niere, unfixierter Kryostatschnitt, Immersionsinkubation. Substrat: Prostin F 2<x,

stabilisiert mit 0,9 % Benzylalkohol. N aehweis einer Alkoholdehydrogenase. Geschlechtsspezifische

Unterschiedeim Reaktionsausfall. a) 6, ohneNAD; b) 6, mit NAD; c) ¥ ohne NAD; d) ¥ mit NAD.

33: 1.

238

a

c

F. WOHLRAB und A. FEUSTEL

, .

d

, ,

Abb.3. Ratte, Niere, unfixierter Kryostatschnitt, Membraninkubationstechnik. Substrat: Min­

prostin F 2<x, TRAM·Salz. Nachweis der NAD·15·PGDR. a) ~,Alter: 7 Tage; b) ~,Alter:. 7 Tage;

c) (f, Alter: 20 Tage; d) ~, Alter: 20 'rage. 52: 1.

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Zur Histotopochemie Prostaglandin F 2", abbauender Enzyme 241

3. Unfixierte Schnitte, Membraninkubationstechnik

NAD-PGDH. Substrat: Minprostin F 2"" THAM-Salz. Nach Inkubation nativer Schnitte in einem substrathaltigen Medium, jedoch in Abwesenheit von NAD, lieB sich kein positiver Reaktionsausfall erzielen. In Gegenwart von NAD reagiert die gesamte Nierenrinde stark positiv nach einer Inkubationszeit von 30 min (Abb. 3a bis d, 4& bis b). Eine ErhOhung des pH-Wertes auf 9,0 bewirkt bei verkiirzter Inkuba­tionszeit eben so eine Zunahme der Reaktionsintensitat, wie eine Erhohung der In­kubationstemperatur auf 41 °0. Unter dem EinfluB von KON und/oder PMS ist die Reaktion stark abgeschwacht. Amobarbital bewirkt keine Hemmung der PGDH, setzt jedoch den Reaktionsausfall in der inneren Rinde herab (Hemmung der NADH~­Diaphorase).

In den Nieren 2 Tage alter Ratten beiderlei Geschlechts konnte nur eine sehr geringe Reaktion in den proximalen gestreckten Tubuli nachgewiesen werden. Bei 7 Tage alten Ratten ist der Reaktionsausfall deutlich verstarkt, besonders in der inneren Rinde reagieren die Epithelien der proximalen gestreckten Tubuli, wahrend die iibrigen Nephronanteile eine deutlieh gering ere Reaktion zeigen (Abb.3a, b). 1m inneren Nierenmark reagieren auch die Epithelien der Sammelrohre sowie das Nierenbeckenepithel positiv. Nach 20 Lebenstagen ist das Reaktionsprodukt in den Epithelien aller Tubuli der Nierenrinde nachweisbar (Abb. 3c, d). In der Niere der erwachsenen Ratte reagiert die gesamte Rinde stark positiv, wobei kein Anhalt fUr ein geschlechtsspezifisches Muster der Enzymverteilung be"teht (Abb. 4a, b).

Unter Verwendung des Substrates PGF2", (freie Saure) ist die Reaktionsintensitat bei gleicher Topik des Reaktionsprodukts deutlich geringer als bei Verwendung von Minprostin, THAM-Salz.

NADP-PGDH. Substrat: Minprostin F 2<x, THAM-Salz. In Gegenwart von NADP im Inkubationsmedium zeigt die Nierenrinde adulter Ratten eine positive Reaktion (Abb. 4c). Der Reaktionsausfall ist jedoch deutlich schwacher als in Gegenwart von N AD. Das Reaktionsprodukt ist in den Epithelzellen proximaler und distaler gewun­dener Tubuli in der auBeren Rinde lokalisiert. Insgesamt zeichnet sich die Reaktion mit NADP durch eine geringe Lokalisationsscharfe sowie UnregelmaBigkeiten in der Verteilung des Reaktionsproduktes iiber die gesamte Nierenrinde aus. Unter PMS-EinfluB ist die Reaktion abgeschwacht.

