ESTRUCTURA DE LA HEMOCIANINA DEL HELIX POMATIA

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ÍNDICE

Resumen

Desarrollo

o Desarrollo del tema

o Sitio activo

o Activación de la hemocianina como fenoloxidasa

o Hemocianina alfa (αD-HpH y αN-HpH)

o Hemocianina beta (β-HpH)

o HpH-d de la hemocianina beta

o HpH-g de la hemocianina beta

Referencias

2

Resumen

Las hemocianinas son enormes proteínas, que se encuentran disueltas en la hemolinfa de

numerosos invertebrados. Su función principal es la de transportar oxígeno extracelularmente, la cual

puede llevar a cabo debido a los dos átomos de cobre que tienen en su sitio activo. Dichos átomos se

unen de forma reversible a una molécula de O2. Esta oxigenación es la que provoca el color azulado de

la hemolinfa de moluscos y artrópodos.

Centrándome en el contenido de la monografía, la estructura de la hemocianina del Helix

Pomatia o caracol de Borgoña (HpH), el cual es un molusco gasterópodo, cuenta con tres isoformas

distintas disueltas en su hemolinfa: dos de tipo alfa (αD-HpH y αN-HpH) y una de tipo beta (βC-HpH).

Dichas isoformas están constituidas por siete u ocho unidades funcionales (FUs) unidas de forma

covalente. La presencia de tres isoformas de la hemocianina solo se da en dos especies: el Helix

Pomatia y el Helix Lucorum.

Desarrollo del tema

Las hemocianinas son enormes metalo-glicoproteínas, concretamente cromoproteínas no

porfirínicas, constituidas por complejos multiméricos de proteínas que interaccionan de forma no

covalente mediante fuerzas electroestáticas, puentes de hidrógeno o fuerzas hidrofóbicas o por puentes

disulfuro. Son proteínas con un enorme peso molecular (en el caso del Helix Pomatia, 9x106 Da) y una

compleja estructura cuaternaria que actúa como transportador de oxígeno en la hemolinfa de

numerosas especies de moluscos (cefalópodos y gasterópodos) y artrópodos (crustáceos y arácnidos).11

Las hemocianinas de los artrópodos y moluscos revelan numerosas diferencias estructurales,

lo que evidencia orígenes evolutivos separados.2 A pesar de las diferentes estructuras terciarias y

cuaternarias de las hemocianinas, las cuales reflejan distintas estructuras primarias, los sitios de unión

del O2 son bastante similares.1

La hemocianina del Helix Pomatia tiene tres isoformas diferentes: dos de tipo alfa (αD-HpH y

αN-HpH) y una de tipo beta (βC-HpH).8 Dichas isoformas están constituidas por siete u ocho unidades

funcionales globulares (FUs) unidas covalentemente. Estas contienen unos 400 residuos de

aminoácido cada una, pero difieren en sus secuencias y patrones génicos. Las tres isoformas presentan

unos valores de pI, determinados por 2D-electroforesis en gel, de 5,3 (αD-HpH), 5,4 (βC-HpH) y 7,0

(αN-HpH), respectivamente.7

Tanto la alfa como la beta hemocianina tienen un contenido casi idéntico de aminoácidos.

Asimismo, tienen unas características comunes. Solo presentan un aminoácido en el extremo N-

terminal: la arginina. No tienen una aminoácido identificado en el extremo C-terminal, aunque algunas

pruebas apuntan hacia la prolina. Los carbohidratos están unidos, normalmente, a la asparagina, lo que

