Skin CD4+ T Cells Produce Interferon-γIn Vitro in Response to Streptococcal Antigens in Chronic...

5
Skin CD4 + T Cells Produce Interferon-g In Vitro in Response to Streptococcal Antigens in Chronic Plaque Psoriasis Dean W. Brown, Barbara S. Baker, Jean-Marc Ovigne, Catherine Hardman, Anne V. Powles, and Lionel Fry Department of Dermatology, Imperial College School of Medicine at St. Mary's, London, U.K. Recently, we have demonstrated that group A streptococcal antigen reactive T cells are present in the skin lesions of chronic plaque psoriasis. To deter- mine the cytokine pro®le (interferon-g, interleukin-4 and interleukin-10) of these T cells in response to streptococcal antigens, T cell lines were cultured from untreated lesional skin of 13 patients with chronic plaque psoriasis and 12 patients with other in¯ammatory skin diseases. T cell lines were incub- ated with or without a sonicated heat-killed mixture of group A streptococcal isolates for 18 h in the pre- sence of a transport inhibitor, stained for surface CD4 or CD8 and intracellular cytokine expression, and analyzed by ¯ow cytometry. Psoriatic T cell lines were grown from 10 of 13 patients and were predominately CD4 + (64%±85%) with 10%±32% CD8 + T cells. Variable numbers of CD4 + T cells pro- duced interferon-g (0.8%±35%, median 13.9) in eight of 10 T cell lines (p < 0.02). In contrast, CD4 + T cells in ®ve of 12 T cell lines obtained from disease controls did not produce or produced minimal inter- feron-g in response to group A streptococcal isolates; this was signi®cantly different from the psoriatic T cell lines (p < 0.05). Small numbers of interleukin-10 positive (0.8%±1.3%) and interleukin-4 positive (2.1%±2.5%) CD4 + T cells induced by group A streptococcal isolates were also present in two out of ®ve and three out of ®ve psoriatic T cell lines, respectively. This was signi®cantly less in each case than the numbers of CD4 + /interferon-g + T cells (p < 0.05). Cytokine-positive CD8 + T cells were rarely observed. These ®ndings demonstrate that a subpopulation of CD4 + T cells in chronic plaque psoriasis skin lesions produces interferon-g in response to streptococcal antigens and may be relevant to the pathogenesis of psoriasis. Key words: cytokines/intracellular/T cell lines. J Invest Dermatol 114:576-580, 2000 P soriasis is a complex in¯ammatory disease of the skin and is characterized by a dense in®ltration of T lymphocytes and hyperproliferation of the epithelial layer. Group A streptococci are a well-recognized trigger for the acute guttate form of psoriasis (Norholm-Pedersen, 1952). In addition, in chronic plaque psoriasis, the disease can be exacerbated by streptococcal infections (Norrlind, 1955). Recently, we have demonstrated that group A streptococcal antigen reactive T cells are present in skin lesions of chronic plaque psorasis, in common with those of the guttate form of the disease (Baker et al, 1993; 1999). In addition, peripheral blood lymphocytes isolated from both guttate (Gross et al, 1977) and chronic plaque (Baker et al, 1991) patients show strong responses to group A streptococcal antigens. Previous studies have investigated the cytokine pro®le of biopsies from skin lesions of patients with psoriasis and/or of T cell clones established from psoriatic skin using polymerase chain reaction or enzyme-linked immunosorbent assay (Uyemura et al, 1993; Schlaak et al, 1994; Vollmer et al, 1994). Recently, however, intracellular staining of cytokines and analysis by ¯ow cytometry has been used to investigate cytokine production in psoriasis. This approach enables subpopulations of T cells (CD4 + or CD8 + ) producing cytokine to be evaluated; furthermore single cells can be stained simultaneously for more than one cytokine (Openshaw et al, 1995). Intracellular interferon-g (IFN-g) production by freshly isolated epidermal and dermal T cells from psoriatic lesions in response to phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin has been reported; both CD4 + and CD8 + T cells were shown to produce IFN-g (Szabo et al, 1998). In addition, the production of IFN-g by psoriatic skin T cell lines (TCL) in response to staphylococcal enterotoxin-A has been detected using intracel- lular staining (Nielsen et al, 1998). The cytokine response to (bacterial) antigens, however, has not been studied in psoriatic skin derived T cells. The aim of this study was therefore to investigate the production of IFN-g, interleukin-4 (IL-4) and IL-10 by T cells derived from chronic plaque psoriatic skin lesions in response to group A streptococcal antigens using intracellular staining and ¯ow cytometry. MATERIALS AND METHODS Patients and biopsies Thirteen untreated chronic plaque psoriasis patients (11 males and two females), age range 29±72 y with 1%±50% skin involvement, were studied. The control group consisted of 12 patients with other in¯ammatory skin diseases (four lichen planus, three pityriasis rosea, one linear IgA, one dermatitis herpetiformis, and three nonspeci®c dermatitis); 10 males and two females, age range 25±72 y. Forty milliliters of heparinized blood and a shave biopsy, or two 3 mm punch biopsies, of lesional skin were taken from each psoriasis or control 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 576 Manuscript received October 15, 1999; revised November 22, 1999; accepted for publication December 13, 1999. Reprint requests to: Dr. B. S. Baker, Dermatology Research, Imperial College School of Medicine at St. Mary's, Norfolk Place, Paddington, London W2 1PG, U.K. Email: [email protected] Abbreviation: TCL, T cell lines.

