IMUNOEXPRESSÃO DA PROTEÍNA GSK3β EM TECIDOS DE CARCINOMA COLORRETAL

HUMANO PREPARADOS POR TISSUE MICROARRAY (TMA)

VII CICI – CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DO IAMSPE

Ac. Caio Dal Moro AlvesOrientador: Prof. Dr. Jaques Waisberg

INTRODUÇÃO

Câncer colorretal (CCR): doença das mais prevalentes entre a população mundial. No Brasil terceira neoplasia mais frequente no sexo masculino e a segunda no sexo feminino;

(Instituto Nacional de Cancer – INCA. Estimativa 2012 incidência de câncer no Brasil: câncer do cólon e reto)

A alta incidência de câncer no epitélio gastrintestinal como um todo está relacionada à rápida e contínua renovação celular deste tecido sujeito a controle genético e exposto a toxinas dietéticas;

(Leedham SJ, at al. From gene mutations to tumours--stem cells in gastrointestinal carcinogenesis. Cell Prolif. 2005; 38(6):387-405.)

Interrupção da homeostase celular processo de malignização com comportamento agressivo perda de características epiteliais e aquisição de fenótipo migratório

Transição Epitelial-mesenquimal (TEM)

TEM: evento crucial no processo de malignização

Regulada por vias embriônicas como Wnt

(Shih IM, et al. Top-down morphogenesis of colorectal tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(5):2640-5.)

(Takayama T, et al. Analysis of K-ras, APC, and beta-catenin in aberrant crypt foci in sporadic adenoma, cancer, and familial adenomatous polyposis. Gastroenterology. 2001; 121(3):599-611. )

GSK3-β

Teoria:

1- Fisiologicamente: atua como chave inibitória da via Wnt (Wnt/ β-catenina) por fosforilar a β-catenina marcando-a para degradação proteassomal (por Axina, CK-1, APC)

2- Patologicamente: ativação secundária a mutações inativa processo desestabilizador da β-catenina acumula no citoplasma celular núcleo transcrição de genes de proliferação celular (c-myc, ciclina D, VEGF)

GSK3-β

Trabalhos: elevação de GSK3β é frequente em Neoplasias gastrointestinais1- Gosh e Altieri, 2005, trabalhando com cultura de células de CCR concluíram que a ablação aguda do gene GSK3β, ativa o gene p-53 apoptose dependente e antagoniza o crescimento tumoral. Esses autores sugeriram que este achado poderia servir como base racional para o tratamento do CCR.

2- Shakaoori et al., 2009, mostraram que a inibição da proteína GSK3β pelo uso do dimetil sulfóxido (DMSO) atenuava a proliferação de células de CCR humano enxertadas em peritônio de ratos.

3- Mai et al., 2009, estudaram células de diversos tumores gastrintestinais e concluíram que, na maioria deles, a expressão da proteína GSK3β está aumentada em contraposição às células não neoplásicas.

4- Wang et al., 2009, compararam a expressão da proteína GSK3β em tumores de cólon de crescimento lateral e tumores de cólon do tipo protuso e sugeriram que a inativação da proteína GSK3β era mais claramente identificada no primeiro tipo.

OBJETIVO

Avaliar a imunoexpressão da proteína GSK3β no carcinoma colorretal e na mucosa adjacente não neoplásica, comparando estes resultados entre si.

MATERIAIS E MÉTODOS

Estudo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Assistência Médica ao Servidor Público Estadual de São Paulo (IAMSPE) (parecer no 043/09) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo (EPM-UNIFESP) (parecer no 815/09) e obedeceu às normas da Declaração de Helsinki de 1964 e emendada em 1986.

Analisamos 64 doentes com CCR operados com intenção curativa ou paliativa no Serviço de Gastroenterologia Cirúrgica do Hospital do Servidor Público Estadual (HSPE) do IAMSPE – Setembro/2009 a Abril/2010

Critérios de Exclusão: menores de 18 anos de idade, doentes com CCR hereditário ou associado às doenças inflamatórias intestinais, enfermos submetidos à operação de urgência e deficiência do material histológico utilizado no estudo imuno-histoquímico.

Divididos em grupos:

1) 54 pacientes (10 excluídos por insuficiência de material para imuno-histoquímica) cujas amostras foram obtidas do tumor

2) 54 pacientes (10 excluídos por insuficiência de material para imuno-histoquímica) cujas amostras foram obtidas do da mucosa colorretal adjacente não neoplásica.