3

ha llevado a proponer una secuencia aminoacídica de la zona de unión: -A-N-S-T-G-. Esta secuencia

coincide con la zona de glicosilación de otras de otras glicoproteínas. Estas moléculas cuentan con la

presencia de complicadas ramificaciones de cadenas de carbohidratos, con la presencia de

glucosamina, manosa, fucosa, galactosa, glucosa y xilosa.4

El ensamblado básico de la molécula nativa de hemocianina en moluscos es un decámero

cilíndrico hueco. Pero en los gasterópodos, como el Helix Pomatia, presenta ciertas variaciones, la

principal es que la molécula está constituida por homodidecámeros formados por la unión de dos

homodecámeros.7 14

Estos decámeros se pliegan en cada una de las unidades funcionales. Cada FUs está formada por dos

dominios estructurales diferenciados, por un lado el α (caracterizado por tener hélices α), y por el otro,

el β (de hoja plegada β). El dominio α se pliega en cuatro hélices α, las cuales engloban el sitio activo,

mientras que el dominio β lo hace en barriles β, que forman cadenas antiparalelas entre ellos.5

Estas

unidades funcionales (subunidades formada por cadenas polipeptídicas) son designadas como HpH-a

hasta HpH-h sobre el extremo N-terminal.8

Figura 1: Arriba, niveles estructurales de la hemocianina en artrópodos y moluscos.5

El decámero consta de una pared formada por una parte externa hecha por 10 copias de un

segmento constituido por las unidades funcionales a-b-c-d-e-f y un complejo en forma de anillo

dipentamérico formado por 10 copias de FU-h.5 Esta última unidad funcional contiene una cola de 100

aminoácidos en el extremo C-terminal que no está presente en las demás FUs, esto es debido a dicha

cola actúa como elemento de unión del anillo dipentamérico formado por las copias de FU-h.9

4

Sitio activo

Las hemocianinas son enormes proteínas transportadoras de oxígeno. Cada unidad funcional

que la forma tiene un sitio activo con dos iones de cobre (Cu2+

) acoplados en un sitio tipo 3, centro

binuclear, formando la estructura de dos pirámides trigonales opuestas. Estos dos átomos de cobre,

denominados CuA y CuB, se enlazan como grupos protéticos a las cuatro hélices α por tres residuos de

histidina cada uno.9 Estos dos iones están sometidos a un acoplamiento antiferromagnético.

Según la estequiometría, cada par de iones de cobre puede unirse reversiblemente a una

molécula de oxígeno. La parte esencial de la oxigenación puede describirse como: [Cu+]2 + O2

[Cu2+

]2 O2 2-

. La proximidad de los dos átomos de Cu2+

puede dar lugar a un acoplamiento dipolar

entre ellos.3 La unión del oxígeno forma un enlace entre los dos átomos de cobre, dicho oxígeno al

unirse se convertiría en un peróxido y se formaría un complejo plano Cu-O2-Cu, esto se ajusta a los

datos espectroscópicos de la hemocianina oxigenada.6

Esta oxigenación provoca un cambio de color, son incoloras cuando están desoxigenadas y

adquieren un tono azul brillante cuando se oxigenan.2

El comportamiento del enlace con el oxígeno se caracteriza por una afinidad baja-moderada, la

cual puede ser modulada por numerosos factores.

Activación de la hemocianina como fenoloxidasa5

Las hemocianinas tienen sitios activos de cobre tipo 3, los cuales se asemejan a los de las

fenoloxidasas (comprenden tirosinas y catecol oxidasas). Estas catalizan el inicio, en dos pasos, de la

síntesis de la melanina y son necesarias en numerosas funciones biológicas. Por un lado, las tirosinas

catalizan las dos etapas (la hidroxilación de monofenoles a o-difenoles y su posterior oxidación a o-

quinonas) y, por el otro, las catecol oxidasas, solo catalizan el segundo paso.

Las hemocianinas pueden ser activadas y convertidas en proteínas con actividad fenoloxidasa

por proteolisis limitada con agentes desnaturalizantes, como son el SDS y la tripsina, mediante un

mecanismo de activación, que consiste en mover los aminoácidos que bloqueen estéricamente el

acceso al sitio activo de las moléculas fenólicas. Por lo que, las hemocianinas realizan un movimiento

parecido al que haría un dominio estructural flexible. Esto posibilita la entrada al sitio activo. Dicha

entrada hace que un fenol entre con una orientación determinada, la cual se define por su interacción

con los residuos de histidina organizados en torno al CuB. Esta orientación del sustrato permite que se

den las reacciones individualmente. Ahora, ese fenol se mueve fijando su grupo hidroxilo a un punto

de coordinación del sitio del CuA. Uno de los átomos de la molécula de O2, que se encuentra unida a

los dos cobres del sitio activo, ataca el anillo fenólico en su posición orto, esto tiene como resultado la

5

formación de un o-difenol, el cual es inmediatamente oxidado. El otro oxígeno se combina con

protones y se produce la formación de una molécula de agua.

