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PESQUISA/RESEARCH

Preparo e caracterização de nanopartículas de poli(ε-caprolactona) contendo megazol, agente anti-chagásico

Preparation and characterization of poli(ε-caprolactone) nanoparticles containing megazol, antichagasic agent

Recebido em 25/04/2012

Aceito em 10/05/2012

Marta Lopes Lima1 & Cristina Northfleet de Albuquerque2* 1Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia, Universidade de São Paulo 2Universidade de São Paulo (USP), Laboratório de Síntese e Otimização de Fármacos, Departamento de Tecnologia de Bioquímico-Farmacêutica, Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP RESUMO

O megazol (1-metil-2-(5-amino-1,3,4-tiadiazolil)-5-nitroimidazol) tem sido descrito na literatura como um composto efetivo contra Trypanossoma cruzi, agente causador da Doença de Chagas. Contudo, este composto mostrou efeitos mutagênicos e baixa solubilidade em sistemas aquosos. O objetivo desta pesquisa foi obter nanopartículas contendo megazol pelo método de nanoprecipitação e caracterização destas por meio do tamanho, morfologia e eficiência de encapsulação a fim de obter uma formulação modificada desta molécula visando à diminuição da dose e toxicidade. O tamanho das partículas obtidas foi de 280±1,34 nm e polidispersão de 0,13±0,003 nm. A análise de microscopia eletrônica (MEV) revelou nanopartículas de superfície lisa e esférica. Uma eficiência de encapsulação de 24% foi alcançada para as nanopartículas contendo megazol. Os resultados deste estudo confirmaram a viabilidade da formulação de nanopartículas carregadas com megazol (MZ).

Palavras-chave: Nanoprecipitação, Espectrofotometria Derivada, Microscopia Eletrônica de Varredura, Doença de Chagas

ABSTRACT

The megazol (1-metil-2-(5-amino-1,3,4-tiadiazolil)-5-nitroimidazol) has been described as a effective compound against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas Disease. Nevertheless this compound has showed mutagenic effect and lower solubility in aqueous systems. The aim this research was prepare poli(ε-caprolactone) nanoparticles containing megazol by nanoprecipitation method to obtain a modified formulation this molecule in order to decrease dosage and toxicity. The particle size was 280±1,34 nm and polydispersity was 0,13±0,003 nm. Scanning electron microscopy (SEM) analysis showed nanostructures spherical in shape with a smooth surface. Approximately 24% drug-encapsulation efficiency was achieved. These results indicated the feasibility of formulation megazol-loaded nanoparticles.

Keywords: Nanopreciptation, Derivative Spectrophometry, Scanning Electron Microscopy, Chagas Disease

INTRODUÇÃO A doença de Chagas, uma das mais importantes infecções parasitárias da America Latina, afeta cerca de 10 milhões de pessoas. Tipicamente endêmica em 21 países, desde o México até a Argentina, atualmente tem sido detectada em países não endêmicos como Austrália, Japão, Estados Unidos, Canadá e países da Europa em decorrência da mobilidade e migração populacional.

Causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi, a infecção ocorre principalmente pelo vetor Triatoma infestans, transfusão sanguínea, transmissão oral através de alimentos contaminados e transplante de órgãos. Acima de 30% dos pacientes irão desenvolver dano no coração e acima de 10% dano no esôfago, colón ou sistema nervoso autonômico (WHO, 2010).

* Contato: Cristina Northfleet de Albuquerque, Departamento de Tecnologia de Bioquímico-Farmacêutica, Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, Avenida Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 16, Cidade Universitária, CEP 05588-900, São Paulo, SP, Brasil, E-mail: northfle@usp.br

