UP 3: Isomerisierung in cyanobakteriellem Phytochrom

400 500 600 700

0

100

200

300

400

statische Absorptionsspektren von Cph1-PCB

Pr Pr und Pfr Pfr

Abso

rptio

n / m

OD

λ / nm

500 550 600 650 700

0

100

200

300

statisches Absorptionsspektrum von Cph1-PEB

PEB

Abso

rptio

n / m

OD

λ / nm

0 100 200 300 400 500

-1,0

0,0

0,0

1,0

-10

0

770 nm

Zeit / ps

555 nm

670 nm

Abso

rptio

nsdi

ffere

nz /

mO

D

Pflanzliches Phytochrom

• einer der wichtigsten Photorezeptoren der Pflanze

• Ausbildung des Photosyntheseapparates

• Steuerung des Blühverhaltens, der Samenkeimung etc.

• Bestandteil der „inneren Uhr“ der Pflanze

Bakterielles Phytochrom aus Cyanobakterium Synechocystis Cph1-PCB:

• phosphoryliert Rcp1 aus seiner Pr-Form

Photoanregung

keine Isomerisierung

durch Fehlen der

C15-C16 Doppelbindung

Cph1-PEB

Cph1-PCB Pr-Form

Isomerisierung:

Wellenpaketdynamik:

Cph1-PCB Pfr-Form

Pr Pfr

Isomerisierung um die

C15-C16 Doppelbindung

Photoreaktion

Analyse der Photoreaktionen:

0 10 20 30 400

1

2

-9-6-30

-6

-4

-2

0

760 nm

Zeit / ps

710 nm

690 nm

Abso

rptio

nsdi

ffere

nz /

mO

D

Transienten λexc. = 727 nm

ReaktionskoordinateE Z

lumi-F

En

erg

ie

S0

S1 540 fs

3,2 ps

kinetisches Modell

Transienten λexc. = 650 nmDifferenzspektren

-6-4-202

0 50 100 150 200 250 300-6-4-202

0369

565 nm Fit

Abso

rptio

nsdi

ffere

nz /

mO

D

640 nm Fit

Zeit / ps

470 nm Fit

Transienten λexc. = 580 nm

450 500 550 600 650 700

0,04,0

-20

-10

0

10

Abso

rptio

nsdi

ffere

nz /

mO

D

Res

iduu

m

λ / nm

Differenzspektrum 60 ps elektronisch angeregter Zustand

stat. Fluoreszenz stat. Absorption stat. Abs. + Fluor.

Differenzspektren

Reaktionskoordinate

EZ

lumi-R

En

erg

ie

S0

S1

kinetisches Modell

150 fs

16 ps

Reaktionskoordinate

Z

Energ

ie

S0

S1

1,1 ns

≤ 150 fs

kinetisches Modell

Transienten λexc. = 580 nm Transienten λexc. = 650 nm

Cph1-PEB Cph1-PCB Pr-Form

Vorhaben zur Reaktionssteuerung durch dieProteinumgebung:� Diskrete Ratenkonstanten oder Verteilung von Ratenkonstanten?

� Ursache für die langsame Isomerisierung in der Pr-Form?

� Abhängigkeit der Dynamik von der Temperatur

� Anisotropiemessungen zur Erweiterung der Datenbasis

� Modifizierung der Chromophor-Protein-Wechselwirkung durch Mutanten

� Welche dynamischen Prozesse werden durch den Ring D und die Möglichkeit der Isomerisierung verursacht (Cph1-PEB und weitere Chromophore)?

� Zeitaufgelöste Strukturuntersuchungen durch Infrarotmessungen

Vorhaben:� genauere Charakterisierung der ultrakurzen Zeitkonstanten in Cph1-PEB sowie in Cph1-PCB in der Pr- und der Pfr-Form

� Abgrenzung der dissipativen von der kohärenten Dynamik

� Untersuchung der oszillatorischen Signale in Cph1-PEB und Cph1-PCB in der Pr-Form

� Charakterisierung der Wellenpaketdynamik

� Sind ähnliche Signale auch in der Pfr-Form zu sehen?

