Universidade Federal de Pernambucofactivation of complement system. Single nucleotide polymorphism...
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Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Veridiana Câmara Furtado PERFIL DO POLIMORFISMO GÊNICO DA β-DEFENSINA-1 E DA MBL2 EM PACIENTES COM DIAGNÓSTICO DE ONICOMICOSE CAUSADAS POR Candida spp Recife, 2008
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Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas
Veridiana Câmara Furtado
PERFIL DO POLIMORFISMO GÊNICO DA β-DEFENSINA-1 E DA
MBL2 EM PACIENTES COM DIAGNÓSTICO DE ONICOMICOSE
CAUSADAS POR Candida spp
Recife, 2008
PERFIL DO POLIMORFISMO GÊNICO DA β-DEFENSINA-1 E DA
MBL2 EM PACIENTES COM DIAGNÓSTICO DE ONICOMICOSE
CAUSADA POR Candida spp
Tese apresentada ao programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas do Centro de Ciências Biológicas daUniversidade Federal de Pernambuco, como pré-requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, Área de concentração-Microbiologia.
Orientadora: Profa. Ana Lúcia Figueiredo Porto, M.D., PhD
Co-Orientador: Prof. Jose Luiz Lima Filho, M. D., PhD
Prof. Sérgio Crovella, M.D., PhD
ii
COMISSÃO EXAMINADORA
Membros Titulares
Profª. Drª. Ana Lúcia Figueiredo Porto Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal-UFRPE, Recife-PE
Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho Departamento de Bioquímica- UFPE, Recife-PE
Prof. Dr. Sérgio Crovella Departamento de Genética- Universidade de Trieste- Itália
Prof. Dr. Paulo Roberto Eleutério Souza Departamento de Genética-UPE, Petrolina-PE
Prof. Dr. Prof. Edson Holanda Teixeira Universidade Federal do Ceará -UFCE
Membros Suplentes
Profª. Drª. Maria Taciana Soares Cavalcante Departamento Morfologia e Fisiologia –UFRPE, Recife-PE
Prof. Dr. Armando Mansden Departamento de Micologia-UFPE-Recife--PE
iii
Tese: PERFIL DO POLIMORFISMO GÊNICO DA β-DEFENSINA-1 E DA
MBL2 EM PACIENTES COM DIAGNÓSTICO DE ONICOMICOSE CAUSADA
POR Candida spp
Doutoranda: Veridiana Câmara Furtado
Data da defesa: 26/02/ 2008
Banca Examinadora:
Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA-UFPE)
Prof. Dr Paulo Roberto Eleutério de souza Universidade de Pernambuco (UPE) Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA-UFPE)
Prof. Dr. Sérgio Crovella Universidade de Trieste- Itália Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Prof Dr. Edson Holanda Teixeira Universidade Federal do Ceará - UFCE
Profa Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto Universidade Federal Rural de Pernambuco Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA-UFPE)
iv
AGRADECIMENTOS
- A minha mãe Graciete, verdadeiro anjo, sempre dispostos a ajudar.
- A meu pai Josenaldo, pelo apoio em meios estudos.
- À Prof. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto, pela orientação objetiva e
esclarecedora.
- Ao Prof. Dr Crovella, por ter acreditado no meu projeto e pela generosidade
das indicações bibliográficas.
- Ao Prof. Dr. Armando Marsden, pela generosidade, amizade e contribuição no
desenvolvimento da tese.
- A Prof, Dr. Paulo Roberto Eleutério Souza, pelo apoio no desenvolvimento do
projeto.
- Ao prof. Dr. José Luiz Filho pelo local cedido para o desenvolvimento da tese
- Às Dras. Rossana Sette e Kedma Lima, que fizeram a identificação das
espécies de Candida.
- À .Profa. Dra Aronita Rosenblatt , que ajudaram com seu apoio e para o
desenvolvimento da tese.
- À Dra. Ana Bloter, pelo apoio no desenvolvimento da tese.
- À Profa. Dra. Patrícia Moura pela ajuda na construção do Projeto.
- Às amigas Viviane Araújo e Clarissa Lins, pelo apoio, por acreditar em mim e
por me ajudarem nos experimentos.
v
- Às minhas amigas, Taciana, Silvia e Idjane, pela amizade e apoio durante
essa jornada.
-A Moises por ser uma pessoa sempre disponível em sua atividade está de
bom humor todos os dias do seu trabalho.
- Aos meus amigos do PROCAPE, Cleide, Naila, Dilenia e Cristian pelo apoio
nas horas que foram preciso.
- À minha amiga Valéria Pereira que me acompanha desde a graduação.
-À Maria José – minha tia – pelas orações que tanto me deram forças para
ultrapassar os obstáculos.
- À minha tia Tânia e ao meu tio Rildo, pelo apoio nos momentos necessários.
- À minha querida irmã Fabiana, pelo apoio em todos os momentos.
- Ao meu irmão Josenaldo pela sua amizade e cumplicidade.
- À Adenilda- pelo seu apoioe atenção quando era por mim solicitada.
- Às minhas amigas Pedrita e Monique pela atenção e carinho.
- A todos que direta e indiretamente contribuíram com a realização deste
trabalho, o meu sincero agradecimento.
- A Deus que sempre esteve ao meu lado, dando-me forças e coragem para
seguir em frente.
OBRIGADA!
Veridiana Câmara Furtado
vi
Eu dedico esta tese:
Ao meu Deus que permitiu mais uma jornada.
A minha mãe pelo
apoio, luta, confiança e amor sempre dedicado em todos esses anos.
vii
“Entrega teu caminho ao senhor, confia nele e o mais ele fará.”
Salmo 37:5
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Aspecto macroscópico das lesões nas unhas do 1° 7
E 5° pododáctilo esquerdo Figura 2: Estrutura da lectina ligadora de Manose 14
Figura 3: Caminhos de ativação do sistema Complemento 16
Figura 4: Ativação da via clássica do complemento pela MBL
independente da presença de anticorpo e da subnidade C1
do complemento 17
Figura 5: Estrutura “em forma de tulipa” da MBL 20
Figura 4: Interação da MBL com HIV 21
Figura 6: Modelo tri-dimensional das estruturas secundária
da α-defensinas e β- defensinas 25
Figura 7: Curva de amplificação gerada por PCR em tempo real 32
Figura 8: Princípio da análise da curva de “melting” 33
ix
RESUMO
A β-defensina-1 (hBD1) e a lectina ligadora de manose (MBL) são importantes
componentes do sistema imune inato. As β-defensina-1 são peptídeos que
atuam como antibióticos naturais contribuindo como a primeira linha de defesa
do nosso organismo. Enquanto a MBL é uma proteína capaz de ligar-se à
carboidratos de superfície de microrganismos e ativar o sistema complemento.
Ambas atuam no reconhecimento e eliminação dos microrganismos, tais como;
bactérias, fungos, protozoários e vírus. O presente trabalho teve como objetivo
analisar o polimorfismo do gene da β-defesina-1 e da MBL2 em pacientes com
onicomicose causadas pelas amostras de Candida ssp. Foram selecionados
100 pacientes atendidos no Departamento de Micologia Médica da UFPE e as
amostras de Candida isoladas foram identifidas no Laboratório de Medicina
Diagnóstica – NKB, baseada segundo as suas características morfológicas,
bioquímicas. Em relação a análise do polimorfismo de um único nucleotídeo
(SNPs), o DNA foi extraído de sangue total e submetido à amplificação por
PCR em tempo-real. Os resultados obtidos da identificação das espécies de
Candida foram os seguintes: C. parapsilosis (50%), C. tropicalis (34%) e C.
albicans (6%). Estes resultados mostram que houve um predomínio de
espécies de Candida não-albicans em relação às C. albicans, os resultados da
freqüência alélica da MBL entre os pacientes com onicomicoses e controle
saudáveis mostraram que a freqüência do alelo 0 foi estatisticamente mais
significativa nos pacientes com onicomicose do que nos pacientes saudáveis
(35% vs. 20%, p=0,0001), odds ratio (OR) 1,72 com 95% de intervalo de
confidência. Na expressão da hBD1 foi observado que diferença na freqüência
genotípica (13% s GG,vs CC 2%):odds ratio (OR= 1,98) e quanto ao mutante
alélico foi predominante nos pacientes com onicomicose em relação ao
controle (25% vs. 14%). Esses resultados indicam que a presença de alelo
mutante da β-defesina-1 e/ou da MBL2 podem contribuir, como um dos fatores,
na onicomicose causada por Candida sp.
Palavras-chave: β-defesina-1, MBL, polimordismo e Candida sp.
x
ABSTRACT
The human β-defensin-1 (hBD1) and mannose-binding lectin (MBL) are
important components of the innate immune system. β-defensin-1 are peptides
that act as natural and antibiotics contributes as first line of body defense. MBL
is a protein that binds on the surface of microorganism and enable the
factivation of complement system. Single nucleotide polymorphism (SNP) of the
gene hBD-1 and MBL2 genes in patients with onychomycosis caused by
Candida species. Was investigated 100 patients attended at the Department of
Medical Mycology/ UFPE and the Candida was identified at Laboratory of
Diagnostic Medicine-based (NKB) second morphological and biochemesty
characteristics. The SNPs analysis DNA was performed using patient extracted
from whole blood and subjected to real-time PCR amplification and genotyping
by melting temperature. The results of Candida species identification were: C.
parapsilosis (50%), C. tropicalis (34%) and C. al assay.albicans (6%). These
results show that there were a predominance of non-Candida albicans species.
The results of the allelic frequency among patients with Candidal
onychomycosis and healthy controls showed that the frequency 0 allele was
significantly higher in patients than healthy patients (35% vs. 20%, p = 0.0001),
odds ratio (OR) 1.72 with a 95% confidence interval regarding hBD1 The
expression was observed that difference in genotypic frequencies (13% s GG,
CC 2%): odds ratio (OR = 1.98) and on the mutant alélico was predominant in
onychomycosis patients in relation to the control (25% vs. 14%). These results
indicate that the presence of β-defesin-1 mutant allele and / or the MBL2 can
contribute, as one of the factors in Candidal onychomycosis
Keywords: β-defesin-1, MBL, polimorphismo and Candida spp
xi
SUMÁRIO
RESUMO x ABSTRACT xi 1. INTRODUÇÃO 01 2. OBJETIVOS 03 2. 1 Objetivo Geral 03 2. 2 Objetivos Específicos 03 3. REVISÃO DA LITERATURA 04 3. 1 Onicomicose 04 3. 2 O Gênero Cândida 08 3. 2. 1 Espécies de Candida spp mais relacionadas com
infecção 09
3. 3 Sistema Imune 11 3. 4 Lectina Ligadora de manose (MBL) 13 3. 4. 1 Polimorfismo Gênico da MBL 22 3. 5 Defensinas 24 3. 5. 1 β-defensinas 3. 5. 2 Polimorfismo Gênico da β-defensina 1 28 3. 6 Polimorfismo de Único Nucleotídeo (SNP) 28 3. 6. 1 Detecção de polimorfismo de um único
nucleotídeo (SNPs) pela técnica da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real)
31
3. 6. 1 Princípio da curva de “melting” 32 4. REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS 34 Capítulo I 44 Capítulo II 56 5. CONCLUSÕES 68 ANEXOS I 69 ANEXO II 73
xii
1. INTRODUÇÃO
As onicomicoses são infecções fúngicas comuns nas unhas, tanto
das mãos quanto dos pés, sendo responsáveis por cerca de 15% a 40% das
doenças ungueais. Sua prevalência está em crescimento o que pode ser
explicado por fatores tais como: o aumento da incidência de imunodeficiências,
idade da população, hábitos esportivos, indumentária, entre outros (SILVA,
2000). Para se conseguir a cura dessas infecções, é imprescindível corrigir os
fatores predisponentes e\ou agravantes que existam. (MINAMI, 200). Porém,
nos últimos anos tem aumentado os casos de onicomicoses causadas por
fungos não dermatófitos. Nesse caso, podemos citar os casos causados por
Candida sp. fazendo parte das infecções causadas por agentes emergentes
(MARTINS et al, 2007).
O sistema imune constitui o mecanismo de defesa do organismo
e está dividido em dois grandes grupos: o sistema imune inato que é a primeira
linha de defesa contra uma grande variedade de microrganismos e o sistema
imune adaptativo que apresenta uma resposta específica. O sistema imune
inato apresenta uma resposta inespecífica mediada por peptídeos, proteínas e
pelos polimorfonucleares, além de células dendríticas e natural Killer. Entre os
componentes do sistema imune inato estão as defensinas e a proteína ligadora
de manose – MBL (ROITT, 2004).
A lectina ligada a manose (MBL) também chamada de proteína
ligada a manose, faz parte da família das proteínas colectinas produzida no
fígado e secretada na corrente sanguínea, e que têm um papel crucial no
sistema imune inato (DOWNING, 2003). A importância dessa proteína está na
capacidade de se ligar a carboidratos do tipo manose, frutose e N-
acetilglicosamina os quais estão presentes na superfície dos microrganismos
(THIEL, 2000). A ligação da MBL, aos carboidratos estruturais da superfície de
bactérias, fungos, protozoários e vírus, apresenta sua atividade antibacteriana
através da destruição dos microrganismos por dois mecanismos: ou caminho
citolítico do sistema complemento ou promovendo a fagocitose por
opsonização (JACK et al, 2001).
1
Entre os outros componentes da imunidade inata temos as
defensinas, que fazem parte do sistema imune inato. São pequenos peptídeos
catiônicos, anfipáticos, contendo em geral de 20 a 45 aminoácidos, não
glicosilados, ricos em arginina com um peso molecular entre 3,5 e 6,0 kDa, as
quais contêm em sua estrutura seis cisteínas que formam pontes dissulfeto
intramoleculares bem características (SANTIAGO et al., 2006). Estas
contribuem para a defesa do organismo contra um amplo grupo de
microrganismos, incluindo bactérias Gram-negativas e positivas, protozoários,
fungos e vírus (ZAPATA & MONTOYA, 2006;). Em humanos foram
descobertas duas classes de defesinas, denominadas α e β, esta classificação
foi realizada através de seus arranjos e seqüências de cisteínas. As β-
defensinas (HBDs) atuam como antibióticos naturais. Podendo ser encontradas
nos trato respiratório e reprodutor feminino (CHEN et al., 2006; HARDER et al.,
2001), em glândulas mamárias (LEHRER; GANZ, 2002. JIA et al., 2001),
epidídimo, líquido seminal, útero, nas glândulas tireoidianas (SANTIAGO et al.,
2006; BIRCHSLER et al., 2001) e tecido epitelial. Já foram descobertas 6 β-
defensinas humanas que são HBD-1, HBD-2, HBD-3, HBD-4, HBD-5 e HBD-6.