Transcript of Skin CD4+ T Cells Produce Interferon-γIn Vitro in Response to Streptococcal Antigens in Chronic...

���� ���� ���� ����� ���������� �� ����� �� �������� ������������ ������� �� ������� ���� ��������

���� �� ���� ������� � ������ ��������� ������� ��������� �������� ���� �� � �!� ��� "��� #�$��%������� & ������ �$� '�%���� � ��� �� & �������� �� �� ���$(!� "���� )�*�

������� ��! �"�������� ���� ����� ������������� ������ �����! ���� �� ����� ���� ���� ������ �� ������� ����� ���������# � ����"�� �� ������� ���$� %����������� �������������� ����������&'( �� ��� ���� �� ������ �������������� �������� ��� ���� � ����������" ������� ������� ���� �� &) ������� ���������� ����� ��������� ��� &* ������� ��� ������+�""����� ���� ������# ��� ���� � ����,���� ��� �� ������ � �������� ��������� "�-����� ����� � ������������ ������� ��� &. � �� �� ������ �� � ��������� ����,����� ������ ��� ��������� �� ��. ��� ������������ ������� -����������� �����/� ,� +� ����"���# �������� ������� � ��� � ���" &' �� &) ������� ��� �����"������ ���� %0�12.31( ��� &'12)*1��.� ����# 4����,� ��",�� �� ���� ���� �������� ���������� %'#.12)31� "���� &)#5( �� ������ &' ��� ���� %�6 '#'*(# �� ��������� ���� ����

�� $! �� &* ��� ���� �,����� ���" ������������� ��� ��� ������ �� ������� "���"�� ����������� �� ������ �� ����� � ������������ �������7���� �� �����$������ ������� ���" �� ��������� ��� ���� %�6 '#'3(# �"��� ��",�� �� ����������&'������! %'#.12&#)1( ��� ����������� ������!%*#&12*#31( ���� ���� ������ ,� ����� ������������� ������� � ���� ����� �� � � ��� ��$! ��� ��� ��� �� $! ��������� ��� �����������!��# ��� �� �����$������ ��� �� ��� ������� �� ��",�� �� ����8����������� ����%�6 '#'3(# ��������������! ��.� ���� ������ �,��!�# �� $������ �"������� ���� ���,���������� �� ���� ���� �� ������� �������������� ���� ������ ������� ���������� �������� �� ������������ ������� ��� "�� ,��!��� �� �� ���������� �� ���������# � ���� ������� ��������������� ��� ��� � � ��� � �������������� �!"# $"""

�!���!�! �! � ��% �+ ��,������$ ��!��!� & ��� !������ �! ����������-�� �$ � ���!� ��. ������ & / $�%��$��! ��� �$%��%� �&������ & ��� �%���� �� �$��� 0�1% � !���%����� ��� � � �������-��������� &� ��� ��1�� �1����� &�� & %!���!�!

23�� �������!��� 45678� '� �������� �� ������ % �91�%!���!�!� ��� ��!��!� ��� �� �+��������� �$ !���%����� ��&�����! 23�� ���� 45668� :����� $� � ���� ����!���������� ��1% � !���%����� ������� �������� / �� ! ��� %��!����� !��� �!��! & ������ % �91� %!��!�!� �� ���� �����!� & ��� �1����� &�� & ��� ��!��!� 2����� �� ��� 455;<45558� '� �������� %���%���� � � $�%��$��! �! ���� &����� �1����� 20�!! �� ��� 45==8 ��� ������ % �91� 2����� �� ���45548 %������! !� !���� ��!%�!�! � ��1% � !���%����� �������!�

�����1! !�1���! ���� ����!������� ��� �$����� %�. � &��%!��! &�� !��� �!��! & %������! ��� %!���!�! ���>� & /�� � ��! �!��� �!��� &�� %!������ !��� 1!��� % $����!������ ������� � ��-$��� ����� ���1�!����� �!!�$2)$��1�� �� ��� 455;< �� ��� �� ��� 455?< � ��� �� ���455?8� :����� $� ������ ������� 1 �� !������� & �$�����! ������ $!�! �$ , �$�����$ ��! ���� 1!�� � ����!������ �$�����

%��1���� �� %!���!�!� /��! �%%���� ���� �! !1�%%1 ����! &/ �� ! 2��?@ � ��A@8 %��1���� �$����� � �� ��� 1����<&1�������� !��� � �� ! ��� �� !������ !��1 ����1! $ &� ������� �� �$����� 2�%��!�� �� ��� 45568� '������ 1 �������&����� 2'#3��8 %��1���� �$ &��!� $ �! ���� �%������ ��� ����� / �� ! &�� %!������ �!��! �� ��!%�!� � %��� 47��$��!���� 4;�������� 2���8 ��� ���$��� ��! ������%����< ��� ��?@ ��� ��A@ / �� ! ��� !�� �%��1�� '#3�� 2 -�� �� ��� 455A8� '� �������� ��� %��1����& '#3�� �$ %!������ !��� / �� ���! 2/�"8 �� ��!%�!� �!��%�$ ���� ������+���� ��! ���� �������� 1!��� ������� � 1 �� !������� 23�� !�� �� ��� 455A8� /�� �$����� ��!%�!� �2�������� 8 �������!� ������ ��! �� ���� !�1���� �� %!������!��� ������� / �� !�

/�� ��� & ���! !�1�$ �! �����&�� � ����!������ ��� %��1����& '#3��� ����� �1����? 2'"�?8 ��� '"�4B �$ / �� ! ������� &�������� % �91� %!������ !��� �!��! �� ��!%�!� � ��1% �!���%����� �������! 1!��� ������� 1 �� !������� ��� ,�$�����$�

��/C:'�" �3� �C/���

������ ��� ,������ /������� 1�������� ������ % �91� %!���!�!%������! 244 �� �! ��� � &��� �!8� ��� ����� 75D=7 $ ��� 4ED6BE !������ ������� ��� !�1����� /�� ���� ��1% ��!�!��� & 47 %������! ������� ��,������$ !��� ��!��!�! 2&1� ����� % ��1!� ����� %��$���!�! �!����� ����� '��� �� ���������! ���%���&���!� ��� ����� ��!%���.����������!8< 4B �� �! ��� � &��� �!� ��� ����� 76D=7 $�

#��$ �� � ����! & ��%�����-�� � � ��� � !���� ��%!$� � � ; ��%1��� ��%!��!� & �!��� !��� ��� ����� &�� ���� %!���!�! � ����

BB77�7B7F>BB>G46�BB H �%$����� � 7BBB �$ /�� ����$ &� '���!�������� ������ �$� '���

390

���1!���%� �������� ������ 46� 4555< ����!�� 3������ 77� 4555<����%��� &� %1� ������ �������� 4;� 4555�

:�%���� ��91�!�! �I ��� �� � ������ ������ �$ :�!������ '�%���� � ��� �� & �������� �� �� ���$(!� 3�& � � ���� ����������"��� �7 4�0� )�*� C��� I �������J������1�

�����������I /�"� / �� ���!�

%������� ��!%������ $� 2'� �! ���%%�%����� � ���� !���� ��%!��! &����!��!� ���� ! ����1!� & ��� ��%� �$ & ��� �!��!�8

/��! !�1�$ �! �%%���� �$ � ���$(! "�� :�!����� C����! ��������2*��!������ ��� !�� ��� ��!����!��� ��� �� �1�����$8� ������� ��!����! ������� %��� � � ����� & !��% �!�

������� ��� ����,���� /�� !���%����� %��%������ 2 ���%��8 �! ���+�1�� & &1� ������� �� ��� !������� ��1% � !���%����� ������! ���! &�� %������! ��� %!���!�! 2����� �� ��� 455;8� ��� & ��� �! ���!�! !���$%�� �! �?� /?� ��� � �! �47� /47< �� �! �� %!!�� � � �$%���� &1��� !�� ���� $�

��� �� ��������! ��?��$�C 2"�1;�8� ��A��$�C 2"�17�8� �����;�#'/� 2"�1?8 ��� ������� &�� ����� ������!� 2�+&��� )�*�8������'#3��D#'/�� �����'"�?��C� �����'"�4B��C ��� �!�$%����������������� ���� ! ��� ������� &�� ���������� 2�+&��� )�*�8�

��������� �� ���� �: ���� ��%!��! &�� %!������ �!��! �����!!����� ��� !�� %����! ��� ����!��� �� B�6E ��$%!�� �� %�!%������1&&���� !� ��� 2�� 8 ��������� B�4E ���$ ���������� ����������� ���� &�?6 ��� �� ;=��� /�� �%������ �� ! ��� !���%�� && ��� 1!�� &� ����!�1���!< ��� ��������� ����� &�������! ��� �!��� ���� �� ����1�2:��' 4K?B % 1! ���������!8�

/�� ��!��!� ���� !��� %1��� ��%!��! ��� ������� &��� & &�����%%�� ��� !�� &�������!� ��� ����!��� ����,$ ��� 4 �� � �����!�%�� � 2 ������ ������ � �� )�*�8 &� ;B ��� �� ;=��� ��� ���� �!������� �� ����1�� �����1! !�1���! ���� !�� ���� !��� /�" �������&�� � � !��� %1��� ��%!��! ��!�!� %��������� $ & ����� / �� ! �!��������� �$ ��� %���� ���� & ��?@ ��� ��A@ / �� ! 2����� �� ��� 455;8�

� /�" ��� �!��� �!��� �$ �1 �1���� ��� !��� &�������! �� ����1�!1%% ������� ��� 4BE �@ !��1� ��� 7 �� � 1������ 2!1%% �����������1�8 ��������� 4�� ���%�� %�� � &� ; �� ������ 7B ) '"�7 %�� � 2"$�%��1 ��/< ����!�� ��1 � )�*�8� ��� ���� �1 �1���� &� � &1�����44D46 �� ��������%��!������ �� ! ��� �� ����� �� ���! !���� �! ����� ��������� �� ! ������� 1� & ��� !��� ��� ��� / �� ! ��� &�� � 1!���!�/�� /�" ��� &1����� �+%����� �$ �1 �1�� ��� � ��+�1�� & 4� 4BK ;B�0$������������ �1� �1! %���%���� � � ���1� ��� �� !� 4�� ���%�� %�� � � ��� 7B ) '"�7 %�� � �

������ ���"������� �&��� 4BD4? � �1 �1��� 4� 4BK !��� /�" % 1!�91� �1����! & ����������� �1� �1! %���%���� � � ���1� ��� �� !��� ���1����� �� 4 � & !1%% ������� ����1� ��� � ���1� ���%���� � ?A � % ��� &� ; �< 7�� ����!��� � ����!%�� �������� 2 ������ �����8 �! ������ ��� ���! �! �1 �1��� &� � &1����� 4K �� /�� �� ! ��������!��� ��� �!��� �� �� ��������� B�7E ����� !��1� � �1���2� �8 2 ������ �����8 ��� !������ ��������� $�

������8������������ �""���+������� �������� �����!��� �� !��� !������ � ��� ��� �������?��$�C � �������A��$�C � �� �!�$%��������� ���� ������$ &� ;B ���� �� ! ��� �!��� ��� �� ���.+�� ��� ?E &��� ���$�� �� �$%������ �� &� 7B ��� �� �����%����1�� ��� �!��� �� �� �B�7E � � 2 ������ �����8� '������ 1 ��!������� �! ������� 1� �� �� ���%����1�� ��� �����'#3��D#'/� % 1!�����'"�4B��C � �����'"�?��C �� 1��� �� �� �B�7E� ��B�4E !�%���2 ������ �����8� �&��� %����������� ��� �� �� ��!�%��� &� 4B ������ ! ��� ���� �!��� ���� ��� �� �� ��!�%��� ! 1��� ��� ����� �.�� �!� �� �� �� � � � !� 1% ��� �� !�

����������� ��� �������� �� +� ����"���� ���� /�����%����������� $!�! �! %��&���� � �� C�'� F" , �$������ 1!��� #'/�� �C���� �$�C� #� ���� ��� $!�! 7B�BBB �����! ��� ��91����� ����� � ��;�+%��!!�� � ��� 1�� $�%��$��!� '!�$%��������� �������� ���� !��� 1!�� � ����&$ ��� !������� !%���.���$ & ��� ��������! ��� ���������� ��� LL��������(( ��� LL%!�����(( %%1 ����!� '�!����.������1��! & �$�����! 2'#3��� '"�?� � '"�4B8 ��� �������� �� ������������� %���%���� � � ���1� ��� �� %%1 ����! ��� � ���1�������� !���1 ���� �� ��� ��!���� & !��� / �� !� "�!� ��� . �! 2���� . ���� &���� !������� !��� !������� ��� ����� ,1��!���� %��������!8 ������ $-�� 1!��� ��� CF�� !&���� %�������

����������� �������� �� ���� /�� ���� ��� ��� $-�� 1!��� ������ ����� �+� ���� !1�� 1�%����� � ��!� ��� �� �� ��������� � �7 ��!�! ���0��%���� '�!��� ��%1��� !&�����

:C )"/

;������ ��� ������� �� ���� �: /�� & 4; 2==E8%!������ /�" ��� !1���!!&1 $ ��� ��� %��������� $ ��?@�������� &�� K?E � A6E ��� 4BED;4E ��A@ / �� !� '�

�����!�� � $ .�� & 47 2?7E8 /�" ��� ��� &�� �!��� !���& ���%!������ ��,������$ !��� ��!��!�!� /��!� .�� ���� /�" 2����� ����� % ��1!� �� %��$���!�! �!��� �� ��!%���.����������!8 ��!�!��� & ;;ED=4E ��?@ / �� ! ��� 4?ED;5E��A@ / �� !� �& ��� ��������� !���� ���� /�"� &1� ���� �������� ��� �� ��!1&.����� �1����! � ��!��

���� ���� ������ �;<�� �� ������ �� ������ ������������ �� ������!� �� ��� %��������� & ��?@>'#3��@ /�� ! �! %��!��� �� ����� & ��� 4B %!������ /�" �� ��!%�!� � ���%�� ��%���� ��� ����1� � ��< ���!� ������!�! ��������� � ��� ������ &�� B�AE � ;6E 2;��� &� *8� /��! ��&&�������! !����!���� $ !����.���� &� ��� ��1% �! � � � 2% M B�B78�

'� �����!�� �� ��� ��!��!� ���� ��1% ������ ������!�! �� �����?@>'#3��@ / �� ! ��� �!����� �� � $ � & ��� .�� /�"2;�� *8� /��! ��&&������ �� '#3�� ��!%�!� �$ %!������ ���������� /�" �! !����!���� $ !����.���� 2% M B�B68�

'� !�1 � �� ���� ����� �� �����!� � %����1! !�1���! 1!����������$��� 2��$��� �� ��� 45A=8� ����� �! � ������1 ���� & ��?@ �+%��!!�� �$ / $�%��$��! �! � ��!1 � &!���1 ���� ��� !���%����� �������!�

�� ������!� �� ��� %��������� & ��A@>'#3��@ / �� ! �! � !�������� �� .�� /�" ������� &�� %!������ %������! �� ��!%�!� � ���%�� ��%���� � ����1� � �� 2;�� *8� /��! ������!� �!������ &� ����� /�"� ������ ��� �! �� !����.���� $��&&����� &� ��� ��1% �! � � �� 3������� �!!� &� %������ A� ���%��������� & ��A@>'#3��@ ! ���� $ �+������ ���� & ��� ��?@>'#3��@ / �� ! �� ��!%�!� � !���1 ���� �$ !���%����� �������!���A@>'#3��@ / �� ! ��� �� ������!�� �� ��!%�!� � ���%�������� ����1� �� ��� ���� /�" 2;�� *8�

:��� �� �:�� ��� �:�&' ���������� �� ������ �������� #��� & ��� %!������ /�" ��� &1� � .�� ���� /�" ��� !1�&��� !������ &� ������ ��? � ��A ��� ���� �1� �!������ &� ������� 1 �� '#3�� ��� '"�? � '"�4B�

/�� %��������� & ��?@>'"�?@ ��� ��A@>'"�?@ / �� ! �!������� $ ������ �� ����� %!������ /�" �� ��!%�!� � ���%����%���� � ����1� 2;�� )8� '� �����!�� ��� ������1�� �1����& ��?@>'"�?@ / �� ! ������!�� �� ��� %��!���� & ���%�� �� �& ��� /�" 26 ��� 4B8 2;�� )8� #� ��� ��1% �! � � �� ����� ���!����.���� $ &��� ��?@>'"�?@ ���� ��?@>'#3��@ / �� ! %��!����� ��� ���%���!���1 ���� %!������ /�" 2% M B�B68�

'� ��� ��!��!� ���� ��1%� � $ �� & ��� .�� /�" !���%��1���� & '"�? �� ��!%�!� � !���%����� �������!�

/�� %��������� & ��� ��?@>'"�4B@ ��� ��A@>'"�4B@ / �� !�!� �� �!� ��!�!� ! ���� $ ������!�� �� ��� %!������ ��� ��!��!�/�" �� ��!%�!� � ���%�� ��%���� � ����1� 2;�� �8� /��!���&&������! ��� �� !����.���� &� ������ ��� %!������ � ��� ��!��!����� ��1%!� /�� ���%������1��� ��?@>'"�4B@ / �� �1����! �� ��� %!������ /�" ��� !����.���� $ �!! ���� ��!�& ��?@>'#3��@ / �� ! 2% M B�B68�

3 '#3��@>'"�?@ / �� ! �� '#3��@>'"�4B@ / �� ! ����������� �� ��!%�!� � ���%�� �� ������ %!������ � ��!��!� ���� /�"�

�' �) '�3

/��! !�1�$ ��! ����!������ ���� ��� ��N���$ & %!������ !��� �!��! ������ � !1�%%1 ���� & ��?@ / �� ! ���� %��1��'#3�� �� ��!%�!� � !���1 ���� �$ ��1% � !���%����� �������!�1� ��� ��!��� &�� ��%!������ ��,������$ !��� �!��!�

� ������ $ ��!������ ������91� �� ���� ������� 1 �� !������� &�$�����! �! �������� �$ , �$�����$ 2�%��!�� �� ��� 4556<������ �� ��� 45568 �! 1!�� � !�1�$ �$����� %��1���� �$%!������ !��� / �� ! �� ��!%�!� � ��1% � !���%����� �������!��!������ ��?@ / �� !� �1� �� ��A@ / �� !� ��!%���� �$%��1���� & '#3��� �� ���� %����1! $ ��%���� ���� ��1% �!���%����� ��������� ��?@ / �� � ��! �! ���� &�� �1����� �!��! %��1�� ���� ��� ! & '#3�� �� ��!%�!� � �� � ����>�������; ������$ 2����� �� ��� 455;8� ����� !�1���! 1!��� /

��"� 44?� 3�� ; ��:�� 7BBB /:C����'3�)�C� '#3�� �:��)�/'�3 '3 � �:'� ' 399

�� � ��! �! ���� &�� ������ % �91� %!������ �!��! ���� � !����!������ '#3��� %��1���� �� ��!%�!� � ��� ��� ���$���2 �� ��� �� ��� 455?< � ��� �� ��� 455?8�

'#3�� % �$! � ������ � � �� ��� ���1�%�������!�! &%!���!�!� '�! ����1! �&&���! ��� 1�� ���1���� & C�!� ����� ������� �� �� ! 2"��1������ �� ��� 455B8 ��� '����4 ���������$��! 20��&.��! �� ��� 45A58� ���� � ! �"�@ / �� ! ������ ��� !��� ��� �������� ��� �%���� �� �� ! 20��&.��! �� ��� 45A58�

#1�������� ��������$��! �� %!���!�! ��� �!! !��!����� � �����������$ �&&���! & '#3�� � %� �&������� ���� ��$ ������1��� ��� �%������ �$%��%� �&������ ���� ����������-�! ���! ��!��!�2����� �� ��� 45AA8�

)� ��� '#3��� '"�? �! %��1��� �$ � $ !�� �1����! &��?@ ���>� ��A@ / �� ! �� ����� %!������ 2��� �� ���� 8/�" �� ��!%�!� � !���%����� �������!� /��! /�4 �$�����%������ & ���� '#3��� '"�? %��1���� �! ��!�!���� ��� ���

;���� *# ������ ������ �;<�� ����������,� ���� ���� �� ���������� ,�� ��� ������������� ���� �:# ��� /�" ��� !������ �!��!������ �� ��� ��%��� � ;�� &� /�� ��&&�������� ��� %��������� & ��?@ ��� ��A@ '#3���%��1���� / �� ! �&��� �1 �1�� ���� ��%���� ��1 �1�� ���1�� !���%����� �������! �! !��&� ���� %������ 24D4B %!���!�!� ��C ��!��!����� !8�

;���� &# ������������� �;<�� ����������,� ���� ���� ���� �� ���������# � %!������!��� /�" �! !������ &� !1�&��� ��? � ��A��� ������� 1 �� '#3�� �+%��!!��� ��� ��� $-���$ , �$�����$� /�� /�" �! �1 �1��� ��� ���%�� 2� 8� � �� ��� ��!���� & ���%�� 2���8� ���%�� ���1��� '#3�� %��1���� �$ ��?@��1� �� ��A@� / �� ! 2 ��%���� ��� 8�/��!� �� � �! ��� ��%��!�������� & ��� ��!1 �!������� &� ����� 1� & 4B %!������ !��� /�"�

39. �:��3 �� � /�C ��):3�" �# '3�C /'0�/'�C �C:��/�"�0O

.�����! & %����1! !�1���! 1!��� % $����!� ����� ������� �����-$��� ����� ���1�!����� �!!�$ � ���!1�� �$����� �:3��� %!������ !��� �!��! ��� �$����� %��1���� �$ !��� / �� � ��!� ��!%������ $ 2)$��1�� �� ��� 455;< �� ��� �� ��� 455?8�'� �������� ��� %!������ /�" ��� �� %��1�� '"�4B ����!%�!� � !���%����� �������!< � ��� & '"�4B �+%��!!�� ��%!������ �!��!� ��� ��� �+��%��� & � !�� %%1 ���� &����� ����%����!� ��! ���� ��%���� %����1! $ 23��� && �� ���455?8�

/�" ��� �!! &��91��� $ �! ���� �$ !���1 ���� ��� ��1% �!���%����� �������! &�� !��� �!��! & ��%!������ ��,�������$ ������!�! 2?7E8 ���� &�� ��!� & %!���!�! 2==E8� /��!!1%%��! ��� .�����! & �� ��� ��� !�1�$ 2����� �� ��� 45558 ���!1���!�! ���� !���%����� ���������������� / �� ! ��� %��!��� �����!�!���� $ ���>� %����%! �� ������ �1����! �� %!������ !��� �!��! ���� �� ��!� & ���%!������ ������!�!�

#1��������� ���! !�1�$ ��! ����!������ � ��&&������ ���$����� ��!%�!� � !���%����� �������! �$ %!������ ��������%!������ !��� / �� !� /�1! %!������ !��� /�" ������ �!1�%%1 ���� & ��?@ / �� ! ���� %��1�� '#3�� �� ��!%�!� �!���%����� �������! ���� �! ��!��� &�� !��� /�" �! ���� &������ ��,������$ !��� ��!��!�! !1�� �! ����� % ��1! ��� %��$���!�!�!��� /��! ��$ !1���!� ���� %!������ ��� ���%!������ !��� / �� !��� ������-� ��� !��� !���%����� �%��%�2!8 �1� ��&&�� �� ������$����� ��!%�!�� � � ��������� $ ���� ����� �! � / �� � �� �� ��! %��!��� �� %!������ !��� �!��! ���� ��!%�� �$ '#3��%��1���� � � !%���.� �%��%�2!8 %��!����� �$ � %!���!�!��!!������ �"� � � �� ���%�� ������! ���$ ��&&����� %�����!<

&1����� ����!�������! � �� ��91���� � ��������� ��� �������2!8��� ����

'� ��� 1!��� ���! !�1�$ ��! !�� ���� � !1�%%1 ���� &��?@ / �� ! &�� !��� �!��! & ������ % �91� %!���!�! %��1��!'#3�� �� ��!%�!� � !���%����� �������!� /��! �! &1������������� ���� !���%����� �������! % �$ � � � �� ��� ���1��%�������!�! & !��� �!��! �� %!���!�!�

��� ������� ����� ���� �� ����������� ��� ������ ���� ���������� ��� ��� ����

��� ��� ������ �� ��� � �� ���� ��� ��������� �� �� ! ���"������� ! ���� ��""�����

���� ���� �

:C#C:C3�C

����� � � � �! ��� �� �����!!� �� #�$ "I �� � ����� ��!%�!� �$ %!��������������$��! � ����� �����&���� ����� # $%%���� 7AI=;6D=?B� 45AA

����� � � � �! ��� �� ���� �*� "��! �� �� �����!!� �� #�$ "I � ����� �� ��������� ���1���$ � ��1% � ���� $��� !���%����� �������! �� ������% �91� %!���!�!� � # ���%���� 476I;AD?7� 4554

����� � � ���� � � �! �� 0����� ��� "��! �� �� �����!!� �� #�$ "I 0�1% �!���%����� ��������!%���.� / $�%��$��! �� �1����� %!������ �!��!� � #���%���� 47AI?5;D?55� 455;

����� � � ��� ��� ����� �� ������� �� 0����� ��� � �! ��� #�$ "I / $�%��$��! �������� &� ��1% � !���%����� �������! �� ������ % �91�%!������ �!��!� ��� ���%���� &�� 754I6K?D6KK� 4555

0��&.��! �C� �����! ��� 3��� && ��I ����������-���� & ������� 1 �� ����!��� ��1 ��4 ��� �"���: �+%��!!�� �� ���� ��� ��,���� !���I ��1 �����$ ���������� ����� �����&��� ��� �1�� ����!�! &����� # % ������%���� 7BIK4=DK75� 45A5

;���� )# =���"�� ������ �� �:��� ���� �������� �� ������ �� ��������� ��� ������������ ���� �:# ��� /�" ��� !������ &�!1�&��� ��? � ��A ��� ������� 1 �� '"�? �+�%��!!�� ��� ��� ��� $-�� �$ , �$�����$�/�� ��&&������ �� ��� %��������� & ��?@ �����A@ '"�?�%��1���� / �� ! �&��� �1 �1�� ������%���� � �1 �1�� ���1�� !���%����� ��������! �! !�� &� %!������ %������! 6� K� =� A� ���4B ��� ��!��!� ���� %������! ��C� 2/��!� /�"����!%�� � ��!� ��� ��� !��� �1���� ��;�� *#8