Hemocianina alfa (αD-HpH y αN-HpH)

Dos de las isoformas que existen de la hemocianina del Helix Pomatia son de tipo alfa. La

gran diferencia entre estas dos isoformas es que la αD-HpH puede disociarse en sus componentes y la

αN-HpH no. Las moléculas didecaméricas de la αD son bastantes similares a las de la hemocianina

beta.7

La hemocianina alfa es una glicoproteína transportadora de oxígeno. Esta ha sido aislada de la

hemolinfa del Helix Pomatia, cuenta con una masa molecular de 9 MDa. Su parte carbohidratada, la

cual constituye un 9% de la molécula, está formada por residuos de fucosa, xilosa, 3-O-metilgalactosa,

manosa, galactosa, N-acetilgalactosamina y N-acetilglucosamina.10

Los residuos de xilosa se encuentran unidos covalentemente a una cadena carbohidratada

ligada a la asparagina.10

Cuando estas dos isoformas de hemocianina, tras ser tratadas con un buffer que modifique el

pH del medio, muestran el mismo comportamiento después de disociarse y reasociarse sus

subunidades. Las subunidades disociadas, cuando el pH se estabiliza, se reasocian en decámeros y

túbulos de corta longitud. La hemocianina beta también puede sufrir esto, pero al reorganizarse forma

túbulos de mayor tamaño. Esto puede deberse a que fuerte glicosilación de algunas subunidades.7

Hemocianina beta (β-HpH)

La hemocianina beta es una de las tres isoformas de hemocianina que se puede encontrar

disuelta libremente en la hemolinfa del Helix Pomatia. Un estudio de dicha molécula ha desvelado

numerosas características de ella: peso molecular, 9,02 x 106 Da; volumen, 14000 nm

3; radio de giro,

18,4 nm; radio de las subunidades esféricas, 2,5±0,2 nm.13

Esta isoproteína, en un medio con un pH 8 (ligeramente básico), se disocia en sus

subunidades. Al realizar una tripsinolisis controlada se obtienen los siguientes fragmentos HpH-abc y

HpH-ef y las unidades funcionales HpH-d, HpH-g y HpH-h.8

Tras esta tripsinolisis, se forman largas

estructuras tubulares, que parecen ser polímeros lineales de moléculas de hemocianina. Estos

polímeros tubulares y la proteína nativa presentan unas propiedades parecidas, algunas son que ambos

se disocian a pH 8 en ausencia de cationes divalentes, muestran un efecto Bohr parecido o la

absorbancia (346 nm) es la misma en los dos.12

Asimismo, si se realiza otra tripsinolisis diferente, y a los polímeros obtenidos se les realiza

una micrografía electrónica, se puede obtener una reconstrucción en 3D de la molécula. Una posterior

6

difracción óptica de los polímeros tubulares oxigenados y desoxigenados deja ver una disminución del

diámetro acompañado por un aumento de la longitud en el polímero desoxigenado. Las diferencias

entre ambos polímeros pueden deberse a un procedimiento de preparación por parte de la molécula

desoxigenada como forma de exclusión de oxígeno.11

La reasociación del polímero deja ver que la tripsinolisis no afecta a la forma en la que se

determina la interacción de la proteína.12

Posteriormente, una proteolisis limitada de los fragmentos no disociados al completo (HpH-

abc y HpH-ef) permite la obtención aislada de cada FUs. Los puentes disulfuro juegan un importante

papel en su estabilidad conformacional.8

La cadena polipeptídica de cada FUs está plegada en dos dominios diferenciados, un dominio

N-terminal helicoidal (donde está el sitio activo) y otro C-terminal que presenta hoja plegada beta.8

La β-HpH contiene un 7% de carbohidratos, estos están repartidos de forma variable entre las

diferentes FUs. Las regiones de glicosilación se sitúan en HpH-d, HpH-e, HpH-g y HpH-h, mientras

que HpH-c y HpH-f no cuentan con carbohidratos. De las unidades HpH-a y HpH-b aún se

desconocen los lugares de unión de glicanos. La mayoría de estas FUS son bastante estables, tienen

unas temperaturas de desnaturalización entre 77-83ºC.8

HpH-d de la hemocianina beta15

La cadena de la unidad funcional D está formada por un polipéptido compuesto por 410

residuos de aminoácidos. Tiene una masa de 47 kDa.

Presenta una región delimitada, desde el aminoácido 37 al 219, que también está presente en

tirosinas y se trata de un dominio central muy conservado en estas.

CADENA POLIPEPTÍDICA

1 davtvashvr kdldtltage ieslrsafld iqqdhtyeni asfhgkpglc qheghkvacc

61 vhgmptfpsw hrlyveqvee alldhgssva vpyfdwispi qklpdliska tyynsreqrf

121 dpnpffsgkv agedavttrd pqpelfnnny fyeqalyale qdnfcdfeiq fevlhnalhs

181 wlgghakysf ssldytafdp vfflhhantd rlwaiwqelq ryrglpynea dcainlmrkp

241 lqpfqdkkln prnitniysr padtfdyrnh fhyeydtlel nhqtvpqlen llkrrqeygr

301 vfagflihnn glsadvtvyv cvpsgpkgkn dcnhkagvfs vlggelempf tfdrlyklqi

361 tdtikqlglk vnnaasyqlk veikavpgtl ldphilpdps iifepgtker

7

Figura 2: Dos representaciones de la estructura secundaria de la HpH-d. A la izquierda, resaltado con colores los seis aminoácidos

de histidina que forman el sitio activo, donde se encuentran los dos átomos de cobre. A la derecha, se resaltan en color verde los dos

aminoácidos (Cys-His) que forman el enlace tioéter.17

Los aminoácidos 44, 55, 71, 175, 179 y 206 corresponden a histidinas (H), que actúan como

zonas de unión con el cobre, en este caso los residuos 44, 55 y 71 son de unión con el CuA, y los 175,

179 y 206, con el CuB.

Se producen varios enlaces Cys-Cys o puentes disulfuro: entre los aminoácidos 50 y 59, 165 y

232 y 321 y 332. Este enlace es de tipo covalente fuerte y se produce entre los grupos tiol (-SH) de dos

cisteínas. Este tipo de enlace es muy importante en la estructura, plegamiento y función de la proteína.

Entre los residuos 60 y 62 se produce un enlace 2’-(S-cisteinil)-histidina (Cys-His), también

llamado enlace tioéter (o sulfuro).

En el aminoácido 253, Asparagina (N), se puede producir una N-glicosilación, que consiste en

una modificación de la cadena polipeptídica con la adición de carbohidratos.

8

Figura 3: Dos representaciones de la estructura secundaria de la HpH-d. A la izquierda, resaltado en verde el residuo de

asparagina (N), en el que se puede dar una N-glicosilación. A la derecha, resaltado en color verde los dos aminoácidos (Cys-His) que forman

el enlace tioéter.17

La cadena polipeptídica presenta tres regiones

conflictivas, en las que hay un tipo de aminoácidos que

puede convertirse en otro: el aminoácido 60, la cisteína (C)

puede pasar a serina (S), el residuo 62, la histidina (H)

puede ser sustituida por serina (S) y el aminoácido 165, la

cisteína (C) puede pasar a ácido aspártico (D).

Figura 4: A la derecha, representación de la estructura secundaria de

la HpH-d, en la imagen de la derecha se resaltan en azul y verde los tres residuos

que pueden presentar un cambio por otro aminoácido.17

El primer residuo y el último de la cadena

polipeptídica no son aminoácidos terminales, ya que

se trata de, en el caso del primero, de ácido aspártico

(D), y en el del 410, de arginina (R).

Con el plegamiento de la cadena

polipeptídica, se forman dos dominios diferentes:

uno de hélice alfa y otro de hoja plegada beta.

Figura 5: A la izquierda, representación de la estructura

secundaria de la HpH-d.17

HpH-g de la hemocianina beta16

CADENA POLIPEPTÍDICA

1 dihttavagv gvrkdvtrlt vsetenlrea lrrikadngs dgfqsiasfh gsppgcehen

61 hsvaccihgm anfpqwhrly vkqwedalta qgakigipyw dwttaftelp alvteevdnp

121 fhhgtiynge ittraprdkl fndpefgkes ffyrqvllal eqtdycdfev qyeishnaih

181 swtggqspyg mstleytayd plfllhhsnv drqfaiwqal qkfrglpyns ancaiqllhq

241 pmrpfsdadn vnpvtrtnsr ardvfnydrl nyqyddlnfh glsiselndv lerrkekari

301 faefllhgig asadvtfdlc dshdhcefag tfailggple hpwafdrlfk ydvtdvfskl

361 hlrpdseyhf nihivsvngt eldshlirsp tvqfvpgvkd yyek

9

La cadena de la unidad funcional G está formada por un polipéptido compuesto por 404

aminoácidos. Tiene un peso molecular de 46 kDa.

La región delimitada desde el aminoácido 41 al 220, también está presentes en tirosinas y se

trata de un dominio central muy conservado en ellas.

Los residuos 50, 61, 77, 176, 180 y 207 corresponden a histidinas (H), se trata de zonas de

unión con un cobre, en este caso los aminoácidos 50, 61 y 77 son de unión con el CuA, y los 176, 180

y 207, con el CuB.

Se producen tres puentes disulfuro (Cys-Cys): entre los aminoácidos 56 y 65, 166 y 233 y 320

y 326.

Figura 6: Dos representaciones de la estructura secundaria de la HpH-g. A la izquierda, resaltado con colores los seis aminoácidos

de histidina que forman el sitio activo, donde se encuentran los dos átomos de cobre. A la derecha, se resaltan en color azul los dos

aminoácidos (Cys-His) que forman el enlace tioéter.18

Entre los residuos 66 y 68, se produce un enlace 2’-(S-cisteinil)-histidina (Cys-His), el cual

también recibe el nombre de enlace tioéter.

Hay tres residuos de asparagina (N), aminoácidos 38, 60 y 378, en los que se puede producir

una N-glicosilación, que se trata de una modificación de la cadena polipeptídica con la adición de

carbohidratos.

10

Figura 7: A la izquierda, representación de la estructura

secundaria de la HpH-g, en la que se resalta en azul y verde los

tres residuos de asparagina (N), en los que se puede dar una N-

glicosilación.18

El primer y último residuo de la cadena

polipeptídica no son aminoácidos terminales, ya

que se trata de, en el caso del primero, de ácido

aspártico (D), y en el del 404, de lisina (K).

Con el plegamiento de la cadena polipeptídica, se forman dos dominios diferentes: uno de

hélice alfa y otro de hoja plegada beta.

El dominio de hélice alfa está formado por

los siguientes aminoácidos: 21-37, 43-49, 72-90,

112-114, 152-160, 165-184, 202-224, 236-237, 253-

257, 261-264, 268-269, 284-295 y 354-360.

El dominio de hoja plegada beta está

constituido por los siguientes aminoácidos: 56-58,

61-63, 124-126, 130-132, 299-308, 313-321, 325-

334, 343-353, 369-376, 380-382 y 391-395.

Figura 8: A la derecha, representación de la estructura

secundaria de la HpH-g.18

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