Entre as β-defensinas, a HBD-2 e HDB-4 apresentam atividade antifúngica.
Estudos também estão sendo realizados com a HBD-1 quanto a sua
participação no processo de defesa nas infecções causada por Candida sp.
esse estudo foi realizado em pacientes que apresentavam candidíase oral
(BONIOTTO et al., 2004).
Estudar o polimorfismo do gene da β-defensina -1, e da MBL2
nas infecções causadas por Candida sp. poderá esclarecer o papel desses
componentes da imunidade inata frente as onicomicose.
2
2- OBJETIVOS
2. 1-Objetivo geral:
Relacionar o polimorfismo do gene da MBL2 e da β-defensina -1
em pacientes acometidos por onicomicose causada por Candida spp.
2.2 - Objetivos Específicos:
Selecionar os pacientes acometidos por onicomicose causada por
Candida spp;
Isolar e identificar as amostras de Candida;
Analisar o polimorfismo do gene MBL 2 e β-defensina-1 nos
pacientes estudados;
Correlacionar o polimorfismo do gene da MBL 2 e da β-defensina
-1 nos pacientes estudados;
Avaliar os pacientes acometidos por onicomicose por Candida em
relação a idade, sexo, local e tempo da infecção.
3
3 - REVISÃO DA LITERATURA
3. 1 ONICOMICOSE
As onicomicoses são infecções fúngicas determinadas por
diversas espécies de fungos: dermatófitos, não dermatófitos e leveduras. A
distribuição desses diferentes patógenos não é uniforme, e depende de vários
fatores tais como clima, área geográfica e migração. Os dermatófitos eram os
principais causadores de onicomicoses. Nos últimos anos, os casos de
onicomicoses não dermatofíticas, aumentaram, sobretudo na Europa, onde são
responsáveis por 1,6 a 6%. (MARTINS, et al., 2007).
A onicomicose representa 20% das doenças que acomete as
unhas e é uma das mais freqüentes causas de onicopatias em todo o mundo.
Na Austrália, Inglaterra e nos Estados Unidos, a prevalência é estimada em
torno de 3% do total da população em geral, elevando-se para 5% com o
aumento da idade acima dos 55 anos. A maioria dos autores diagnostica como
agentes mais freqüentes os dermatófitos (80 a 90%), seguidos pelas leveduras
(5 a 17%) e por fim fungos filamentosos não dermatofíticos (2 a 12%). Em
Barcelona a prevalência dos fungos filamentosos foi de 7,6%, sendo o
Scopulariopsis brevicaulis a espécie mais freqüentemente encontrada. (Araújo,
et al, 2007). Porém, em estudo realizado na cidade de São José do Rio Preto,
SP relatam uma incidência de onocomicose causadas por Candida sp maior
que por dermatófitos e sendo a C. parapsilosis a predominante com 47%
dentro do grupo das leveduras (MARTINS et al., 2006).
Sua prevalência está em crescimento o que pode ser explicado
por fatores como aumento da incidência de imunodeficiências e da idade da
população, melhora da vigilância médica, e dos cuidados, tanto do médico
quanto do paciente, em relação às unhas (RAMOS, 2000).
Alguns fatores favorecem o desenvolvimento, tais como uso de
calçados fechados e/ou úmidos, traumatismos freqüentes nas unhas, e pisar
4
descalço em banheiros públicos são fatores que podem levar ao aumento
dessa incidência. Por estas razões as infecções fúngicas dos pés, entre elas as
onicomicoses, podem ser muito mais comuns em certos grupos, sujeitos a
esses fatores, como é o caso do pessoal das forças armadas, mineiros de
carvão, nadadores freqüentes, escolares, e desportistas, do que se constata
nos estudos de população geral.
A onicomicose ou tinha da unha é afecção eminentemente
crônica, é universal, e se manifesta por descolamento da unha, hiperceratose
subungueal, podendo chegar até a destruição parcial ou total da unha. Há, por
vezes, grande dificuldade para se chegar ao diagnóstico de infecção fúngica
das unhas, o que ocorre tanto em relação ao seu diagnóstico diferencial com
outras onicopátias, quanto à etiologia da própria onicomicose, o que implicará
em diferentes tratamentos.
As manifestações da onicomicose são: unhas frágeis,
quebradiças, com fendas longitudinais ou transversais, chegando até á
alteração completa da lâmina ungueal (RAMOS, 2000). A onicólise se
caracteriza por um descolamento da unha de seu leito na sua região distal e/ou
lateral, dando um aspecto esbranquiçado e criando um espaço subungueal
onde se acumulam germes, sujeira, queratina e outros detritos. Nesses casos é
preciso ter certos cuidados como evitar traumatismo, detergentes e certos
medicamentos, além de tentar erradicar os fungos e bactérias porventura
presentes, e afastar a possibilidade de psoríase (BACHETTI, 2001).
Oníquia e Paroníquia devidas a leveduras: a Candida albicans e
raramente outras leveduras podem produzir paroníquias e, secundariamente,
oníquias. São afetados um ou mais dedos das mãos, raramente os
pododáctilos (referente aos dedos dos pés). A princípio, forma-se coleção
puriforme nas dobras unguiais que se tornam vermelho-vivo e dolorosas, às
vezes acompanhadas de adenite axilar. Em alguns dias, o exsudato começa a
ser eliminado, atenuando-se o caráter inflamatório. Todavia, subsistem edema
e eritema de tonalidade arroxeada das dobras, descoladas em extensão de 1.a
2 mm e fazendo nítido relevo sobre a lâmina unguial. Pela compressão surge
gotícula puriforme entre as dobras e a unha. Nesta, com o tempo, aparecem
sulcos transversais de cerca de 1 mm, paralelos, dando-lhes aspecto ondulado
5
e manchas escuras, circulares ou ovais (LACAZ, 2000).
Em alguns casos as leveduras determinam lesão primária da
lâmina, que se torna friável, opaca e pardacenta; as alterações são
confundíveis com as da onicomicose tricofítica, sendo muito difícil a
diferenciação clínica (BECHELLI et al, 1978). Os fatores que contribuem para
a instalação de onicomicoses podem ser divididos em fatores predisponentes:
sexo, perturbações circulatórias periféricas, resistência diminuída para as
infecções e fatores de precipitação: traumatismos (no trabalho, na manicure,
etc.), infecções (piogênica: S. aureus; micótica - C. albicans); fatores de
manutenção; profissão (imersão dos dedos, maceração), clima (sensibilidade
ao frio), disfunção hormonal (menopausa, obesidade, diabetes). É comum em
mulheres que se põem mais em contato com água (cozinheiras, lavadeiras,
etc.). Nos homens, tal infecção pode ocorrer particularmente nos lavadores de
louças, manipuladores de frutas, jardineiros, operários de curtume, etc.
(Esteves et al, 1978) As alterações clínicas vão de pequenas manchas
esbranquiçadas ou amareladas (discromia), espessamento, fendilhação,
descolagem que promove a separação da unha em duas lâminas e
hiperceratose sub-unguial. Nas partes lesadas, observa-se perda de brilho,
opacidade e, destruição da unha (BECHELLI et al, 1978).
A onicomicose tem sido vista, por muitos, como um problema
meramente estético e tem tido por isso sua importância negligenciada. É
necessário, no entanto, ser dimensionado de uma maneira categórica o seu
real significado, já que interfere de modo expressivo no bem estar e na
qualidade de vida dos pacientes. A onicomicose está, com certeza, associada
ao desconforto físico e psicológico, e por ser doença contagiosa e de aspecto
muito desagradável, a maior parte dos pacientes com lesão de unha da mão
procuraram escondê-la, e, quando no pé, local de desenvolvimento mais
freqüente, muitos evitaram ir à praia ou à piscina para não ter que tirar os
sapatos em público. Além disso, uma onicomicose não tratada pode vir a
causar problemas mais sérios com o passar do tempo, ou seja, se o indivíduo
seja acometido por alguma doença que comprometa sua imunidade como, por
exemplo: Diabetes Mellitus, doenças auto-imunes ou até mesmo passar por
algum processo cirúrgico e usos de drogas imunossupressoras. Também tem
6
sido relatada a importância dessa infecção em crianças e portadores do vírus
do HIV (PIRACCINI & TOSI, 2008).
Diante desses relatos a onicomicose está deixando de ser vista
como apenas um problema estético sem maiores agravantes para a saúde e
passando a ser considerada uma doença que, aparentemente inofensivo, pode
vir a se tornar sério problema para o indivíduo portador. O que vai depender do
seu estado geral de saúde bem como seu organismo responde
imunologicamente a infecções. Salientando que nos últimos anos vem
aumentando a prevalência de do gênero Candida causando onicomicose
(SEGAL, et al, 2000).
oFigura 1 – Aspecto macroscópico das lesões nas unhas do 1 e
5º Pododáctilo Esquerdo. Cortesia do Prof. Armando Marsden
7
3. 2 O GÊNERO CANDIDA
A Candida faz parte da classe dos Ascomicetos, um grupo de
fungos potencialmente patogênicos que podem causar doenças infecciosas
nos seres humanos, por exemplo, a Candidíase ou Candidose. Sendo
considerado um fungo microscópico de paredes finas e pequenas, medindo
cerca de 4 a 6 µm (SANTOS et al., 2004).
Em 1923, foram classificados por Berkhout do seguinte modo:
Reino................................................................ Fungi
Filo.................................................................... Ascomycota
Subfilo.............................................................. Ascomycotina
Classe............................................................... Ascomycetes
Ordem.............................................................. Saccharomycetaceae
Gênero......................................................... Candida
As leveduras do gênero Candida apresentam-se
micromorfologicamente como células globosas, ovaladas ou alongadas e gram-
positivas. As colônias de Candida têm uma consistência cremosa e um
crescimento em geral rápido de 2 a 4 dias. Quando na forma micelial,
apresentam-se como pseudo-hifas, podendo formar hifas verdadeiras, que se
alongam a partir das leveduras. A identificação de hifas e pseudo-hifas pode
ser facilitada pelo uso de hidróxido de potássio a 10% ou lactofenol azul de
algodão azul de Amann (MIRANDA et al., 2005).
A sua reprodução ocorre por brotamento ou gemulação
(reprodução com divisão do citoplasma através de estrangulamento). As
formas leveduriformes são responsáveis pela colonização e pelas infecções
fúngicas superficiais causadas em imunocompetentes bem como, infecções
sistêmicas causadas em imunodeprimidos. Essas infecções ocorrem em
função do desequilíbrio entre parasito-hospedeiro, devido às desordens
8
causadas por mudanças hormonais, tais como, menopausa, gravidez, a
ingestão de pílulas anticoncepcionais ou em função de endocrinopatias
principalmente a Diabete Mellitus (especialmente quando este não for
controlado) (MIRANDA et al, 2005).
Existem mais de 150 espécies identificadas, mas só nove é
patogênica ao homem: C. albicans, C. guilhermondii, C. krusei, C. parapsilosis,
C. tropicalis, C. pseudo-tropicalis, C. lusitaneae, C. dublinensis e C. glabrata.
As leveduras patogênicas mais nocivas ao homem – que provocam doenças –
são a C. albicans, C. glabrata, C. krusei e a C. parapsilosis (SANTOS et al.,
2004).
3. 2. 1 - Espécies de Candida spp mais relacionadas com infecções
As espécies do gênero Candida podem ser encontradas fazendo
parte da microbiota do homem ou dependendo das alterações imunológicas do
hospedeiro podem ser potencialmente patogênicas. As espécies apresentam
de um modo geral peculariedades quanto à virulência e resistência a
antifúngicos. Entre as espécies de Candida a C. albicans, foi a que apresentou,
durante muitos anos, um maior interesse médico. Devido a essa espécie estar
presente em torno de 80% da população humana sob circunstâncias normais,
podendo ser encontrada nas mucosas dos tratos respiratórios, gastrintestinais,
genitais e na pele. Em função de desordens que o organismo pode vir a sofrer,
tais como: alterações hormonais, menopausa, gravidez, ingestão de pílulas
contraceptivas, este fungo passa de sapróbio a parasita podendo causar
infecções em pacientes debilitados e imunossuprimidos (MEZZARI et al,
2004;).
Quanto a C. glabrata, até algum tempo atrás, acreditava-se não
ser patogênica e totalmente inofensiva ao ser humano. Em estudos posteriores,
em função do aumento do número de pessoas imunodeprimidos, esta espécie
foi considerada a 2º ou 3º causa mais freqüente de infecções fúngicas depois
da C. albicans. Este fato foi relatado em indivíduos acometidos pelo vírus HIV.
(MEZZARI et al., 2004).
Semelhante a C. glabrata, a C. parapsilosis, (Langeron et Talice,
9
1932), é uma levedura oportunista ao homem podendo causar candidíase
superficial e sistêmica em pacientes imunocomprometidos. Embora menos
comum que a C. albicans, a C. parapsilosis causa vaginite, peritonite,
candidíase oral, infecção no trato urinário, septicemia e endocardite (MEZZARI
et al., 2004).
A Candida tropicalis pode ser encontrada fazendo parte da flora
normal muco-cutânea. Porém, segundo estudos realizados na Austrália essa
espécie foi considerada uma das principais causas de septicemia e candidíase
disseminada, sendo encontrada principalmente em pacientes com linfoma,
leucemia e diabetes (ALMEIDA et al., 2000).
Em relação a C.krusei é considerada uma espécie pouco
patogênica e com baixa capacidade de aderência, podendo conviver
passivamente com o hospedeiro, mas ao encontrarem condições favoráveis
principalmente em indivíduos imunocomprometidos desenvolvem seu poder
patogênico, invadindo os tecidos e sendo encontrado na boca, tubo digestivo,
no intestino, na orofaringe, na vagina e na pele de indivíduos sadios (CORRÊA
et al., 2005).
As micoses oportunistas respondem hoje por uma grande parcela
de complicações infecto-contagiosa, ocasionando diferentes manifestações
clínicas documentadas em muitos pacientes submetidos a procedimentos
médicos invasivos. Devido a esse fato, os pacientes são submetidos
invariavelmente a tratamentos prolongados com drogas, corticóides, hormônios
ou antibióticos de amplo espectro. Por outro lado, os indivíduos com
imunodepressão adquirida ou induzida, bem como os portadores de doenças
degenerativas, neoplásicas ou transplantados de uma maneira geral, pagam
um maior tributo. Dentre as centenas de espécies descritas, as leveduras do
gênero Candida são os mais importantes agentes de infecções hospitalares.
Dados obtidos em hospitais norte-americanos notificaram que o gênero
Candida é responsável por cerca de 8% a 10% do total de infecções na
corrente sangüínea, sendo o 6º patógeno nosocomial. Ocupando, deste modo,
a quarta posição nas infecções hospitalares. Vale salientar que essas leveduras
sofrem o problema de resistência antifúngica, por isso, representam um desafio
para a sobrevida de pacientes com doenças graves e em período pós-
10
operatório (COLOMBO et al., 2003).
