1

Π. ΙΩΑΝΝΟΥ-ΑΜΑΡΑΝΤΙΔΟΥ

ΚΑΘ. ΧΗΜΕΙΑΣ

ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ

ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΣΠΟΥΔΩΝ

ΑΘΗΝΑ 2003

2

ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ (LUMINESCENCE)

ΠΗΓΗ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ ΕΙΔΟΣ ΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ

ΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΡΕΥΜΑ ΗΛΕΚΤΡΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ

(ELECTROLUMINESCENCE)

ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ

ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ

ΡΑΔΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ

(RADIOLUMINESCENCE)

EΝΕΡΓΕΙΑ ΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΧΗΜΕΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ

(CHEMILUMINESCENCE)

ENΕΡΓΕΙΑ ΧΗΜΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ

ΣΕ ΖΩΝΤΑΝΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ

ΒΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ

(BIOLUMINESCENCE)

ΘΕΡΜΟΤΗΤΑ ΘΕΡΜΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ

(THERMOLUMINESCENCE)

ENΕΡΓΕΙΑ ΤΡΙΒΗΣ ΤΡΙΒΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ

(TRIBOLUMINESCENCE)

ENEΡΓΕΙΑ ΦΩΤΟΝΙΩΝ ΦΩΤΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ

(PHOTOLUMINESCENCE)

ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ

(FLUORESCENCE)

ΦΩΣΦΟΡΙΣΜΟΣ

(PHOSPHORESCENCE)

EΠΙΒΡΑΔ. ΦΘΟΡ

DELAYED FLUOR.

1 – 10-4 s

10-6 – 10-9 s1 – 10-4 s

3

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΦΩΤΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ

Μήκος κύματος, λnm

Φθ

ορ

ισμ

ός,

σχ.

μο

νάδ

ες

ΑπορρόφησηΦωσφορισμός

Φθορισμός

Eπιβραδ. φθορισμός

4

M1

M0

M1

M0

M1

M0

S1

S0

S1

S0

S1

S0

ISC

ISC

ISC

ISC

ET

ET

PhFL

CT-L

FL

Ph

M1

M0

S1

S0

Abs

Abs

Abs

Abs

Mεταφορά Ενέργειας

Λανθανίδες (Τb, Sm, Dy, Eu)

Στοιχεία Μετάπτωσης

(Pd και Pt με πορφυρίνες)

Mεταφορά Φορτίου

Ru, Os, Ir + N-ετεροκυκλικοί

υποκαταστάτες

(συλλέκτες ηλιακής ενέργειας)

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΜΕΤΑΛΛΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ

Τ1

Τ1

Τ1

Τ1

ΕΝ

ΕΡ

ΓΕ

ΙΑ

5

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΙΔΡΟΥΝ ΣΤΟ ΦΘΟΡΙΣΜΟ

ΧΗΜΙΚΗ ΔΟΜΗ

pH

ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ

ΔΙΑΛΥΤΕΣ

ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ

6

CH3

CH3

CH3

CH2OH

CH3CH

3

ΦΩΤΑΥΓΕΙΑ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΚΑΙ ΔΟΜΗ

Ύπαρξη π- ηλεκτρονιακού συστήματος (λex>220nm)

Εκτεταμένο π- ηλεκτρονιακό σύστημα συνεπάγεται

Φθορισμός

Φωσφορισμός

Μεγάλα μήκη κύματος

Vitamin A1

λex= 333nm, λem= 500nm

Bενζόλιο

S1 263 nm, T1 340 nm

Aνθρακένιο

S1 376 nm, T1 680 nm

Χαμηλότερη διεγερμένη απλή κατάσταση

(αντιδεσμικά) π* - π (δεσμικά) Ισχυρός φθορισμός (φωσφ.)

