Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΧρήστοςΠαναγιωτίδης,Ph.D.ΚαθηγητήςΚυτταρικής/ΜοριακήςΒιολογίαςΕργαστήριοΦαρμακολογίας,ΤομέαςΦαρμακογνωσίας/ΦαρμακολογίαςΤμήμαΦαρμακευτικής, ΣχολήΕπιστημώνΥγείας,ΑριστοτέλειοΠανεπιστήμιοΘεσσαλονίκης54124Θεσσαλονίκη

ΜοριακήBιολογίαΔIAΛEΞΕΙΣ1-3

EIΣAΓΩΓHΣΤΗΝΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΤΟΥDNA

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

OΔιδάσκων

Δρ.Xρήστος ΠαναγιωτίδηςKαθηγητής Kυτταρικής &Mοριακής Bιολογίας

ΤμήμαΦαρμακευτικης Α.Π.Θ.

Επικοινωνία:καθημερινά11 π.μ.-12μ.,Γραφείο 315/ 3ος όρόφοςΦαρμακευτικήςήηλεκτρονικά(e-mail)στο:pchristo@pharm.auth.gr

ΠΛHPOΦOPIEΣσχετικά με το μάθημα,ανακοινώσεις,διαλέξεις,βαθμολογίες,κλπ.

θααναρτώνται στους πίνακες ανακοινώσεων του 3ουορόφουκαι στην ιστοσελίδα:

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Διαδικασίαεξέτασηςκαιεργασίες

α)ΗεξέτασηγίνεταικάθεΙανουάριοκαιΣεπτέμβριομεγραπτέςεξετάσεις.

β)Οιεξετάσειςαποτελούνταιαπό20ισοβαρήθέματα(0,5μονάδεςτοκαθένα).Κάθεθέμαείναιμίαπρότασηπουπρέπεινααπαντηθείανείναισωστήήλάθος(0,1μονάδαςγιακάθεσωστήαπάντησηκαι-0,1γιακάθελάθος).Ησωστήαιτιολόγησητουκάθεθεματοςλαμβάνει0,4μονάδες.Ηδιάρκειατηςεξέτασηςείναιμίαώρα.

γ)ΤαεργαστήριαείναιυποχρεωτικάκαιγίνονταιείτετηνεβδομάδαπριντιςδιακοπέςτωνΧριστουγένων ήαμέσωςμετάτιςδιακοπέςκαιπριντηνεξεταστικήτουΙανουαρίου.

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Tι είναιΜοριακήΒιολογία;

Mοριακήβιολογίαείναιηεπιστήμηπουμελετάτηνδομήκαιτηνέκφρασητουγενετικού

υλικού.

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Eναύσματα γιατηνανάπτυξητηςσύγχρονηςΜοριακήςΒιολογίας

Hδυνατότηταμαςνααναλύουμετηδομήκαιτηνέκφρασητουγενετικούυλικού(αντικείμενοτηςμοριακήςβιολογίας)είναιευθείασυνάρτησητηςικανότηταςμας:

✔ Nα«κόβουμε»τοDNAσεμικρότερατμήματα✔ Να«αρχειοθετούμε»τοDNAστοεργαστήριο✔ NααναλύουμετηνπρωτοταγήδομήτουDNA✔ Nαμετράμετηνέκφρασητωνγονιδίων✔ Nαεκφράζουμεταγονίδιασεετερόλογασυστήματαείτεγιανα

μελετήσουμετηλειτουργικότητάτουςήγιαναπαράγουμεμεγάλεςποσότητεςτωνπροϊόντωντους

✔ Ναενισχύουμεγενετικόυλικόαπόαπειροελάχιστεςποσότητες

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΓIATIHΓΝΩΣΗΤΗΣMOPIAKHΣBIOΛOΓIAΣ

EINAIΣHMANTIKHΓIAENAΦOITHTHΦAPMAKEYTIKHΣ;

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΗσημασίατηςτεχνολογίαςτουανασυνδυσμένουDNAστηΦαρμακευτικήΒιοτεχνολογία

1973: Oι StanleyCohenκαιHerbertBoyerανακαλύπτουντημέθοδογιατημεταφοράτηςγενετικήςπληροφορίαςμεταξύοργανισμών

1976: ΟHerbertBoyerιδρύει,μαζίμεάλλους,τηνGenentechτηνπρώτηεταιρείαστιςΗ.Π.Α.πουχρησιμοποιείτεχνολογίατουανασυνδυασμένου DNA