Diskussion

Die Nachweisbarkeit del' Aktivitaten del' biochemisch charakterisierten prostaglandinab­

bauenden Enzyme st6f.lt unter histochemischen Bedingungen in del' Rattenniere in mehrfacher Hinsicht auf Schwierigkeiten. Diese Schwierigkeiten haben ihre Ursachen

a) in del' Nichtstrukturgebundenheit diesel' Enzyme;

b) in einer Coenzymabhangigkeit del' Aktivitaten diesel' Enzyme;

c) in unterschiedlichen Umsatzraten del' verschiedenen Prostaglandine; d) in verschiedenen extremen physiologischen Parametern diesel' Enzyme in del' Ratten­

niere Bowie

e) in einer relativ kurzen Halbwertszeit del' Inaktivierung del' NAD-PGDH del' Rattenniere.

16 Acta blstochem. Ed. 67

242 F. WOHLRAB und A. FElIS'l'.t;L

Aus biochemischen Untersuchungen an Gewebshomogenaten geht hervoI', dal3 die Akt ivitat del' NAD- und NADP-PGDH in samtlichen Organen del' bisher untersuchten Saugetierspezies

im Homogenatuberstand lokalisiert ist (vgl. u. a. ANGG.ARD und SAMUELSSON [1967], NAKANO et a.]. [1967], HORTON [H17 2], LEE und LEVlNE [1974, 1975J, KATZEN et al. [1975], HANSEX [1976]).

Fur die Niere del' Ratte wird angegeben, dal3 sich ca. 86 % del' NAD-PGDH im Homogenatuber­

stand befinden, wahrend ca. 14 % der Mikl'osomenfraktion zugeordnet werden (PACE-AsCIAK und DOMAZET 1975, WRIGHT et al. 1976). Somit sind fUr einen rnoglichst ortsgel'echten histo­

chemischen Nachweis dieses Enzyms geeignete Inkubationsvel'fahren anzuwenden, um einen Aus­tritt del' PGDH aus den Schnitten zu vermeiden bzw. herabzusetzen. N achdem der N achweis

erbracht werden konnte, daf3 n ach einer Vorfixierung del' Kryostatschnitte mit Formol bzw. Glut­araldehyd die R eaktion in gleicher \Veise negativ ausfiel wie nach der Inkubation nativer Schnitte

in einem substratspezifischen Medium, wurde die Membraninkubationstechnik angewendet. Mit Hilfe dieser Technik liiJ3t Rich ein Austritt loslicher PGDH aus den Schnitten heraus vermeiden

oder zurnindest stark einschranken, obgleich n ach GOSSRAU (1977) wie au ch n ach eigenen Er­fahrungen die Membraninkubationstechnik b eim Nachweis von Dehydrogenasen in vielen Fallen

k eine Vorteile bringt. Die PGDH weist nach Angaben aus dem biochemischen Schrifttum weitere Charakterist ika

auf, die fUr eine moglichst spezifische Erfassung del' Aktivitat im histochemischen Test zu b eachten

sind. Von Bedeutung fUr die Zeitspanne der histochemischen N achweisbarkeit ist hierbei die kurze Halbwertszeit del' PGDH, die in del' Niel'e der Ratte nul' ca. 1 h betragt. Eine Wiederherstellung

del' Aktivitat ist an eine Neusynthese von Enzymproteinen gebunden (BLACKWELL et a l. 1975).

Die Labilitat der NAD-PGDH del' Rattenniere im nichteingefrorenen Zustand wird auch von

\VRIGHT et al. (1976) hel'vorgehoben. Danach betriigt die H albwertszeit del' Enzyminaktivierung 3 h bei 37 cC, 3 bis 4 Tage bei + 4 cC, 1 Monat bei -20 DC und 1 Jahr bei -90 cC. Fur histoche­

mische Untersuchungen ist dabei besonders die kurze Halbwertszeit der Inaktivierung des Enzyms

urn ungefrorenen Zustand des Gewebes zu beachten. Die Inkubation del' Schnitte soUte da her lUwerzuglich nach der Anfertigung innerh alb der Halbwertszeit del' Enzyminaktivierung in eingefrorenen, d. h. wiederaufgetauten Schnitten erfolgen.