Além da maior ocorrência de micoses invasivas documentadas
em diferentes serviços médicos, outro aspecto importante a ser considerado na
epidemiologia atual das infecções fúngicas é o número crescente de espécies
de fungos que vem sendo documentado entre as infecções oportunísticas. Em
relação aos dados de necropsia realizados em pacientes que foram a óbito em
função do câncer, foi observado que em torno de 5% a 25% apresentavam
evidências de acometimento visceral por agentes fúngicos, particularmente
Candida spp e Aspergillus spp. Já no caso de pacientes submetidos a
transplantes de órgãos, cerca de 3% a 20% podem evoluir para infecções
fúngicas invasivas, bem como da ocorrência de episódios de rejeição após
transplante. É importante observar que a mortalidade associada a tais micoses
em pacientes imunocomprometidos é da ordem de 40% a 100% (COLOMBO et
al., 2004).
Em um estudo realizado no Brasil, em quatro hospitais da cidade
de São Paulo, durante um período de 12 meses (março de 2002 a fevereiro de
2003) no qual, reuniu 7.038 episódios de bacteremias e fungemia, observou-se
que a Candida sp. respondeu por cerca de 4,3 % do total das infecções. Foi
possível concluir que a candidemia é um problema de saúde pública em todo
mundo. Também é importante relatar que além da sua alta incidência nos
hospitais terciários, os índices de mortalidade por infecções da corrente
sangüínea chegam a 60% e, de mortalidade atribuída a fungemia é de 40%
(COLOMBO, et al., 2004).
3. 3 - SISTEMA IMUNE
O termo imunidade é derivado do latim immunitas, que se referia
à insenção de vários deveres cívicos e processos legais oferecidos aos
senadores romanos durante os seus mandatos. Historicamente, a imunidade
significava proteção contra a doença e, mais especificamente, as doenças
infecciosas. Portanto, as células e as moléculas responsáveis pela imunidade
constituem o sistema imune, e sua resposta coletiva é induzida quando as
11
substâncias estranhas entram em contato com o organismo, este processo é
chamado de resposta imune (ABBAS, 2005).
A função fisiológica do sistema imune é a defesa contra os
microrganismos infecciosos. Todavia, mesmo sustâncias estranhas “não-
infecciosas” podem despertar respostas imunes. Além disso, em alguns casos
os próprios mecanismos que normalmente protegem contra a infecção e
eliminam as substâncias estranhas são capazes de causar lesões teciduais e
doença. Portanto, uma definição mais inclusiva da imunidade é a de uma
reação a substâncias estranhas, incluindo microrganismos, bem como
macromoléculas, proteínas e polissacarídeos, independentemente das
conseqüências fisiológicas ou patológicas dessa reação (Roitt et al, 2006).
Existem dois tipos de mecanismos de defesa: os inatos ou não
específicos, também conhecido como imunidade natural, e o sistema imune
adaptativo ou imunidade adquirida, os quais fazem parte de um dos sistemas
fisiológicos do organismo, que apresentam aspectos diferentes, tais como:
sistema de reconhecimento, participação células, e mecanismos de ação. A
imunidade inata é a primeira linha de defesa e está presente na maioria dos
organismos. Os receptores das células do sistema imune inato foram
desenvolvidos durante o processo evolutivo. Por outro lado, os receptores das
células do sistema imune adquirido são desenvolvidos durante os rearranjos
gênicos (LEHNER, 2003; SIERRA et al., 2005; MAGNADÓTTIR, 2006).
Há também diferença no padrão de reconhecimento de patógenos de
ambos os sistemas. Receptores encontrados na superfície de células
chamados de PRRs (receptores de reconhecimento padrão) participantes do
sistema imune inato reconhecem estruturas conservadas, presentes numa
grande variedade de patógenos (vírus, bactérias, fungos) chamadas de PAMPs
(padrão moleculares associados ao patógeno) como, por exemplo, o
reconhecimento de lipopolissacarídios (LPS) presentes na superfície de todas
as bactérias gram-negativas. Por outro lado, os receptores de sistema
adquirido reconhecem epítopos únicos, expressos na superfície de um
patógeno. Por último, as células envolvidas pelos dois sistemas também são
diferentes. O sistema inato inclui células naturais killers (NKs), células
dendríticas (DCs), macrófagos, linfócitos T citotóxicos (LTC), neutrófilos e
12
células B-1. O sistema adquirido, inclui células apresentadoras de antígenos
(APCs), incluindo DCs e macrófagos, células TCD4+, TCD8+ e linfócitos B
(LEHNER, 2003; SIERRA et al., 2005; MAGNADÓTTIR, 2006).
As células dendríticas e as células NK são consideradas as
principais células envolvidas no desenvolvimento do sistema imune inato. As
células matadoras naturais ou naturais killer (NK) formam um componente
crítico da resposta inata do hospedeiro contra uma variedade de vírus, fungos,
parasitas e bactérias. Elas foram originalmente identificadas pela sua
capacidade de lisar certas células tumorais sem prévia estimulação. As células
NK são grandes células linfóides granulares que possuem marcadores de
superfície característicos de células T ou B. Já as células dendríticas (DCs)
capturam antígenos nos tecidos periféricos, transportam para os órgãos
linfóides, digerem e apresentam os peptídeos resultantes às células T, desta
forma, as DCs atuam como potentes células apresentadoras de antígenos e
têm uma importante função na indução da resposta imune adaptativa
(COOPER et al., 2004).
3. 4 - LECTINA LIGADORA DE MANOSE (MBL)
A lectina ligadora a manose (MBL) também chamada de proteína
ligadora de manose, faz parte da família das proteínas colectinas produzidas
no fígado e secretadas na corrente sanguínea e é uma proteína de fase aguda
e tem um papel crucial no sistema imune (DOWNING et al, 2003). A
importância dessa proteína está na capacidade de se ligar a carboidratos do
tipo manose, frutose e N-acetilglicosamina os quais estão presentes na
superfície dos microrganismos (THIEL,et al 2000). Portanto, as colectinas são
proteínas que contêm um domínio lectina e outro domínio colágeno (McBRIDE
et al., 1998). A unidade estrutural básica da MBL é um homotrímero de
peptídeos de (subnidades) que se auto-associam dentro de uma tripla hélice
semelhante a um colágeno (Figura 1) e contém quatro domínios distintos: um
curto domínio N-terminal, rico em cisteína, seguido por um domínio colágeno,
13
uma porção α-hélice chamada de pescoço “neck” e um domínio C-terminal de
reconhecimento de carboidratos (CRD). Apresenta cadeias peptídicas idênticas
de subunidades de 32 kDa que se associam dentro de trímeros pelo seu
domínio colágeno formando tripla hélices que são estabilizadas por pontes
dissulfeto formadas entre resíduos de cisteína nos domínios N-terminal. O
padrão de pontes dissulfeto é heterogêneo e assimétrico (WALLIS et al., 2003).
d
b
a
4 c
Figura 2. Estrutura da lectina ligadora de manose (MBL); (a) apresenta o domínio de
reconhecimento de carboidratos (CRD), (b) as regiões dos quatro exons (1, 2, 3, 4); (c)
sítios de ligação dependentes de cálcio; (d) zona de interação com as proteínas serina
protease (MASP) e as pontes dissulfetos. Fonte: (Turner et al.1996)
A MBL sérica é uma estrutura multimérica composta de mais de 6
trímeros (complexo multimérico reunidos como um bouquet de tulipas) que
circulam na corrente sangüínea como tetrâmeros, pentâmeros ou hexâmeros
da unidade estrutural (WORTLEY et al., 2005) e cada peptídeo possui um
domínio C terminal dependente de cálcio (Figura 2) que reconhece
oligossacarídios ricos em manose e N-acetilglicosamina presentes numa
14
ampla variedade de bactérias, vírus, fungos e parasitas (WALLIS, 2003).
Contudo, a MBL não se liga a células humanas normais porque os açúcares
que elas apresentam na sua superfície, freqüentemente, terminam em ácido
siálico, para a qual não é ligadora. Por outro lado, padrões de glicosilação em
células tumorais são diferentes daqueles de células normais e algumas células
tumorais são reconhecidas pela MBL (TURNER, 1996).
Existem três caminhos de ativação do sistema complemento e
estudos filogenéticos sugerem que o caminho via MBL pode ter sido uns dos
primeiros caminhos da evolução celular (TURNE, 2003). O caminho de
ativação do sistema complemento via lectina é muito semelhante a via clássica.
É iniciada pela ligação da manose a lectina (MBL) na superfície dos
microrganismos. A ligação da MBL é resultado da ação de um agente
patogénico e da associação de duas serina proteases, MASP-1 e MASP-2
(MBL-associados serina proteases). As MASP-1 e MASP-2 são semelhantes
aos C1r e C1s do sistema complemento, respectivamente, e MBL é semelhante
ao C1q do mesmo sistema. A formação do MBL/MASP-1/MASP-2 complexos
tri-moleculares resultando na ativação do MASPs e posterior clivagem de C4
em C4a e C4b. O C4b fragmento liga-se a membrana e o fragmento do C4a é
liberado no microambiente. As MASPs, ativas, também decompõem o C2 em
C2a + C2b. C2 ao ligar-se a membrana em associação com C4b e C2b é
liberado no microambiente. O resultado é um complexo C4bC2a convertase
C3, o C3 é clivado em C3a + C3b. O C3b liga-se a membrana em associação
com C4b, C2a e C3a convertase e é liberado no microambiente. A resultante
C4bC2aC3b é um C5 convertase. A geração de C5 convertase é o final do
caminho de ativação do sistema complemento, via lectina. Pode-se visualizar
essa via na Figura 3 (MAYER, 2007).
Normalmente, a MBL é encontrada na forma oligomerizada,
também conhecida como MBL funcional. Para a MBL exercer sua função de se
ligar à superfície de microrganismos e ativar o sistema complemento, requer
uma ordem estrutural altamente organizada na forma de tetrâmero. Porém,
também são encontradas as estruturas de dímero, trímero e hexâmero na
corrente sangüínea. A MBL circulante está associada com quatro proteínas
estruturalmente conhecidas como pró-protease serina-específica apresentando
15
os tipos MASP –1, MASP –2, MAP –3 e Map 19, esta última, uma variante da
MASP –2. Em humanos, o complexo MASP-2 parece ser um eficiente ativador
do sistema complemento na ausência de um outro componente ativador
(MØLLER-KRISTENSN, 2003). A ligação da MBL aos carboidratos é
dependente de Ca++ e estruturalmente similar a IgM e ao componente C1q do
sistema complemento, este é um componente essencial de ativação da via
clássica. A ativação do sistema complemento, via MBL, independente de
anticorpo tem sido chamada de ativação do complemento via MBL
(MINCHINTON et al, 2002).
A MBL associada à serina proteases (MASP-1 e MASP-2) tem
uma importante função na imunidade protetora por interagir com resíduos de
manose, ativando ambas as vias clássica e alternativa do sistema
complemento (Figura 4), e podem também ligar a novos receptores de
fagócitos, resultando na opsonização, fagocitose e lise celular (NEPOMUCENO
e et al., 1997; MATSUSHITA & FUJITA, 1992; THIEL et al., 1997).
Via
CalssicaVia
lectinaVia
alternativa
Superfície microbiana
Superfície microbiana
Superfície microbiana
MBL, Ficolins etc. MASP-2
MASP-1,-3
C1q C3
Fator D
C3b + Fator B
C3bBb
Ativação C3
Ativação do C5
Formação do complexo ataque membrana (C5b-nC9)
Opsonisação
Quimiotaxia
Lise
C1r + C1s
C4 + C2
C4 b C2a
Ativação do complemento na imunidade inata:
Serina esterase
Ativação do
C3 convertase
Figura 3. Os caminhos de ativação do complemento: via clássica, via lectina e via
alternativa.
16
Figura 4. Ativação da via clássica do complemento pela MBL independente da
presença do anticorpo e da ativação da subunidade C1 do complemento. (a) A MBL
circula como um complexo com as proteínas MASPs. Presume-se que a ligação da
MBL a grupos açúcares sobre a superfície dos microrganismos resulte numa
alteração conformacional que ativa as MASPs e permite a clivagem do C4. (b) O
fragmento C4b liga-se covalentemente a superfície (ou possivelmente aos domínios
lectinas como mostrado acima) e provém um sitio aceptor para C2. (c) A MASP cliva
o ligante C2 para criar o complexo C4b2a (C3 convertase) que pode assim atacar
C3. Além disso, alguns C3 podem ser clivados diretamente pela MASP. (d) O maior
fragmento clivado do C3 (C3b) torna-se covalentemente ligado a superfície do
microrganismo provendo múltiplos fragmentos opsônicos para interação
subseqüente com receptores de fagócitos. Fonte: Turner, 1996.
A afinidade de ligação da MBL a carboidratos de superfície dos
microrganismos é variável. Sendo classificada como: alta, moderada, leve ou
17
ausente (NETH et al, 2000). Estas variações ocorrem tanto entre os diferentes
grupos de microrganismo como até mesmo dentro de uma mesma espécie
(TOWNSEND et al, 2001).
A deficiência da MBL oligomerizada, normalmente, pode está
associada com aumento da susceptibilidade à infecção, quando se trata do
sistema imune inato. Estes relatos podem ser observados em crianças
prematuras ou em indivíduos imunocomprometidos, como no caso de
indivíduos transplantados ou em pacientes durante tratamento quimioterápicos
para o câncer. A deficiência da MBL também está associada com muitas
doenças severas de origem auto-imune semelhante ao Lupus Eritematoso
Sistêmico e Artrite Reumátoide. Também foi observado que sua deficiência
mostra ser um fator de risco para pacientes com Fibrose Cística (CARRED,
2000).
Várias pesquisas buscam esclarecer o envolvimento dos níveis de MBL
séricos com os processos infecciosos e a evolução das patológias causadas
por microrganismos. As pneumonias foram significativamente associadas a um
decréscimo nos níveis de MBL (< 500 g/ L) nos pacientes em tratamento
quimioterápico. A alta relação entre variantes alélicas da MBL e a
susceptibilidade a doenças meningocócicas tem sido mostrada em pacientes
pediátricos. Já no caso da Mycobacterum leprae os pacientes, freqüentemente,
apresentam aumento dos níveis de MBL, por provavelmente potencializar a
fagocitose mediada por complemento (MINTCHITON, 2002). Estudo
envolvendo população de negros do Sul da África mostrou que o alelo B
conferia proteção para tuberculose, meningite e doenças pulmonares. Estas
associações são mais fortes em crianças, quando a imunidade materna
adquirida tem decaído, e o repertório imune adaptativo da criança é imaturo.