1978: Ησωματοστατίνη,μίαορμόνη-ρυθμιστήςτηςανθρώπινηςαυξητικήςορμόνης,παράγεταιμεχρήσητηςτεχνολογίαςτουανασυνδυασμένου DNA

1980:ΟHerbertBoyer κλωνοποιεί τογονίδιοτηςανθρώπινηςινσουλίνηςκαιχρησιμοποιείτοβακτήριοEcoliγιατηνπαραγωγήανασυνδυασμένης ινσουλίνης•14Οκτωβρίου1980:ΗμετοχήτηςGenentechυπερδιπλασιάζεται($35->$89)

1977-1980:ΟιWigler,Axel&Silvestein, στοπανεπιστήμιοColumbia,αναπτύσσουντηντεχνολογίατηςεισαγωγήςκαιέκφρασηςξένωνγονιδίωνσεκύτταραθηλαστικών1980-1983:ΚατοχύρωσητωνδικαιωμάτωντηςπαραπάνωτεχνολογίαςμεπατέντεςαπότιςοποίεςτοπανεπιστήμιοColumbia είχεέσοδα100εκατομυρίων τοχρόνο(σύνολοσχεδόν1δις) [πηγή:Colaianni,A;Cook-Deegan,R(2009).

].

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

DNAμπορείνααπομονωθείείτεαπόκύτταραήαπόιστούςπροκειμένουναμελετηθεί• ΠΡΟΣΟΧΗ:

ΤοDNA είναιέναΤΕΡΑΣΤΙΟ μόριο(ακόμηκαιτο DNAτωνσχετικάμικρώνβακτηριακώνγονιδιωμάτωνείναιαρκετάμεγάλο) πουείναιεξαιρετικάευαίσθητοστημηχανικήκαταπόνηση,δηλαδήμπορείπολύεύκολανα«σπάσει»σεμικρότεραθραύσματακατάτηδιάρκειατωνεργαστηριακώνχειρισμών.

ΕΠΟΜΕΝΩΣ

üΤο«κόψιμο»τουDNA σεμικρότεραθεραύσματαμπορείναβελτιώσειτημηχανικήτουσταθερότητα καινααπλοποιήσειτοχειρισμότου

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Πωςμπορούμενα«κόψουμε»τοDNAσεμικρότεραθραύσματα;

METHXPHΣHEIΔIKΩNENZYMΩN

✍YΠAPXOYNΠPOΫΠOΘEΣEIΣ;

✔NAI,TAENZYMAAYTAΘAΠPEΠEINAΔIAΣΠOYNTODNAΠANTAΣTIΣIΔIEΣAΛΛHΛOYXIEΣOIOΠOIEΣEINAIEKTΩN

ΠPOTEPΩNΓNΩΣTEΣ

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Τιείναιοιενδονουκλεάσες περιορισμού;

Οιενδονουκλεάσεςπεριορισμούείναιενδονουκλεάσεςοιοποίεςαναγνωρίζουνσυγκεκριμένεςπαλινδρομικές

αλληλουχίεςστοDNA,τοοποίοδιασπούνπάνταστιςίδιεςπροκαθορισμένεςθεσεις.

Θαδείξουμεμερικάπαραδείγματαστιςεπόμενεςδύοδιαφάνειες

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Τέσσερις“δημοφιλείς” ενδονουκλεάσεςπεριορισμού

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Περισσότερεςενδονουκλεάσες περιορισμού

EcoRI

HindIII

AluI

NotI

PstI

θέσηδιάσπασης Σακχαροφωσφορικόςσκελετός

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Απόπουπροέρχονταιοιενδονουκλεάσεςπεριορισμού;

✔Οιενδονουκλεάσεςπεριορισμούαπομονώθηκαναρχικάαπόβακτήρια.Είναισυστατικάενός

μηχανισμούάμυναςτωνβακτηρίωνενάντιασεεισβολήξένουγενετικούυλικού,π.χ.απόμόλυνση

μεκάποιονβακτηριοφάγο.