Das Temperaturoptimum fur die NAD-PGDH del' Rattenniere liegt nach WRIGHT et a1. (1976)

bei 41°C. Bei dieser Temperatur zeigt die R eaktion eine zeitliche Linearitat nur fUr eine Dauer von 35 min, wahrscheinlich bedingt durch eine Inaktivierung del' PGDH, wahrend bei 37°C

die Reaktion bis zu 90 min zeitlich linear verlauft (WRIGHT und CORDER 1979). Die NAD-PGDH der Rattenniere b esitzt ein eng begrenzt es pH-Optimum bei 9,6. 1m bio­

chemischen Test ist die Aktivitat des Enzyms bei diesem pH-\Vert fast 5mal hoher als bei pH = 7,5 (WRIGHT et al. 1976). Fur den histochemischen Nachweis del' NAD-PGDH ist eine Inkubation

der Schnitte bei diesem hohen pH-Wert von nachteiligem EinfluLl auf einen spezifischen R eaktions­

ablauf, da mit zunehmend alkalischem pH in Gegenwart von NAD del' "nothing dehydrogenase

effect" verstarkt auftritt (vgl. WOHLRAB, SEIDLER und KUNZE [1979J). Die a ls Substrate ver­

wendeten Prostaglandine sind bis pH = 9,6 stabil, unterliegen jedoch b ei hoher alkalischen

pH-Werten einer Zerstorung (WRIGHT und CORDER 1979). Das fUr die histochemische Erfassung

der NAD-PGDH als Substrat verwendete PGF2<x wird hinsichtlich der Umsatzrate von PGE2

ubertroffen. N ach biochemischen Untersuchungen (NAKANO et a l. 1969, WRIGHT et al. 1976) wird

von allen Prostaglandinen mit PGE2 bei niedrigstem Km-Wert die hochste Reaktionsgeschwindig­

keit in del' Niel'e der Ratte erzielt. Bei 4fach h iiheren Km-Werten betriigt die Reaktionsgeschwin­digkeit mit PGF2<x etwa 2/a del' von PGE2 (WRIGHT und CORDER 1979).

Wie die Ergebnisse unserer Untersuchungen zeigen, wi rd PGF2<x in del' Rattenniere durch

eine spezifische PGDH abgebaut. Ais spezifisch konnen jedoch nul' die Befunde angesehen wer­den, die unter Verwendung von PGF2<x-THAM-Sa]z und NAD mit Hilfe del' Membraninkubations­

methode erhoben wurden. Del' Reaktionsablauf erfolgt innerhalb del' Halbwertszeit der Enzym­

inaktivierung ungefrorener Schnitte sehr rasch und wird durch eine Erhohung des pH-Wertes des Inkubationsmediums auf 9 sowie der Inkubationstemperatur auf 41 °C beschleunigt. Die

Zur Histotopochemie Prostaglandin F 2<% abbauender Enzyme 243

Befunde, die unter Verwendung von Prostin F 2<% an nativen Schnitten ohne Anwendung der Mem­

braninkubationstechnik und partiell auch in Abwesenheit von NAD erhoben wurden, sprechen

insges.amt fUr die Erfassung eines alkoholdehydrierenden Enzymsystems, wobei der zur Prosta­

glandin-Stabilisierung verwendete Benzylalkohol als Substrat dient. Da die PGDH unter diesen

Inkubationsbedingungen weitgehend aus nativen Gewebsschnitten austritt, diirfte es sich bei dem

unter Verwendung von ProstinF2" erzielten Reaktionsausfall nicht um eine Miterfassung del'

Aktivitat del' PGDH handeln. Unter diesen Aspekten sind auch unsere friiheren Angaben zur

Lokalisation der PGDH in del' Rattenniere unter Verwendung von Prost in F 2<% als Substrat zu

werten (vg1. WOHLRAB und FEUSTEL [1978]). In diesem Zusammenhang erhebt sich die Frage

nach del' Bedeutung del' bisher durchgefUhrten Untersuchungen ZUm histochemischen Nachweis

der PGDH im Hinblick auf die Spezifitat del' Nachweisreaktion. Wahrend NISSEN und AXDERSEN

(1968, 1969) die Auffassung vertreten, daLl keine PGDH-Diffusion aus nativen Schnitten heraus

erfolgt und mit PGE2 als Substrat in del' Rattenniere eine positive Reaktion vorwiegend in den

Epithelien del' aufsteigenden dicken Schleifenteile und del' distalen Tubuli nachweisen konnten,

wurden von SIGGINS et a1. (1971) die Schnitte zur Diffusionsverminderung in einem Agargel­

medium unter Verwendung verschiedener Prostaglandine als Substrate inkubiert. In den PUR­

KINJE-Zellen des Rattengehirnes war es so moglich, die PGDH nachzuweisen.