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Em 2006, a Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS) e a Organização Mundial de Saúde (OMS) certificaram a erradicação da transmissão da Doença de Chagas pelo inseto vetor e via transfusional no Brasil2. Contudo, uma perda mínima estimada em US$ 5,6 milhões devido ao absentismo dos trabalhadores afetados pela doença é computada anualmente (Who, 2010). Apesar do grande número de pacientes infectados, somente dois fármacos são clinicamente prescritos, nirfutimox, 4-[(5-nitrofurfurilidena)-amino-3-metiltiomorfolina-1,1-dioxido], e benznidazol, N-benzil-2-nitro-1-imidazol acetamida. Entretanto ambos apresentam sérios efeitos tóxicos e mutagenicidade (Castro et al., 2006) O megazol [1-metil-2-(5-amino-1,3,4-thiadiazol)-5-nitroimidazol] (MZ), sintetizado em 1968 pela American Cianamid, é um derivado nitroheterocíclico com atividade antibactericida (Albuquerque, 1995) e antiparasitária, principalmente contra tripanossomas (Lages-Silva et al., 1990; Maya et al., 2003; Bouteille et al., 1995; 1999; Enanga et al., 1998; 2000). Embora apresente maior atividade tripanocida do que o nifurtimox e benznidazol (Lages-Silva et al., 1990), eficiência em todos os estágios das Tripanossomíases mesmo em dose única (Bouteille et al., 1995; Enanga et al., 2000), o desenvolvimento do MZ foi descontinuado devido ao seu potencial mutagênico (Ferreira & Ferreira, 1986). O caráter lipofílico do MZ, o qual é praticamente insolúvel em água, torna difícil sua formulação e biodistribuição, mas por outro lado, esta propriedade é uma característica inerente da molécula que confere propriedades biológicas extremamente importantes tais como difusão passiva através de membranas plasmáticas

(Barrett et al., 2000) e barreira hematoencefálica (Enanga et al., 2000), propriedades estas extremamente importantes no alcance de alvos intracelulares e sistema nervoso central para o tratamento de tripanossomíases. Assim, o grande potencial de ação do MZ principalmente contra T. cruzi e a necessidade de novos fármacos contra a doença de Chagas justificam a continuação dos estudos desta molécula. Recentemente, sistemas de transporte de fármacos nanoparticulados têm ganhado aplicação no campo farmacêutico, uma vez que estas formulações podem ter solubilidade, biodistribuição, farmacocinética e propriedades toxicológicas melhoradas quando comparado a pequenas moléculas farmacológicas isoladas (Mohanraj & Chen, 2006). Dentre estes, sistemas coloidais poliméricos têm recebido considerável atenção particularmente àqueles preparados com polímeros que não apresentam atividade biológica e são facilmente degradados in vivo. Poli(ε-caprolactona) (PCL), um poliéster biodegradável e biocompatível, tem sido usado extensivamente para o desenvolvimento de sistemas de transporte de fármacos nanoparticulados (Sinha et al., 2004). Finalmente, apesar do índice terapêutico promissor, a atividade biológica do MZ é limitada devido a pobre biodisponibilidade e toxicidade. A fim de aumentar a atividade tripanocida em menor dose e reduzir a toxicidade, o objetivo deste trabalho foi preparar e caracterizar PCL nanopartículas contendo MZ para veri-