✄ΓιατίοιενδονουκλεάσεςπεριορισμούδενδιασπούνκαιτοDNAτουβακτηρίουπουτιςπαράγει;

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΧημικέςτροποποιήσειςτουDNA τωνβακτηρίωνπουπαράγουνενδονουκλεάσες

περιορισμούτοπροστατεύουναπόενδονουλεολυτική πέψηαπόαυτές

ΜεθυλιωμένοDNA

ΜημεθυλιωμένοDNA

Η EcoRIδεμπορείναδιασπάσειτομεθυλιωμένο DNA

ΜημεθυλιωμένοDNA

ΔιάσπασητουDNA

«κολλώδη»άκρα

ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI

EcoRIμεθυλάση

ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΚΑΙΜΕΤΑΤΗΝΚΟΠΗΤΙ;

ΠωςαναλύεταικαιπωςχρησιμοποιείταιτοDNAμετάτηνπέψητουμεενδονουκλεάσες

περιορισμού;

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Hλεκτροφορητική ανάλυσητουDNA

κοντόθραύσμα

μεσαίου-μεγέθουςθραύσμα

κοπήμεενδονουκλεάσηπεριορισμού

κοπήμεενδονουκλεάσηπεριορισμού

κοπήμεενδονουκλεάσηπεριορισμού

DNA

Μεγαλύτερομέγεθος

μικρότερομέγεθος

ΔίκλωνοπλασμιδιακόDNA

ΠέψημεEcoRI ΠέψημεHindIII

Αρχή

Τέλος

Εμφάνισηφιλμ

εμφανισμένοαυτοραδιογράφημαφύλλοφωτογραφικού

χαρτιού

πηκτήαγαρόζηςζεύγηνουκλεοτιδίων(Χ10

00)

201086

2

+

-

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Aρχές ηλεκτροφορητικής ανάλυσης

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

KΛΩNOΠOIHΣHH«αρχειοθέτηση»τουDNAστο

εργαστήριο

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Πλασμίδια:Οιπιοκοινοίφορείςκλωνοποίησης

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Χωρητικότητακοινώνφορέωνκλωνοποίησης

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Hδιαδικασίατηςκλωνοποίησης

ΚΟΠΗΜΕΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

θραύσμαDNA πουθακλωνοποιηθεί

ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗΣΥΝΔΕΣΗΜΕΤΗΝDNAΛΙΓΑΣΗ

δίκλωνοκυκλικόπλασμιδιακό DNA

ανασυνδυασμένο DNA

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Πολλαπλασιασμόςτωναντιγράφωνενόςγονιδίουμεκλωνοποίηση

βακτηριακόκύτταρο καλλιέργειαγιατον

πολλαπλασιασμότωνβακτηριακών κυττάρων

Μετάαπόλύσητωνβακτηριακών κυττάρωναπομονώνονταιμεγάλεςποσότητεςDNA

Τοανασυνδυασμένοπλασμιδιακό DNAεισάγεταιστοβακτηριακό κύτταρο

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Aπαραίτητες ιδιότητεςενόςπλασμιδιακούφορέακλωνοποίησης

1. Aλληλουχίες έναρξηςαντιγραφής(ORI)2. Γονίδιοπουεπιτρέπειεύκοληεπιλογή(π.χ.

αντίστασησεαντιβιοτικό)3. Aλληλουχίες πουεπιτρέπουνκοπήαπόαρκετές

ενδονουκλεάσες περιορισμού(polylinker)4. (Υποκινητής πουεπιτρέπειρυθμιζόμενη

έκφραση)

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Γενωμικές &cDNA Bιβλιοθήκεςχρωμοσωμικό DNA

γονίδιοΑ γονίδιοΒγονίδιοΒ γονίδιοΑ

εξόνιο ιντρόνιο μη-μεταγραφόμενοDNA

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ

ΠΕΨΗΜΕΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΤΟΥ DNA

ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΜΕΤΑΓΡΑΦΗ&ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗDNA

ΣΥΡΡΑΦΗ(ΜΑΤΙΣΜΑ)ΤΟΥ RNA

mRNAs

RNAμετάγραφα

θραύσματαDNA

γενωμικοί κλώνοιDNAσεγενωμική βιβλιοθήκη cDNA κλώνοισεβιβλιοθήκη cDNA

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Κατασκευήγενωμικών βιβλιοθηκών

DNA ανθρώπουΠΕΨΗΜΕ

ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΤΑΘΡΑΥΣΜΑΤΑΤΟΥDNAΕΝΣΩΜΑΤΩΝΟΝΤΑΙΣΕ

ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ

εκατομύρια θραύσματαγενωμικού DNA

ΕΙΣΑΓΩΓΗΤΩΝΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝΣΕΒΑΚΤΗΡΙΑ

ανασυνδυασμένα μόριαDNA

γενωμική βιβλιοθήκη

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΔιαδικασίαπαρασκευήςcDNA

ιστός,π.χ.εγκέφαλος

λύσητωνκυττάρωνκαι απομόνωση

mRNA

mRNA

υβριδισμόςμεεκκινητή polydT

mRNAκατασκευήαντιγράφουDNAμε

χρήσηαντίστροφηςμεταγραφάσης

κατεργασίαμεάλκαλι γιανααποικοδομηθεί τοRNA

Το3’άκροτουcDNAσχηματίζει

θηλειά

σύνθεσησυμπληρωματικήςαλυσίδαςDNA μεDNA-πολυμεράση,ηθηλειάτου

3’άκρουδραωςεκκινητής

δίκλωνοcDNA αντίγραφοτουαρχικούmRNA

κατεργασίαμενουκλεάση πουαποικοδομεί μονόκλωνοDNA γιανα

αποικοδομηθεί ηθηλειά

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Bιβλιοθήκες DNAμπορούννακατασκευασθούνκαισεβακτηριοφάγους

λυτική οδόςλυτική οδόςσχηματισμόςπροφάγου (λυσιγονία)

βακτηριακό κύτταρο

βακτηριακό χρωμόσωμα

βακτηριφάγοςλάμδα

τοDNAτουφάγουκυκλοποιείται

πρόσδεσητουφάγου στονξενιστήκαι«ένεση»τουιικού DNA

σύνθεσητωνιικώνπρωτεϊνώνπου

χρειάζονταιγιατοσχηματισμόνέωνιών

ΤαχείααντιγραφήτουDNA τουλφάγου και

πακετάρισμασεπλήρειςιούς

λύσητουκυττάρουκαιαπελευθέρωση

μεγάλωνποσοτήτωννέωνιών

βήμαενεργοποίησης

ΕνσωμάτωσητουDNAτουλφάγου στοχρωμόσωματου

ξενιστή

κυτταρικήδιαίρεση

τοενσωματωμένοDNA τουλφάγουαντιγράφεταιμαζίμετοχρωμόσωματουξενιστή

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Ταβήματατηςκλωνοποίησης σεπλασμίδιο

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Πολύπλοκεςγενετικέςκατασκευέςμπορούνναγίνουνμεδιαδοχικέςκλωνοποιήσεις

θραυσμάτωνDNAπλασμιδιακός φορέας

πρώτοένθεμα

δεύτεροένθεμα

τρίτοένθεμα

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΠροσανατολισμένηκλωνοποίησητουδίκλωνουcDNAσεπλασμιδιακόφορέα

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Διάκρισημπλε-λευκώναποικιώνγιατονεντοπισμόανασυνδυασμένωνφορέων

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Eντοπισμός ανασυνδυασμένων φορέωνμεβάσητηνέκφρασηενόςγονιδίουθανάτου

Nsi I*

Hind

III

Asp7

18 I

Kpn

IEcl1

36 II

Sac I

Bam

H I

Spe

IEcoR

IPst I

EcoR

VNo

t IXho

INsi I*

Xba

IDra

IIApa

IBstB

I

pZErO™-2.13.3 kb

Stu IPlaclacZα ccdB

f1 ori

Apo I†

BspH I

SnaB I

Comments for pZErO™-2.1 3297 nucleotides

Lac Promoter/Operator Region: bases 95-216M13 Reverse Priming Site: bases 205-221LacZα ORF: bases 217-558Sp6 Priming Site: bases 239-256Multiple Cloning Site: bases 269-381M13 (-20) Forward Priming Site: bases 415-430M13 (-40) Forward Priming Site: bases 434-450Fusion Joint: bases 559-567ccdB Lethal Gene ORF: bases 568-870f1 origin: bases 895-1307Kanamycin Resistance ORF: bases 2116-1322ColE1 origin: bases 2502-3175

ColE1Kanamycin

Afl III

* The two Nsi I sites in theMCS are the only sites inthe vector.

† There are two tandemApo I sites at thislocation. Apo I alsorecognizes the EcoR Isite.

Sp6

A-160319

The sequence of pZErO™-2.1 has been compiled from information in sequence databases, publishedsequences, and other sources. This vector has not been completely sequenced. If you suspect an error in thesequence, please contact Invitrogen's Technical Services Department.