Isto sugere que a MBL é mais importante quando a resposta imune é imatura
ou defeituosa (SUMMERFIELD et al., 1997).
A relação entre deficiência de MBL e aumento da susceptibilidade a
doenças meningocócicas tem sido sugerido por estudos e pode ser em
particular mais relevante em crianças, quando a imunidade mediada por
anticorpo não está completamente desenvolvida. Já nos casos da Diabetis tipo
1, o estudo do polimorfismo do gene da MBL realizado com crianças e
18
adolescente no Brasil, mostrou que a frenqϋência alélica do gene da MBL não
foi diferente entre os pacientes diabéticos e saudáveis (ARAÚJO et al, 2007).
Infecções virais como no caso do pelo vírus da imunodeficiência
humana (HIV), os pacientes com deficiência de MBL mostraram uma evolução
mais agressiva da doença em relação aos que apresentavam níveis normais,
quadro que foi revertido com a terapia de reposição da MBL. A MBL se liga a
glicoproteína do envelope, gp120, dos vírus da imunodeficiência humana, HIV-
1 e HIV-2, opsoniza o vírus eficientemente e tem sido relacionada com a
inibição da infecção do HIV em células T in vitro (Figura 6). Contudo, como
resultado desta interação com gp120, MBL pode ativar a cascata clássica do
complemento independente da presença de anticorpo (McBRIDE et al., 1998).
Em outro estudo, observaram uma maior prevalência de homozigotos para
mutações do gene MBL2 (8%) entre os portadores da infecção HIV quando
comparado ao grupo controle de indivíduos sadios (0,8%) (GARRED et al.,
1997). Análises de mutações no gene da MBL-2 têm sido correlacionadas com
uma significativa diminuição no tempo de progressão para AIDS (MAAS et al.,
1998), Enquanto que, os polimorfismos na posição - 550 da região promotora
do gene MBL2 têm sido relacionados com risco de transmissão vertical do HIV-
1 e progressão para síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), assim
como, uma deleção na região - 328 também foi correlacionada com a infecção
do HIV-1, Figura 5 (BONIOTTO et al., 2000, SOUZA, et al, 2006).
19
Figura 5. Estrutura “em forma de tulipa” da MBL. A unidade estrutural básica
(peptídeo), o triplete de peptídeos e a forma da MBL em tulipas composta de vários
peptídeos associados. Fonte: Boniotto, 2003.
20
Figura 6. Interação da MBL com o HIV. A figura mostra resíduos de manose
associadas à glicoproteína gp 120 presentes na superfície do vírus e os domínios
existentes na proteína MBL. Fonte: Ji et al, 2005.
Nos fungos, por ser a manose um dois maiores componentes da
parede celular, a ligação da MBL à superfície desses microrganismos é
considerada de alta afinidade como é o que ocorre com a Candida albicans, o
Aspergilus fumigatus e o Cryptococus neoformans (EISEN, 2003). Estudos
realizados com Candida albicans mostraram um importante papel da MBL no
controle da candidíase vulvovaginal, uma vez que a MBL encontra-se presente
na secreção vaginal (PELLIS, 2005).
No caso dos protozoários, a MBL mostrou se ligar ao Plasmodium
falciparum, mas não inibe seu crescimento. Portanto, a presença de MBL não
interfere no caso da Malária. Os estudos realizados mostram uma gama de
informações sobre a MBL, as quais indicam que os níveis de MBL sérico e seu
polimorfismo genético dentro de determinados grupos populacionais, está
envolvido à susceptibilidade a determinadas infecções. Contudo, não se
21
conhece o mecanismo que explique como apenas alguns indivíduos com
baixos níveis de MBL apresentam essa predisposição a infecções e o
desenvolvimento de doenças auto-imunes (JÜLIGER, 2000).
3. 4. 1 - POLIMORFISMO GÊNICO DA MBL
O nível de MBL no plasma é geneticamente determinado. Cada
indivíduo tem os níveis de MBL constitucional refletida para estrutura genômica
na região controlada bem como na a região do códon. A MBL humana é
codificada pelo gene MBL2 e encontrado no cromossomo 10 (10q11. 2-21).
Contudo, na mesma região cromossomal um pseudogene MBL tem sido
encontrado (MBL1) (GUO et al., 1998). Transcrição, “splicing” e tradução do
gene MBL2 gera uma cadeia polipeptídica de um peso estimado de 24 kDa. A
região codificadora da proteína do gene MBL2 contém 4 exons, separados por
três introns. O exon 1 codifica um peptídeo sinal, um domínio rico em cisteína e
sete cópias da seqüência repetida (Gly- Xaa-Yaa) típico para formação da tripla
hélice da estrutura de colágeno onde, Xaa e Yaa indica qualquer aminoácido.
Este padrão de tripla hélice é continuado pela adição de 12 repetições da
sequência Gly- Xaa -Yaa no exon 2. Quanto o Exon 3 codifica a região do
pescoço “neck” e o exon 4 codifica o domínio de reconhecimento de
carboidratos (SASTRY et al., 1989).
Há cinco sítios polimórficos conhecidos dentro da região gênica e
promotora da MBL que afeta a quantidade desta proteína sérica. Dois estão
situados dentro da região promotora do exon-1 MBL [H ou L (G/C) na posição -
550 e Y ou X (C/G) na - 221]. Estas mutações afetam a atividade transcricional
do complexo promotor-basal, que resulta em níveis reduzidos da MBL
circulante, embora ambos os polimorfismos no promotor afetem o nível
reduzidos de MBL produzida, -221 Y para X resulta em níveis muito mais
baixos do que H para L (MADSEN et al., 1996).
Atribui-se para a deficiência de MBL variações alélicas nas
regiões promotora ou estrutural do gene. As mutações que ocorrem no gene
22
são referentes a um único códon 52, 54 e 57 do exon 1, estas mudanças
formam as seguintes variantes: B, C e D respectivamente. Sendo o tipo A, a
representação da forma selvagem, ou seja, não mutagênica (TURNER, 1996).
Já na região promotora a substituição ocorre nas posições – 550 alelos (H/L), -
221 (X/Y) e + 4 (P/Q). Os alelos – 550 e – 221 formam os haplótipos HY, LY,
LX e HX. Dos 64 possíveis haplótipos, só sete têm sido observados (HYPA,
LXPA, LYQA, LYPA, HYPD, LYPB e LYQC) (MINCHITON, et al, 2002). Os
haplótipos HYP estão associados com altos níveis de MBL, enquanto LXP está
associado com baixos níveis da concentração de MBL no soro. Os defeitos
estruturais em relação aos indivíduos homozigotos mostram baixos níveis de
MBL oligomérica, enquanto os indivíduos heterozigotos mostraram níveis
baixos e intermediários (PRESANIS, 2003).
A freqüência do polimorfismo estrutural da MBL varia entre os
diferentes grupos étnicos. Alelos mutantes do codon 54 são comuns em
populações Caucasianas (LIPSCOMBE et al., 1996), Eskimós (MADSEN et al.,
1996) com freqüência gênica variando entre 0,11 e 0,17. Os alelos mutantes do
codon 57 são quase sempre encontrados em populações de origem africana
com freqüência de 0,29 (SULLIVAN et al., 1996). Estudos têm demonstrado
que indivíduos carreando alelos mutantes são mais susceptíveis a infecção e
que um alelo mutante do codon 54 pode ser um fator adicional na
susceptibilidade a doenças auto-imune tais como Lupus Eritematoso Sistêmico-
SLE. As mutações no codon 52 é a menos comum das mutações estruturais e
está presente em populações caucasianas e pretas, com freqüência gênica de
5% em ambas as populações. Os indivíduos que são homozigotos para o alelo
mutante no codon 54 não possuem virtualmente nenhuma MBL no soro.
Heterozigotos e Homozigotos para o alelo mutante 57 também mostram um
grau semelhante de redução de MBL no soro (CROSDALE et al., 2000).
23
3. 5 - DEFENSINAS
No inicio de 1970, entre os diversos componentes do sistema
imune inato, encontra-se o grupo de peptídeos com atividade antimicrobiana,
os quais foram inicialmente relatados como peptídeos de plantas que
apresentavam atividades antimicrobiana e antifúngicas. Passado mais de 20
anos uma grande variedade de peptídeos conhecidos como antibióticos
naturais foram descobertos. Todos esses peptídeos apresentam propriedades
biológicas e além das atividades anteriormente citadas também possuem
propriedades antivirais e anticancer. Contudo, podem influenciar em processos
inflamatório, proliferação celular, liberação de citocinas, homeostasia,
quimiotaxia e preservação do balanço entre proteases e seus inibidores (SMET
et al, 2005).
As defensinas são peptídeos catiônicos, anfipáticos, contendo
em geral de 20 a 45 aminoácidos não glicosilados, ricos em arginina, com um
peso molecular entre 3,5 e 6,0 kDa, contendo em sua estrutura seis cisteínas
que formam pontes dissulfeto intramoleculares bem características
(SANTIAGO et al., 2006). Esses peptídeos apresentam atividade microbicida
contra um amplo grupo de microrganismos incluindo, bactérias Gram-negativas
e positivas, protozoários, fungos e vírus. São sintetizadas inicialmente como
pró-peptídeos, e armazenadas em granulócitos, macrófagos ou em células
epiteliais secretoras (DORK, 1998). As defensinas dos mamíferos se
classificam em três grupos: alfa, beta e teta (YANG et al., 2002). Essa divisão é
baseada no tamanho, na seqüência de aminoácidos e na distribuição das
pontes dissulfeto entre as cisteínas (ZAPATA; MONTOYA, 2006). Nas α-
defensinas as ligações ocorrem entre o primeiro e sexta cisteína (Cys1 6-Cys ),
Cys2 4 3 5-Cys e Cys -Cys , enquanto β-defensinas ocorrem entre Cys1 5-Cys , Cys2-
Cys4 e Cys3 6-Cys . Em contraste, θ- defesinas tem uma estrutura circular com
residuos de cisteínas ligados entre Cys1 6-Cys , Cys2 5 3 4-Cys e Cys -Cys
(KLOTMAN, 2006).
Em humanos só foram encontradas as alfa e beta-defensinas
(ZAPATA; MONTOYA, 2006; SMET et al., 2005). Algumas dessas defensinas
24
podem ser induzidas por citocinas pró-inflamatórias, assim como por moléculas
próprias dos patógenos. As α-defensinas humanas (HNP) são pequenos
peptídeos catiônicos antimicrobianos, sintetizadas como pré-propeptídeos
encontrados nos grânulos azurófilos dos neutrófilos. Em 1980, foram isoladas
quatro α-defensinas humanas (HNP-1, -2, -3 e -4), também designadas
peptídeos neutrofílicos humanos porque elas são expressas principalmente em
neutrófilos, células neutrofílicas mielóides e de macrófagos. As HNP–1 e -3
constituem cerca de 5 a 7% do total de proteína celular das células
neutrofílicas, já nos grânulos azurófilos a composição dessas α-defensinas é
cerca de 30 a 50%, também foram encontradas nas células B e em células
natural Killer. Em 1992 e 1993, duas defensinas entéricas, HD-5 e HD-6 foram
localizadas em células do intestino (SMET et al., 2005), e posteriormente
observaram a expressão da HD-5 em células do epitélio do trato reprodutor
feminino. Estudos realizados com Mycobacterium avium intracellular (MAI),
mostraram sua atividade contra bactérias anaeróbicas (MARTINS et al., 2005).
Até o momento, foram identificadas seis α-defensinas humanas (ZAPATA;
MONTOYA, 2006; CHEN et al., 2005).
Figura 6: Modelo tri-dimensional da estrutura secundaria da α-defensinas HNP-3 (a) e
a β-defensina hBD-1 (b), ...
25
3. 5. 1 - β-Defensinas
As defensinas humanas mostram uma grande homologia com as
defensinas de outros mamíferos. Os homólogos da β-defensina humana nos
bovinos são o TAP (peptídeo antimicrobiano traqueal) e o LAP (peptídeo
antimicrobiano língual), os quais se expressam depois de serem induzidos por
LPS (lipopolissacarídeos), pelo Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e alguns
patógenos específicos de bovinos. Existem pelo menos duas isoformas de β-
defensinas, uma com 40 e outra com 44 aminoácidos (SANTIAGO et al., 2006).
A expressão das HBD ocorre em vários tecidos, tais como,
músculo esquelético, trato respiratório, esôfago, língua, intestino e pele
(ZAPATA; MONTOYA, 2006). Uma β-defensina humana típica contém de 41-50
resíduos de aminoácidos e seis cisteínas modificadas em formato
tridimensional contendo ligações dissulfetos nas posições 1-5, 2-4 e 3-6 Com
base em estudos genômicos se conhece pelo menos 28 β-defensinas
humanas, mas até o momento apenas seis foram identificadas (SCHUTTE et
al., 2002; ZAPATA; MONTOYA, 2006).
A primeira β - defensina humana-1 (HBD-1) foi isolada em 1995
do plasma. Posteriormente sua expressão foi detectada em células epiteliais
derivadas dos rins, trato reprodutivo feminino, trato respiratório, pâncreas,
glândulas parótidas, mucosas bucais e língua (VALORE et al., 1998; CHEN et
al. 2006). A HBD-1 também é expressa nas glândulas epiteliais mamárias
humana, estando presente no leite materno na concentração de 1-10 µg/ml
conferindo assim proteção contra as infecções e aumentando as defesas
imunológicas do recém-nascido (LEHRER et al., 2002; JIA et al., 2001).
As β-defensinas humanas tipo 2 (HBD-2) foram descobertas no
ano de 1997 em extratos de lesões de pacientes acometidos de psoríase
(YAMAGUCHI et al., 2002; CHEN et al., 2006), apresentando 41 resíduos de
aminoácidos. Sendo encontradas no epitélio das superfícies internas e
externas do corpo humano, tais como: pele, trato respiratório e intestinal
(SANTIAGO et al., 2006). Possuem uma potente atividade contra bactérias
Gram-negativas e fungos como Candida sp, mas não apresenta atividade
contra Gram-positivas como o Staphylococcus aureus (LEHRER; GANZ, 2002).
26
Alguns estudos detectaram a presença desta defensina em lavados brônquicos
alveolares e nas secreções do trato respiratório humano já que várias células
do pulmão são capazes de expressá-la (SINGH et al., 1998; SANTIAGO et al.,
2006). Nessas células a expressão basal da HBD-2 é mínima, ocorrendo na
ordem de µg/ml, aumentando consideravelmente na presença de estímulos
exercidos por patógenos, quando o pulmão sofre um processo inflamatório
intenso, por exemplo, quando ocorre a fibrose cística (SANTIAGO et al., 2006;
SCHUTTE; McCRAY, 2002). Em outro estudo realizado com pacientes com
fibrose cística, foi observado que as HBD-1 e 2 foram neutralizadas pelas altas
quantidades de NaCl secretadas pelo pulmão, devido à neutralização das
cargas positivas, o que pode ter acarretado conseqüentemente uma elevação
na taxa de infecções por bactérias, principalmente Pseudomonas aeruginosa
(SANTIAGO et al., 2006, ASHITANI et al., 2001; GOLDMAN et al., 1997).
Semelhante as HBD -2, as HBD-3 também foram descobertas a
partir de extratos de lesões de pacientes acometidos de psoríase, no ano de
2000. Esta defensina apresenta um peso molecular de 5kD que é maior em
relação às outras defensinas, porém seu mecanismo de ação é similar
(SANTIAGO et al., 2006). Outra semelhança com a HBD-2, é que também são
induzidas por estímulos inflamatórios podendo ser detectadas in vitro depois da
co-estimulação com Interleucina-1 (IL-1) e Fator de Necrose Tumoral (TNF-α ).
A HBD-3 apresenta um amplo espectro antimicrobiano, em especial uma maior
atividade contra Staphylococcus aureus, sendo esta expressa abundantemente
nos rins, amídalas, células epiteliais derivadas do trato respiratório e do trato
reprodutivo feminino (Chen et al., 2006; Harder et al., 2001), bem como
miocárdio, músculo esquelético, placenta, esôfago e traquéia (CHEN et al,
2006; JIA et al., 2001).
Em relação à β-defensina -4 (HBD-4), encontrada principalmente
no trato respiratório, podendo também ser detectadas em glândulas mamárias,
epidídimo, líquido seminal, útero e nas glândulas tireoidianas. Sendo, portanto,
considerada a mais importante de todas as defensinas pela sua ampla
localização. Estudos demonstraram que esta apresenta atividade contra
bactérias e fungos, possuindo também ação quimiotática. Sua indução,
semelhante à HBD-2, pode ocorrer através de algumas citocinas e por
27
moléculas próprias de patógenos (PAMP’), quanto a sua inativação, pode
ocorrer em função de altas concentrações de sal (SANTIAGO et al., 2006;
BIRCHSLER et al., 2001).
Em 2002, os genes da β-defensina humana 5 e 6 (HBD–5, HBD-
6) foram descobertos e clonados. Essas duas defensinas são especialmente
expressas em epidídimos humanos. Porém, poucos estudos existem sobre
estas defensinas (YAMAGUCHI, 2002; CHEN et al., 2006). 3. 5. 2- POLIMORFISMO DA β-DEFENSINA-1
Quanto a β-defensina 1 a análise para a determinação do sitio
das polimorfismo de um único nucleotídeo SNPs incluem 322 (A-T) na posição
-379), 668 (C-G na posição -44), 692 (G-A na posição -20), 1654 (G-A;V371)
1741 (T-A; C66S), e 1836 (poliadenilação no sitio:A-G). O sitio -22 (-379) foi
encontrado nos grupos étnicos. O sitio 668 (-44) e 692 (-20) são ambos
localizado na região da 5’ não translocada da β-defensina -1. As mudanças no
sitio 1654 e 1741 são mudanças não silenciosa do código da região exon 2 e
tem sido relatada antes mais ocorre com pouca freqüência. A V371 e C66S
podem está associada com mudanças no peptídeo estrutural e sua função
(RICHARD, 2003).
A ordem da determinação da freqüência de alelos no gene da
HBD1 varia conforme a população. Em diferentes populações estudadas a
freqüência desses alelos variou significativamente. Três polimorfismo foi
observado, localizado 3`UTR (16 G/A, 24 C/G e 48 A/G) tem sido relatado
como uma árvore de possibilidades halotípicas.
3. 6 - POLIMORFISMO DE UM ÚNICO NUCLEOTÍDEO (SNPs)
Com o estudo do genoma humano pode-se obter informações
importantes para o conhecimento das mutações. O projeto Genoma Humano
deixou um legado de aproximadamente 30 a 65 mil genes descritos e
28
depositados nos bancos de dados públicos. O seqüenciamento e a descrição
física dos genes distribuídos ao longo dos 23 cromossomos humanos
auxiliaram e permitiram o avanço de diversas outras áreas relacionadas à
genética humana. De fato, um dos principais frutos do término do Projeto
Genoma Humano foi à descoberta de milhões de variações ao longo do DNA,
das quais a maioria destas variações, acima de 1,5 milhões, se referiam a
pequenas e pontuais modificações no genoma humano comumente chamadas
de SNPs (KWOK, 2001). As SNPs representam a maior fonte de variações
interindividuais genéticas (BRAY et al., 2001) e podem ser utilizadas para
identificar as contribuições poligênicas em determinadas doenças funcionando
como uma extraordinária ferramenta na análise de marcadores genéticos
devido a sua abundância (SCHWARTZ et al., 2004).
O termo polimorfismo é originário do grego e significa "muitas
formas" (poli = muitas, morphos = formas). A seqüência de alelos que revela
uma única mudança de nucleotídeo é chamada de polimorfismo de um único
nucleotídeo (SNPs). Podem ocorrer em partes não codificadas do gene e não
ser observado alterações na produção da proteína. Por isso, as SNPs são um
tipo de marcador molecular capaz de diferenciar indivíduos por meio de
variações em apenas um nucleotídeo de seqüências de DNA que codificam (ou
não) genes. As SNPs mais comuns, encontrados em diferentes espécies, são
os de transição (em que uma base púrica é substituída por outra púrica) e de
transversão (em que uma base púrica é substituída por uma pirimídica, ou vice-
versa). As variações alélica são detectadas por seqüenciamento. O
desenvolvimento de seqüenciamento de DNA tornou fácil observar as versões
alélicas do gene por mostrar através do gene, entre os diferentes membros da
população a presença de indivíduos heterozigotos. Deste modo, o Polimorfismo
das SNPs pode ser usado como marcador de possíveis doenças (WENZ,
1999).
O estudo das SNPs ganhou mais espaço na década de 90 entre
os geneticistas moleculares principalmente devido ao aumento do interesse
nas doenças multifatoriais, como o câncer e diabetes (GRAY et al., 2000). Esta
clara o envolvimento dos polimorfismos gênicos na predisposição a uma gama
de infecções e doenças genéticas. É evidente que as combinações dos
29
polimorfismos genéticos e sua associação aos fatores sócio-ambientais
definem unicamente as características inerentes ao homem no que diz respeito
às respostas a determinadas drogas, a severidade e progressão às doenças e
em especial a susceptibilidade a infecções comuns (LIDA et al., 2006).
As SNPs podem ser encontradas mais freqϋentemente nas
regiões não codificantes e em mudanças não silenciosas que não alteram ou
substituem os aminoácidos, devido ao código genético ser degenerado. Isto
reflete a grande pressão seletiva das regiões codificantes. Em outras palavras,
as SNPs podem ou não alterar a expressão gênica, a síntese protéica ou o
enovelamento protéico, afetando deste modo sua atividade, dependendo da
localização ao longo do genoma humano (NOWOTNY et al., 2001).
O genoma humano é formado, basicamente, por regiões gênicas
permeadas por regiões intergênicas. A definição e a descrição de um gen, bem
como de sua estrutura, são bastante maleáveis e dependem muito da formação
do pesquisador. A definição que se segue é um modelo simples, mas o
suficiente para o entendimento dos efeitos das SNPs no genoma. Os genes
estão organizados em duas regiões: os éxons e os íntrons. Os genes são
estruturas formadas por DNA, que para transmitir as informações contidas nas
suas seqüências de bases nitrogenadas é transcrito inicialmente numa
molécula de RNA primário, que ainda contém os éxons e os íntrons, e que
através do mecanismo de maturação, que envolve a formação de CAP, calda
poli A e “splicing”, o RNA perde seus íntrons e se transforma no RNA
mensageiro maduro. A primeira observação é que os íntrons por não
apresentarem regiões codificantes para proteínas foram por muitos anos
denominados, assim como as regiões intergênicas, de “DNA lixo”. Porém
atualmente, reconhece-se que os íntrons estão envolvidos em outros cenários
moleculares. Os RNAs maduros, já sem os íntrons, são constituídos pelas suas
caldas CAP e poli A e pelos éxons. Inserido no primeiro e no último éxon,
existem ainda uma porção que não é traduzida em aminoácidos e apresenta
papel primordial na tradução das proteínas, denominadas de UTR, de forma
que apenas a porção entre os primeiro e último éxons sejam traduzidas em
aminoácidos sendo chamadas de CDS ou ORF.
30
Essa descrição simplificada da hierarquia linear do já datado
dogma central da biologia molecular, de que o DNA passa as informações para
o RNA que as transmite para as proteínas que desempenham as funções vitais
do metabolismo celular, pode nos dar um embasamento suficiente para
descrever o efeito das SNPs. Uma SNP na porção 5’-UTR ou 3’-UTR do gene
pode alterar substancialmente a síntese protéica, visto que polimorfismos nesta
região podem aumentar ou diminuir a afinidade dos ligantes envolvidos na
síntese protéica fazendo com que aumente ou diminua a quantidade de
proteína produzida, respectivamente. Quando o polimorfismo existe na CDS do
gene pode alterar um aminoácido na seqüência protéica de forma que afete o
enovelamento protéico consequentemente aumentando, diminuindo ou
anulando sua atividade. Evidentemente SNPs podem não produzir efeitos
nenhum sobre o metabolismo celular. Um outro efeito bastante estudado é
quando as SNPs se encontram na região promotora do gene e pode afetar os
mecanismo de transcrição do DNA em RNA e, conseqüentemente, os níveis
das proteínas produzidos (NOWOTNY et al., 2001).
3. 6. 1 - Detecção de polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) pela técnica da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real)
A Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (PCR em
tempo real) é utilizada em diferentes propósitos, particularmente para
quantificação e genotipagem de ácidos nucléicos. Desde sua invenção em
1996, o número de publicações envolvendo esta metodologia tem aumentado
consideravelmente (WILHELM & PINGOUD, 2003; LIEW et al., 2004).
A peculiaridade da PCR em tempo real é que o processo da
amplificação é monitorizado em tempo real usando técnicas de fluorescência. A
informação obtida, que é a curva de amplificação (figura 5), pode ser utilizada
para quantificar quantidades iniciais de DNA molde “templates” com uma ampla
variação de concentração. Na análise da curva de “melting” feita
31
subseqüentemente, as seqüências amplificadas podem ser caracterizadas com
relação a sua temperatura de “melting” aparente (Tm) que é função do
comprimento do produto e da composição de bases. Esta análise é rápida, fácil
e evita contaminações pós-PCR (WILHELM & PINGOUD, 2003; LIEW et al.,
2004; CHENG et al., 2004).
Efeito Platô
Figura 7. Curva de amplicação gerada pela PCR em tempo real. Fonte:
www.appliedbiosystems.com/support/ tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf –
3. 6. 2. 1 - Princípio da curva de “melting”
A análise da curva de “melting”, uma tecnologia revolucionária
patentiada pela Roche Applied Science, baseia-se na adição de sonda de
oligonucleotídeo seqüência-específica, marcada com fluorescência durante as
fases da reação em cadeia da polimerase (PCR) Figura 6. Após a PCR, uma
curva de “melting” é gerada por um aquecimento lento da dupla fita
amplicom/sonda (heteroduplex) medindo a mudança na fluorescência que
resulta quando a sonda desnatura, ou “melts”, fora do amplicom (Figura 6B)
(Roche Applied Science). Higuchi et al. (1992) foram os pioneiros na análise da
cinética da PCR por construir um sistema que detecta produtos da PCR no
32
momento em que se acumulam. Este sistema “tempo real” contém um corante
que se intercala na dupla fita de DNA, uma sonda marcada pode ser realizada
em tempo real, sendo conhecida como PCR em tempo real. Cada fita de DNA tem sua temperatura de “melting” específica (Tm), que
é definida como a temperatura em que 50% do DNA tornar-se fita simples.
Estas temperaturas são determinadas pelo comprimento da dupla fita de DNA;
a proporção de GC (Tm é maior em fragmentos ricos em GC); e o grau de
complementariedade entre as fitas, por exemplo, e especialmente importante
entre fitas “heteroduplex” (HIGUCHI et al., 1992; CHENG et al., 200).
Figura 8. Princípio da análise da curva de “melting”. A. Esquema da ligação da sonda
marcada a uma seqüência tipo selvagem (inferior) ou a uma seqüência mutante
(superior). B. Uma curva de “melting” mostra alteração na fluorescência assim que a
temperatura é lentamente aumentada. C. A primeira derivada negativa da curva de
“melting” mostra a temperatura de “melting” (Tm) de cada produto presente em cada
amostra, mostrando genótipos que podem ser facilmente identificados. Fonte:
www.roche-applied-science.com/usa/genomics.htm
33
3. 6. 2. 2 Detecção do produto amplificado (AMPLICOM)
A coloração pelo SYBR Green é um dos métodos usados para
analise de PCR em tempo real. O corante SYBER Green se liga a alça menor
do dsDNA e emite luz fluorescente. Quando o dsDNA é desnaturado o corante
SYBR Green se desloca. Quanto maior o número de duplas fitas de DNA
formadas durante a reação de PCR (formação de amplicons), maior a emissão
de fluorescência (RIRIE et al., 1997; CHENG et al., 2004).
34
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43
CAPÍTULO I
44
ARTIGO A SER SUBMETIDO À REVISTA HUMAN IMMUNOLOGY
CAPÍTULO I: Análise da Relação entre o Polimorfismo do Gene da Lectina Ligadora de Manose (MBL2) e Onicomicoses causadas por
Candida spp.
45
Análise da Relação entre o Polimorfismo do Gene da Lectina Ligadora de Manose (MBL2) e Onicomicoses causadas por Candida spp.
b, fFurtado, V. C. ; Araújo, V. P. a b, f; Souza, P. R. ; Marsdem. A. L. a; Sette. R. c; Lucas,
C. A. b a, b; Moura, P. ; Guimarães, L. R. b ; Lima-Filho, J. L. b; Porto, A. L. F. b, g & Crovella, S. b, d, h
a Departamento de Micologia Médica, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); b Laboratório Imunopatologia Keizo Asami- LIKA/ UFPE; c Laboratório Medicina Diagnóstica-NKB; d Departamento de Genética- Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); f Universidade de Pernambuco (UPE); g. Departamento de Morfologia e Fisiologia Anima,Universidade Federal Rural de Pernambuco- UFRPE; h. Department of Developmental and Reproductive Sciences, Department University of Trieste, Italy. Correspondencia do autor Veridiana Câmara Furtado
Laboratório de Imunologia Keizo Asami
Universidade Federal Pernambuco – UFPE
Campus Universitário, Recife, PE, Brasil.