Nach unserer Auffassung ist es gegenwartig moglich, die NAD-PGDH mit Hilfe der Membl'an­

inkubationstechnik in adaquater Aktivitatshohe zu erfassen, jedoch bedal'f die Frage des stimulie­

l'enden Einflusses von Effektoren auf den Reaktionsausfall einer weiteren Abklarung. Von Be­

deutung fUr den Reaktionsausfall beim histochemischen Nachweis coenzymgebundener Dehydro­

genasen sind die entsprechenden Diaphorasen. Ihr limitierender EinfluLl auf den Reaktionsausfall

laLlt sich durch den Einsatz geeigneter intermedial'er Elektl'oneniibertrager wie PMS, ausschal­

ten. Das PMS nimmt dabei die Elektronen auf nichtenzymatischem Wege Yom gebildeten NADH2

auf und iibertl'agt sie direkt auf das Nitro-BT (vg1. WOHLRAB, SEIDLER und KUNZE [1979]). Unter

den von uns gewahlten Bedingungen zeigt das PMS einen hemmenden EinfluLl auf die NAD­

PGDH-Aktivitat, was auch von NISSEN und ANDERSEN (1968) beobachtet wurde. Ein Zusatz von

KCN zum Inkubationsmedium zur Verhinderung del' PMS-Reoxidation dul'ch Hemmung del'

Cytochromoxidase und del' Superoxiddismutasen (vg1. SEIDLER [1979]) zeigte den gleichen Effekt.

Nach biochemischen Untersuchungen (WRIGHT et a1. 1976) wird die NAD-PGDH del' Ratten­niere durch KCN direkt gehemmt, so daLl hierin eine Ursache fiir den reaktionsabschwiichenden

Effekt des KCN zu suchen ist. Sehr wahrscheinlich spielt abel' auch das im Reaktionsablauf ge­

bildete NADH2 eine limitierende Rolle auf den Reaktionsablauf, da es die NAD-PGDH kompe­

titiv hemmt (RUCKRICH et al. 1975, HANSEN 1976). Das NADH2 wird zwar dul'ch die hohe NADH2-

Diaphol'ase-Aktivitat del' Niere J'Hsch oxidiert, jedoch muLl dadurch die Moglichkeit einer gleich­

zeitigen Miterfassung del' NADH2-Diaphorase-Aktivitiit im histochemischen Test in Betracht

gezogen werden. Ein Zusatz von Amobarbital zum Inkubationsmedium, das im biochemischen

Test die NADH2-Diaphorase hemmt, hingegen nicht die NAD-PGDH (WRIGHT et a1. 1976), be­

wirkt einen starken Reaktionsausfall in del' Nierenrinde. Offenbar ist die Konzentration an gebil­

detem NADH2 zu gering, urn die PGDH kompetitiv zu hemmen. Eine gleichzeitige Anwesenheit

von PMS im Inkubationsmedium zur Ubernahme del' Elektronen vom gebildeten NADH2 be­

wirkte eine Reaktionsabschwachung, so daLl del' hemmende Effekt auf den Reaktionsausfall

wahrscheinlich dem PMS zugeschrieben werden kann. Von HANSEN (1976) werden eine Reihe von

Inhibitoren angegeben, die die NAD-PGDH-Aktivitat beeinflussen. Moglicherweise gestattet

ihr Einsatz in del' Histochemie eine bessel'e Abgrenzung del' NAD- von del' NADP-PGDH, die

nach biochemischen Untersuchungen beide in del' Rattenniere vol'kommen (KATZEN et a1. 1975,

LEE und LEVINE 1975).

Wie einleitend vermerkt wul'de, erfolgt del' PGF2,,-Abbau mehl'stufig (vg1. Abb. 1). Es bestehen

jedoch nach biochemischen Untersuchungen in del' Saugetiel'niere speciesabhiingig rnehrere Abbau­

wege (vg1. HOULT und MOORE [1977]). Wahrend del' PGF2,,-Abbau initial nul' an del' Hydroxyl­

gl'uppe am C15 des PG-Molekiils ansetzt, besitzt die Kaninchenniere eine 9-PGDH, die gleich-

16'