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΠΩΣMΠOPOYMENATAYTOΠOIHΣOYMEAΠOIKIEΣΠOYΠEPIEXOYNANAΣYNΔYAΣMENOYΣΦOPEIΣKΛΩNOΠOIHΣHΣAΠO

AYTEΣΠOYΠEPIEXOYN«AΔEIOYΣ»ΦOPEIΣ;

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Yβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων

μίγμαμονόκλωνωνμορίωνDNA

υβριδισμόςσε50%φορμαμίδιοστους42˚C

υβριδισμόςσε50%φορμαμίδιο στους35˚C

ουβριδισμόςδενείναιακριβής

υβριδισμόςσε50%φορμαμίδιο στους35˚C

μονόκλωνοιDNAανιχνευτέςγιατογονίδιοΑ

μόνοτοΑσχηματίζεισταθερήδιπλήέλικα

ταΑ,CκαιEσχηματίζουνσταθερέςδιπλέςέλικες

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

TαυτοποίησηAποικιώνπουΠεριέχουνΘετικούςKλώνουςμεYβριδισμό

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΠΩΣMΠOPOYMENAEΠITYXOYMETHN

ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣHΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN

DNA(πριντην κλωνοποίησηήκαιμετά);

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΣτύπωμακατάSouthern μετάαπόανάλυσηDNAμεηλεκτροφόρησησεπήκτωμα

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Aνίχνευση τηςμετάλλαξηςπουπροκαλείδρεπανοκυτταρικήαναιμίαμευβριδισμό

νουκλεϊνικών οξέων

πρωτεΐνη

φυσιολογικήβ-σφαιρίνη

φυσιολογικήπρωτεΐνη

μεταλλαγμένηπρωτεΐνη

παθολογικήβ-σφαιρίνημετάλλαξη

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

ανιχνευτήςφυσιολογικούγονιδίου

ανιχνευτήςμεταλλαγμένουγονιδίου

άτομα άτομα• Τοάτομο1έχειδύο

φυσιολογικάγονίδιαβ-σφαιρίνης

• Τοάτομο2έχειδύομεταλλαγμέναγονίδιαβ-σφαιρίνης

• Τοάτομο3έχειέναφυσιολογικόκαιέναμεταλλαγμένογονίδιοβ-σφαιρίνης

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΔιαδικασίααλληλούχισηςDNAμετημέθοδοτουSangerπουβασίζεταιστηχρήση

διδεοξυνουκλεοτιδίων

Διδεοξυαδενοσίνη (ddATP)

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Aλληλούχιση DNAμετημέθοδοτουSanger

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΗγνώσητηςαλληλουχίαςτωνβάσεωντουDNAεπιτρέπειτονπροσδιορισμότωνπεριοχώνπουκωδικοποιούνπρωτεΐνες

πλαίσιαανάγνωσης

πλαίσιαανάγνωσης

πλαίσιαανάγνωσης

πλαίσιαανάγνωσης

DNA

DNA

ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςπάνωαλυσίδαςτουDNA

ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςπάνωαλυσίδαςτουDNA

ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςκάτωαλυσίδαςτουDNA

ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςκάτωαλυσίδαςτουDNA

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

TIKANOYMEOTANTOΔIAΘEΣIMOΓENETIKOYΛIKOΔENEINAIΔIAΘEΣIMOΣEΠOΣOTHTEΣIKANEΣΠPOΣ

ANAΛYΣH;

ΦTIAXNOYMEΠEPIΣΣOTEPOΜΕΤΗΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ

ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ(PCR)

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

PCR– Η ενίσχυσητουDNAinvitro

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΟκύκλοςτηςτεχνικήςPCR

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΠολλαπλασιασμόςτουDNAμεPCR

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΕκθετικήαύξησητουDNAκατάτηνPCR

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΜοριακήδιαγνωστικήμεPCRστηνιατροδικαστική

ηλεκτροφορητική ανάλυσηεκκινητέςPCR

ομόλογαχρωμοσώματα

πατρικό

μητρικό

ΕπαναλλαμβανόμενεςαλληλουχίεςσεθέσηVNTR

άτομο A άτομο B άτομο C άτομο F

αριθμό

ςεπα

ναλήψεω

ν

Ηλεκτροφ

όρησ

η

3ζεύγηομ

όλογωνχρωμο

σωμά

των

Ηλεκτροφ

όρησ

η

VNTR:VariableNumberTandemRepeat(Μεταβλητόςαριθμόςιαδοχικώνεπαναλήψεων)