CEP: 50670-901, Tel: + 55 81 21268484
46
RESUMO A onicomcose é uma infecção causada por fungos que atinge indivíduos em todas as regiões do mundo. A lectina ligadora de manose (MBL) é um importante constituinte do sistema imune inato, atua ligando-se a carboidratos presente na superfície de vários microrganismos como vírus, bactérias e fungos ativando o sistema complemento. Esse estudo objetivou a análise do polimorfismo do gene da MBL2 em 100 pacientes com onicomicose causada por Candida spp. atendidos no Laboratório de Micologia Médica da Univerdidade Federal de Pernambuco. A análise do polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene da MBL2 foi realizada através da técnica de PCR em tempo real. As amostras de Candida foram submetidas à identificação por análises morfológicas e bioquímicas, bem como o cultivo em meio cromogênico (CROMOagar Candida®). Os resultados obtidos mostraram predominância de Candida não-albicans como C. parapsilosis (50%), C. tropicalis (34%) e C. albicans (6%). O resultado do polimorfismo demonstrou que o alelo 0 foi mais freqüente em pacientes com onicomicose do que em relação ao controle saudável (35% vs. 20%, p = 0,0001), respectivamente. Quanto à distribuição do genótipo A0 foi significativamente diferente entre os pacientes com onicomicose e o controle saudável (10% vs. 6%, p = 0,0003), respectivamente. Os resultados obtidos deste trabalho mostraram que o alelo 0 conferiu uma maior susceptibilidade à onicomicose causada por Candida spp. (OR= 2,19, e IC= 95%). INTRODUÇÃO Oniconicose é uma infecção, primária ou secundária, considerada um problema
universal atingindo 30% das infecções fungicas superficiais. Contudo, a participação de
fungos emergentes nesta infecção tem aumentado nos últimos anos e dentre os
microrganismos, Candida spp. tem despertado um grande interesse na área médica por
se destacar como fungos emergentes sendo o principal fungo associado a infecções
hospitalares, e o quarto envolvido nestas infecções. Porém seu interesse não é limitado a
apenas a pacientes com infecções hospitalares e imuno comprometidos, mas se
destacam nas onicomicoses como agentes etiológico logo após dos fungos dermatófitos
[1, 2, 3]
A lectina ligadora de manose (MBL) é um importante componente do sistema
imune inato sintetizada no fígado, e derivada de lectina do tipo C, sendo liberada na
corrente sanguínea. A MBL2 apresenta na unidade de sua estrutura primária uma
molécula helicoidal de 96 kDa constituída de três cadeias de colágeno idênticas de 32
kDa cada com regiões de carboidratos apresentando domínio C-terminal. Essas
unidades são estabilizadas por regiões N-terminal ricas em cisteínas ligadas por pontes
de sulfeto [4, 5].
47
Uma das principais características da imunodeficiência severa é a associação da
baixa imunidade do hospedeiro com a infecção causada por microrganismos
específicos. Entretanto, há numerosos estudos que mostram a deficiência da MBL como
um importante fator de risco para adquirir infecções, particularmente em crianças, e
doenças associadas à imunodeficientes como no caso do HIV [6, 7].
O polimorfismo de um único nucleotídeo (SNPs) nas regiões não identicadas e
identificadas dos códons do gene MBL2 são responsáveis pela variações na produção e
função da MBL2 in vivo [8].
As variações dos níveis de MBL2 são resultantes do polimorfismo na região
promotora do gene as quais influenciam nos níveis sorológicos da lectina [9]. A
deficiência desta proteína tem sido associada com o aumento da susceptibilidade a
infecções em pacientes neutropênicos, com meningite meningocócicas, com infecções
fúngicas invasivas, infecção por HIV e entre outras. Existem vários relatos que sugerem
que a MBL2 é capaz de modular a severidade da doença e pode ser usada como
predicativo de terapia [10, 11].
Em humanos, baixos níveis de MBL2 pode ser causado por uma das três
mutações estruturais localizada no exon 1 do seu gene. Que são causadas pelo
polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) nos códon 52, 54 e 57 do gene. Estas
mutações são freqüentemente representadas por D, B e C, respectivamente, com “A”
representando o tipo selvagem. Em complementação, mutações estruturais do gene da
MBL2 em muitos polimorfismo da região promotora na posição -550, -221 e da região
5’ do gene da MBL2 codificam os alelos H/L e X/Y que representam os níveis de MBL2
em indivíduos com o gene tipo selvagem e em indivíduos heterozigotos para mutação
estrutural do gene. O halótipo HYA produz altos níveis de MBL, o halótipo LYA produz
níveis intermediários e o halótipo LXA produz baixos níveis. Enquanto a descrição das
variações estrutural do gene da MBL2, muitos estudos e trabalho adotam o A/A para
homozigotos selvagem, 0/0 para homozigotos mutante e A/0 para heterozigotos. O
termo “halótipo B” e “halótipos H“ referem respectivamente, as variantes estruturais e
promotoras de alelos da MBL [12,13,14].
Esse estudo teve como objetivo investigar a possível associação da
freqüência do polimorfismo do gene da MBL2 em pacientes acometidos por
onicomicose causada por Candida sp.
48
MATERIAL E MÉTODOS
Seleção dos pacientes Foram selecionados e coletadas amostras de 100 pacientes (ambos os sexos) na
faixa etária entre 18 a 70 anos, atendidos no Laboratório de Micologia Médica - UFPE.
Como critério de inclusão dos pacientes foram utilizados o critério de idade entre 18 a
70 anos, com apresentação de solicitação médica para realização do exame, e que
aceitaram fazer parte da pesquisa, respondendo a um questionário e assinando o termo
de livre esclarecimento. Como critérios de exclusão foram eliminados os pacientes que
apresentassem os seguintes históricos: Diabetes Mellitus, HIV, portadores de doenças
malignas, submetidos a tratamento quimioterápicos até seis meses antes da coleta,
utilizando drogas imunosupressoras, transplantados, sem apresentar nenhuma outra
doença imunosupressora diagnosticada e que não tenha adquirido a infecção após
internamento ou procedimento cirúrgico nos últimos seis meses.
Isolamento e Identificação da Candida spp.
Foram realizada raspagem das áreas lesionadas das unhas das mãos e dos pés
com o auxílio de um bisturi e submetidas ao exame direto após clarificação com KOH a
30% e cultivo em meio de cultura Sabouraud acrescido de clorafenicol 2% (p/v). As
culturas depois de isoladas foram submetidas à identificação através de análises
morfológicas utilizando a técnica de microcultivos em lâmina, produção de tubo
germinativo a 37ºC em placas contendo soro humano, provas bioquímicas
convencionais como teste de fermentação e assimilação de carboidratos. Além da
utilização do meio cromogênico (CROMagar ® Candida)
Extração do DNA
Foi utilizado sangue total para a extração do DNA genômico através do kit
GenomePrep (Armesham-Pharmacia, Buckinghamshire, UK). E o processo de extração
foi realizado conforme protocolo estabelecido pelos fabricantes.
49
Genotipagem do gene da MBL2
Os três polimorfismos (na posição 52, 54 e 57 do primeiro exon do gene) foram
agrupados juntos na categoria (alelo 0), porque eles tem um efeito substancial na MBL
sérica, a combinação dos três alelos selvagem foram agrupados como alelo “A”. A
genotípagem do polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) da MBL2 foi determinado
pela temperatura de “melting” como previamente descrito por Souza [15]. Para o
genotipagem da SNP da MBL2 foram utilizados os seguintes oligonucleotídeos (5’
AGGCATCAACGGCTTCCCA-3’). Com amplificação de 90pb e temperatura de
“melting” de 84ºC [10].
Análise estatística
A freqüência genotipica e alélica foi calculada por contagem direta do gene pelo
teste exato de Fisher’s usando a comparação das freqüências genotípicas usando 2 x 2 e
3 x 2.
RESULTADOS Identificação das espécies de Candida Os resultados da identificação realizados com amostras de 100 pacientes com
onicomicose por Candida sp estão representados na tabela 1. Pode-se observar que
ocorreu uma predominância de C. parapsilosis (50%) e C. tropicalis (34%), em vez da
C. albicans que foi encontrada em 6% das amostras. Enquanto que, o percentual de 1 a
2 % correspondeu as demais espécies de Candida.
Table 1: Resultados da identificação e freqüência de amostras de Candida spp isoladas de pacientes com onicomicose atendidos no Laboratório de Micologia Médica da Universidade Federal de Pernambuco.
Amostras Candida spp Freqüência (%) C. parapsilosis 50
C. tropicalis 34 C. albicans 6
C. guilliermondii 2 C. krusei 2
C. glabrata 2 C. famata 2
C. glabrata and C. famata 1 C .parapsilosis and C. guilliermondii 1
50
Estudo do polimorfismo do gene da MBL2 Nas análises das amostras de DNA extraídas dos 100 pacientes e dos 150
controles saudáveis, realizadas através do método baseado na temperatura de “melting”,
foi possível detectar o polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene da MBL2
e os resultados encontrados foram os seguintes: A/A (um pico de 83,1 ± 0,1 oC), A/0
(dois picos de 82,6 ± 0,3 e 80,7 ± 0,1 oC), e 0/0 (um pico de 81,7 ± 0,1 oC). A
frequência do polimorfismo do gene da MBL2 em pacientes com onicomicose e
controle saudável esta apresentada na tabela 2.
A frequência do genótipo 0/0 homozigoto foi significativamente alta nos
pacientes com onicomicose (0,10) do que nos pacientes controles (0,06; p = 0.0003),
enquanto que freqüência do genótipo MBL2 A/A homozigoto foi alta no controle
saudável (0,67) do que nos pacientes infectados (0,39; p = 0,0003). No caso do alelo 0,
esse foi significativamente mais freqüente no grupo de pacientes com onicomicose
(0,35; p=0,0001), do que no controle saudável (0,20), odds ratio [OR] de 2,19, com
intervalo de confiança de 95%.
Table 2. Frequência genotípica e alélica do gene da MBL2 em pacientes com
onicomicose causada por Candida sp. atendidos no Laboratório de Micologia Médica
da Universidade Federal de Pernambuco.
Controle saudável Pacientes com onicomicose
Frequência Genotípica
A/A 102/150 (67 %) 39/100 (39 %) A/0 41/150 (27 %) 46/100 (46 %) 0/0 7/150 (6 %) 10/ 100 (10 %)
P=0,0003
Frequência Alélicas
A 245/300 (80 %) 65/100 (65 %) 0 55/300 (20 %) 35/100 (35 %)
p= 0, 0001 OR= 1,72, 95%
CI= Intervalo de confiança; OR= odds ratio. CI= 2,39
51
DISCUSSÃO
A identificação das amostras de Candida sp. demostrou a prevalência de
Candida não-albicans em relação a C. albicans. Estes dados estão de acordo com outros
autores que citam que a predominância de Candida não-albicans, na população de
pacientes com onicomicoses no Brasil e em outros países (Israel, Inglaterra, Canadá,
Estados Unidos) [1, 3, 16].
Estudo realizado na cidade de Maringá – Paraná/ Brasil com pacientes
acometidos por onicomicose, mostrou que a freqüência de C. parapsilosis (44%)
seguida C. tropicalis (22%) e C. albicans (15%) [17]. Estudos similares realizados em
Israel apresentaram C. parapsilosis como principal agente de onicomicose. Trabalhos
realizados no município de São Jose do Rio Preto, São Paulo, demonstraram uma maior
freqüência de onicomicoses causadas por C. parapsilopsis (47%) seguida de C.
guilliermondii (9%) e C. tropicalis (7 %), representando as espécies de Candida não-
albicans[1].
Em onicomicose superficial branca diagnosticadas em pacientes com HIV e
crianças saudáveis na Itália, não foi observado a prevalência espécies de Candida sp na
infecção [18], esses dados estão contrapostos aos obtidos nesse trabalho, os quais
obtiveram como o principal agente envolvido na onicomicose a C. parapsilosis, porém
o grupo de pacientes selecionados nesse trabalho não foram pacientes imunodeprimidos
e com imunidade em estágio da maturação, o que pode ter concorrido para as respostas
encontradas.
Três variantes da MBL2 (Arg52Cys, Gly54Asp, Gly57Glu) foram
agrupadas e denominadas alelo 0, a combinação das três formas do alelo selvagem foi
denominado alelo A, o genótipo do tipo selvagem (A/A) confere aos indivíduos um
maior nível de produção de MBL e os indivíduos com o genótipo heterozigoto (A/0)
apresentam níveis intermediários de MBL circulante enquanto indivíduos que
apresentam o genótipo homozigoto mutante (0/0) são susceptíveis à determinadas
infecções. Estudos mostram que indivíduos que apresentam genótipos A0 e 00
desenvolveram a forma mais severa de infecção por HIV do que indivíduos que
apresentam o genótipo AA [11, 7].
Trabalho realizado por Liu et al, 2006 com pacientes que apresentaram
candidíase vulvovaginal (CVV) e candidíase vulvovaginal recorrentes (CVVr),
52
demonstrou que o genótipo mutante 00 foi mais freqüente nos que apresentaram CVVr
em comparação ao controle, sendo observado baixos níveis de MBL2 nesses pacientes
[19].
Em outra pesquisa realizada com pacientes com candidíase vulvovaginal,
demonstrou que a MBL2 e C3 presente na cavidade vaginal age reconhecendo as
moléculas dos agentes infecciosos que colonizam a mucosa cervico vaginal, atribuindo
a deficiência da MBL2 a susceptibilidade à infecção [20]. Dados obtidos por outros
autores relataram a relação entre a redução no nível da MBL e o aumento da ocorrência
do polimorfismo do gene da MBL2 apresentado por mulheres com candidíase
vulvovaginal recorrente (VVCr) [21, 22].
A relação entre a Candida albicans e o hospedeiro é devido à expressão das
glucanas presente na parede celular do microrganismo, sendo determinada pela resposta
imune do hospedeiro. As variações na regulação do sistema imune está envolvida na
capacidade da Candida sp. em passar de saprófitos para parasita. Esse fato pode ser
verificado por muitos dos pacientes apresentarem dificuldade na obtenção da cura
através de tratamentos convencionais. A expressão das moléculas de glucanas tem um
importante papel na biologia da Candida albicans para o controle da estrutura e
plasticidade da parede celular e no envolvimento da interação levedura/hospedeiro.
Essas glucanas são reconhecidas como não próprias pela imunidade inata e adaptativa
no sistema imune do hospedeiro [23].
A partir dos resultados obtidos da avaliação do polimorfismo de um único
nucleotídeo do gene da MBL2 em pacientes com onicomicose por Candida sp., foi
possível analisar a freqüência genotípica e alélica para o gene MBL2, a qual demonstrou
que a presença de um alelo mutante nos pacientes estudados, sugere o seu envolvimento
na susceptibilidade à onicomicose por Candida. Os dados aqui relatados são os
primeiros descritos na literatura envolvendo a expressão de gene da MBL2 em pacientes
com onicomicoses sem doenças primárias imunosupressoras.
