1

Spektrofotometri

Olav KlingenbergAvdeling for medisinsk biokjemi

OUS-Rikshospitalet

2

• Lys• Basale konsepter

– Transmittans– Absorbans

• Instrumentering• Anvendelse• Feilkilder

3

Lys

• Bølge- og partikkelegenskaper - fotoner• Energi: proporsjonal med lysets frekvens

omvendt proporsjonal med bølgelengde

Fotometri - måling av lysSpektrofotometri - måling av lysintensitet ved valgt(e) bølgelengde(r)

Elektromagnetisk stråling

Kosmisk stråling10-9 nm (10-18 m)

Radiobølger1000 km (106 m)

Lysca 380-750 nm

4

• Ulike stoffer kan absorbere lys i deler av spekteret

Abs

orba

ns

Noen basale størrelser

5

Transmittans

• Refleksjon• Absorbert av løsningsmiddel

-Disse faktorene må elimineres

I0 IST=IS/I0

6

T for analytt:

IS/IR

Transmittans

I0 IS

T=100%I0 IR

Sample

Referanse

T=IR/I0

T=IS/I0

7

• A=-Log(IS/IR)=-LogT

Transmittans - Absorbans

Absorbans Transmittans

0,1 ~79,4 %1 10 %2 1 %3 0,1 %

8

Beer-Lamberts lov

A=abcA - Absorbansa - absorptivitet b - Lysvei (cm)c - konsentrasjon

Når b=1 cm og c er uttrykt i mol/L uttrykkes a som ε.

ε er konstant for et gitt stoff ved gitt bølgelengde og gitte

betingelser for pH, løsningsmiddel, temp. etc

ε - molar ekstinksjonskoeffisient eller molar absorbtivityForutsetninger:

Monokromatisk lysLav abs. av løsn.middelIkke optisk interferensIkke pågående kjemisk reaks.Konsentrasjonsnivå →

9

Anvendelse av Beer-Lamberts lov

• A=abc• a=A/bc• Ac/bccc= Au/bucu

• Ac/cc= Au/cu

• cu=cc*Au/Ac

• cu=Au*K

A - Absorbansa - absorptivitet b - Lysvei (cm)c - konsentrasjon

Subscript c - calibratorSubscript u - ukjent

K - Kalibreringskonstant funnet ved måling av absorbans av kalibrator med kjent konsentrasjon

10

Spektral båndbredde• Instrumentets lys• Smal spektral båndbredde gunstig,

særlig ved smale absorbanstopper.• Forutsetning for Beer-Lamberts lov• Øker sensitivitet og linearitet• Naturlig båndbredde- båndbredde

ved halvparten av max absorbsjon• Spektral båndbredde≤10% av

naturlig båndbredde

Koproporfyrin I

1 nm

10 nm

20 nm naturligbåndbredde

11

Instrumentering - to hovedtyper

enkeltstråle

12

Instrumentering

dobbeltstråle(in space eller in time)

13

-Gløde-LASER

Lyskilde Monokromator Kuvette Detektor

14

GlødeLASER

Lyskilde Monokromator

PrismeDiffr.gitter(Filter)

Kuvette Detektor

15

GlødeLASER

Lyskilde Monokromator

PrismeDiffr.gitter(Filter)

Kuvette

Glass-lysKvarts-UVPlast-begge-

engangs

Detektor

16

GlødeLASER

Lyskilde Monokromator

PrismeDiffr.gitter(Filter)

Kuvette

GlassKvartsPlast

Detektor

FotomultiplikatorrørFotodiode-fotosensitivt

halvledermateriale-resolusjonTidBølgelengde

Lys

17

Anvendelse

• Klinisk enzymymology• Fargebindingsassay• Kromogene assay

18

Klinisk enzymologi• Måle endring i kons av substrat eller produkt• Redusert absorbans fra substrat • Økt absorbans fra produkt (best)

Tid

A

Lag

Optimalisering av reaksjon

Tid Tid Tid

[Pro

dukt

]

[Pro

dukt

]

[Pro

dukt

]

19

Fast tid vs.Kontinuerlig monitorering

Hastighet

Substrat-konsentrasjon

Tid

Måle i lineært område, hastighet da avhengig av enzymkonsentrasjon

20

LD

Eksempel: LD

Laktat Pyruvat

+ NADH+H+NAD+ +

NADH

NAD+

pH 8,8-9,8

pH 7,4-7,8

P→Log

L→P

IFCC

21

Fargebinding, total-Ca

o-kresolftalein complexon CPC+ Ca2+

Ca2+-CPC+ rødfarge, 570-580 nm

22

Kromogent assay

Substrat, fargeløst

Enzym

Produkt

23

Kromogent substrat

Spesifikkgjenkjennelsessekvens

Kuttesete

p-nitroaniline

24

Kromogent assay

• Eksempel: AntitrombinAT

Heparin TrombinFXaPas-plasma (AT)

Trombin (kjent mengde)Heparin

Inkuberes, 60 sek Kromogent substrat

Farget produkt(p-nitroaniline, pNA)

AT pNA

25

Feilkilder

• MANGE ! • I prøve - Optisk interferens

– lysspredende substanser (lipemi, klotting...)– fargede substanser -bilirubin -hemolyse

• I instrument– Monokromator - endret bølgelengde