Estudo Histológico

Amostras fixadas em formalina 10% e processadas em parafina

Lâminas coradas com hematoxilina-eosina(HE), para confirmação de diagnóstico

Excluídos: áreas de necrose, hemorragia, desmoplasia e áreas com baixa celularidade ou acelulares

Construção do TMA

O bloco de TMA foi elaborado usando aparelho de Beecher™ (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, EUA)

Etapas:1- marcação da área selecionada no respectivo bloco de parafina;

2- construção da "casela" no bloco receptor;

3- extração de 1 mm de tecido do bloco doador da área de interesse previamente selecionada;

4- obtenção do tecido do cilindro de transferência a partir de bloco doador e sua colocação na "casela" anteriormente criada no bloco receptor;

5- progressão para as novas posições dentro do bloco receptor criando assim, um conjunto de amostras de tecido em matriz e avaliação da qualidade do bloco final para o armazenamento.

Fotografias do aparelho utilizado para a obtenção dos blocos de tissue microarray (TMA). Fonte: Laboratório de Patologia Molecular da UNIFESP/EPM

Cilindros de tissue microarray (TMA) corados com a técnica de hematoxilina-eosina. Fonte: Laboratório de Patologia Molecular UNIFESP/EPM

Estudo Imiuno-Histoquímico

Lâminas pré-tratadas, desparafinizadas com xilol e etanol

anticorpo primário: anticorpo de coelho policlonal primário anti-GSK3β (H-76), lote B1009 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) em concentração de 1:100

anticorpo secundário: biotinilado (LSAB-kit DakoCytomation, CA, USA)

Controle Positivo: utilizada lâmina contendo cortes histológicos de adenocarcinoma colorretal em tecido humano, comprovada como positiva para o anticorpo estudado.

Controle Negativo: lâmina similar à positiva subtraindo o anticorpo primário da reação.

Estudo da expressão imuno-histoquímica: método Hao et al.

- positividade e intensidade da coloração acastanhada (reação positiva)

- cálculo do escore final da imunoexpressão

Positividade: - grau 0: >5% células coradas

- grau 1: 5-25% células coradas

- grau 2: 26-50% células coradas

- grau 3: 51-75% células coradas

- grau 4: >75% células coradas

Intensidade: - grau 0: negativa

- grau 1: intensidade fraca

- grau 2: intensidade moderada

- grau 3: intensidade forte

Escore final: variou de 0 a 12 (intensidade X positividade)

- 0 a 8: reduzido

- 9 a 12: forte

Fotomicrografias da imunoexpressão positiva do anticorpo GSK3β no citoplasma das células de carcinoma colorretal (imuno-histoquímica: A 100x; B 400x). Fonte: Laboratório de Patologia Molecular UNIFESP/EPM

A(100X) B(400X)

Análise Estatística

Correlação de Spearman: escores de imunoexpressão da proteína GSK3β

Teste t Student: significância de parâmetros clinico-patológicos

Testes do qui-quadrado e de Mann-Whitney: demais parâmetros

Testes de qui-quadrado e Exato de Fischer: associação da positividade na marcação das proteínas

Teste de McNemar: comparação da imunoexpressão da proteína GSK3β na mucosa adjacente não neoplásica e no carcinoma colorretal (dados pareados) p=1,00

SPSS versão 15.0 (The Predictive Analytics Company, Chicago, IL, USA)

RESULTADOS

Todas as amostras de carcinoma colorretal e de mucosa adjacente não neoplásica apresentaram percentagem de coloração acima de 50%

positividade da imunoexpressão da proteína GSK3β na mucosa adjacente não neoplásica: forte em 81,5% das amostras

positividade da imunoexpressão da proteína GSK3β no CCR: forte em mais de 80% das amostras

Intensidade N (%)

Fraca 0 (0%)

Moderada 10 (18,5%)

Forte 44 (81,5%)

Tabela 1 - Intensidade da imunoexpressão da proteína GSK3β na mucosa colorretal adjacente não neoplásica nos doentes com adenocarcinoma colorretal

Intensidade N (%)

Fraca 1 (1,9%)

Moderada 8 (14,8%)

Forte 45 (83,3%)

Tabela 2 - Intensidade da imunoexpressão da proteína GSK3β nos casos de adenocarcinoma colorretal.

CONCLUSÃO

Nas condições desse estudo, os resultados obtidos permitiram concluir que, de fato, a imunoexpressão da proteína GSK3β teve comportamento praticamente idêntico na mucosa adjacente não neoplásica e no CCR.

OBRIGADO