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55
CAPÍTULO II
56
ARTIGO Á SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO Journal of Clinical Microbiology
CAPÍTULO II: Análise do Polimorfismo de um único Nucleotídeo (SNP) do gene da β Defensina-1 em pacientes com Onicomicoses causadas por Candida
sp
57
Análise do Polimorfismo de um único Nucleotídeo (SNP) do gene da β Defensina-1 em pacientes com onicomicoses causadas por
Candida spp
b, fFurtado, V. C. ; Araújo, V. P. a b, f; Souza, P. R. ; Marsdem. A.L. a; Sette. R. c; Lucas, C. A. b; Lins, C.I. M. a, b; Guimarães, L. R. b ; Lima-Filho, J. L. b; Crovella, S. b, d, h & Porto, A. L. F. b, g
a Departamento de Micologia Medica, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); b Laboratório Imunopatologia Keizo Asami-LIKA/ UFPE; c Laboratório Medicina Diagnostica-NKB, Recife, PE; d Departamento de Genético- Universidade Federal de Pernambuco UFPE; f Universidade de Pernambuco-UPE; g. Departamento de Morfologia e fisiologia Animal-Universidade Federal Rural de
Pernambuco- UFRPE; h. Departament of Developmental and Reproductive Sciences, Department University of
Trieste, Italy.
Corresponding author (Reprint request):
Veridiana Câmara Furtado.
Laboratório de Imunologia Keizo Asami
Universidade Federal Pernambuco-UFPE.
Campus universitário, Recife, PE, Brasil.
CEP: 50670-901, Tel: + 55 81 21268484
Email: [email protected]
58
Resumo
Defensinas são peptídeos antimicrobianos os quais têm um importante papel no sistema
imune inato, contribuindo para a defesa de organismos multicelulares. A expressão da
β- defensina-1 é principalmente restrita a células epiteliais do corpo e pode ser induzida
por fatores inflamatórios e microbiológicos. Este trabalho teve por objetivo analisar o
polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene da β defensina-1 em pacientes
com onicomicoses causadas por Candida sp.. Foram selecionados 100 pacientes
atendidos no Departamento de Micologia Médica-UFPE e coletadas amostras de sangue
total para extração de DNA, o qual foi amplificado por PCR em Tempo Real para
análise do polimorfismo de um único nucleotídeo. As amostras de Candida spp. foram
submetidas a análise por exame direto utilizando a clarificação com KOH a 30% e
cultivadas em meio Saboraund. Para identificação das espécies foram avaliados critérios
morfológicos e bioquímicos das culturas. Os resultados da identificação das amostras de
Candida mostraram prevalência de onicomicoses por C. parapsilosis (50%), C.
tropicalis (34%) e C.albicans (6%). Quanto à análise do polimorfismo de um único
nucleotídeo do gene da defensina-1 foi observado que o alelo G (mutante) foi
predominante em indivíduos com onicomicose em relação ao controle saudável (25%
vs. 14%; p=0,0047). Também foi encontrado diferenças significativas na freqüência do
genótipo GG do grupo de pacientes em relação ao grupo controle saudável (13% vs.
2%; p=0,00068), OR = 1,98%. Os resultados aqui apresentados demonstraram que o
alelo G conferiu maior susceptibilidade à onicomicose por Candida sp. nos pacientes
estudados.
59
INTRODUÇÃO
O sistema imune inato fornece a primeira linha de defesa contra um grande
número de microrganismo antes do desenvolvimento da resposta imune adaptativa. Por
isso, tem um importante papel na defesa contra substâncias estranhas e microrganismos
invasores (vírus, fungos, protozoários e bactérias gram positivas e gram negativas). As
defensinas (hBDs), fazem parte do sistema imune inato, são pequenos peptídeos
catiônicos, anfipáticos, contendo em geral de 20 a 45 aminoácidos, não glicosilados, as
quais contém sua estrutura rica em cisteínas ligadas por ponte de sulfeto com peso
molecular entre 3,5 e 6,0 kDa (1,3,4). Todas as defensina identificadas tem a capacidade
matar e/ou inativar um amplo espectro de microrganismo “in vitro”, sendo geralmente
consideradas efetores direto da imundade inata (5).
A β-defensina –1 (hBD-1) é um peptídeo com 68 aminoácidos produzidas em
vários tecidos epiteliais. Estas funcionam dependente de sal e parece está comprometida
com o tranporte de ions em pacientes com fibrose cistica (FC). O gene da hBD-1 tem
sido clonado e caracterizado, abrangendo aproximadamente 8kB no cromossomo
8p23٠1 e “split” entre dois exons. Devido a sua carga positiva ela pode interagir e
integrar a membrana de patogênos incluindos bactérias, fungos e virus envelopados,
matando-os. Podem também atacar células do sistema imune adquirido. Mais de 30
genes da β-defensina têm sido indentificados em humanos porém, somente quatro tem
sido estudado em detalhes, DEFB- 1, DEFB- 4, DEFB- 10 -3A e DEFB-104. Que estão
juntos a uma distância de aproximadamente de 6 kb a partir do DEFB- 1. Recentes
estudos têm demostrado a importância da avaliação do polimorfismo envolvendo o gene
da β-defensina -1, os quais exercem um significante papel na susceptibilidade à
infecções por vírus, bacterias e fungos (6).
A colonização por Candida pode estimular uma alta expressão de antibióticos
naturais em doenças de refluxo esofagiano, tornando possível observar sua ação através
da regulação das defensinas a qual mantem a infecção limitada à superfície da mucosa,
impedindo que ela se torne invasiva. Recentes estudos têm esclarecido a ação do
mecanismo complexo e múltiplo pelo qual as defensinas inibem infecções virais. As
defensinas podem bloquear as infecções virais agindo pela ação direta no virion ou
indiretamente afetando a célula alvo, com isso interferindo na infecção viral (4).
60
As espécies do gênero Candida podem ser encontradas fazendo parte da
microbiota do homem ou dependendo das alterações imunológicas do hospedeiro
podem ser potencialmente patogênicas. As espécies Candida apresentam de um modo
geral peculariedades quanto à virulência e resistência a antifúngicos. No caso das
onicomicoses causadas por Candida várias espécies podem estar envolvidas com a
infecção, e a cura dessa infecção nem sempre é alcançada com êxito (9). Salientado que
as onicomicoses são responsáveis por 20% das infecções nas unhas sendo uma das mais
freqüentes onicopatias no mundo. O aumento dos fungos emergentes causando esta
doença vem despertando interesse na área médica (10,11). O objetivo desse trabalho foi
avaliar o polimorfismo do gene da β-defensina-1 em indivíduos acometidos por
onicomicose causada por Candida sp.
MATERIAL E MÉTODOS
Seleção dos pacientes
Foram selecionadas e coletadas 100 amostras de pacientes (ambos os sexos) na
faixa etária entre 18 a 70 anos atendidos no Laboratório de Micologia Média - UFPE.
Como critério de inclusão os pacientes com idade entre 18 a 70 anos, com apresentação
de solicitação médica, sem apresentar nenhuma outra doença imunosupressora
diagnosticada e não tenha adquirido a infecção após internamento ou procedimento
cirúrgico nos últimos seis meses e que aceitaram fazer parte da pesquisa respondendo
um questionário e assinando o termo de livre esclarecimento. Como critério de exclusão
foram pacientes com Diabetes Mellitus, HIV, portadores de doenças malignas,
submetidos a tratamento quimioterápicos até seis meses antes da coleta, utilizando
drogas imunosupressoras, transplantados.
Isolamento e Identificação da Candida spp.
61
Foram realizada raspagem das áreas lesionadas das unhas das mãos e dos pés
com o auxílio de um bisturi e submetidas a exame direto após clarificação com KOH a
30% e cultivo em meio Sabouraud acrescido de clorafenicol 2%. As culturas depois de
isoladas foram submetidas à identificação por análises morfológicas através de
microcultivos em lâmina, produção de tubo germinativo a 37 ºC em soro humano, teste
de fermentação e assimilação de carboidratos. Além da utilização do meio cromogênio
(CROMagar ® Candida).
Extração do DNA
Foi utilizado sangue total para a extração do DNA genômico através do kit
GenomePrep (Arsham-Paharmacia, Buckinghamshire, UK). E o processo de extração
foi realizado conforme protocolo estabelecido pelos fabricantes
Genotipagem do gene da β-defensina-1
A genotipagem foi realizada por PCR em tempo real segundo o protocolo de
Bonioto, 2004. O ciclo de termociclagem usado foi de 2’ 95ºC, 40 ciclos 15 “95ºC, 60
ºC 1’. Para cada paciente foi duas leituras: uma para WT (tipo selvagem) e outro MT
(tipo mutante). A análise do genotípica foi realizada de acordo com a curva de
Threshold, a qual analisa os resultados baseado na fase do ciclo que ocorre amplificação
(8).
Análise estatística
A freqüência genotipica e alélica foi calculada por contagem direta do gene pelo
método de Fisher’s direto usando a comparação das freqüências genotípicas usando 2 x
2 e 3 x 2.
Identificação das espécies de Candida
O resultado do presente estudo realizado com 100 amostras de pacientes
com onicomicose por Candida sp. estão representados na tabela 1. No qual
62
ocorreu uma predominância de C. parapsilosis (50%) e C. tropicalis (34%),
enquamto que a C. albicans que foi de apenas (6%). As demais espécies que
ficaram em torno de 1 a 2 %. Estes resultados estão condizentes com outros
trabalhos citados na literatura, os quais relatam um aumento das infecções por
Candida não-albicans.
Table 1: Resultados da identificação e freqüência de amostras de Candida spp
isoladas de pacientes com onicomicose atendidos no Laboratório de Micologia
Médica da Universidade Federal de Pernambuco.
Candida spp Freqüência (%)
C. parapsilosis 50
C. tropicalis 34
C. albicans 6
C. guilliermondii 2
C. krusei 2
C. glabrata 2
C. famata 2
C. glabrata and C. famata 1
C .parapsilosis and C. guilliermondii 1
Analise do SNP dos polimorfismos do gene β-defensina-1
A tabela 2 mostra os resultados da freqüência alélica e genotípica do SNP (-44
C/G) em pacientes com onicomicoses e controle saudável: O alelo G foi
estatisticamente mais freqüente nos pacientes com onicomicose do que nos pacientes
saudáveis (25% vs. 14%, p=0,00047), odds ratio (OR) 1,98, com 95% de intervalo de
confidência. Da mesma forma, a distribuição genotípica foi significativamente diferente
entre pacientes com onicomicose e controle (13% vs. 2%, p= 0,00068).
63
Tabela 2. Freqüência genotípica e alélica do gene da β-defensina-1 em paciente
com onicomicose causada por Candida sp
Controle sadio Pacientes
Freqüência Genotípica
CC 108/ 150 (73 %) 63/100 (63%)
CG 36/ 150 (25%) 24/100 (24%)
GG 5 / 150 (02%) 13/100 (13%)
p=0,013
Freqüência Alélica
C 258 / 300 (86%) 75/100 (75%)
G 42/ 300 (14%) 25/100 (25%)
p=0,016
OR= 1,98; IC=95%
Dados do numero de pacientes (%).
OR= odds ratio; IC= Intervalo de Confiança
DISCUSSÃO
A identificação das amostras de Candida sp. demostrou a prevalência de Candida não-
albicans em relação a C. albicans. Estes dados estão de acordo com outros autores que
citam que a predominância de Candida não-albicans, na população de pacientes com
onicomicoses no Brasil e em outros países (Israel, Inglaterra, Canadá, Estados Unidos)
(12, 13). Estudo realizado na cidade de Maringá – Paraná/ Brasil com pacientes
acometidos por onicomicose, mostrou que a freqüência de C. parapsilosis (44%)
seguida C. tropicalis (22%) e C. albicans (15%) (14). Estudos similares realizados em
Israel apresentaram C. parapsilosis como principal agente de onicomicose. Trabalhos
realizados no município de São Jose do Rio Preto, São Paulo, demonstraram uma maior
freqüência de onicomicoses causadas por C. parapsilopsis (47%) seguida de C.
64
guilliermondii (9%) e C. tropicalis (7 %), representando as espécies de Candida não-
albicans (15).
Os resultados obtidos, do presente estudo, em relação à amplificação do gene da
β – defensina-1, realizados com PCR em tempo real pela analise da ciclo de Thresold,
apresentaram três possibilidades genotípicas: WT (tipo homozigoto selvagem - CC),
MT/WT (tipo heterozigoto - CG) e MT (homozigoto mutante GG). Esses alelos (WT,
MT e WT/MT), correspondem à posição - 44 da região promotora de gene da β-
defensina-1 (1, 8,16). O genótipo WT, MT e Wt/Mt confere maior, menor e
intermediaria atividade protetora β-defesina-1, respectivamente (17).
Os dados obtidos da análise do polimorfismo de um único nucleotídeo do gene
da β-defesina-1 em indivíduos com onicomicose demostrou predominância do alelo
mutante G em relação aos controles saudáveis. Também obteve diferença significativa
na freqüência genotípica entre os dois grupos analisados. Nesse caso o alelo G conferiu
uma maior susceptibilidade à infecção.
Estudos realizados utilizando linhagem de camundongos imunocompetentes
(BALB/c e C57BL/6) com candidiase gástrica causada por Candida albicans
expressaram diferenças significativas na regulação basal dos níveis de β-defensinas. A
expressão do RNA mensageiro da β–defensinas-1 (mhBD-1) foi similar entre as duas
linhagens. Entretanto, a β–defensinas-4 (mhBD-4) apresentou maior expressão na
linhagem C57BL/6 e a β–defensinas-3 (mhBD-3) expressou maior nível em BALB/c. O
uso de duas diferentes linhagens de camundongos imunocompetentes mostraram que
ambas exibiram diferenças na estimulação de suas respostas imunes para candidíase
gástrica no local da infecção (18).
Muitos mecanismos podem ter uma importante contribuição na atividade
antifúngica das hBDs. Enfatizando a atividade antifúngicas das β-fensinas frente às
espécies de Candida isoladas da cavidade orofaríngea, as que tiveram melhor
desempenho em matar C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis foram as rhBD-2 e -3 do
que rhBD-1. Entretanto, a rhBD-1 demonstrou uma melhor atividade contra C. glabrata
do que as demais. A C. glabrata apresentou resistência a todas hBDs. Porém, às hBDs
inibiram sua aderência as células do hospedeiro evitando desse modo sua fixação (19).