ficar a viabilidade desta formulação. MATERIAL E MÉTODOS Químicos O MZ foi sintetizado no Laboratório de Síntese e Otimização de Fármacos do Departamento de Tecnologia de Bioquímica-Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP pela Drª. Cristina Northfleet de Albuquerque. PCL (MW = 60,000) foi obtido da Sigma-Aldrich (Estrasburgo, França), triésteres de glicerol dos ácidos cáprico e caprílico, Miglyol 810® foi obtido da Brasquim (Porto Alegre, Brasil), o monoestearato de sorbitan, Span 60® e o polisorbato 80, Tween 80® foram obtidos da Delaware (Porto Alegre, Brazil). Acetona, dimetilsulfóxido (DMSO) e acetonitrila (ACN) apresentaram grau analítico e cromatográfico, respectivamente. Preparação das suspensões Para a obtenção das nanopartículas contendo MZ foi utilizado o método de nanoprecipitação descrito por Fessi et al. (1989). A solução orgânica, PCL (0,318 g), Mygliol® (1,003 mL), e Span 60® (0,237 g) foram dissolvidos em acetona (81 mL) sob agitação magnética (400 rpm) a 40°C. Em um frasco separado, a solução aquosa consistiu de Tween 80® (0,225 g) adicionado em 159 ml de água. A solução orgânica foi vertida na solução aquosa sob agitação magnética a temperatura ambiente. Após 10 minutos, a acetona foi eliminada e fase aquosa concentrada sob pressão reduzida utilizando-se evaporador rotatório a 40°C (Rotavapor® R-3/Vacuum Pump V-700 BUCHI). O volume final foi ajustado para 30 mL. Desta maneira, suspensões de nanopartículas brancas, ou seja, sem a adição do MZ, foram obtidas na concentração de 10 µg.ml-1 de polímero PCL. As amostras contendo MZ (10 µg.ml-1) foram preparadas pela adição deste (3 mL) na fase orgânica antes da nanoprecipitação. Caracterização das suspensões Determinação do diâmetro médio e polidispersão das suspensões O diâmetro das partículas em suspensão e o índice de polidispersão foram determinados por espalhamento de luz dinâmica diluindo-se as amostras em água desmineralizada e observando-se a luz espalhada em ângulo de 90ºC. O tamanho das partículas foi determinado empregando equipamento Zetasizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, UK). As amostras foram realizadas em triplicata, após a preparação. Análise Morfológica Primeiramente, alíquotas (1 mL) de nanopartículas brancas e nanopartículas contendo MZ foram tratadas com glicose (concentração final 20%) conforme metodologia descrita por Saez et al.(2000) e posteriormente congeladas a -20 °C. As amostras congeladas foram liofilizadas (mediznischer apparatebau 336 osterode/harz - ehvisa – volkwagenwerk) por 48 h. As nanopartículas liofilizadas foram fixadas em stubs com fita dupla-face de carbono e

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cobertas com uma camada de 10 nm de platina usando sistema de metalização Bal-Tec MED-020. As amostras foram examinadas em microscópio eletrônico de varredura Quanta-600 (FEI, Eindhoven, Netherlands) utilizando voltagem de 5 kV. Procedimentos analíticos Espectrofotômetro de feixe duplo Hewlett Packard-HP®, model 8453 (UV-vis) foi usado para quantificação do MZ associado as nanopartículas por meio da espectrofotometria de derivadas no ultravioleta (UV), método ponto de anulação (Donato et al. 2010). Os espectros de absorção obtidos foram realizados em cubetas de quartzo 1 cm e intervalo de 300-500 nm. O espectro de primeira derivada foi obtido usando software com ∆λ5 nm. Preparação das amostras O solvente utilizado para o preparo das amostras de MZ foi PBS (pH 7,4) contendo 1% DMSO (v/v). A solução estoque (100 µg.ml-1) foi preparada pela dissolução de 1 mg de MZ neste solvente. A solução branca utilizada na calibração do espectrofotômetro correspondeu a uma mistura de ACN:1%DMSO/PBS (7:3). A solução de MZ a 10 µg.ml-1 (I) foi preparada pela diluição da solução estoque na solução branca. A solução (II) de nanopartículas brancas foi preparada pela adição de uma alíquota da suspensão de nanopartículas na solução branca. A solução III consistiu da mistura física da solução I e II. As soluções II e III foram centrifugadas (14.000 rpm, 30 min, temperatura ambiente) e o sobrenadante foi usado para as medições. Método de quantificação A metodologia analítica foi desenvolvida considerando especificidade, linearidade, precisão e a exatidão, limite de quantificação e detecção em conformidade com RE 899/2003 da ANVISA (BRASIL, 2003). A especificidade foi avaliada pela análise das soluções I, II e III. O espectro de ordem zero foi obtido no intervalo de 300-500 nm e a partir destes o espectro de primeira derivada foi obtido. A linearidade foi avaliada pela análise de regressão linear a qual foi calculada pelo método de quadrados mínimos. As medições foram feitas em triplicata. A curva analítica foi obtida no intervalo de concentração de 1 a 12 µg.ml-1. Para as análises de precisão e exatidão alíquotas de nanopartículas brancas foram adicionadas a quantidades conhecidas da solução estoque de MZ e diluídas com a solução branca para as concentrações analíticas (4, 6 e 8 µg.mL-1), centrifugadas (14.000 rpm, 30 min, temperatura ambiente) e os sobrenadantes utilizados para as medições. Coeficiente de variação (%) e exatidão (%) (BRASIL, 2003) foram calculados para expressão matemática do parâmetro precisão e exatidão inter e intra-dia. Limite de detecção e quantificação foram estimados pela inclinação e desvio padrão médio das concentrações empregadas na construção da curva analítica (BRASIL, 2003). Eficiência de encapsulação das nanopartículas A concentração total do MZ no sistema coloidal foi determinada pela dissolução das nanopartículas em ACN. A concentração de MZ livre, ou seja, não associado às

nanopartículas, foi determinada no ultrafiltrado obtido a partir de dispositivo ultrafiltração/centrifugação (Microcon® - 10.000 Mw, Millipore, USA). A quantidade de MZ associada às nanopartículas foi determinada pelo parâmetro eficiência de encapsulação (EE), calculado da seguinte maneira (Muthu & Singh, 2008):

EE�%� =Concentração de �MZ total − MZ livre�

concentração teórica de MZ x 100

As análises foram realizadas em triplicata. RESULTADOS E DISCUSSÃO As suspensões de nanopartículas revelaram distribuição de tamanho unimodal. A população foi bastante uniforme com diâmetro de 280 nm ± 1,34, polidispersão de 0,13 ± 0,003 e deste modo foram consistentes com as suspensões coloidais preparadas com polímero PCL e o método de nanoprecipitação (Muthu & Singh, 2008; Schaffazick et al. 2002; 2006; Raffin et al., 2003). De acordo com Zilli et al. (2005), três fatores são considerados essenciais na determinação do tamanho das nanopartículas, a concentração do polímero na fase orgânica, a polaridade dos solventes e a relação fase externa/interna. Cruz et al. (2006) a partir da mesma composição quali-quantitativa e concentração de polímero (10 mg.ml-1) do atual estudo obtiveram nanopartículas de PCL carregadas com indometacina a de tamanho médio 288 nm ± 13 e uma polidispersão menor do 0,12. A similaridade destes resultados pode ser explicada pelo caráter hidrofóbico de ambos os fármacos. Em contraste, para a encapsulação da risperidona, um fármaco antipisicótico altamente hidrofóbico, Muthu & Singh (2008) obtiveram uma suspensão de nanopartículas de PCL (12 mg.ml-1) de tamanho médio de 96,7 nm ± 12,4. Neste caso a divergência no tamanho das partículas, além da concentração de polímero, deve-se, provavelmente, ao surfactante hidrofílico (Pluronic® F68), o qual apresenta maior equilíbrio hidrofílico-lipofílico (EHL=29, a 25 °C) comparado ao Tween® 80 (EHL=15 a 25 °C) usado na obtenção de nanopartículas de MZ. De acordo com Bouchemal et al. (2004) a média de tamanho da partícula diminui quando o valor do EHL do sistema coloidal aumenta. A análise morfológica mostrou nanoestruturas esféricas com a superfície lisa coberta pelo agente crioprotetor (Figura 1). Ainda, as fotomicrografias MEV confirmaram o diâmetro médio das partículas determinado pelas análises de espalhamento de luz dinâmica. Fotomicrografias muito similares foram obtidas por MEV a partir de nanopartículas de PCL carregadas com indometacina (Raffin et al., 2003; Pohmann et al., 2002). Dependendo do método de obtenção empregado no preparo das nanopartículas, o agente ativo pode estar dissolvido, encapsulado, adsorvido, ligado ou quimicamente acoplado nas matrizes poliméricas. O tipo de interação físico-química dependerá, sobretudo, da polaridade do fármaco e do polímero empregrados no sistema coloidal. Portanto, as mais variadas interações fármaco/polímero e o tamanho reduzido das partículas fazem da determinação da quantidade de fármaco associ-

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ada às nanopartículas especialmente complexa, particularmente na separação da fração de fármaco associado a fração de fármaco não associado ao sistema. Para calcular a porcentagem de associação (EE) do MZ as nanopartículas de PCL, um rápido e efetivo método de espectrofotometria de derivadas foi desenvolvido.