� Untersuchung des freien PCB- und PEB- Chromophors auf oszillatorische Signale

� Vergleich der ermittelten Schwingungsfrequenzen mit Infrarotmessungen

Pfr

Chromophor:

N

H

RN

O

Cys

H

NH

R

NH O

+A BC

D

Pr

510

15

PCB:

PEB:

1510

5 D

CBA +

N

H

RN

O

Cys

H

NH

R

OHN

N

H

R

N

O

Cys

H

N

H

R

N

H

O

+A BC

D

510

15

Photoreaktion:� Verteilung von Ratenkonstanten in der Primärdynamik um (16 ps)-1

� Bei höherenergetischer Anregung wird die Verteilung breiter

� Spektren der Grundzustandsabsorption, des angeregten Zustandes und des Photoproduktes überlagern stärker als in pflanzlichem Phytochrom (Andel et al., Rentsch et al., Bischoff, Holzwarth et al.)

dissipative Prozesse im angeregten Zustand:� Schnelle Umverteilung der Anregungsenergie innerhalb 150 fs

Photoreaktion:� 2 Ratenkonstanten beschreiben die Primärreaktion

� Die Relaxation auf der S1-Oberfläche ist barrierelos

� Die Dynamik ähnelt der bR-Dynamik

� Deutlicher Unterschied der Reaktionssteuerung durch das Protein in der Pfr-Form im Gegensatz zur Pr-Form

� Ratenkonstanten analog zu Haferphytochrom (Bischoff)

Kooperationen:• Prof. J. Hughes (Gießen), Dr. T. Lamparter (FU Berlin)

• Priv. Doz. G. Hermann (Jena)

Photoreaktion:� strahlende Lebensdauer 1,1 ns

� dissipative Prozesse sind nach etwa 200 fs im elektronisch angeregten Zustand abgeschlossen

� Spektrum des elektronisch angeregten Zustandes ist deutlich blauverschoben im Gegensatz zur Pr-Form in Cph1-PCB

� Chromophor-Protein Wechselwirkung am Ring D beeinflußt die spektrale Lage des elektronisch angeregten Zustandes stark

0 400 800 1200 1600

0,0

0,4

0,8

1,2

Four

ierk

oeffi

zien

ten

a.u.

Wellenzahl / cm-1

Summe derFouriertransformiertenaus den Residuen der

Transienten

Summe derFouriertransformiertenaus den Residuen der

Transienten

� Oszillatorischer Signalanteil in den Transienten

� komplexe mehrexponentielle Dynamik im Zeitbereich unter 200 fs

F. Andel, K.C. Hasson, F. Gai, P.A. Anfinrud und R.A. Mathies; Biospectroscopy 3, 421 (1997)Mark Bischoff, Dissertation, Friedrich-Schiller-Universität Jena, (1999)A.R. Holzwarth, E. Venuti, S.E. Braslavsky und K. Schaffner; Bioch. Biophys. Acta 1140, 59 (1992)S. Rentsch, M. Bischoff, G. Hermann und D. Strehlow; Appl. Phys. B 66, 259 (1998)

600 620 640 660 680 700 720 740 760-15

-10

-5

0

-15

-10

-5

0

λanr. = 615 nm

Abso

rptio

nsdi

ffere

nz /

mO

D

λ / nm

300 fs 600 fs 1,2 ps 2,4 ps 5 ps 10 ps 20 ps 40 ps 80 ps 150 ps 300 ps

Grundzustands- absorption

stimulierte Emission

λanr. = 650 nm

300 fs 600 fs 1,2 ps 2,4 ps 5 ps 10 ps 20 ps 40 ps 80 ps 150 ps 300 ps

0 400 800 1200 16000

1

2

Four

ierk

oeffi

zien

ten

a.u.

Wellenzahl / cm-1

-30-20-10

0-6-30

0 200 400 600 800 1000-4-20

Ab

sorp

tions

diffe

renz

/ m

OD

580 nm

565 nm

Zeit / fs

640 nm