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

AνίχνευσηHIVμεRT-PCR

δείγμααίματοςαπόμολυσμένο

άτομο

ελάχισταιοσωμάτια HIVστονορότουμολυσμένουατόμου

Απομάκρυνσητωνκυττάρωνμεφυγοκέντρηση

Εκχύλισητουιικού RNA

γονιδιώματος

Αντίστροφημεταγραφή/ενίσχυσημε

PCR

Ηλεκτροφόρηση σεπηκτή

αίμαμημολυσμένουατόμου

χρησιμοποιείταιωςαρνητικόςμάρτυρας

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

XρήσηRT-PCRμεπολλαπλούςεκκινητέςστημοριακήδιαγνωστικήμιάςιογενούςνόσου

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

HPCRστηνκλωνοποιησηDNAκαιRNAκύτταρα

απομόνωσηRNAαπομόνωσηDNA

DNAπουθακλωνοποιηθεί

mRNAπουθακλωνοποιηθεί

Αποδιάταξη DNA/ προσθήκηεκκινητών

ΕνίσχυσημεPCRΕνίσχυσημεPCR ΕνίσχυσημεPCR

Αποδιάταξη αλυσίδων&προσθήκη2ου εκκινητή

Προσθήκη1ου εκκινητή,αντίστροφηςμεταγραφάσης

καινουκλεοτιδίων

ΕνίσχυσημεPCR

γενωμικοίκλώνοι

cDNAκλώνοι

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΧρήσητηςPCRπραγματικούχρόνουγιαποσοτικέςμετρήσειςγενετικούυλικού

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Kατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεσηπλασμιδιακός φορέας

συνθετικόολιγονουκλεοτίδιο/εκκινητής πουφέρειτηνεπιθυμητήμετάλλαξη

αποδιάταξηαλυσίδωνDNA

κλωνοποιημένο φυσιολογικόγονίδιο

ΟλοκλήρωσητηςσύνθεσηςμεχρήσηDNAπολυμεράσης και

DNAλιγάσης

ΕισαγωγήσεκύτταραΑντιγραφήκαιαπομόνωσηστα

θυγατρικάκύτταρα

μεταγραφή μεταγραφή

μετάφραση μετάφραση

ταμισάκύτταραπαράγουνφυσιολογικήπρωτεΐνη

ταμισάκύτταραπαράγουνμεταλλαγμένηπρωτεΐνηπουφέρει

αλλαγήσεένααμινοξύ

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Eισαγωγή τροποποιήσεωνστογενετικόυλικό

ΦυσιολογικόγονίδιοΧ

Μόνοτομεταλλαγμένογονίδιοεκφράζεται

Προσθήκηγονιδίου

Απαλειφήγονιδίου

Αντικατάστασηγονιδίου

Δενυπάρχεικανέναενεργόγονίδιο

Εκφράζεταικαιτοφυσιολογικόκαιτομεταλλαγμένογονίδιο

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Kατασκευή διαγονιδιακών ποντικώνθηλυκόποντίκι

τροποποιημένογονίδιομεμεθόδουςγενετικήςμηχανικής

ES κύτταρασταοποίαένααπόταδύοαντίγραφατουγονιδίουέχειαντικατασταθείμετην

μεταλλαγμένημορφή

εισαγωγήτροποποιημένουγονιδίουστακύτταρα

τακύτταρασχηματίζουναποικίες

Απομονωμένοπρώιμοέμβρυο

ζευγάρωμακαιαναμονήγια3μέρες

ΈνεσηκυττάρωνESστο πρώιμοέμβρυο

πρώιμοέμβρυοπουσχηματίσθηκεμερικώςκαιαπό

κύτταραES

εισαγωγήεμβρύουσεψευδο-εγκύους

ποντικούς

αναζήτησησπάνιωναποικιώνπουπεριέχουντο

τροποποιημένογονίδιο

Διαγονιδιακός ποντικόςμεγαμετικάκύτταραταοποίαπεριέχουνκαιτροποιημένααντίγραφατουγονιδίου-στόχου

ελέγχεταιηπαρουσίατουτροποποιημένουγονιδίουσεσωματικάκύτταρααπογόνωνκαιοιθετικοίαπόγονοιδιασταυρώνονται

Γέννηση

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας