Protein ubiquitinationProtein ubiquitination

Passmore, and Bardford, Biochem J, 2004

Pickart, Cell, 2004

Brzovic and Klevit, Cell Cycle, 2006

Hochstrasser, Cell, 2006

Protein ubiquitination: regulatory process influencing several aspect of eukaryoyic cell biology

Polyubiquitin (polyUb) chain: link ε-amino group of a Lys of one Ub to the C-terminal carboxyl group of the next Ub in the chain

E1-E2-E3 responsible for activating and transferring Ub to proteins

Fundamental mechanisms of Ub-chain assembly and of E1-E2-E3 regulation still not clearly understood

Ubiquitin like proteins (Ubls) 8-20 kDa

Ub 76 aa

Globular domain (4βstrands in a antiparallel βsheet +αhelix) + flexible C-terminal terminating with a gly

7 Conserved lysine residues in Ub

N.B. ISG15: ha due domini Ubl

Di-Ubiquitina

Ogni Ubl ha il suo set di E1-E2-E3

E2: Ub-conjugating enzymesE2: Ub-conjugating enzymes

Michelle et al., J Mol Evol, (2009)

Ye and Rape, Nat Rev Mol Cel Biol (2009)

Identification of phosphorylations by Cdks and CK2 kinases affecting E2 activity

Cys forms a thiolester bond to C-terminal Gly of Ub

Asn stabilizes oxyanion transition state

E1E1

E3/E3/E3E3

Multi-domain E2 classification in 17 familes reflecting structural organization of cat. dom.

B_LEU8A_ILE44

B_ILE44

B_VAL70

A_VAL70

A_LEU8

B_Cterm

Legame isopeptidico

polyUb crossilinkata by K48 sono segnale universale per la degradazione da proteasomaAdottano una CONFORMAZIONE CHIUSA in cui L8, I44 and V70 (patch idrofobico sulla superficie di una singola molecola di Ub) sono sequestrati all’interfaccia tra due molecole di Ub adiacenti

K48-linked polyUb

Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K48 via NMR o X-ray e una struttura X-ray della tetra-polyUb crosslinkata via K48

Tetra-Ubiquitina crosslinkata K48

Strutture cmq dinamiche in soluzione – alcuni di questi residui potrebbero diventare accessibili per diretta interazione con fattori di riconoscimento

For example, does linkagespecificrecognition arise from differential display of theevents, ubiquitin (Ub) is engaged as a signaling molehydrophobicsurfaces or from the presence of novelcule in the form of different polyubiquitin (polyUb)linkage-specific surfaces?chains. PolyUb chains are formed by making isopep- hHR23a (human homolog of yeast Rad23a

K63-linked polyUb polyUb crosslinkata via K63 agisce come segnale regolatorio piuttosto che degradativo in molti pathway,

Adotta conformazione estesa in soluzione senza contatti diretti tra patch idrofobici

Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K63 via NMR o X-ray e una struttura X-ray della tetra-polyUb crosslinkata via K63

G76K63

K48

Hydrophobic patch

Monomeric Ub

Come conseguenza a queste differente in conformazione, il segnale di riconoscimento presentato dalle due tipologie di catene è molto diverso .

Differenti modalità di interazione con gli UBA-2 domain (di hHR23a).

UBA-domain sono domini di legame per Ub – L’UBA domain di hHR23a è coinvolto nella modulazione dell’interazione tra catene di poliUb e proteasoma (alta affinità per catene poliUb linkate via K48)

IL RICONOSCIMENTO SPECIFICO DI UNA DELLE DUE CATENE HA ORIGINE DA UN DIVERSO MODO DI ESPRRE LE SUPERFICI IDROFOBICHE O DALLA PRESENZA DI NUOVI PATCH DI INTERAZIONE SULLA SUP. DELLE DUE CATENE?

Varadan R et al. 2005, Mol Cell, 18, 687-698

Non-canonical PoliUb chains

K48

K63

G76

Hydrophobic patch

K33

K29K11

K6K27

Nessuna di esse isolata finora in studi in vitro

\

Lo studio delle catene non canoniche importante per:-Chiarire i meccanismi molecolari con cui avviene riconoscimento di specifiche catene di poliUb - Capire se solo le catene linkate da K48 o anche altre permettono una struttura globulare stabilizzata da interazioni non covalenti tra molecole di Ub adiacenti- La conformazione estesa di catene linkate via K63 come hp da Varadan et al. è dovuta a vincoli sterici che prevengono diretto contatto tra i patch idrofobici di due unità di Ub