(αντιδεσμικά) π*- n (μη δεσμικά) Ασθενής φθορισμός, ισχυρός φωσφορισμός

(περιβ. υψηλού ιξώδους)

7

O

COO-

O O

COO-

O

N NH

π* - nΔε φθορίζει

(μη πολικ. διαλ)

Ναφθαλίνιο ΙνδόλιοΚινολίνη

π* - πΦθορισμός

Φωσφορισμός

π* - πΦθορισμός

Φωσφορισμός

ο – p –υποκαταστάτες αύξηση φθορισμού

m – υποκαταστάτες ελάττωση φθορισμού

Δε φθορίζει Φθορίζει

Αύξηση μοριακής ακαμψίας αύξηση φθορισμού

ΦΑΙΝΟΛΟΦΘAΛΕΪΝΗ

(ΔΕ ΦΘΟΡΙΖΕΙ)

ΦΛΟΥΟΡΕΣΚΕΪΝΗ

(ΦΘΟΡΙΖΕΙ)

+

-NO2

-COOH

-CH2COOH

-Cl, -Br, -I

-O-

-NH3+

OHNH

2 -OH

-O-CH3

-NH2

-NHCH3

-F

8

ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑΣ

ΥΨΗΛΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ (zero background technique)

ΜΕΓΑΛΗ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ (multiparameter technique)

ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ:

λex, λem, τ , λphosph., P, μη ειδικές παράμετροι

ΑΠΛΗ ΚΑΙ ΣΧΕΤΙΚΑ ΧΑΜΗΛΟΥ ΚΟΣΤΟΥΣ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ

9

ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ

Συντελεστής

κβαντικής απόδοσης

Ισχύς απορροφούμενης

ακτινοβολίας

Ισχύς εκπεμπόμενης

ακτινοβολίας

Σε πολύ αραιά διαλ. (εbc < 0.05)

Ισχύς φθορισμού σε χρόνο t μετά

τη διέγερση

Xρόνος ζωής φθορισμού

Πόλωση φθορισμού

fnonf

f

Fkk

k

ί

ί

..

..

bc

otoA ePPPP 303,21

bc

oFAF ePPF 303,21

cKbcPF oF 303,2

nFF

/t

ot eFF

HVHV FFFFP

10 F

!.3/303,2!2/303,2303,232

bcbcbc

10

ΠΗΓΗ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ ΕΠΙΛΟΓΕΑΣ ΜΗΚΟΥΣ

ΚΥΜΑΤΟΣ ΚΥΨΕΛΙΔΑ

ΕΠΙΛΟΓΕΑΣ ΜΗΚΟΥΣ

ΚΥΜΑΤΟΣ

ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ

ΕΝΙΣΧΥΤΗΣΟΡΓΑΝΟ ΜΕΤΡΗΣΗΣ

ΣΧΗΜΑΤΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΦΑΣΜΑΤΟΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΟΥ

ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ

-Φθορισμόμετρα

-Φασματοφθορισμόμετρα

-Φθορισμόμετρα για ειδικές εφαρμογές

11

ΠΗΓΕΣ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ-Λυχνίες τόξου υδραργύρου [υψηλής (366nm) και χαμηλής πίεσης (254nm)]

-Λυχνίες τόξου αερίου ξένου (συνεχές φάσμα, 250-600nm)

α) συνεχούς εκπομπής

β) στιγμιαίας εκπομπής

-Λέιζερ (ενισχυτές φωτός εξαναγκασμένης εκπομπής)

α) μονοχρωματικοί

β) λέιζερ χρωστικών με επιλογή μήκους κύματος

ΕΠΙΛΟΓΕΙΣ ΜΗΚΟΥΣ ΚΥΜΑΤΟΣ-Φίλτρα (υάλου αποκοπής ή συμβολής)

-Μονοχρωμάτορες (πρίσματος, φράγματος)

ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ-Φωτοπολλαπλασιαστές (PMT)

-Aνιχνευτές ζεύξης φορτίου (Charge-coupled detectors)

ΚΥΨΕΛΙΔΕΣ

12

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΤΩΝ

ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΜΕΤΡΗΣΕΩΝ

ΣΚΕΔΑΣΗ (SCATTERING)

Rayleigh (μόρια διαλύτη, <<λ)

Tyndall (μικρά σωματίδια, < λ)

Raman (δονητικές και περιστροφικές κινήσεις μορίων διαλύτη)

ΕΝΔΟΓΕΝΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ

ΑΠΟΣΒΕΣΗ (QUENCHING)

ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΦΙΛΤΡΟΥ

(INNER FILTER EFFECT)

13

370 455 555

λ, nm

370 400 435

λ, nm

400 500 600

λ, nm

Φάσμα εκπομπής θειικής κινίνης (λex=366nm)

και παρεμπόδιση από σκέδαση Raman

A- H20; B- 0,1μg/ml κινίνης (σε ίδια ευαισθησία)

C, D- 0,1 μg/ml κινίνης (υψηλή ευαισθησία)

Φάσμα εκπομπής ανθρακενίου σε κυκλοεξάνιο

και παρεμπόδιση από σκέδαση Raman

A- διαλύτης

Β, C, D- ανθρακένιο σε διάφορες συγκεντρώσεις

1

2

3

1. Φυσιολογικός ορός

2. Αιμολυμένος ορός

3. Υκτερικός ορός

14

ΠΟΛΥΠΑΡΑΜΕΤΡΙΚΟΤΗΤΑ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑΣ

Φάσματα

Πόλωση

φωτός

Χρόνος

ζωής

Ειδικό

μέρος

- Φθορισμός

- Φωσφορισμός

(χρόνος ή-φάση)

- διέγερσης

- εκπομπής

- σύγχρονης σάρωσης

-σε χαμηλές θερμοκρασίες

Φθορισμομετρία :

- Πολωμένου φωτός

- Κυκλικά πολωμένου

φωτός.

- Κυκλικού

διχρωισμού

- Απόσβεση

- Επιφανειοδραστικά

- Σχηματισμός φθοριζόντων

παραγόντων

- Χρωματογραφία ανίχνευσης

Φθορισμός

15

λ

ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ ΣΥΓΧΡΟΝΗΣ ΣΑΡΩΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΣ

(Δλ=const)

Βασικά χαρακτηριστικά φάσματος:

-Ελάττωση ημιεύρους κορυφής

-Απλοποίηση φάσματος

-Ελάττωση φασματικής περιοχής αναλυτικού ενδιαφέροντος

1

2

3

Κλασική

φθορισμομετρία

Φθορισμομετρία

σύγχρονης

σάρωσης

Mex Mem

Mex

Mex Mem

Mem

% I

f%

If

% I

f

λ

λ

λ

Δλ

16

17

18

19

Φαιναθρένιο

Πυρυλένιο

Ανθρακένιο

20

ΦΑΣΜΑΤΑ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΔΙΑΙΘΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΛΥΣΕΡΓΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ (LSD), λex= 325 nm

ΦΑΣΜΑΤΑ ΣΥΓΧΡΟΝΗΣ ΣΑΡΩΣΗΣ, Δλ = 110 nm

1) 1 ng/ml 2) 0.3 ng/ml 3) H2O

DOL= 0.1 ng/ml DOL= 2 ng/l

21

ΧΡΟΝΟΣ ΖΩΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ

22

ΑΡΧΗ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΧΡΟΝΙΚΑ ΔΙΑΧΩΡΙΖΟΜΕΝΟΥ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ

(Time-resolved Fluorimetry)

EΦΑΡΜΟΓΕΣ:

-Ελάττωση ακτινοβολίας υποβάθρου

-Ανοσοχημικοί προσδιορισμοί

-Μέδοθοι υβριδοποίησης DNAAπόσβεση φθορισμού συμπλόκων ενώσεων λανθανιδών

Chelate Excitation(nm) Emission (nm) Fluorescence

Lifetime ()

(µsec)

Suggested Emission Filter

Europium (Eu) 340 615 730 620/40

Samarium (Sm) 340 642 50 645/40

Terbium (Tb) 320 545 1050 545/40

*(Dyprosium (Dy) 320 572 16 575/15

*Ruthenium (Ru) 459 620 0.4 620/40

Χρήση ιχνηθετών μεγάλου χρόνου ζωής φθορισμού (ιόντα λανθανίδων)

Διέγερση δείγματος με βραχύ παλμόακτινοβολίας

Μέτρηση μετά απόσβεση βραχύβιου φθορισμού υποβάθρου

23

ΙΟΝΤΙΚΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΥΡΩΠΙΟΥ ΚΑΙ ΤΕΡΒΙΟΥ

24

ΑΡΧΗ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΦΑΣΙΚΑ ΔΙΑΧΩΡΙΖΟΜΕΝΟΥ

ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ (Phase- resolved Fluorimetry)

EΦΑΡΜΟΓΕΣ:

-Προσδιορισμός χρόνου ζωής φθορισμοφόρων

- Ανάλυση μίγματος ουσιών

25

ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ ΠΟΛΩΜΕΝΟΥ ΦΩΤΟΣ

(FLUORESCENCE POLARIZATION)