244 F. \VOIILRAB und A. FEUSTEL

POOH L113R

POF2o.. ----+ [ISIf] --+ IJ, !It, IS-F

9HD ~ *.f%

POEZ ----------.,3, !It,lS-E

Ral

POOH PGFu ----+ [lSIf J

!!!g.L. guinea - e/g_ POOH L113R

..1t3R ~ 13,lft, IS-F

80%lSHO

13, tit, 1S-E

POF2 (/.. ~ IS H ~ 13, 1~, IS -F -+ 13, '*, diH-F 15%

Abb.5. W ege des PGF2",-Met abolismus in vitro in del' Niere verschiedener Saugetiere. PGDH

NAD-15-PGDH; 9HD = 9-PGDH. Andere Bezeichnungen vgl. Abkiirzungen in der Einleitung. N ach HOULT und MOORE (1977).

zeitig die Hydroxylgruppe am C9 in eine Ketogruppe umwandelt und dam it PGF2", zu 13,14,15-K-PGE2 oxidiert (Abb. 1, 5). In der Rattenniere wandelt die 9-PGDH erst in einem 2. Schritt

13,14,15-F zu Prostaglandin E um (Abb. 5). Eine gleichzeitige Erfassung der 15-PGDH und der 9-PGDH unter histochemischen Bedingungen ist somit fUr die Niere del' Ratte nicht in Betracht zu ziehen. N ach biochemischen Untersuchungen (PACE-AsCIAK und MILLER 1974, PACE-AsCIAK 1975a, b) ist die 9-PGDH in der Niere fetaler und neugeborener Ratten nicht nachweisbar und steigt erst nach 4 Lebenswoch en auf die Aktivitatsh6he adulter Tiere an. Demgegeniiber steigt

die 15-PGDH-Aktivitat von Geburt an bis a uf Maximalwerte um den 19. Lebenstag, urn dann

kontinuierlich auf die W erte adulter Tiere abzufallen. 1m histochemischen Test war die NAD-

15-PGDH-Aktivitat in der Niere 2 Tage alter Ratten k aum wahrnehmba r, jedoch konnte a b

7. Lebenstag ein starker R eaktionsausfall beobachtet werden, wobei Geschlechtsunterschiede offen­

bar nicht b est ehen. In der Topik des Reaktionsprodukts best eht insgesamt eine gute Ubereinstim­

mung mit den nach der "oil well teehnic" erhobenen quantitativen histochemischen Befunden

von WRIGHT und CORDER (1979) beim Nachweis der NAD-15-P GDH in der Rattenniere unter

Verwendung von PGEl als Substrat. Die Befunde stiitzen die Auffassung, da B sich der Abbau

bzw. die Umwandlung von PGF und PGE innerh alb derselben nephronalen Strukturen voIlzieht.

E s bedarf jedoch weiterer Bemiihungen unter Verwendung geeigneter Effektoren und Subst rate zur Charakterisierung und histochemischen Erfassung del' verschiedenen prost aglandinabbau en­den Enzyme.

Literatur

ANGGARD, E., Studies on the analysis and metabolism of t h e prostaglandins. Ann. N. Y. Acad.

Sci. 180, 200-215 (1971).

Zur Histotopochemie Prostaglandin F 2", abbauender Enzyme 245

LARSSON, C., and SAMUELSSON, B., The distribution of IS-hydroxy prostaglandin dehydro­genase and prostaglandin-Ll13-reductase in tissues of the swine. Acta physioI. scand. 81, 396-

404 (1971). and SAMUELS SON, B., The metabolism of prostaglandins in lung tissue. In: Prostaglandins,

Proc. of the Second Nobel Symposium, eds.: S. BERGSTROM and B. SAMUELSSON, pp. 97 -105. Stockholm: Almquist & Wiksell 1967.

BLACKWELL, G. J., FLOWER, R. J., and VANE, J. R., Rapid reduction of prostaglandin 15·hydroxy

dehydrogenase activity in rat tissues after treatment with protein synthesis inhibitors. Brit.