Os resultados desse estudo possibilitaram demonstrar que o polimorfismo de um único
nucleotídeo do gene da β-defensina-1 apresentou uma frequência predominante do alelo
65
mutante G nos pacientes com oniconicose provocada por Candida sp., sugerindo ser um
dos fatores que favoreceram a infecção nesses pacientes.
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67
CONCLUSÃO
• Nos pacientes selecionadas com diagnóstico de onicomicose causada por
Candida sp. houve uma predominância de C. parapisilosis (50%), C. tropicalis
(34%). Enquanto, a C. albicans foi de apenas 6 %. Esse resultado mostra uma
predominância de espécies de Candida não albicans em relação à C. albicans.
Isto pode ser devido ao fato dos pacientes selecionados não apresentarem
doenças primárias que levem a imunosupressão.
• A análise do polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene da MBL2
mostrou diferença significativa tanto alélica como genotípica entre os pacientes
estudados e o grupo controle saudável, sugerindo que a presença de um alelo
mutante 0 pode contribuir com a susceptibilidade a onicomicose causada por
Candida sp.
• O estudo do polimorfismo gênico da β-defensina-1, nos pacientes acometidos
por onicomicose causada por Candida sp., mostrou diferença significativa entre
os pacientes com onicomicose e o grupo controle em relação à expressão
genotípica e alélica entre os dos grupos. Evidenciando que presença de um alelo
mutante G pode agir favorecendo a onicomicose causada por Candida sp.
• O estudo do polimorfismo do gene da MBL2 e β-defensina-1 contribui para uma
análise do comportamento da imunidade inata frente a pacientes com
onicomicose causada por Candida sp. o que mostra a importância desses dois
componentes do sistema imune inato na defesa ou controle da infecção.
• Salientamos que se faz necessário mais estudos para um melhor esclarecimento
da participação da MBL2 e β-defensina-1 na onicomicose causada por Candida.
Pois não existe nenhum outro relato dessa associação na literatura.
68
ANEXO I
69
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70
Brief Communications should be limited to 2500 words, with an abstract of 150 words maximum and up to 30 references. Review articles should be no more than 5000 words (excluding references, tables and figures), with an abstract of 200 words maximum and up to 80 references. Reports of Meetings or Workshops, Editorials, and Reviews. A letter of inquiry should be sent to the Editor, prior to the submission of these materials. Preparation of Articles The manuscript should include the following sections: Title Page, Abstract (not more than 200 words), Keywords (up to 5), Abbreviations (list of abbreviations used), Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements, References, Tables, Figure Legends, and Figures. The title page should include the names and affiliations of the authors, the complete address, e-mail address, and telephone and facsimile numbers of the corresponding author, five keywords, and an abbreviated title of not more than 45 characters and spaces. Footnotes in the text should be defined on the page on which they appear and be numbered consecutively with superscript Arabic numerals. References. Identify references in the text by Arabic numerals in brackets, and number consecutively in the References section in the order they are first mentioned. References should follow the standard "Vancouver" style. List all authors, but if the number exceeds six, give only the first six followed by et al. Examples: Journal. Leen MPJM, Gorski J. Differential expression of isomorphic HLA-DR genes is not a sole function of transcription. Hum Immunol 1996;50:111-15. Book. Peter JB, Shoenfeld Y. Autoantibodies. Amsterdam: Elsevier; 1996. Chapter in a book. Bendtzen K, Hansen MB, Ross C, Svenson M. Cytokine autoantibodies. In: Peter JB, Shoenfeld Y, editors. Autoantibodies. Amsterdam: Elsevier; 1996. Tables. Each table should be typed double-spaced on a separate page, and numbered with Arabic numerals in the order of reference in the text. Use only horizontal rules. Table titles should be informative, with detailed information appearing as footnotes and identified in the table by superscript letters. Figures. Authors should consult the Elsevier website for guidelines for preparing (electronic) artwork: http://authors.elsevier.com/artwork. N.B. With web submission, only the following formats are acceptable: TIFF, PDF and EPS. Please keep in mind that in the journal illustrations will appear either across a single column (=8.3 cm) or a whole page (=17.6 cm). The illustrations
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should be numbered in Arabic numerals according to the sequence of appearance in the text, where they are referred to as Fig. 1, Fig. 2, etc Color figures. If together with your accepted article, you submit usable color figures, then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these figures will appear in color on the web (e.g., ScienceDirect and other sites) regardless of whether these illustrations are reproduced in color in the printed version. For color reproduction in print, you will receive information regarding the costs from Elsevier after receipt of your accepted article. For further information on the preparation of electronic artwork, please see http://authors.elsevier.com/artwork. DNA sequences and GenBank accession numbers. Authors wishing to enable other scientists to use the accession numbers cited in their papers via links to these sources should type this information in the following manner: For each and every accession number cited in an article, authors should type the accession number in bold, underlined text. Letters in the accession number should always be capitalized (see example below). This combination of letters and format will enable the typesetter to recognize the relevant texts as accession numbers and add the required link to GenBank's sequences. Example: GenBank accession nos. AI631510 , AI631511 , AI632198 , and BF223228 ), a B-cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048 ), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no. AA361117 ). Authors are encouraged to check accession numbers used very carefully. An error in a letter or number can result in a dead link. In the final version of the printed article, the accession number text will not appear bold or underlined. In the final version of the electronic copy, the accession number text will be linked to the appropriate source in the NCBI databases, enabling readers to go directly to that source from the article. Proofs and Offprints Proofs will be sent to the author by e-mail to be carefully checked for file conversion errors. Changes or additions to the edited manuscript cannot be allowed at this stage. Corrected proofs should be returned to the publisher within two days of receipt. It is important to ensure that all corrections are sent back to us in one communication. The corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of the article via e-mail or, alternatively, 50 free paper offprints. The PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use. Additional offprints may be ordered at the price listed on the order form that will be sent from the Publisher. Author inquiries. Visit http://www.elsevier.com/authors for the facility to track accepted articles and set up e-mail alerts to inform you when an article's status has changed. The Elsevier site also provides detailed artwork guidelines, copyright information, frequently asked questions and more. Contact details for questions arising after acceptance of an article, especially those relating to proofs, are provided after registration of an article for publication.
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ANEXO II
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JUORNAÇ OF CLINICAL MICROBIOLOGY GUIDELINES FOR REVIEWERS for ASM Journals Reviewing a manuscript written by a fellow scientist is a privilege. It is also an exciting and enjoyable educational experience. However, it is also a time-consuming responsibility. ASM and its editors, authors, and readers therefore appreciate your willingness to accept this responsibility and your dedication. We hope that these Guidelines will help make your job easier. General Policies and Procedures Authors submit their manuscripts electronically via Rapid Review to ASM. Each manuscript is reviewed by ASM staff for relevancy to the individual journal. Should a question arise, the production editor will contact the editor in chief (or an appropriate editor), who then decides whether the manuscript should be transferred to another ASM journal, editorially rejected owing to scope, or retained for review by the journal to which it was submitted. If retained, the manuscript is assigned to an editor, who in turn chooses one or more editorial board members or ad hoc reviewers to review it. On receipt of the invitation to review, you should immediately:
• Read the editor's transmittal e-mail, which includes the article abstract, to determine whether the subject is within your area of expertise and whether you can complete the review in the stated time period.
• Look at the "Special comments from the editor" paragraph (which will generally be at the end of the e-mail) to see whether there is any supplemental material and, if so, whether it is intended for online posting. The editor will indicate whether any special software is required to view the files. If you do not have the software, you will need to decline to review.
• Log on to Rapid Review and either accept or decline the invitation to review.
If you decline the invitation to review:
• Indicate why you are declining.
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• If possible, please suggest a colleague who may be able to review the manuscript. If appropriate, the editor will send an invitation to review to that individual. You may not “transfer” your invitation to review the manuscript to a colleague.
If you accept the invitation to review, you will have access to the complete PDF of the manuscript and should immediately:
• Double-check the manuscript title page and the Acknowledgments section to determine whether there is any conflict of interest for you (with the authors, their institution, or their funding sources) and whether you can judge the article impartially. (See also p. 5 of these Guidelines.)
• Quickly skim the relevant portions of the manuscript and verify that it fits within the scope of the journal.
If you have either a time problem or a conflict of interest, contact the editor (outside of Rapid Review) for instructions. He may extend your deadline or cancel the review assignment as appropriate. If your cursory examination reveals that the manuscript does not fit within the scope of the journal, indicate that in the Confidential Comments to the Editor section of the review form. You will also need to click the appropriate button in each category in the Confidential Assessment for the Editor section (these are required fields; if none of the selections is appropriate, indicate in the Confidential Comments to the Editor section that the editor should ignore them). Do not discuss the paper with its authors either during or after the review process. Although it may seem natural and reasonable to discuss points of difficulty or disagreement directly with an author, especially if you are generally in favor of publication and do not mind revealing your identity, this practice is prohibited because the other reviewer and the editor may have different opinions, and the author may be misled by having "cleared things up" with the reviewer who contacted him/her directly. The manuscript provided to you for review is a privileged document. Please protect it from any form of exploitation. Do not cite a manuscript or refer to the work it describes before it has been published and do not use the information that it contains for the advancement of your own research or in discussions with colleagues. In your comments intended for the author, do not make statements about the acceptability of a paper (see the next paragraph); suggested revisions should be stated as such and not expressed as conditions of acceptance. Organize your review so that an introductory paragraph summarizes the major findings of the article, gives your overall impression of the paper, and highlights the major shortcomings. This paragraph should be followed by specific, numbered comments, which, if appropriate, may be subdivided into major and minor points. (The numbering facilitates both the editor's letter to the author and evaluation of the author's rebuttal.) Criticism should be presented dispassionately; offensive remarks are not acceptable.
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Confidential remarks directed to the editor should be entered in the box so labeled. Advise the editor of your recommendation for acceptance, modification, or rejection by clicking the appropriate button. The final decision regarding modification, acceptance, or rejection of a manuscript rests solely with the editor, so do not state your recommendation in the portion of the review that will be sent to the author. After completing your review, click the Submit Review button. There is no need to make a copy of your review because it will be saved in your Reviewing History in Rapid Review. The Review Adopt a positive, impartial, but critical attitude toward the manuscript under review, with the aim of promoting effective, accurate, and relevant scientific communication. Please consider the following aspects when reviewing a manuscript:
• Significance to the target scientific community • Originality • Appropriateness of the approach or experimental design • Appropriateness of the statistical analyses
Adherence to correct scientific nomenclature
• Appropriate literature citations • Adequacy of experimental techniques • Soundness of conclusions and interpretation • Relevance of discussion • Organization • Adherence to the Instructions to Authors • Adequacy of title and abstract • Appropriateness of figures and tables • Appropriateness of supplemental material intended for posting (if applicable) • Length • Whether it describes misuse of microbial systems or the information derived
therefrom
You are not required to correct deficiencies of style, syntax, or grammar, but any help you can give in clarifying meaning will be appreciated. In particular, point out the use of scientific jargon, misspellings of chemical names, use of outmoded terminology or incorrect genetic nomenclature, and use of misspelled, incorrect, or outdated scientific names of organisms. Your criticisms, arguments, and suggestions concerning the paper will be most useful to the editor and to the author if they are carefully documented. Do not make dogmatic, dismissive statements, particularly about the novelty of the work. Substantiate your
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statements. Reviewer's recommendations are gratefully received by the editor; however, since editorial decisions are usually based on evaluations derived from several sources, reviewers should not expect the editor to honor every recommendation. You will be asked to suggest acceptability as noted on the specific review form (e.g., accept; accept with revision; reject; modify, rereview required; convert to Note). Should you review manuscripts for more than one ASM journal, note that their review forms and categories may vary slightly.
• Very few papers qualify for an immediate, unconditional acceptance. • There are many reasons to reject a paper. In general, if there are serious flaws in
experimental design, incorrect interpretation of data, extensive additional experiments required, or any organizational or English usage flaws that prevent critical review of the manuscript, then recommend that the manuscript be rejected.
• If you feel that the deficiencies can be corrected within a reasonable period of time (1 to 2 months), then recommend modification (e.g., modification; convert to Note; accept with revision; or modify - rereview required, if the revisions are extensive enough to warrant a second review). For some of the ASM journals, you may recommend "convert to Note" if you feel that the presentation can fit into the Note format, which usually should not exceed 1,000 words plus an illustration or a table or two; this format should not be used as an excuse to publish work of questionable quality. (Note: Some ASM journals call them "Short Forms"; some do not publish either Notes or Short Forms; some have different word count requirements.)
Some ASM journals publish very short communications in a "letter" format. These are usually concise (750 words maximum) communications of important new data; they do not meet the criteria for full-length articles or Notes. In some instances, you may want to recommend that Notes be converted to letters. However, please be aware that letters are usually not indexed and abstracted by most services. ASM Publication Policies; Ethics Although the staff at the ASM Journals Department and the journal editors may be able to note a breach of publication policy or ethical conduct after publication, we rely heavily on the reviewers to detect such problems before publication. ASM publication policies are described in the Instructions to Authors, which are published in the January issue of each journal (March for MMBR). Examine them each year for changes; updates are highlighted for easy reference. Some of the items for which you should be alert include:
• Plagiarism – Plagiarism is not limited to the Results and Discussion sections; it can involve any part of the manuscript, including figures and tables, in which material is copied from another publication without attestation, reference, or permission. Note that wording does not have to be exact to be copyright
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infringement; use of very similar words in almost the same sequence can also be infringement. Data themselves are not copyrightable, but their presentation is.
• Missing or incomplete attestation - Authors must give appropriate credit to ideas, concepts, and data that have been published previously. This is accomplished by the inclusion of references. Missing, incomplete, or incorrect references must be brought to the editor's attention.
• Dual submission and/or publication - Be wary of attempts to submit/publish similar material more than once. This is often difficult to detect "before the fact," but checking literature citations, as well as having a critical eye, is helpful.
• Conflicts of interest - If you are aware of any commercial affiliations, consultancies, stock or equity interests, or patent-licensing arrangements on the part of the authors, bring them to the attention of the editor.
Note that similar conflicts of interest on your part must also be brought to the attention of the editor, who may, at his discretion, subsequently cancel your invitation to review the manuscript. If one of the manuscript authors is at your institution, there could be a perceived conflict of interest, and you should immediately contact the editor so that another individual can be invited to review the manuscript in your place. In summary, you must communicate suspicions of policy or ethics problems directly to the editor, who in turn will contact the editor in chief. Under no circumstance should you contact the author directly. ASM has policies for investigation and resolution of such problems and these must be followed.
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![ΓΕΝΙΚΗ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑ ... · Genus species Albugo candida –(Λευκή ... Microsoft PowerPoint - ERGASTIRIO.5_OOMYCETES.ppt [Λειτουργία συμβατότητας]](https://static.fdocument.org/doc/165x107/5ac2987b7f8b9a1c768e30a9/-species-albugo-candida-.jpg)