Figura 1. Fotomicrografias de varredura eletrônica das nanopartículas PCL em glicose como crioprotetor A derivação do espectro de ordem zero pode levar a separação de sinais sobrepostos e eliminar o ruído causado pela presença de outros compostos em misturas sem anterior separação ou purificação (Donato et al., 2010).

Figura 2. Espectro de primeira derivada da solução I (—); solução II (- - -) e solução mistura III (……). (a) solução II com nanopartículas brancas a 5% (v/v); (b) solução II com nanopartículas brancas a 10% (v/v). Ponto de anulação em 345 nm A especificidade do método foi confirmada no espectro de primeira derivada onde a concentração do MZ na mistura com as nanopartículas pode ser completamente recuperada. Independentemente da concentração das nanopartículas na solução III, 5 ou 10% (Figura 2ab), em 345 nm o espectro das nanopartículas sofreu anulação e portanto a amplitude mensura da neste comprimento de

onde é proporcional apenas a concentração de MZ. A linearidade (Figura 3) foi demonstrada pela curva analítica do MZ obtida no intervalo de 1-12 µg.ml-1 e o coeficiente de correlação foi maior do que 0,997. A equação de regressão linear obtida foi y = 0,0009x + 0,0002. Os valores obtidos para o parâmetro precisão e exatidão inter e intra-dia foram reportados na Tabela 1. Limite de detecção e quantificação foram estimados em 0.66 µg.ml-1 e 2.00 µg.ml-1, respectivamente. O método provou ser de baixo custo, simples, rápido, preciso, exato e especifico para aplicação na determinação de MZ associado às nanopartículas de PCL.

Figura 3. Espectros de primeira derivada sobrepostos contendo concentrações aumentadas de MZ (a-h). Concentrações foram 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12 µg.mL-1 Tabela 1. Análises intra- e inter-dia para determinação da precisão e exatidão

a n = 3; b n = 9; d.p. = desvio padrão; CV (coeficiente de variação) = precisão; E = exatidão Em relação a EE (%), a formulação preparada mostrou 24% de associação do MZ ao sistema coloidal. Poovi et al. (2011) reportaram que, normalmente a baixa EE deve-se a alta afinidade do fármaco e/ou do polímero aos solventes empregados na fase orgânica e/ou aquosa. A baixa afinidade do MZ aos solventes empregados (água e acetona) dificulta o escape para qualquer um destes, invalidando, por conseguinte, esta hipótese. Uma das possíveis explanações a respeito da baixa EE obtida para as nanoparticulas de MZ encontra-se na relação quantidade de polímero/MZ adicionada à formulação. Peng et al. (2007) citaram que a EE (%) aumentou devido a maior proporção de polímero em relação a quantidade de fármaco na formulação. Para o sistema nanoparticulado com MZ, uma maior proporção de MZ em relação a quan-

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tidade de polímero foi adicionada. Finalmente, a hipótese que melhor explica a baixa EE das nanoparticulas obtidas neste estudo, assim como em Guterres et al. (1995), fundamenta-se no formação de cristais de MZ estabilizados pelo surfactante quando a concentração deste excede a solubilidade no núcleo oleoso das nanocápsulas. Uma vez que nenhum grumo macromolecular foi visível e a distriuição de tamanho das nanopartículas obtidas foi baixa, estes cristais, possivelmente, apresentaram tamanho compatível ao das nanoestruturas. CONCLUSÃO Este estudo confirmou a viabilidade de formulação de nanopartículas de PCL carregadas com MZ pelo método de nanoprecipitação. Nanopartículas esféricas e homogêneas com 280 nm e eficiência de carreamento da molécula de 24% foram obtidas. A baixa eficiência deste sistema de transporte preparado tornou-o desvantajoso do uma vez que houve perda de 76% do MZ adicionado no processo. Deste modo, sob estas condições, maiores pesquisas ainda são necessárias para otimizar o processo de preparação. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), a Pós Drª. Nádia Araci Bou-Chacra, Drª.Vladi Olga Consiglieri, o Dr. Guilherme Diniz Tavares e o Laboratório de planejamento e síntese de quimioterápicos potencialmente ativos em doenças negligenciadas. REFERÊNCIAS

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