D

D F + Ab

Ab

Ab

D

D F

Μη πολωμένος

φθορισμός Πολωμένος

φθορισμός

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ

-Προσδιορισμός μεγέθους και ολικών διαστάσεων μακρομορίων επισημασμένων με φθορισμοφόρα

-Ανοσοφθορισμομετρικοί προσδιορισμοί συναγωνιστικού τύπου

HVHV FFFFP

26

ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΛΥΣΗΣ

ΑΜΕΣΕΣ

(Ενδογενής φθορισμός)

-ΒΙΤΑΜΙΝΕΣ

-ΦΑΡΜΑΚΑ

-ΑΜΙΝΟΞΕΑ

-ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΗ

-ΠΟΛΥΑΡΩΜΑΤΙΚΟΙ

ΥΔΡΟΓΟΝΑΝΘΡΑΚΕΣ

ΕΜΜΕΣΕΣ

(Μετατροπή σε φθορίζον προϊόν)

α) Σχηματισμός φθορίζοντος

παραγώγου με σύνδεση με

φθορίζουσες ουσίες (δανσυλο-

χλωρίδιο για αμινοξέα και φαινόλες,

ο-φθαλαλδεϋδη για πρωτοταγείς

αρυλαμίνες, αρυλυδραζίνες)

β) Μετατροπή του αναλύτη σε

φθορίζον προϊόν μέσω χημικών

αντιδράσεων

γ) Σχηματισμός φθορίζοντος

συμπλόκου για τον προσδιορισμό

μεταλλοϊόντων ή οργανικών μορίων

δ) Με απόσβεση ή ενίσχυση

φθορισμού

27

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΕΜΜΕΣΩΝ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ

Μέθοδοι διαχωρισμού με ανιχνευτή φθορισμού

(Χρωματογραφικές τεχνικές, τριχοειδής ηλεκτροφόρηση)

Ενζυμική ανάλυση

α) Προσδιορισμός ενεργότητας ενζύμων

β) Προσδιορισμός υποστρωμάτων

Προσδιορισμός μεγέθους και ολικών διαστάσεων μακρομορίων επισημασμένων με φθορισμοφόρα

(Φθορισμομετρία πολωμένου φθορισμού)

Μελέτη σύνδεσης μικρομορίων, π.χ. φαρμάκων με πρωτεΐνες

(Τεχνική φθορίζοντος ιχνηθέτη)

Μετρήσεις αποστάσεων μεταξύ ομάδων μακρομορίου με βάση το φαινόμενο μεταφοράς ενέργειας

Μικροσκοπία φθορισμού

(Χρώση κυττάρων, χρήση επισημασμένων αντισωμάτων ειδικών για τα συστατικά του κυττάρου)

Φθορισμοανοσοχημικοί προσδιορισμοί

Μέθοδοι υβριδοποίησης DNA

28

29

30

BIBΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Parker CA, Photoluminescence of Solutions, Elsevier, Amsterdam, 1968

2. Hemmila IK, Applications of Fluorescence in Immunoassays, John Wiley & Sons,

New York, 1991

3. Warner IM, Patonay G, Thomas MP, “Multidimensional Luminescence

Measurements”, Anal Chem, 57, 463 A, 1985

4. Rubio S, Gomez-Henz A, Valcarcel M, “Analytical applications of synchronous

fluorescence spectroscopy”, Talanta, 33, 633-640, 1986

5. Seitz RW, “Fluorescence derivatization”, CRC (Critical Reviews in Analytical

Chemistry), p. 367, 1980

6. Georges J, “Lanthanide-sensitized Luminescence and applications to the

determination of organic analytes”, Analyst, 118, 1481-1486, 1993

7. Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA, Principles of Instrumental Analysis, Brooks/Cole

Pub Co; 5th edition, 1997

8. Bright FV, “Bioanalytical Applications of Fluorescence Spectroscopy”, Anal Chem,

60, 1031A, 1988

9. Gudgin Dickson EF, Pollak A, Diamandis EP, “Time-resolved detection of lanthanide

luminescence for ultrasensitive bioanalytical assays”, J Photochem Photobiol, B:

Biology, 27, 3-19, 1995