;���� �# =���"�� ����� �� �:�&'� ������ ������ �� ������ �� ��������� ��� ������ ������� ���� �:# ��� /�" ��� !������&� !1�&��� ��? � ��A ��� ������� 1 �� '"�4B�+%��!!�� ��� ��� ��� $-�� �$ , �$�����$�/�� ��&&������ �� ��� %��������� & ��?@ �����A@ '"�4B�%��1���� / �� ! �&��� �1 �1�� ������%���� � �1 �1�� ���1�� !���%����� ��������! �! !�� &� %!������ %������! 4� 7� ;� ?� ���4B ��� ��!��!� ���� %������! ���� 2/��!� /�"����!%�� � ��!� ��� ��� !��� �1���� ��;�� *#8

��"� 44?� 3�� ; ��:�� 7BBB /:C����'3�)�C� '#3�� �:��)�/'�3 '3 � �:'� ' 395

0�!! �"� ������1!�� )� ���� 0� ��!�%�� C� ����!�%���! C� �� ��� �I"$�%��$�� ��������� �$ !���%����� �������! �� %!���!�!� � # ���%����5=I675D6;K� 45==

"��1������ �#� �� �!�1�� C�� ��1����� /�� �11���� ��I '#3���������1 ���! ��� �+%��!!�� & ��� ����!�� � ��1 � C"���4 ��� '"�K%��1���� �$ �1��� ������ �� �� ! �� ������ # $%%���� 4?6I744BD744?�455B

3��� && ��� #����!� ��� *1��� "� ������� :�� /1��� "�I *�������$������� �1����4B �+%��!!�� �! 1%���1 ���� �� ��%��!���%%�� !���� %�!� ��$���������!� ��� �-��$ !$������ �1� �� �� %!������ % �91�!� ���� $%%����$%%���"����� =;IK;DKA� 455?

3�� !�� ��� ��1� 3� 0����� �� �� ��I ��%�$ ���� ������+���� ������ $!���1 ���! !���� ����!�1���� ��� �����&��������� %��1���� �� %!������ /��� ���!� ������ ������� 67I6;BD6;A� 455A

3�� �������!�� �I '�&�����! ��� %!���!�!� ��� ���%���� '������� (������);7I465D4K=� 4567

3�� ��� :I ����.����� & ��&�����! & %!���!�!� ��� &���% ����� 4I4;6D4??�4566

�%��!�� �� �1�%�$ CC� �!��� 3�� ���� �� ����! *� �1�%�$ *� �(0���� �I�����������$ & ������� 1 �� �$����� !$����!�! �� ��� !��� ���� ��� ��

% ���!�� / �� %�� 4 ��� / �� %�� 7 %%1 ����!� # �*" +�� 4A7I4;6=D4;K=�4556

������ "�� ���� �*� P�����!�� P� /���� �:� �� ��% "I ������ ����!������ &�$����� !$����!�! �����������$ ���� �1��� ����$ > �&&���� / �� ! �$, �$�����$� ���� AKI4?BAD4?54� 4556

�� ��� �#� �1! �1 �� ���1� �� �� ��I / �� ! ��� ��� �� %!���!�! �1 ����! �� ��!� ��� /�4 !1�!��� # $����� ���%���� 4B7I4?6D4?5� 455?

-�� *� ���������� �� O!���� O� ������!�� P� �%�� *�I '�����.�������� 91��������� & �����&��������� %��1���� / �� ! �! %!������ �!��!< �� �!���� � ��� ��?@ ��� ��A@ !1�!��!� # $����� ���%���� 444I4B=7D4B=A�455A

)$��1�� *� O����1�� �� #����!� �#� �� �� :"� 3��� && ��I /�� �$���������� �� �!��� ��� �!���&��� %!������ !��� �! ����������-�� �$ � /��� %���$%� 4 �� ��������� ��!%�!�� # $����� ���%���� 4B4I=B4D=B6� 455;

� ��� � ���!!�� �� /��� �� �� ������ �� ����- ��I / $�%��$��! �������&�� !��� �!��! & %������! ��� %!��!�! �1 ����! �+%��!! � ��� �$�����%������ ���� �! ��!����� &�� ���� & / �� %�� �$%� 4 ��� / �� %�� �$%� 7 �� !���� # $%%���� 7?I7;==D7;A7� 455?

��$��� ��� 0��-$ �� #������ �0I ��1 ���� & ��? �$ ��������� ����������# $%%���� 4;AI4;64D4;6?� 45A=

3.' �:��3 �� � /�C ��):3�" �# '3�C /'0�/'�C �C:��/�"�0O