J. Pharmac. 55,233 (1975). GOSSRAU, R., Spezifitatsprobleme bei histochemischen Enzymnachweisen. Acta histochem.,

SuppI. 18, 75-84 (1977). HANSEN, H. S., 15·Hydroxyprostaglandin dehydrogenase. A review. Prostaglandins 12, 647 -679

(1976). HORTON, E. \V., Prostaglandins. Springer, Berlin, Heidelberg, New York 1972. HOULT, J. R. S., and MOORE, P. K., Pathways of prostaglandin F 2", metabolism in mammalian

kidneys. Brit. J. Pharmac. 61,615-626 (1977). KATZEN, D. R., PONG, S., and LEVINE, L., Distribution of prostaglandin E 9·ketoreductase and

NAD+·dependent and NADP+-dependent 15·hydroxyprostaglandin dehydrogenase in the

renal cortex and medulla of various species. Res. Commun. Chem. Pharmacol. 12, 781- 795

(1975). LEE, S. C., and LEVINE, L., Prostaglandin metabolism. 1. Cytoplasmic reduced nicotinamide

adenine dinucleotide phosphate· dependent and microsomal reduced nicotinamide adenine dinucleotide· dependent prostaglandin E 9·ketoreductase activities in monkey and pigeon

tissues. J. bioI. Chem. 249,1369-1375 (1974). - Prostaglandin metabolism. II. Identification of two 15-hydroxyprostaglandin dehydro·

genase types .. J. bioI. Chern. 250, 548-552 (1975). NAKANO, J., ANGGARD, E., and SAMUELSSON, B., 15·Hydroxy·prostaonate dehydrogenase. Pro­

staglandins as substrates and inhibitors. Eur. J. Biochem. 11, 386-389 (1969). NISSEN, H. 1\1., and ANDERSEN, H., On the localization of a prostaglandin· dehydrogenase activity

in the kidney. Histochemie 14, 189-200 (1968).

- On the activity of a prostaglandin-dehydrogenase system in the kidney. A histochemical study during hydration/dehydration and salt·repletion/salt·depletion. Histochemie 17, 241-247 (1969).

PACE·AsCIAK, C., Activity profiles of prostaglandin 15· and 9·hydroxydehydrogenase and 13· reductase in the developing rat kidney .. J. bioI. Chem. 250, 2795-2800 (197501).

Prostaglandin 9·hydroxydehydrogenase activity in the adult rat kidney. J. bioI. Chem. 250, 2789-2794 (197Sb).

and DOYIAZET, F., 9-Hydroxyprostaglandin dehydrogenase activity in the adult rat kidney.

Regional distribution and subfractionation. Biochim. biophys. Acta 380, 338 - 343 (197 5).

and MILLER, D., Prostaglandins during development. II. Identification of prostaglandin 9·

hydroxy dehydrogenase activity in adult rat kidney homogenate. Expericntia 30, 590 - 592 (1974).

RUCKRICH, M. F., WENDEL, A., SCHLEGEL, IV., .JAcKISCH, R., und JUNG, A., 15.Hydroxyprosta·

glandin.Dehydrogenase aus Humanplacenta. II. Steady state Kinetik und der EinfluJ3 von

Prostaglandin F 2",·Analogen. Hoppe·Seyler's Z. PhysioI. Chem. 356, 799-809 (1975).

SEIDLER, E., Zum Mechanismus del' Tetrazoliumsalzreduktion und \Virkungsweise des Phenazin­

methosulfates. Acta histochem. 65, 209-218 (1979).

SIGGINS, G., HOFFER, B., and BLOOM, F., Prostaglandin-norepinephrine interactions in brain: microelectrophoretic and histoehemical correlates. Ann. N. Y. Acad. Sci. 180, 302 - 319 (197I).

246 F. WOHLRAB und A. FEUSTEL, Zur Histotopochemie Prostaglandin F2<X abbauender Enzyme

WOHLRAB, F., und FEUSTEL, A., On the histochemistry of prostaglandin. dehydrogenase; Acta bioI. med. germ. 37, 897-899 (1978).

- SEIDLER, E., und KUNZE, K. D., Histo- und Zytochemie dehydrierender Enzyme. Grundlagen

und Problematik. Johann Ambrosius Barth Leipzig 1979.

WRIGHT, J. T., and CORDER, C. N., NAD+-15-Hydroxyprostaglandin dehydrogenase distribution

in rat kidney. J. Histochem. Cytochem. 27,657 -664 (1979).

- and TAYLOR, R., Studies on rat kidney 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase. Biochem. Pharmacol. 25, 1669 -1673 (1967).

Fur zuverlassige technische Assistenz danken wir Frau MTFA URSULA KURSOHNER.

Adresse: Dr. rer. nat. habil. FRANK ""OHLRAB, Pathologisches Institut der Karl-Marx-Uni­versitat Leipzig, DDR - 7010 Leipzig, Liebigstra13e 26.