Dissertation endgültige Fassung -...

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3.1 Erstellung einer Mammakarzinom-spezifischen cDNA-

Expressionsbank in λ-Phagen

3.1.1 RNA-Isolierung aus Zellen(RNeasy Mini, Qiagen)

Das Prinzip der RNA-Isolierung mit dem Qiagen-Kit basiert auf der Methode vonChomczynski et al. (1987). Die Probe wird unter stark denaturierenden Bedingungen lysiert

und homogenisiert. Der Lysispuffer enthält Guanidium Isothiocyanat und β-Mercaptoethanol,um RNasen zu inaktivieren. Durch Zugabe von Ethanol werden optimale Bedingungen ge-schaffen, um die RNA an eine Silicagel-Membran zu binden. In mehreren Waschschrittenwerden Kontaminationen entfernt und die RNA nachfolgend mit DEPC-Wasser von derMembran eluiert.

MaterialRNeasy Mini Kit, QiagenQiagen Schredder-Säulen

β-Mercaptoethanol70% Ethanol

Durchführung(1) Zu je 1 ml Lysispuffer werden 10 µl β-Mercaptoethanol pipettiert

(2) Lysis:eingesetzte Menge Lysispuffer: 350 µl für bis zu 107 Zellen/600 µl für > 107 ZellenDas Zellpellet (4 x 107 Zellen) wird in 2,4 ml Lysispuffer durch Auf- undAbpipettieren resuspendiert.

(3) Homogenisierung:je 600 µl des Lysates werden auf eine Qiagen-Schredder-Säule gegeben und diese1 min. bei 14.000 rpm zentrifugiert.

(4) Das Reaktionsgemisch wird mit einem Vol. (2,4 ml) 70% Ethanol aufgefüllt und durchAuf und Abpipettieren gemischt, bis keine Schlieren mehr vorhanden sind.

(5) Die Probe wird sukzessive auf 4 RNeasy-Säulen geladen und je 15 sec. bei 14.000 rpmzentrifugiert.

(6) Die Säulen werden mit je 700 µl Puffer RW1 gewaschen (auf Säule geben und zentri-fugieren).

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(7) Die Säulen werden in 4 neue 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und 2x mit 500 µlWaschpuffer RPE gewaschen. Der 2. Zentrifugationsschritt beträgt 2 min. statt 15 sec.,um die Membran zu trocknen.

(8) Elution:Die Säulen werden in neuen 1,5 ml Reaktionsgefäßen plaziert und 50 µl DEPC-Wasserauf die Mitte der Membran pipettiert. Nach einer 5 minütigen Inkubation bei Raum-temperatur werden die Proben 15 sec. bei 14.000 rpm zenrifugiert. Dieser Schritt wirdeinmal wiederholt.

3.1.2 Photometrische Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration

Der Nukleinsäuregehalt und die Reinheit einer Probe können durch eine spektralphotome-trische Messung um UV-Bereich bestimmt werden. Hierbei wird die Absorption bei 260 nmund 280 nm gemessen. Die optische Dichte einer Nukleinsäurelösung bei 260 nm (OD260) istein Maß für die Konzentration an Nukleotiden. Die OD280 gibt Aufschluß über die Verunrei-nigung mit Proteinen. Der Quotient OD260/OD280 sollte bestimmte Grenzwerte nicht über-schreiten, da sonst keine lineare Abhängigkeit der Absorption bei 260 nm zur Nukleinsäure-konzentration gegeben ist.Eine optische Dichte von 1 entspricht bei 260 nm 50 µg/ml dsDNA und 40µg/ml ssRNA. DerQuotient OD260/OD280 sollte zwischen 1,7 und 2,0 liegen. Die Messung wird in speziellenQuarzküvetten vorgenommen, da diese keine Eigenabsorption im UV-Bereich besitzen.

Formeln zur Berechnung der NukleinsäurekonzentrationRNA: 40 x OD260 x Verdünnungsfaktor = µg RNA/mlDNA: 50 x OD260 x Verdünnungsfaktor = µg DNA/ml

3.1.3 Agarosegelelektrophorese

Zur analytischen und präparativen Trennung von Nukleinsäuren werden horizontale Agarose-gele verwendet. Abhängig von der Größe der DNA bzw. RNA und dem gewünschten Trenn-bereich werden unterschiedliche Agarosekonzentrationen verwendet. Es entstehen Gele mitverschiedenen Porengrößen, durch die die negativ geladene Nukleinsäure nach Anlegen einerSpannung im Laufpuffer zum positiven Pol wandert. Zur Anfärbung der DNA/RNA unterUV-Licht wird dem Gel Ethidiumbromid zugesetzt, welches in den Nukleinsäurestrang ein-gelagert wird. Durch gleichzeitiges Auftragen eines Größen- oder Mengenstandards könnenGröße und Konzentration der DNA bestimmt werden.

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Agarosekonzentration (%[w/v]) Bereich der optimalen Auftrennung linearer DNA-Moleküle (kb)

0,3 5-600,6 1-200,7 0,8-100,9 0,5-71,2 0,4-61,5 0,2-32,0 0,1-2

Tabelle 3.1.3 Agarosekonzentration und optimale Auftrennung der DNA im Gel.

Material5x TBE-PufferLadepufferEthidiumbromid-LösungAgarose

Durchführung(1) Die entsprechende Menge Agarose wird nach den Richtlinien der Tabelle 3.1.3 in

50 ml oder 150 ml 0,5x TBE aufgenommen und in der Mikrowelle bis zur völligenAuflösung des Agarosepulvers erhitzt.

(2) Die Lösung wird unter ständigem Rühren auf 40-50 °C abgekühlt und mit 1 µl (50 ml-Gel) bzw. 3 µl (150 ml-Gel) (0,2 µg/ml Endkonzentration) Ethidiumbromidlösung ver-setzt.

(3) Das flüssige Gel wird in den Gelträger gegossen und der Gelkamm eingesteckt.

(4) Nach Polymerisation wird das Gel in die mit 0,5x TBE-Puffer gefüllte Elektro-phoresekammer gelegt und der Kamm sowie die Gelträgerdichtungen entfernt.

(5) Die Nukleinsäureproben werden mit 20% (Endkonzentration) Ladepuffer aufgefülltund in die Geltaschen pipettiert.

(6) Die Elektrophoresekammer wird geschlossen und eine Spannung von nicht mehr als5 Volt/cm Elektrodenabstand eingestellt.

(7) Die Nukleinsäurebanden können unter einer UV-Lampe (245 nm) sichtbar gemachtund abfotografiert (Eagle EyeTM, Stratagene, La Jolla, CA) oder mit einem Skalpellausgeschnitten werden.

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3.1.4 cDNA-Synthese

Es wird das cDNA Synthesis Kit von Stratagene verwendet, welches bis auf die Lösungen zurAufreinigung der Reaktionsansätze alle benötigten Reagenzien enthält.

(1) Erststrang-SyntheseDer zum RNA-Strang komplementäre cDNA-Strang wird mittels einer ReversenTranskriptase (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase - MMLV-RT)synthetisiert. Der Primer besitzt eine poly (dT)-Sequenz sowie eine XhoI-Konsensus-Sequenz. Hierdurch wird gewährleistet, daß er sich an den komplementären poly-A-Schwanz der mRNA anlagert und nur mRNA in komplementäre cDNA umgesetztwird. Der im Kit enthaltene dNTP-Mix enthält Methyl dCTP, so daß der neu entste-hende DNA-Strang teilweise methyliert ist. Diese Maßnahme soll die DNA vor demVerdau durch Restriktionsenzyme schützen. In der Erststrang-Reaktion entsteht einRNA-DNA-Hybrid.

(2) ZweitstrangsyntheseRNase H zerlegt den verbliebenen RNA-Strang in einzelne Fragmente, welche derDNA-Polymerase I als Primer dienen. Das Enzym synthetisiert den zum ersten Strangkomplementären zweiten DNA-Strang. Die dNTPs enthalten in dieser Reaktion keineMethylgruppen mehr, damit die cDNA später mit den entsprechenden Restriktionsen-zymen geschnitten werden kann.

(3) Herstellung von glatten Enden (blunt ends)

Die überstehenden Enden der cDNA werden mittels Pfu DNA-Polymerase in glatteEnden umgewandelt, da die Ligation mit blunt-end-Adaptern erfolgt.

(4) Ligation der EcoR I-Adapter

Die verwendeten Adapter sind doppelsträngige Nukleotide, die eine EcoR 1-Schnitt-stelle enthalten und zudem ein blunt end und ein sticky end aufweisen. Nur das glatteEnde ist phosphoryliert, um eine Anlagerung an die cDNA zu gewährleisten. Alleanderen Enden sind dephosphoryliert, um eine Selbstligation der Adapter zu verhin-dern.

(5) Phosphorylierung der ligierten Adapter

Um eine Ligation in den Vektor zu ermöglichen, werden die ligierten Adapter imnachfolgenden Schritt phopsphoryliert.

(6) Xho I-Verdau der cDNA

Da sich nur jeweils an einem Ende der cDNA-Stücke eine Xho I-Schnittstelle befindet,werden nur hier nach XhoI-Restriktion die EcoR 1-Adapter wieder freigesetzt. Amanderen Ende der cDNA bleibt der EcoR 1-Adapter erhalten. Man erhält also cDNAmit einem Xho I- und einem EcoR I-verdauten Ende. Da die ZAP® II -DNA mit dengleichen Restriktionsenzymen geschnitten ist, erfolgt die Insertion der cDNA in der

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richtigen Orientierung. Ein korrekter Leserahmen und damit ein funktionsfähigesFusionsprotein ergibt sich jedoch nur in einem von drei Fällen.

Linker-Primer

3‘ AAAAAAAAAAAA

5‘ CTCGAGTTTTTTTTTTTT

5‘ mRNA-Template

MMLV-Reverse Tranrkriptase5-Methyl-dCTPdATP, dGTP, dTTP

Rnase HDNA Polymerase IdNTPs

Erststrang-Synthese3‘ AAAAAAAAAAAA


CH3 CH3CH3CH3CH3

5‘

3‘Xho I

Zweitstrang-Synthese3‘ GAGCTCAAAAAAAAAAAA


CH3 CH3CH3CH3CH3

5‘

3‘Xho I

EcoR I-AdapterT4 DNA Ligase

AdapterLigation...CTTAA 5‘

5‘ AATTC...CTCGAGTTTTTTTTTTTT

3‘ G...GAGCTCAAAAAAAAAAAA

CH3 CH3CH3CH3CH3

...G 3‘

Xho IEcoR I EcoR I

5‘ TCGAGTTTTTTTTTTTT

3‘ CAAAAAAAAAAAA

Xho I

...CTTAA 5‘

CH3 CH3CH3CH3CH3

...G 3‘

EcoR I

Xho I-Verdau

CH3 CH3

RNA

5-methyl-cDNA

DNA

LEGENDE

Abbildung 3.1.4 cDNA-Synthese zur gerichteten Insertion der Inserts in den λ-Phagen-Vektor ZAP® II. (Quelle: Stratagene cDNA Synthesis Kit Instruction Manual, Stratagene,1999)

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MaterialcDNA Synthesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)Phenol-Chloroform-IsoamyalkoholChloroform100% und 70% Ethanol3M Na-Azetat

Durchführung(1) Erststrang-Synthese

(a) Das finale Volumen der Reaktion ist 50 µl. Enzyme und Reagenzien betragen 12,5 µl,daher werden DEPC- H2O und RNA in einem Volumen von 37,5 µl zum Ansatz gege-ben. Hierbei hängt es von der RNA-Konzentration ab, welches Volumen Wasser undRNA einnehmen. Die RNA-Menge sollte ungefähr 5 µg poly(A) RNA entsprechen.

Es werden in folgender Reihenfolge pipettiert:

5,0 µl first strand buffer3,0 µl first strand methyl nucleotide mixture2,0 µl linker-primer

x µl DEPC-H2O1,0 µl RNase Block Ribonuclease Inhibitor

11,0 µl

(b) Die Reaktion wird durch Auf- und Abpipettieren gemischt und die entsprechendeRNA-Menge zugegeben.

(c) Die Probe wird 10 min. bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Primeranlagerung zugewährleisten.

(d) Zum Ansatz wird 1,5 µl MMLV-RT pipettiert und die cDNA-Synthese 1 Std. bei 37°Cdurchgeführt. Danach wird die Probe sofort auf Eis gestellt.

(2) Zweitstrang-Synthese

(a) Es werden folgende Reagenzien zum Ansatz gegeben:

20,0 µl second strand buffer6,0 µl second strand dNTP mixture

114,0 µl dd H2O

(b) Vor dem Hinzufügen der Enzyme muß die Probe eine Temperatur von < 16°Caufweisen:

2,0 µl RNase H (1,5U/µl)11,0 µl DNA polymerase I (9U/µl)

(c) Der Ansatz wird vorsichtig gevortext und kurz herunterzentrifugiert.

(d) Die Zweitstrang-Reaktion wird 2,5 Std. bei 16°C inkubiert und sofort auf Eis gestellt.

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(3) Herstellung von glatten Enden(a) Es werden zum Reaktionsansatz pipettiert:

23,0 µl blunting dNTP mix2,0 µl Pfu DNA polymerase (2,5U/µl)

(b) Die Probe wird gevortext, herunterzentrifugiert und 30 min. bei 72°C inkubiert.(c) Phenol-Chloroform-Extraktion

• Die Reaktion wird mit 200 µl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol gemischt und2 min. bei Raumtemperatur und 14.000 rpm zentrifugiert

• Die obere, wässrige Phase, welche die DNA enthält, wird in ein neues 0,5 mlEppendorf-Gefäß überführt, 1 VT Chloroform hinzupipettiert und der Ansatz ge-mischt

• Nach einem weiteren 2 minütigen Zentrifugationsschritt wird erneut die obere,wässrige Phase in ein neues Gefäß überführt

(d) Ethanol-Fällung

• Die cDNA-Reaktion wird mit 2 VT 100% Ethanol und 1/10 VT Natrium-Azetatversetzt, gemischt und über Nacht bei –20°C gefällt

• Die DNA wird 30 min. durch Zentrifugation bei 14.000 rpm und 4°C pelletiert

• Das Pellet wird mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen und 2 min. bei 14.000 rpm undRaumtemperatur zentrifugiert

• Das Pellet wird getrocknet, in 9 µl EcoR I-Adaptern aufgenommen und mindestens30 min. bei 4°C inkubiert, um die DNA zu resuspendieren

(4) Ligation EcoR I-Adapter(a) Es wird folgendes zum Ansatz gegeben:

1,0 µl 10x ligase buffer1,0 µl 10 mM rATP1,0 µl T4 DNA ligase (4U/µl)

(b) Die Reaktion wird herunterzentrifugiert und über Nacht bei 8°C inkubiert.(c) Am nächsten Morgen erfolgt eine Hitzinaktivierung der Ligase für 30 min. bei 70°C.(d) Die Probe wird 2 sec. zentrifugiert und 5 min. auf Raumtemperatur abgekühlt.

(5) Phosphorylierung der ligierten Adapter(a) Es wird in folgender Reihenfolge pipettiert:

1,0 µl 10x ligase buffer2,0 µl 10 mM rATP6,0 µl ddH2O1,0 µl T4 polynucleotide kinase (10U/µl)

(b) Die Phosphorylierung wird 30 min. bei 37°C durchgeführt und nachfolgend die Kinasefür 30 min. bei 70°C hitzeinaktiviert.

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(c) Der Reaktionsansatz wird 2 sec. zentrifugiert und 5 min. auf Raumtemperatur abge-kühlt.

(6) Xho I-Verdau der cDNA(a) Es werden hinzugefügt:

28,0 µl Xho I buffer supplement3,0 µl Xho I (40U/µl)

(b) Die cDNA wird 1,5 Std. bei 37°C verdaut.(c) Um optimale Pufferbedingungen für die Größenfraktionierung zu schaffen, wird 5 µl

10x STE-Puffer zum Ansatz pipettiert.

3.1.5 Größenfraktionierung der cDNA mit Sepharose-Säulen

Um eine Klonierung zu kleiner und damit nur unvollständige Gene repräsentierender cDNAzu vermeiden, wird die cDNA über eine Sepharose-Säule aufgereinigt. In diesem Moleku-larsieb wird die DNA der Größe nach aufgetrennt. Größere, schwere cDNAs verdrängen dieGelpartikel durch ihr Gewicht schneller als kleine, leichte cDNAs. Daher werden nach Bela-den der Säule große cDNA-Moleküle zuerst eluiert. Für die Klonierung werden nur die ersteneluierten Fraktionen verwendet, die die größten DNA-Stränge enthalten. Mit den hier einge-setzten Säulen erfolgt eine Anreicherung von cDNAs > 400 bp.

MaterialSize Sep 400 Spun Columns (Pharmacia, Peapack, NJ)STE-Puffer

Durchführung(1) Äquilibrierung der Säule(a) Die Säule wird mehrmals umgedreht, um das Gel zu resuspendieren.(b) Beide Verschlüsse werden abgenommen und der Puffer abgelassen. Hierbei ist darauf

zu achten, daß die Säule nicht trocken läuft.(c) Die Säule wird mit 2 ml STE-Puffer beschickt, verschlossen und wieder mehrmals

umgedreht, um das Gel zu resuspendieren. Der Puffer wird wieder entfernt.(d) Diese Waschschritte werden noch zweimal wiederholt. Das Ablaufen des Puffers nach

dem letzten Waschschritt wird gestoppt, bevor die Säule trocken läuft. Die Geloberflä-che sollte von etwas Puffer bedeckt sein.

(2) Größenfraktionierung(a) Die Verschlüsse werden entfernt, die Säule in einem 15 ml Falcon-Röhrchen festge-

klebt und 2 min. bei 400 x g zentrifugiert.(b) Die cDNA wird auf die Mitte der Geloberfläche pipettiert, es sollte nichts neben die

Säule laufen.

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(c) Die Säule wird in einem 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß festgeklebt, in ein 50 ml Röhrchengesteckt und 2 min. bei nicht mehr als 400 x g zentrifugiert. In dieser ersten Fraktionsind die größten cDNA-Moleküle enthalten.

(d) Die Säule wird noch zweimal mit je 60 µl STE-Puffer beschickt und es werden zweiweitere Fraktionen eluiert.

(3) Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung der cDNADie cDNA-Fraktionen werden wie bereits beschrieben Phenol-Chloroform-extrahiertund über Nacht gefällt (3.1.4 (3c + d)). Die Pellets werden in je 5 µl dd H2O aufge-nommen.

3.1.6 Mengenbestimmung der cDNA mittels Ethidium Bromide PlateAssay

Eine genaue Bestimmung der cDNA-Menge ist notwendig, da das Verhältnis von Insert(cDNA) zu Vektor bei der Ligation eine wichtige Rolle spielt. Der Ethidium Bromide PlateAssay verwendet als Standards eine DNA-Verdünnungsreihe bekannter Konzentration(200 ng/µl-10 ng/µl). Von jedem Standard werden 0,5 µl auf ein mit Ethidiumbromid ver-setztes Gel aufgetragen. Daneben wird 0,5 µl cDNA pipettiert. Unter UV-Licht kann die Kon-zentration der cDNA durch Vergleich mit der Fluoreszenz der Standard-DNA ermittelt wer-den.

Material50x TAE-PufferEthidiumbromid-LösungSalmon Sperm DNA (Stratagene, La Jolla, CA))100 mM EDTA-Lösung10 cm Petrischalen

Durchführung(1) Von der Salmon Sperm DNA (10 µg/µl) wird eine Verdünnungsreihe in 100 mM

EDTA-Lösung hergestellt, so daß eine DNA-Standardreihe entsteht:

Standard-Verdünnung Salmon Sperm DNA in EDTA200 ng/µl 1 : 50150 ng/µl 1 : 67100 ng/µl 1 : 100 75 ng/µl 1 : 133 50 ng/µl 1 : 200 25 ng/µl 1 : 400 10 ng/µl 1 : 1000

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(2) 0,4 g Agarose werden durch Aufkochen in 50 ml 1x TAE gelöst (0,8%iges Gel). DasGel wird auf 50°C abgekühlt und mit 10 µl Ethidiumbromidlösung versetzt. Je 10 mlGel wird in eine 10 cm Petrischale gegossen.

(3) Je 0,5 µl eines Mengenstandards wird vorsichtig (ohne Luftblasen) auf das Gel pipet-tiert, so daß eine Standardreihe mit den Konzentrationen 100 ng bis 5 ng DNA ent-steht. Neben die Mengenstandards wird 0,5 µl cDNA aufgetragen.

(4) Das Gel wird unter UV-Licht fotografiert und eine Mengenbestimmung durch Ver-gleich mit den DNA-Standards vorgenommen.

3.1.7 Ligation der cDNA in λ-Phagen-Vektor ZAP® II

Es können 50-150 ng cDNA/µg Vektor eingesetzt werden. Das optimale Vektor/Insert-Ver-hältnis wird durch Ligation unterschiedlicher cDNA-Mengen in 1 µg Vektor ermittelt.

MaterialcDNA Synthesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)Vektor ZAP® II XR (Stratagene, La Jolla, CA)

Durchführung(1) Es werden in ein 0,5 ml Eppendorf-Gefäß pipettiert:

0,5 µl cDNA~150 ng (Ligation 1) bzw. 0,3 µl cDNA~100 ng (Ligation 2)0,5 µl 10x ligase buffer0,5 µl 10 mM rATP1,0 µl ZAP® II (1µg/µl)0,5 µl T4 DNA ligase (4U/µl)

5 µl

(2) Die Reaktion wird über Nacht bei 12°C inkubiert.

3.1.8 Verpackungsreaktion

Nach der Ligation liegt die Phagen-DNA als rekombinante DNA vor. Es sollte möglichstnahezu jedes Phagen-DNA-Molekül ein cDNA-Insert enthalten. Die rekombinante DNA wirdnun in Phagenpartikel verpackt und es entstehen infektionsfähige Phagen, welche ihr cDNA-Insert während der Vermehrung exprimieren. Die nach der Verpackung entstandene Expres-sionsbank wird auch als Primärbibliothek bezeichnet.

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MaterialGigapack® III Gold Packaging Extract (Stratagene, La Jolla, CA)SM-PufferChloroform

Durchführung(1) Der Verpackungsextrakt wird in der Hand erwärmt, bis er beginnt zu tauen. 1-5 µl re-

kombinante DNA wird sofort hinzugegeben.(2) Dar Ansatz wird durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt. Es dürfen keine

Luftblasen entstehen. Die Reaktion wird kurz herunterzentrifugiert.(3) Die Inkubation erfolgt für 1,5 bis 2 Std. bei 22°C und sollte auf keinen Fall länger als

2 Std. dauern.(4) Die Verpackung wird durch Zugabe von 500 µl SM-Puffer beendet.(5) Es werden 20 µl Chloroform hinzugegeben, die Reaktion gemischt und durch kurzes

zentrifugieren Zelltrümmer pelletiert.(6) Der Überstand wird in ein neues 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß überführt und bei 4°C im

Kühlschrank gelagert.

3.1.9 Titerbestimmung der Primärbibliothek mit Blau-Weiß-Selektion

Die „multiple cloning site“ des ZAP® II-Vektors befindet sich innerhalb des β-Galaktosidase

Gens (lacZ-Gen). Die β-Galaktosidase setzt das Substrat x-gal zu einem blauen Farbstoff um.Befindet sich ein Insert im Vektor, so ist das Gen unterbrochen und es wird kein funktionsfä-higes Enzym gebildet. Daher bilden Insert-tragende (rekombinante) Phagen weiße Plaques,nicht-rekombinante Phagen hingegen blaue Plaques.

A. Präparation der Wirtszellen XL1-Blue-MRF‘

Um eine Selektion Episom-tragender Bakterien zu erzielen, werden die Wirtszellen auf Tetra-zyklin-haltigem LB-Medium ausgestrichen. Das Flüssigmedium zur Anzucht der Bakteriensollte mit Maltose und Magnesiumsulfat supplementiert werden, um die Infektion der Phagenzu ermöglichen. Diese binden über den Maltoserezeptor an die Bakterien und werden dabeidurch MgSO4 stabilisiert. Daher sollten alle Flüssig- und Festmedien, die für die Vermehrung

von λ-Phagen in Bakterien verwendet werden, Maltose und MgSO4 enthalten.

MaterialGlycerolstamm XL1-Blue MRF‘LB-Tetrazyklin kleine PlattenLB-Flüssigmedium + 0,2% Maltose/10mM MgSO4

10 mM MgSO4

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Durchführung(1) Je 10 µl einer 10-1 und 10-2-Verdünnung des XL1-Blue MRF‘ Glycerolstamms werden

auf LB-Tetrazyklin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.(2) Es werden 5 x 3 ml LB + Maltose/MgSO4 in 15 ml Bakterienröhrchen pipettiert und in

jedes Röhrchen eine Kolonie XL1-Blue überführt.(3) Die Bakterien werden bei 37°C und ca. 200 rpm geschüttelt bis zu einer OD von

0,8-1,0 (4-6 Std.). Die Kulturen dürfen nicht überwachsen, da Phagen auch an toteBakterien binden und somit der Titer verfälscht wird.

(4) Die Wirtszellen werden 10 min. bei 2200 rpm pelletiert und das Pellet in der Hälfte desursprünglichen Volumens (1,5 ml) in 10 mM MgSO4 aufgenommen.

(5) Die Bakterien können 2 Tage im Kühlschrank gelagert werden.

B. Titerbestimmung

MaterialSM-PufferLB + 0,2% Maltose/10 mM MgSO4 kleine PlattenLB + 0,2% Maltose/10 mM MgSO4 Top-AgarIPTG 0,5 Mx-gal (40 mg/ml)

Durchführung(1) Von den Verpackungsreaktionen wird eine 1:10-Verdünnung in SM-Puffer erstellt.

Hierzu wird 1 µl Verpackungsreaktion in 9 µl SM-Puffer transferiert.(2) Die Bakterien werden in 10 mM MgSO4 bis zu einer OD von 0,5 verdünnt (1,5 ml auf

4 ml auffüllen).(3) In 1,5 ml Reaktionsgefäßen werden je 200 µl XL1-Blue mit 1 µl bzw. 1 µl der

10-1-Verdünnung der Verpackungsreaktionen infiziert. Das Bakterien-Phagen-Gemischwird 15 min. bei 37°C und 175 rpm inkubiert, um eine Anlagerung der Phagen zu er-möglichen.

(4) Der Top-Agar wird währenddessen in der Mikrowelle erhitzt, bis er flüssig ist. Ersollte handwarm sein, wenn er zu der Bakterien-Phagen-Suspension gegeben wird.

(5) In die entsprechende Zahl 15 ml Röhrchen (10 Stck. für 5 Verpackungsreaktionen)werden je 15 µl 0,5 M IPTG und 50 µl x-gal pipettiert.

(6) Hierzu werden die Bakterien-Phagen-Mischung sowie je 3 ml Top-Agar gegeben. DieReaktion wird gut gemischt und auf LB + Maltose/MgSO4 ausplattiert.

(7) Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag können blaue undweiße Plaques ausgezählt werden. Der Titer wird in pfu/ml angegeben.Formel zur Titerberechnung: Anzahl Plaques x Verdünnung x 1000 = pfu/ml

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3.1.10 Amplifizierung der Primärbibliothek

Um eine stabile Bibliothek zu etablieren, werden die nach der Verpackung generiertenPhagenklone noch einmal in Bakterien vermehrt.

A. Präparation der Wirtszellen XL1-Blue MRF‘

Die Durchführung erfolgt wie bereits für die Titerbestimmung beschrieben. Da ein größeresVolumen Wirtszellen benötigt wird, werden 8 x 3 ml Nährmedium mit je einer Kolonie in-kubiert.

B. Amplifizierung

MaterialVerpackungsreaktionenLB + 0,2% Maltose/10 mM MgSO4 große PlattenLB + 0,2% Maltose/10 mM MgSO4 Top-AgarSM-PufferChloroform

Durchführung(1) Die Bakterien werden in 10 mM MgSO4 bis zu einer OD von 0,5 verdünnt (1,5 ml auf

4 ml auffüllen).(2) In 1,5 ml Reaktionsgefäße werden je 600 µl Bakterien und ca. 50.000 pfu der Ver-

packungsreaktionen pipettiert. Die Reaktionen werden 15 min. bei 37°C und 175 rpminkubiert.

(3) Die Bakterien-Phagen-Suspensionen werden mit 7,5 ml Top-Agar gemischt und aufgroße LB + Maltose/MgSO4 Platten gegeben.

(4) Die Platten werden 10-11 Std. bei 37°C inkubiert, bis die Plaques eine Größe von1-2 mm erreicht haben.

(5) Auf jede Platte wird 8-10 ml SM-Puffer pipettiert und die Schalen über Nacht bei 4°Cunter leichtem Schütteln inkubiert.

(6) Die Phagen diffundieren über Nacht in den Puffer. Am nächsten Morgen wird derPuffer von den Platten abgenommen und in ein steriles Gefäß überführt. Jede Plattewird nochmals mit 2 ml SM-Puffer gespült. Der gesammelte Puffer enthält die ampli-fizierte Bibliothek.

(7) Die Bibliothek wird mit 5% Chloroform (finale Konzentration) versetzt, gemischt und15 min. bei Raumtemperatur belassen.

(8) Durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 10 min. werden Zelltrümmer pelletiert und derÜberstand in ein neues Gefäß überführt. Diese Aufreinigung (Mischen mit Chloroformund Zentrifugieren) wird so lange wiederholt, bis der Überstand klar ist (2-3 mal).

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C. Titerbestimmung und Blau-Weiß-Selektion

Titer und Blau-Weiß-Selektion werden entsprechend den Vorgaben für die Verpackungs-reaktionen durchgeführt. Da die amplifizierte Bank einen Titer von 108-1010 pfu/ml aufweist,müssen lediglich höhere Verdünnungen (10-3-10-7) ausplattiert werden.

3.1.11 Lagerung der cDNA-Expressionsbank

λ-Phagen-Bibliotheken können ohne großen Titerverlust ca. ein Jahr im Kühlschrank aufbe-wahrt werden. Als Backups sollten jedoch Aliquots bei –80°C gelagert werden.

MaterialChloroformDMSO

Durchführung(1) Die Hälfte der Bank (ca. 20-25 ml) wird in 1 ml Aliquots aufgeteilt und in jedes Gefäß

0,3% (finale Konzentration) Chloroform pipettiert, um ein Bakterienwachstum zuverhindern. Die Bank wird bei 4°C gelagert.

(2) Die andere Hälfte der Bibliothek wird ebenfalls aliquotiert und mit 7% (finale Kon-zentration) DMSO gut gemischt. Die Bank wird in flüssigem Stickstoff schockgefro-ren und bei –80°C aufbewahrt.

3.2 Immunisierung von Mäusen mit Membranfraktionen

Die Immunisierung der Mäuse ist Bestandteil einer anderen, im Rahmen des Mammakarzi-nom-Projektes angefertigten Doktorarbeit und wird daher nur kurz beschrieben.

3.2.1 Präparation der Membranfraktionen

Je 1 x 107 Zellen der Mammakarzinom-Zellinien 870-BC und BT-474 werden gewaschen,herunterzentrifugiert und die Pellets in einem Sucrose-haltigen Lysispuffer resuspendiert. DieZellen werden dreimal mit einer Ultraschallsonde sonifiziert und anschließend zentrifugiert,um ganze Zellen, Zellkerne und –trümmer abzutrennen. Der die Membranen enthaltendeÜberstand wird zweimal bei 100.000 x g zentrifugiert und das Zellmembranpellet schließlichin 150 µl Puffer aufgenommen. Die Protein-Konzentration wird mit dem DC-Protein AssayKit (Bio-Rad, München) bestimmt und beträgt 0,8-1,0 mg Protein/ml.

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3.2.2 Immunisierung von Balb/c-Mäusen

Die Membranfraktionen der beiden Zellinien werden 1:1 gemischt und mit einem Adjuvanssubkutan verabfolgt. Die Immunisierung erfolgt in Woche 0, 3, 6 und 10. Es werden vor undnach der Vakzinierung wöchentlich Blutproben entnommen, um das Serum auf einen Anstiegdes spezifischen Antikörpertiters zu untersuchen. Seren, welche den höchsten Antikörperge-halt aufweisen, werden zum Screening der Mammakarzinom-spezifischen cDNA-Expressionsbank eingesetzt.

3.2.3 Kontrolle des Antikörpertiters mittels ELISA

Maxisorb-Platten werden mit Membranfraktionen der Zellinie 870-BC beschichtet. In die ein-zelnen Vertiefungen wird je 100 µl einer steigenden Verdünnungsreihe des Mausserums pi-pettiert (1:100-1:100.000). Der Bindungsnachweis erfolgt mit einem Peroxidase gekoppeltenSchaf anti-Maus IgG-Antikörper. Der Substratumsatz durch die Peroxidase in der Entwick-lungsreaktion ergibt ein Produkt von gelb-brauner Farbe. Die Absorption jeder Vertiefungwird bei 450 nm im ELISA-Reader (MWG-Biotech, Ebersberg) gemessen. Der Titer ist defi-niert als der reziproke Wert der höchsten Serum-Verdünnung, die ein Signal ergibt, das min-destens doppelt so stark ist wie der Hintergrund.

3.3 Screening der Mammakarzinom-spezifischen cDNA-Expressionsbank mit Serum immunisierter Mäuse (SEREX)

3.3.1 Absättigung des Serums gegen E.coli-Proteine durchPseudoscreening

Da sich nahezu alle Lebewesen mit Coli-Keimen auseinandersetzen, enthält jedes Serum An-tikörper, welche gegen E.coli-Proteine gerichtet sind. Diese Immunglobuline binden an die inden Plaques durch Phagenlyse entstandenen Bakterienproteine. Da jeder an den Filter gebun-dene Antikörper, ob spezifisch oder unspezifisch, durch den Sekundärantikörper nachgewie-sen wird, verursachen anti-E.coli Antikörper eine starke Hintergrundfärbung sämtlicherPlaques. Um solche Antikörper vor dem Screening aus dem Serum zu entfernen, wird einsogenanntes Pseudoscreening durchgeführt. Extrakte von Coli-Proteinen werden an Nitro-zellulosefilter gebunden und diese mit dem Serum inkubiert. Anti-E.coli Antikörper binden andie Filter und werden so aus dem Serum entfernt. Das aufgereinigte Serum kann unter Zusatzvon Natrium-Azid mehrere Wochen im Kühlschrank gelagert werden, ohne seine Aktivität zuverlieren.

3 Methoden

51

A. Herstellung von Coli-Lysat

Zur Herstellung des zur Absättigung verwendeten Coli-Lysats werden die Wirtsbakterien derPhagen eingesetzt (XL1-Blue MRF‘).

MaterialLB-Tetrazyklin kleine PlattenLB-FlüssigmediumGlycerolstamm XL1-Blue MRF‘Lysispuffer

Durchführung(1) Die Bakterien werden wie bereits beschrieben (3.1.9) auf LB-Tetrazyklinplatten aus-

gestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.(2) Eine Kolonie von der Platte wird mit einer sterilen Öse in 100 ml LB-Flüssigmedium

überführt und die Kultur über Nacht bei 37°C geschüttelt.(3) Die Bakterien werden 10 min. bei 4°C und 5000 rpm zentrifugiert und das Pellet in

3 ml Lysispuffer resuspendiert.(4) Die Lösung wird 4-6 mal in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei Raumtemperatur

wieder aufgetaut.(5) Das Lysat wird auf Eis 6 mal für 20 sec. mit einer Ultraschallsonde sonifiziert.(6) Zelltrümmer werden durch 10 minütige Zentrifugation bei 12.000 rpm pelletiert und

der die Proteine enthaltende Überstand in frische Eppendorf-Gefäße aliquotiert. DasColi-Lysat wird bei –20°C gelagert.

B. Absättigung des Serums

MaterialTBS pH 7,5TBST pH 7,5 (TBS + 0,05% Tween)BSA0,45 µm Nitrozellulosefilter15 cm GlaspetrischalenColi-LysatColi-Phage-Lysate (Stratagene, La Jolla, CA)10% Na-Azid

Durchführung(1) Je 2 ml selbst hergestelltes Coli-Lysat und Coli-Phage-Lysate von Stratagene werden

mit TBST 1:40 auf 80 ml verdünnt.(2) Jede Lysatverdünnung wird in 2 Glaspetrischalen gegeben (2 mal 40 ml) und in jede

Schale werden zwei Nitrozellulosefilter gelegt (4 Filter pro Lysat).

3 Methoden

52

(3) Die Filter werden 30 min. bei Raumtemperatur langsam auf dem Rundschüttler be-wegt.

(4) Die Filter werden auf Whatman-Papier getrocknet und danach 4 mal für je 5 min. inTBS gewaschen (20 ml pro Filter).

(5) Die Blockierungsreaktion erfolgt 30 min. bei Raumtemperatur in TBS + 3% BSA.(6) Die Filter werden 3 mal für je 5 min. in TBST gewaschen.(7) 1 ml Serum wird in TBS auf 20 ml verdünnt und jeder Filter wird mit dem Serum

10 min. bei 37°C unter Schütteln inkubiert.(8) Das Serum wird mit 0,5% Na-Azid versetzt, um Bakterienwachstum zu verhindern

und bei 4°C gelagert.

3.3.2 Ausplattieren der cDNA-Expressionsbank und Übertragung derPhagenplaques auf Nitrozellulosefilter (Plaque Lift)

Pro 15 cm Agarplatte sollten nicht mehr als 40.000 pfu ausplattiert werden. Bei einer höherenDichte gehen die einzelnen Plaques ineinander über und eine saubere Detektion des Proteinsist nicht möglich. Die Vermehrung der Phagen erfolgt zunächst ohne die Zugabe von IPTG.Durch den von den Bakterien gebildeten Repressor wird die Synthese von rekombinantemFusionsprotein inhibiert. Da manche Fusionsproteine für die Bakterienzelle toxisch sind, wirddie Synthese rekombinanten Proteins erst mit beginnender Plaquebildung induziert, um einHochwachsen aller Klone zu ermöglichen. Dies geschieht durch Auflegen IPTG getränkterFilter nach einer Inkubationszeit von ca. 4 Std. Die Phagen werden weitere 3,5 Std. vermehrtund bilden in dieser Zeit innerhalb der Bakterien Fusionsprotein, das nach Lyse der Wirts-zellen in den Plaques vorliegt und auf Nitrozellulosefilter übertragen wird.

A. Präparation der Wirtszellen XL1-Blue MRF‘

Siehe 3.1.9 A

B. Plaque Lift

MaterialDie Angaben beziehen sich auf das Ausplattieren von 6 großen (15 cm) Agarplatten6 Stck. LB + 0,2% Maltose/10 mM MgSO4 große Platten~ 50 ml LB + 0,2% Maltose/10 mM MgSO4 Top-AgarSM-PuffercDNA-Expressionsbank3,6 ml XL1-Blue MRF‘ OD 0,5 in 10 mM MgSO4

1,6 ml 0,5 M IPTGsteriles dd H2O6 NitrozellulosefilterKimwipe-Tücher

3 Methoden

53

StempelkissentinteTuberkulinspritzeKanüle 0,7 mmTBS pH 7,5MagermilchpulverGlaspetrischalen mit Deckel

Durchführung(1) Die cDNA-Expressionsbank wird 1:100 in SM-Puffer verdünnt.(2) 6 x 600 µl XL1-Blue OD 0,5 werden mit je einem Volumen der verdünnten Bank infi-

ziert, das ca. 40.000 pfu entspricht.(3) Das Gemisch wird 15 min. bei 37°C und 175 rpm inkubiert.(4) In der Zwischenzeit wird der Top-Agar in der Mikrowelle erhitzt und kann anschlie-

ßend abkühlen.(5) Die Bakterien-Phagen-Suspension wird in sterile 15 ml Röhrchen überführt, mit je

7,5 ml handwarmem Top-Agar gemischt und auf 15 cm Agarplatten gegossen.(6) Die Platten werden 20 min. bei Raumtemperatur belassen, damit der Agar aushärtet.(7) Die Platten werden für 3,5-4,5 Std. bei 42°C inkubiert, bis kleine Plaques gerade sicht-

bar werden.(8) Während dieser Inkubationsphase wird 1,6 ml 0,5 M IPTG-Lösung mit sterilem

Wasser auf 80 ml verdünnt (10 mM Lösung) und je 40 ml in eine große Petrischale ge-füllt.

(9) Die Nitrozellulosefilter werden numeriert, sukzessive in die IPTG-Lösung gelegt, bisdie Oberfläche vollständig benetzt ist, 10-20 min. inkubiert und dann auf Kimwipe-Tüchern getrocknet.

(10) Sobald auf der gesamten Platte kleine Plaques zu sehen sind, werden die Filter auf denAgar gelegt.

(11) Die Phagen werden weitere 3,5 Std. bei 37°C vermehrt. 20 min. vor Ende der Inku-bationszeit werden die Deckel der Petrischalen geöffnet, um die Platten zu trocknenund somit das Abziehen der Filter zu erleichtern.

(12) Die Platten werden auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Lage der Filter muß markiertwerden, um das Identifizieren positiver Klone auf den Platten sicherzustellen. Die Fil-ter werden jeweils am Rand an drei asymmetrischen Punkten mit einer Kanüle durch-stochen und etwas Tinte in den Agar gespritzt.

(13) Die Filter werden mit einer Pinzette abgezogen und in TBS überführt. Die Protein-tra-gende Seite sollte sich hierbei oben befinden. Jede Petrischale kann mit bis zu 4 Filternbestückt werden. Das Puffervolumen pro Filter sollte mindestens 20 ml betragen, umein Aneinanderkleben der Nitrozellulose zu verhindern.

(14) Die Filter werden 2 mal 15 min. und abschließend noch einmal 30 min. in TBST ge-waschen.

(15) Die Absättigung freier Bindungsstellen erfolgt in TBS + 5% Magermilchpulver überNacht bei 4°C.

3 Methoden

54

3.3.3 Inkubation der Filter mit Serum

MaterialTBS pH 7,5TBST pH 7,5 (TBS + 0,05% Tween)Mausserum10% Na-AzidWaschpuffer TBST pH 7,5 + 1% BSAMagermilchpulverGlaspetrischalen mit Deckel

Durchführung(1) Nach dem Blocken werden die Filter 2 mal 15 min. in TBS gewaschen.(2) Um 6 Blots zu screenen muß das Serum auf ein Volumen von mindestens 90 ml ver-

dünnt werden (15 ml pro Blot). 8 µl Serum werden in 90 ml TBST aufgenommen(Verdünnung 1:11.250) und 90 µl 10%iges Na-Azid (Endkonzentration 0,1%) sowie240 mg Magermilchpulver (Endkonzentration 0,2%) hinzugegeben.

(3) Jeder Filter wird einzeln in einer Petrischale mit 15 ml des verdünnten Serums überNacht bei Raumtemperatur auf einem Rundschüttler inkubiert.

(4) Am nächsten Tag wird das Serum abpipettiert, mit 0,5% Na-Azid (finale Konzen-tration) versetzt und im Kühlschrank aufgehoben.

(5) Die Blots werden 3 mal 10 min. in TBST + 1% BSA gewaschen.

3.3.4 Nachweis gebundener Antikörper im APAAP-Assay (AlkalischePhosphatase-Anti Alkalische Phosphatase-Assay)

Gebundene Antikörper können auf den Blots durch enzymgekoppelte Sekundärantikörper(anti-Maus) nachgewiesen werden. Das Enzym setzt ein bestimmtes Substrat zu einem Farb-stoff um. Auf dem Blot bildet sich an der Stelle, an die Antikörper gebunden haben, ein farbi-ger Niederschlag. Die Enzymreaktion mit Alkalischer Phosphatase ergibt eine rötliche Farb-reaktion.Das APAAP-System basiert auf einer Verstärkung der AP-Wirkung durch VernetzungAP-bindender-Antikörper über Brückenantikörper.

3 Methoden

55

Y

YY

Y

Antigen

Maus-Serumantikörper

Kaninchen anti-Maus

„Brückenantikörper“

Maus anti-AP

AP

Substrat AP = Farbreaktion

Y

Abbildung 3.3.4 APAAP-Assay

MaterialWaschpuffer TBST pH 7,5 + 1% BSA20 mM Tris-Cl pH 8,2Brücken-Antikörper: Kaninchen-anti-MausÜberstand Maus anti-Alkalische Phosphatase AntikörperNaphthol-AS-BisphosphatDMFLevamisolFast RedFaltenfilter 595 ½Whatman-Papier

Durchführung(1) Der Brücken-Antikörper wird 1:30 in Waschpuffer verdünnt und die Blots 1 Std. mit je

15 ml Antikörper-Lösung unter Schütteln inkubiert.(2) Der Brücken-Antikörper wird abpipettiert und aufgehoben. Die Blots werden 3 mal

5 min. mit Waschpuffer gewaschen.(3) Danach werden die Filter 1 Std. mit je 15 ml des Maus anti-Alkalische Phosphatase-

Überstandes inkubiert. Dieser wird ebenfalls abpipettiert und aufgehoben. Die Blotswerden wie oben gewaschen.

(4) Die Schritte (1)-(3) werden einmal wiederholt. Die Inkubationszeit der Antikörper be-trägt 45 min.

Entwickler-Lösung

3 Methoden

56

(5) Die Filter werden 2 mal mit Waschpuffer und abschließend 4 mal mit Tris-Cl pH 8,2 jefür einige min. gewaschen.

(6) Die Entwicklerlösung wird wie folgt angesetzt: 40 mg Naphthol-AS-Bisphosphat wer-den in 4 ml DMF aufgenommen. Das Naphthol, 20 mg Levamisol sowie 200 mg FastRed werden in 200 ml Tris-Cl pH 8,2 gelöst. Der Entwickler wird durch Faltenfilterfiltriert, um ungelöstes Fast Red zu entfernen.

(7) Die Blots werden 2 Std. bei 37°C mit je 20 ml Entwickler unter Schütteln inkubiert.Die Reaktion wird mit Wasser abgestoppt und die Filter auf Whatman-Papier getrock-net.

3.3.5 Separation positiver Plaques von der Platte

Um positive Signale in einem 2. Screening zu bestätigen, werden positive Plaques aus demAgar ausgestochen, die enthaltenen Phagen aufgereinigt und erneut ausplattiert.

MaterialKopierfolieKanüle 0,7 mmSM-Puffergelbe PipettenspitzenChloroform

Durchführung(1) Die Kopierfolie wird auf Form und Größe der Filter zugeschnitten. Positve Plaques

sowie die Lagemarkierungen werden auf die Folie übertragen.(2) Die Folien werden von außen unten auf die Agarplatten gelegt und die Bereiche posi-

tiver Plaques durch Einstechen der Kanüle in die Petrischale markiert. Es entsteht einkleines Loch im Kunststoff, das mit Folienstift farbig markiert wird.

(3) Das spitze Ende einer gelben Pipettenspitze wird abgeschnitten. Mit der Pipettenspitzewird der Bereich um den markierten Plaque ausgestochen und in 500 µl SM-Puffer+ 20 µl Chloroform überführt.

(4) Das Agarstück wird gevortext und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Phagen diffun-dieren in den Puffer.

(5) Das Gemisch wird 4 min. bei 10.200 rpm zentrifugiert und der Überstand in neueEppendorf-Gefäße übertragen.

(6) Es werden 5% Chloroform (finale Konzentration) hinzupipettiert, die Lösung gemischtund 15 min. bei Raumtemperatur inkubiert, um Bakterien und Zelltrümmerauszufällen.

(7) Die Reaktion wird 10 min. bei 4400 rpm zentrifugiert und der Überstand in frischeEppendorf-Gefäße pipettiert. Der Phagenlösung wird 0,3% Chloroform (finale Kon-zentration) zugesetzt. Die Lagerung erfolgt im Kühlschrank.

3 Methoden

57

3.3.6 Subklonierung positiver Phagen zur Vereinzelung positiver Plaques

Um für eine Insertsequenzierung einen einzelnen, positiven Plaque zu gewinnen, müssen diepositiven Klone vereinzelt werden. Dies geschieht durch Ausplattieren steigender Verdün-nungen der positiven Phagen. Eine Plaquedichte von 500-750 pfu pro 15 cm Agarplatte er-möglicht zumeist die Separation einzelner Klone.

MaterialSiehe 3.3.2 bis 3.3.5

Durchführung(1) Titer positive Klone 1. Screening

Der Titer der aufgereinigten positiven Phagen des 1. Screenings wird bestimmt. Er be-trägt erfahrungsgemäß 106-107 pfu/ml. Es wird je 1 µl einer 5 x 10-2 und einer2,5 x 10-2-Verdünnung ausgestrichen (siehe 3.1.9), auf eine Blau-Weiß-Selektion kannverzichtet werden.

(2) 2. ScreeningEs werden je 20.000 pfu der positiven Plaques des 1. Screens eingesetztsiehe 3.3.2 bis 3.3.4

(3) Separation positive Plaques 2. Screeningsiehe 3.3.5

(4) Titer positive Klone 2. Screeningsiehe (1)

(5) 3. Screening, Vereinzelung positiver KloneEs werden 500-750 pfu der positiven Phagen des 2. Screenings ausplattiertsiehe 3.3.2 bis 3.3.4

(6) Separation einzelne positive Plaques 3. Screeningsiehe 3.3.5

(7) Titer Klone 3. Screeningsiehe (1)

3.3.7 Excision des p-Bluescript-Plasmids aus λ-Phagen mit ExAssistHelferphagen

A. Präparation der Wirtszellen

MaterialLB-Tetrazyklin kleine PlattenLB-Kanamycin kleine PlattenGlycerolstamm XL1-Blue MRF‘Glycerolstamm SOLRLB + 0,2% Maltose/MgSO4-Flüssigmedium

3 Methoden

58

LB-Flüssigmedium10 mM MgSO4

DurchführungDie Gewinnung der Wirtsbakterien erfolgt wie unter 3.1.9 A beschrieben. Die XL1-Blue-Zellen werden auf LB-Tetrazyklin ausgestrichen und in LB + 0,2% Maltose/MgSO4 inku-biert. Der SOLR-Stamm wird auf LB-Kanamycin ausgestrichen und in LB kultiviert. Fürdie Flüssigkulturen wird je eine Bakterienkolonie in 4 ml Medium aufgenommen, bis zueiner OD von 0,8-1,0 vermehrt und 10 min. bei 2200 rpm zentrifugiert. Das Pellet wird in1 ml 10 mM MgSO4 resuspendiert und bei 4°C gelagert. Vor ihrer Verwendung werden dieBakterien mit 10 mM MgSO4 auf eine OD von 1,0 verdünnt.

B. Excision

MaterialXL1-Blue MRF‘ OD 1,0 in 10 mM MgSO4

SOLR OD 1,0 in 10 mM MgSO4

2 x YT FlüssigmediumPositiver Phagenklon (> 50.000 pfu)ExAssist (> 1 x 106 pfu/µl)LB-Ampicillin kleine Platten

Durchführung(1) 200 µl XL1-Blue MRF‘ OD 1,0 werden mit 100 µl des λ-Phagen-Klons (> 50.000

pfu/ml) und 1 µl ExAssist-Helferphagen in einem 50 ml Röhrchen gemischt und15 min. bei 37°C und 190 rpm geschüttelt.

(2) Es werden 5 ml 2 x YT-Flüssigmedium hinzugegeben und die Kultur weitere 2,5 Std.bei 37°C unter Schütteln inkubiert.

(3) Die Bakterien-Phagen-Suspension wird 20 min. auf 70°C erhitzt, um die Wirtszellenabzutöten.

(4) Die Bakterien werden 15 min. bei 4000 x g pelletiert, der die Phagmide enthaltendeÜberstand wird in neue Röhrchen überführt und im Kühlschrank gelagert.

(5) Je 200 µl SOLR-Zellen OD 1,0 werden mit 1 µl und 25 µl des Phagmid-Überstandesvermischt und 15 min. bei 37°C inkubiert.

(6) Von dem 1 µl-Ansatz werden 15 µl, von dem 25 µl-Ansatz 5 µl auf LB-Ampicillin-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C kultiviert.

3.3.8 Plasmid-DNA-Minipräparation

Es wird das QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) verwendet. Dieses basiert auf derMethode der alkalischen Lyse nach Birnboim & Doly (1979). Die Bakterien werden in einem

3 Methoden

59

NaOHSDS-Puffer (Puffer P2) unter Zusatz von RNase lysiert. SDS löst Phospholipide undProteine aus der Zellwand, die alkalischen Bedingungen führen zur Denaturierung der Pro-teine sowie chromosomaler und Plasmid-DNA. Die optimale Lysisdauer ermöglicht maxi-male Freisetzung von Plasmid-DNA ohne gleichzeitige Fällung von chromosomaler DNA.Durch Zugabe von Puffer N3 wird das Lysat neutralisiert und eine hohe Salzkonzentrationeingestellt. Durch eine Erhöhung der Salzkonzentration werden denaturiertes Protein, chro-mosomale DNA, Zelltrümmer und SDS präzipitiert. Plasmid-DNA wird renaturiert und bleibtin Lösung.Der die Plasmid-DNA enthaltende Überstand wird auf QIAprep-Säulen aufgetragen und dieDNA an die Silica-Gel-Membran gebunden. In mehreren Waschschritten werden Endo-nucleasen (Puffer PB) und Salze (Puffer PE) entfernt. Die DNA wird mit sterilem Aqua Dest.von der Säule eluiert.

MaterialLB-FlüssigmediumAmpicillin (50mg/ml)QIAprep Spin Miniprep KitAutoklaviertes ddH2O

Durchführung(1) 3 ml LB-Flüssigmedium werden mit 6 µl Ampicillin (Endkonzentration 100 µg/ml)

versetzt und mit einer Bakterienkolonie inokuliert.(2) Die Kultur wird über Nacht bei 37°C und 200 rpm inkubiert.(3) 1,5 ml der Übernachtkultur werden in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und die

Bakterien für 5 min. bei 6000 rpm pelletiert.(4) Das Pellet wird in 250 µl Puffer P1 (Resuspendierungspuffer) durch mehrmaliges Auf-

und Abpipettieren gelöst.(5) Nach Zugabe von 250 µl Puffer P2 (Lysispuffer) werden die Bakterien durch fünfma-

liges Invertieren lysiert.(6) Es werden 350 µl Puffer P3 (Neutralisierungspuffer) hinzugegeben, die Gefäße wieder

fünfmal invertiert und das Präzipitat 10 min. bei 14.000 rpm abzentrifugiert.(7) Der Überstand wird auf QIAprep Spin-Säulen übertagen, die in ein 2 ml Sammel-

röhrchen gesteckt werden.(8) Nach einminütiger Zentrifugation (14.000 rpm) wird der Durchfluß verworfen, 500 µl

Puffer PB auf die Säule gegeben und erneut wie zuvor zentrifugiert.(9) Der Durchfluß wird entfernt und die Matrix mit 750 µl Puffer PE gewaschen (Zentri-

fugation 1 min., 14.000 rpm).(10) Das Filtrat wird verworfen und die Säule noch einmal 1 min. bei 14.000 rpm zentrifu-

giert, um die Matrix vollständig zu trocknen.(11) Die Säule wird in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Gefäß gesteckt und 50 µl ddH2O in die

Mitte der Membran pipettiert. Nach einer Inkubation von 1 min. wird die Plasmid-DNA durch Zentrifugation (1 min., 14.000 rpm) eluiert.

3 Methoden

60

3.3.9 Anlegen von Bakterien-Glycerolstämmen

Von SOLR Bakterien, die das pBluescript-Plasmid positiver Klone tragen, werden alsBackups Aliquots bei –80°C eingefroren.

MaterialLB-Ampicillin Platten mit SOLR-Einzelkolonien (von Excision)LB-Ampicillin Flüssigmedium87% Glycerol, steril filtriert

Durchführung(1) Eine Bakterienkolonie wird von der Platte in 3 ml LB-Ampicillin überführt(2) Die Bakterien werden bis zu einer OD von 0,8-1,0 kultiviert.(3) Um eine Endkonzentration von 15% zu erreichen werden zu 3 VT Bakterienkultur

0,7 VT 87%iges Glycerol gegeben.(4) Die Lösung wird gut gemischt, aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei

–80°C gelagert.

3.3.10 Restriktionsverdau des pBluescript-Plasmids undGrößenbestimmung des Inserts im Gel

Um die Insertgröße zu ermitteln, werden die aus der λ-Phagen-DNA mittels Helferphagenamplifizierten Plasmide Xho I/EcoR I verdaut. Das Insert wird herausgeschnitten und dieGröße kann durch Agarosegelelektrophorese bestimmt werden.

MaterialPlasmid-DNARestriktionsenzym Xho IRestriktionsenzym EcoR I10x Restriktionsenzympuffer HAutoklaviertes ddH2OMineralöl

Durchführung(1) In ein 0,5 ml Eppendorf-Gefäß werden pipettiert:

4,0 µl Plasmid-DNA4,0 µl ddH2O

3 Methoden

61

1,0 µl 10x Puffer H0,5 µl EcoR I0,5 µl Xho I

10,0 µl

Die Reaktion wird gemischt und mit einem Tropfen Öl überschichtet.(2) Die DNA wird über Nacht bei 37°C verdaut.(3) Jede Reaktion wird mit 3 µl Ladepuffer aufgefüllt und in einem 1%igen Agarosegel

analysiert (siehe 3.1.3). Durch Vergleich mit einem 100 bp-Größenstandard kann dieGröße des Inserts bestimmt werden.

3.3.11 Plasmid-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode

Die DNA-Sequenzierung wurde nach der enzymatischen Didesoxy-Kettenabbruch-Methode(Sanger et al., 1977) durchgeführt. Sie beruht auf dem Einbau eines 2‘,3‘-Didesoxynukleotids(ddNTP), so daß die DNA-Polymerase aufgrund der fehlenden OH-Gruppe des ddNTP denneu zu synthetisierenden Strang nicht weiter verlängern kann. Es wurde das Big-Dye Termi-nator Sequenzierkit von PE Applied Biosystems verwendet. Hierbei sind die Desoxynukleo-tide mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert, die es ermöglichen, die entste-henden PCR-Fragmente in einer anschließenden Gelelektrophorese mittels Laser zu detektie-ren. Der Reaktionsmix des Kits enthält bereits Taq-Polymerase, Reaktionspuffer und die mitFarbstoffen markierte Nukleotidmischung. Zur Durchführung der PCR-Reaktion müssen nurnoch Plasmid-DNA und die gewünschten Primer hinzugegeben werden. Die Herstellung desPolyacrylamid-Sequenzgels sowie die Gelelektrophorese auf dem ABI-PRISM 377 DNA-Sequencer erfolgten im Sequenzierlabor des SFB 502 und werden nicht näher beschrieben.

MaterialABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction KitPlasmid-DNASequenzierprimer T3 und T7 (2,5 µM)3M Na-Azetat mit Dextranblau100% und 70% Ethanol

Durchführung(1) In ein 0,5 ml PCR-Röhrchen werden pipettiert:

10,7 µl Plasmid-DNA1,3 µl T3 bzw. T7 Primer (2,5 µM)8,0 µl Terminator Ready Reaction Mix

20,0 µl

3 Methoden

62

(2) Die Reaktion wird durch Auf-und Abpipettieren gemischt und mit 40 µl Mineralölüberschichtet.

(3) Es werden 35 Zyklen des folgenden PCR-Programms ausgeführt:96°C 30 sec.50°C 15 sec.60°C 4 min.

Danach wird die Lösung auf 4°C heruntergekühlt.

(4) Die Reaktion wird ohne Öl in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 2 µl 3M Na-Azetat sowie 50 µl 100%igem Ethanol gemischt.

(5) Die DNA wird 30 min. bei Raumtemperatur gefällt und anschließend bei 4°C und15.000 rpm für 30 min. pelletiert.

(6) Das Pellet wird mit 250 µl 70%igem Ethanol gewaschen und erneut 10 min. bei 4°Czentrifugiert.

(7) Das PCR-Produkt wird 1 min. bei 90°C getrocknet und bis zur Auftragung auf das Gelbei -20°C aufbewahrt.

3.4 Genexpressionsanalysen

3.4.1 Polymerase chain reaction (PCR)

Das Prinzip der PCR beruht auf einer zyklischen Wiederholung dreier Reaktionsschritte, diebei unterschiedlichen Temperaturen ablaufen. Im ersten Schritt werden die zu amplifizieren-den DNA-Moleküle durch Hitze denaturiert. Die DNA-Stränge lösen sich voneinander undermöglichen so im nächsten Schritt eine Primer-Anlagerung (Denaturierung). Die Primerhybridisieren unter geeigneten Temperaturbedingungen mit je einem der beiden DNA-Einzel-stränge. Hierbei lagert sich der sogenannte „For-Primer“ an den „Sense-Strang“ (+Strang) undder „Back-Primer“ an den Antisense-Strang (-Strang) (Annealing). Im letzen Teil der PCR-Reaktion erfolgt die Verlängerung dieser Startermoleküle entlang der einzelsträngigenMatrize durch eine hitzestabile Taq-DNA-Polymerase (Elongation).

5´ 3´

Sense-Strang

5´3´For-Primer

3´ 5´

Antisense-Strang

3´5´Back-Primer

Abbildung 3.4.1 PCR

3 Methoden

63

Polymerase-Ketten-Reaktionen werden in sogenannten programmierbaren „Thermal Cyclern“durchgeführt. Diese enthalten entweder einen Heizblock, welcher innerhalb kurzer Zeit zwi-schen den erforderlichen Temperaturen hin- und herwechselt oder die Reaktionsgefäßewerden über einen schwenkbaren Arm in Blöcken unterschiedlicher Temperatur plaziert(„Robocycler“). Das PCR-Produkt kann anschließend durch eine Agarosegelelektrophoreseanalysiert werden. Werden Primer verwendet, welche einen Abschnitt eines bestimmten Gensamplifizieren, so kann die Genexpression in der cDNA von Zellen oder Geweben evaluiertwerden. Eine Quantifizierung durch anschließende Mengenbestimmung des PCR-Produkts imGel oder im Photometer ist jedoch nur schwer möglich und mit vielen Fehlern behaftet.

MaterialMatrizen-DNA10x Taq-Polymerase-PufferdNTP-Mix (je 10 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP)For- und Back-Primer (100 ng/µl)Taq-DNA-PolymeraseddH2OMineralöl

Durchführung(1) Pro 50 µl PCR-Reaktion werden eingesetzt:

36,5 µl ddH2O5,0 µl 10x Taq-Polymerase-Puffer1,0 µl For-Primer1,0 µl Back-Primer1,0 µl dNTP-Mix5,0 µl Matrizen-DNA0,5 µl Taq-Polymerase

(2) Der Ansatz wird mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet und die DNA wird mitfolgendem Programm amplifiziert:

95°C 5 min. → initiale Denaturierung

30-65°C 2 min. → initiale Primer-Anlagerung (Annealing)

68°C 3 min. → initiale DNA-Synthese (Elongation)

95°C 30 sec. → Denaturierung

30-65°C 30 sec. → Annealing

68°C 2 min. → Elongation

68°C 10 min. → abschließende Elongation

4°C Pause → Kühlung des PCR-Produktes

(3) Die amplifizierte DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen und analysiert.

35 Zyklen

3 Methoden

64

3.4.2 One Step RT-PCR

Die RT-PCR unter Verwendung einer normalen PCR-Maschine eignet sich zum Nachweiseines bestimmten Gens in einer RNA-Präparation. Die mRNA wird mit genspezifischenPrimern unter Zusatz von dNTPs und einer Reversen Transkriptase zunächst in cDNA umge-schrieben. Nach Hitzeinaktivierung der Reversen Transkriptase wird die cDNA in einer PCR-Reaktion vervielfältigt. Mittels einer solchen RT-PCR kann die Genexpression in der RNAvon Zellen oder Geweben dokumentiert werden. Mit dem ProSTAR™-RT-PCR-System vonStratagene ist es möglich, cDNA-Synthese und anschließende PCR in einem Reaktionsgefäßunter Verwendung eines PCR-Programmes durchzuführen.

MaterialGesamt-RNAProSTAR™ HF Single-Tube RT-PCR System (High Fidelity) (Sratagene, La Jolla, CA)Genspezifische Primer (100 ng/µl)

Durchführung(1) Es werden in ein 0,5 ml PCR-Röhrchen pipettiert:

39,5 µl RNase-free water5,0 µl 10x HF RT-PCR buffer1,0 µl Genspezifischer Primer For1,0 µl Genspezifischer Primer Back1,0 µl dNTP Mix (40mM)1,0 µl RNA

(2) Die MMLV-RT wird wie folgt verdünnt:6,7 µl RNase-free water0,8 µl 10x HF RT-PCR buffer0,5 µl MMLV-RT

8,0 µl

(3) 1,0 µl der verdünnten MMLV-RT und 0,5 µl TaqPlus Precision DNA PolymeraseMixture werden zur Reaktion pipettiert.

(4) Der Ansatz wird gemischt und mit 40 µl Mineralöl bedeckt.(5) Auf einem „Thermal Cycler“ wird folgendes Programm ausgeführt:

37°C 15 min. → cDNA Synthese

95°C 1 min. → Hitzeinaktivierung RT


60°C 30 sec. → Primer Annealing

68°C 2 min. → Elongation



40 Zyklen

3 Methoden

65

(6) Die Analyse des PCR-Produktes erfolgt in 1%igem Agarosegel.

3.4.3 Quantifizierung der Genexpression mittels real time PCR auf demLightCycler™

3.4.3.1 Besonderheiten der PCR-Reaktionskomponenten für die Quantifizierung

Die LightCycler™-Kits beinhalten ein fertiges Reaktionsmix sowie 25 mM MgCl2-Lösungzum Einstellen der optimalen MgCl2-Konzentration. Der DNA Master SYBR® Green I Mixenthält Reaktionspuffer, Taq-Polymerase, 10 mM MgCl2, SYBR® Green I sowie einen dNTP-Mix, in welchem dTTP durch dUTP ersetzt ist. Durch den Einbau von dUTP können nachZusatz von Uracil DNA Glycosylase (UNG) sogenannte „carry-over“ Kontaminationen ver-mieden werden. Durch Kontaminationen mit DNA vorheriger PCRs kann es zu falsch posi-tiven Ergebnissen kommen. Die Uracil DNA Glycosylase setzt Uracil aus einzel- und doppel-strängiger DNA frei und bedingt eine Degradation. LightCycler™ PCR-Ansätze werdendaher 5 min. mit hitzelabiler UNG inkubiert. Hierbei wird die dUTP enthaltende DNA frühe-rer Reaktionen degradiert. Native DNA-Matrizen oder Primer, welche kein dUTP tragen, blei-ben intakt. Zu Beginn des PCR-Laufes wird der Ansatz zunächst 2 min. auf 94°C erhitzt, umdie UNG zu zerstören.Um die Bildung von Primer-Dimeren, frühzeitige Elongationen sowie unspezifischen Primer-Anlagerungen zu verhindern, werden Quantifizierungs-PCRs auf dem LightCycler™ immermit einem Hot Start durchgeführt. Hierfür wird der Reaktion ein anti-Taq DNA PolymeraseAntikörper zugesetzt, der das Enzym bis zu einer Temperatur von 70°C inhibiert. Durch denersten 94°C Temperaturschritt wird der Antikörper zerstört. Für den LightCycler™ eignetsich nur dieses Verfahren, da die manuelle oder Wachs Hot Start-Technik aufgrund derschmalen Kapillaren nicht möglich sind.

3.4.3.2 Quantifizierung eines Gens in Gewebeproben cDNA

Ermittelt werden soll die cDNA-Menge eines bestimmten Gens in mehreren Tumorproben imVergleich zur Expression in einer Normalgewebe-Probe des gleichen Organs. Hiermit solluntersucht werden, ob das Gen im Tumorgewebe unter- oder überexprimiert ist.

A. Erstellung einer Standard-Verdünnungsreihe des zu amplifizierenden Gens

MaterialcDNA10x Taq-Polymerase-PufferdNTP-Mix (je 10 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP)genspezifische For- und Back-Primer (100 ng/µl)Taq-DNA-Polymerase

3 Methoden

66

ddH2OMineralölQIAquick Gel Extraction KitSkalpellIsopropanol

Durchführung(1) PCR(a) Pro 50 µl PCR-Reaktion werden pipettiert:

38,5 µl ddH2O5,0 µl 10x Taq-Polymerase-Puffer1,0 µl For-Primer1,0 µl Back-Primer2,0 µl dNTP-Mix2,0 µl cDNA0,5 µl Taq-Polymerase

(b) Der Ansatz wird mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet und die DNA wird aufeinem herkömmlichen „Thermal Cycler“ amplifiziert:

94°C 5 min. → initiale Denaturierung

60°C 5 min. → initiale Primer-Anlagerung (Annealing)

72°C 90 sec. → initiale DNA-Synthese (Elongation)


60°C 45 sec. → Annealing

72°C 90 sec. → Elongation



(2) Gelextraktion mit dem Qiaquick Gel Extraction KitWie bei anderen Qiagen-Säulen auch wird die aufzureinigende DNA unter hohen Salzkon-zentrationen an eine Silica-Membran gebunden. Es können DNA-Fragmente von 100 bp-10 kb aufgereinigt werden. Durch mehrere Waschschritte werden Primer, Enzyme, Salze,Nukleotide, Agarose und Öl entfernt. Die DNA wird mit ddH2O eluiert und kann alsTemplate für die LightCycler™-PCR eingesetzt werden.

(a) Die gesamte PCR-Reaktion wird ohne Öl auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen, dieBande unter UV-Licht ausgeschnitten und in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt.

(b) Das Gelstück wird gewogen und 3 VT Puffer QX1 hinzugegeben(100 mg = 300 µl Puffer).

(c) Die Reaktion wird 10 min. bei 50°C unter leichtem Vortexen inkubiert und mit einemGelvolumen Isopropanol versetzt.

35 Zyklen

3 Methoden

67

(d) Eine QIAquick-Säule wird in ein 2 ml-Sammelröhrchen gesteckt und mit der Probebeladen. Das maximale Ladevolumen beträgt 800 µl. Größere Volumina werden suk-zessive auf die Säule pipettiert, für jeweils eine min. bei 14.000 rpm zentrifugiert undder Durchfluß verworfen.

(e) Die Säule wird mit 0,5 ml Puffer QX1 gewaschen, wieder 1 min. bei 14.000 rpm zen-trifugiert und der Durchfluß entfernt.

(f) Der nächste Waschschritt erfolgt mit 750 ml Puffer PE. Die Probe wird wie zuvorzentrifugiert.

(g) Durch nochmalige Zentrifugation für 1 min. wird die Säule getrocknet und anschlie-ßend in einem neuen 1,5 ml Eppendorf-Gefäß plaziert.

(h) 50 µl ddH2O werden in die Mitte der Matrix pipettiert und die DNA 1 min. bei14.000 rpm eluiert.

(3) Verdünnung der Standard –DNA1 µl des aufgereinigten Templates werden in 99 µl ddH2O überführt (1:100). Hierzu werden100 µl ddH2O pipettiert (Verdünnung 1:1 der Standardreihe). Von dieser Verdünnung wer-den 10 µl in 90 µl H2O aufgenommen (Verdünnung 1:10). Auf diese Weise entsteht eineStandardreihe mit folgenden Verdünnungen: 1:1 / 1:10 / 1:100 / 1:1000 / 1:10.000 /1:100.000. Diese wird bei –20°C gelagert.

B. Photometrische Bestimmung der cDNA-Konzentration

MaterialQuarzküvettenddH2O

DurchführungDie cDNAs werden jeweils 1:500 oder 1:250 in ddH2O verdünnt und im Photometer bei260 nm gegen einen Leerwert (ddH2O) gemessen.

C. Quantifizierungs-PCR auf dem LightCycler™

Die optimalen PCR-Bedingungen müssen für jede zu amplifizierende DNA-Sequenz durchVorversuche ermittelt werden. Von besonderer Bedeutung ist hierbei die MgCl2-Konzen-tration. Diese kann von 1 mM bis 5 mM (finale Konzentration) variieren. Folgende Mengender MgCl2-Stammlösung müssen zur Reaktion gegeben werden, um die angegebene Konzen-tration zu erreichen:

Finale MgCl2-Konzentration (mM) 1 2 3 4 5

µl MgCl2-Stammlösung/Reaktion 0 0,8 1,6 2,4 3,2

MaterialLightCycler™-DNA Master SYBR® Green Igenspezifische For-und Back-Primer (100 ng/µl)

3 Methoden

68

anti-Taq AntikörperUracil DNA Glycosylase (UNG) (1U/µl)cDNAStandardverdünnungen der DNA des zu amplifizierenden GensLightCycler™-Kapillaren

Durchführung(1) Es wird ein Mastermix für alle Reaktionen angesetzt. Pro PCR-Reaktion werden

benötigt:0,16 µl anti-Taq-Antikörper1,00 µl UNG0,40 µl For-Primer (Endkonz. 5µM)0,40 µl Back-Primer

0 - 3,20 µl MgCl2-Stammlösung (25mM)14,04 -10,84 µl H2O

2,00 µl SYBR® Green I

18,00 µl

Die Mischung wird 5 min. bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert, um eine Anlagerungdes anti-Taq Antikörpers zu ermöglichen.(2) 18 µl des Mastermixes werden in jede Glaskapillare pipettiert. Zum Schluß wird die

Template DNA hinzugefügt, also je 2 µl der Verdünnungen des Standards sowiegleiche Mengen jeder cDNA-Probe (max. Volumen 2 µl).

(3) Die Reaktion wird einige sec. bei 100 x g in den Kapillaren herunterzentrifugiert unddiese mit Plastikstopfen verschlossen.

(4) Auf dem LightCycler™ wird folgendes Programm ausgeführt:

95°C 2 min. → Hitzinaktivierung UNG

95°C peak → Denaturierung

60°C 15 sec. → Annealing

72°C 16 sec. → Elongation

Schmelzkurve

(5) Mit dem Quantifizierungsprogramm des LightCyclers™ können die fiktiven Kopien-zahlen des amplifizierten Gens bestimmt werden.

45 Zyklen

3 Methoden

69

3.5 Klonierung des CD30-Antigens in λ-Phagen

3.5.1 Amplifizierung des CD30-Antigens aus dem Vector pcDNA 3

Um die CD30-Antigen-Sequenz in den λ-Phagen-Vektor ZAP® II klonieren zu können, wer-den für die PCR Primer verwendet, die eine EcoR I-Schnittstelle (For-Primer) und eine Not I-Schnittstelle (Back-Primer) enthalten.

MaterialpcDNA 3-CD30-Antigen-Matrize10x Taq-Polymerase-PufferdNTP-Mix (je 10 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP)CD30 For-Primer (100 µM)CD30 Back-Primer (100 µM)Taq-DNA-PolymeraseddH2OMineralölQIAquick Gel Extraction Kit

Durchführung(1) Es wird Folgendes in ein 0,5 ml PCR-Gefäß pipettiert:

0,5 µl pcDNA 35,0 µl 10x Taq-Polymerase-Puffer2,0 µl dNTP-Mix5,0 µl MgCl2 (25mM)2,0 µl CD30 For-Primer2,0 µl CD30 Back-Primer

32,5 µl ddH2O1,0 µl Taq-DNA-Polymerase

50,0 µl

(2) Der Ansatz wird mit einem Tropfen Öl bedeckt und ein Standard-PCR-Programm miteiner Annealing-Temperatur von 56°C durchgeführt (siehe 3.4.3.2 A (1)).

(3) Die Reaktion wird über eine Gelextraktion mit dem QIAquick Kit aufgereinigt(siehe 3.4.3.2 A (2)).

3.5.2 Restriktionsverdau CD30-Antigen und λ-Phagen-DNA

Beide Nukleinsäuren werden EcoR I/Not I verdaut, um das CD30-Antigen in der korrektenRichtung in den Phagen-Vektor zu klonieren.

3 Methoden

70

MaterialAufgereinigte CD30-Antigen-DNALambda ZAP® II Undigested Vector KitRestriktionsenzym EcoR IRestriktionsenzym Not I10x Restriktionsenzympuffer HddH2OMineralöl

DurchführungDie Verdaus werden wie folgt angesetzt:

CD30-Antigen ZAP® II1,0 µl CD30-Antigen-DNA 0,2 µl ZAP® II-DNA (200 ng)1,0 µl 10x Puffer H 1,0 µl 10x Puffer H0,5 µl EcoR I 0,5 µl EcoR I0,5 µl Not I 0,5 µl Not I7,0 µl ddH2O 7,8 µl ddH2O

10,0 µl 10,0 µl

Die Reaktionen werden mit einem Tropfen Öl abgedeckt und 2,5 Std. bei 37°C inkubiert.

3.5.3 DNA-Gelextraktion

Um optimale Ligationsergebnisse zu erzielen, müssen die verdauten DNA-Stränge zunächstaufgereinigt werden. Für das 1147 bp große CD30 Antigen kann das QIAquick Gel ExtractionKit verwendet werden (siehe 3.4.3.2 A (2)). Die ZAP® II-DNA kann mit einer Größe von40 kb nur über das QIAEX II DNA Gel Extraction Kit gereinigt werden, da die QIAEX II-Partikel DNA bis zu einer Größe von 50 kb binden. Die Silicamatrix, an welche die DNAgebunden wird, befindet sich auf kleinen Kügelchen, welche zu dem gelösten Agarosestückgegeben werden. Unter hohen Salzkonzentrationen kommt es zur Adsorption der DNA an dieSilicapartikel. Die Partikel werden durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand verwor-fen. Waschpuffer wird hinzugegeben und die Kügelchen mit der gebundenen DNA durchvortexen resuspendiert und gewaschen. Nach mehrmaligem Waschen werden die Partikel inddH2O gelöst, die DNA eluiert und die Kügelchen abzentrifugiert.

x 2

3 Methoden

71

MaterialQIAEX II DNA Gel Extraction KitddH2O2 Verdaus ZAP® II-DNA

DurchführungSämtliche Zentrifugationsschritte werden bei 14.000 rpm durchgeführt.(1) Die verdaute Vektor-DNA wird ohne Öl auf ein 0,3%iges Agarosegel aufgetragen, die

Bande unter UV-Licht ausgeschnitten und in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt.(2) Das Gelstück wird gewogen und bei DNA-Fragmenten > 4kb werden 3 VT Puffer

QX1 sowie 2 VT ddH2O hinzugefügt (z.B. 100 mg = 300 µl QX1 + 200 µl ddH2O).(3) Die QIAEX II Partikel werden gevortext und 10 µl zum Ansatz pipettiert. Die Lösung

wird 10 min. bei 50°C inkubiert. Alle 2 min. wird leicht mit dem Finger gegen das Ge-fäß geschnippt, um die Reaktion zu mischen. Aufgrund der Größe der DNA darf dieReaktion nicht gevortext werden, da dies ein Auseinanderscheren der DNA-Strängezur Folge hätte.

(4) Die Partikel werden 30 sec. zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wirdin 500 µl Puffer QX1 resuspendiert (mit dem Finger gegen das Gefäß schnippen) undzentrifugiert. Der Überstand wird mit einer Pipette abgenommen und verworfen.

(5) Auf die gleiche Weise wird der Ansatz zweimal mit Puffer PE gewaschen.(6) Das Pellet wird 10-15 min. getrocknet bis es eine weiße Farbe annimmt. Es werden

20 µl ddH2O hinzugegeben und das Pellet resuspendiert. Um die DNA zu eluierenwird die Reaktion 10 min. bei 50°C inkubiert.

(7) Die QIAEX-Kügelchen werden 30 sec. abzentrifugiert und der die DNA enthaltendeÜberstand wird in ein neues Gefäß überführt.

(8) Ein zweiter Elutionsschritt kann angeschlossen werden. Er erhöht den DNA-Ertrag um10-15%.

3.5.4 Dephosphorylierung und Ethanolpräzipitation der ZAP® II-DNA

Um eine Autoligation unvollständig verdauter Vektor-DNA zu verhindern, wird diesedephosphoryliert.

Material3M Na-Azetat70% und 100% Ethanol10x DephosphopufferShrimps Alkalische PhosphataseddH2O

3 Methoden

72

Durchführung(1) Beide Verdaus (Volumen/Verdau nach Gelextraktion ca. 17 µl) werden in ein 0,5 ml

Eppendorf-Gefäß pipettiert und über Nacht gefällt (siehe 3.1.4 (3)).(2) Das Pellet wird getrocknet und in 15 µl ddH2O aufgenommen(3) Es wird Folgendes zum Ansatz pipettiert:

2,3 µl 10x Dephosphopuffer4,5 µl Shrimps Alkalische Phosphatase (1 U/µl)1,2 µl ddH2O

23,0 µl

Die DNA wird 30 min. bei 37°C dephosphoryliert.(4) Es erfolgt eine abschließende Ethanolfällung (siehe 3.1.4 (3)). Das Pellet wird in 1,3 µl

ddH2O resuspendiert.

3.5.5 Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration von Insert und Vektormit DNA-Standards

Das Vektor : Insert-Verhältnis ist für Ligationen in λ-Vektoren von besonderer Relevanz. Zugroße Mengen Insert führen zu einer schlechten Klonierungseffizienz. Daher ist es notwendig,die Konzentrationen der in die Ligation einzusetzenden DNA möglichst genau zu bestimmen.Dies geschieht mittels Agarosegelelektrophorese (siehe 3.1.3). Die Quantifizierung erfolgt fürdas CD30-Antigen und die ZAP® II-DNA in getrennten Gelen, da diese aufgrund der DNA-Größe unterschiedlich konzentriert sein müssen. Auf das Gel wird eine bestimmtes Volumender verdauten Nukleinsäure (CD30-Antigen 1µl, ZAP® II 0,2 µl) aufgetragen. In die benach-

barten Geltaschen wird je 6 µl eines DNA-Standards (λ-DNA-Längen-Standards, Life Tech-nologies, Rockville, MD) pipettiert. 6 µl dieses Standards entsprechen 15 ng, 31 ng und 63 ngDNA. Durch Vergleich der Fluoreszenzintensität der zu quantifizierenden Proben mit denStandards ist eine Mengenabschätzung möglich.

3.5.6 Ligation der CD30-Antigen-DNA in den λ-Phagen-Vektor ZAP® II

MaterialcDNA Synthesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)CD30-Antigen-DNA, EcoR I/Not I verdaut und gelextrahiertZAP® II-DNA, EcoR I/Not I verdaut, gelextrahiert, dephosphoryliert und gefälltddH2O

Durchführung(1) Es werden in ein 0,5 ml Eppendorf-Gefäß pipettiert:

0,8 µl CD30-Antigen-DNA (~12 ng)0,5 µl 10x ligase buffer

3 Methoden

73

0,5 µl 10 mM rATP0,3 µl ZAP® II-DNA (~4 ng)0,5 µl T4 DNA ligase (4U/µl)

5,0 µl

(2) Die Reaktion wird über Nacht bei 12°C inkubiert.

3.5.7 Etablierung eines stabilen, CD30-Antigen exprimierenden λ-Phagen-Klons

Die Methoden stimmen bis auf kleine Änderungen mit denen der Erstellung einer cDNA-Expressionsbank (3.1) überein. Daher erfolgt lediglich eine Aufzählung der einzelnen Ar-beitsschritte mit einem Verweis auf die bereits beschriebene Methode.

MaterialSiehe 3.1.8-3.1.10 und 3.3.5-3.3.11

Durchführung(1) Verpackungsreaktion

siehe 3.1.8Die gesamte Ligationsreaktion (5 µl) wird mit einem Packaging Extract verpackt.

(2) Titerbestimmung der Verpackungsreaktion mit Blau-Weiß-Selektionsiehe 3.1.9Es werden 50 µl der Verpackungsreaktion zur Titerbestimmung eingesetzt.

(3) Separation rekombinanter Klone von den Titerplattensiehe 3.3.5Die Klone werden gepickt, um eine Excision mit anschließender Sequenzierung desInserts durchzuführen. Hiermit soll sichergestellt werden, daß es sich bei dem Insertum das CD30-Antigen handelt. Weiterhin kann untersucht werden, ob das Insert imrichtigen Leserahmen kloniert wurde und somit das Protein korrekt gebildet wird. Erst

dann werden die zugehörigen λ-Phagen vermehrt, um einen stabilen Klon zu etablie-ren.

(4) Titerbestimmung der gepickten rekombinanten Klonesiehe 3.3.6

(5) Excision der rekombinanten Klonesiehe 3.3.7

(6) Plasmid-DNA-Minipräparationsiehe 3.3.8

(7) Restriktionsverdausiehe 3.3.10

3 Methoden

74

Es kann verifiziert werden, daß die Inserts der rekombinanten Klone die richtige Größeaufweisen (CD30-Antigen = 1147 bp)

(8) Sequenzierung der Insertssiehe 3.3.11

(9) Amplifizierung der gepickten, rekombinanten λ-Phagensiehe 3.1.10

(10) Titerbestimmungsiehe 3.1.9

3.6 Screening eines Gemisches aus Mammakarzinom-spezifischer cDNA-Expressionsbank und CD30-Antigen-Phagen mit einem anti-CD30 scFv (Ki-4) auf filamentösenPhagen

3.6.1 Ausstreichen des Ki-4-Bakterienklons auf Minimalmedium

Bei der Gewinnung („rescue“) von filamentösen Phagen werden Phagmid-tragende Bakterienmit Helferphagen infiziert, die den Phagenreplikationsursprung des Phagmids aktivieren,Phagenhüllproteine synthetisieren und Phagmid-DNA in neue Phagenpartikel verpacken. Hel-ferphagen können ihre Wirtszellen nur über den F‘-Pilus infizieren. Daher ist es wichtig, daßdie Baktrien das für den F‘-Pilus kodierende Episom nicht im Verlaufe der Lagerung oderKultivierung verlieren. Um das F‘-Episom selektiv aufrechtzuerhalten, werden die Ki-4-Bak-terien vor der Gewinnung von Phagen auf Minimalmedium ausgestrichen und Glycerol-stämme angelegt.

MaterialMinimalmedium kleine PlattenGlycerolstamm TG-1-Bakterien mit Ki-4-Phagmid2 x YT-Ampicillin-FlüssigmediumGlycerol 87%

Durchführung(1) 50 µl des Glycerolstamms wird auf einer Minimalmedium-Platte ausgestrichen und

2 Tage bei 37°C inkubiert.(2) Eine Kolonie wird von der Platte in 100 ml 2 x YT-Ampicillin überführt und die Kul-

tur über Nacht bei 37°C geschüttelt.(3) Die Bakterien werden bei 3000 rpm 10 min. zentrifugiert und das Pellet in 500 µl

2 x YT-Ampicillin resuspendiert.

3 Methoden

75

(4) Die Lösung wird mit 15% (finale Konzentration) Glycerol versetzt, aliquotiert, inflüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.

3.6.2 Mischen und Ausplattieren der λ-Phagen

Die zuvor erstellte Mammakarzinom-spezifische cDNA-Expressionsbank wird mit dem

CD30-Antigen exprimierenden λ-Phagen-Klon im Verhältnis 1:1 gemischt. Die Phagen wer-den wie bereits unter 3.3.2 für das SEREX-System beschrieben ausplattiert. Als Wirts-bakterien werden statt XL1-Blue MRF‘ XL1-Blue MR eingesetzt. Diese besitzen kein F‘-Episom und müssen daher auf LB-Platten ausgestrichen werden.

3.6.3 Gewinnung der Ki-4 scFv-tragenden filamentösen Phagen (phagerescue)

Bei der Gewinnung von filamentösen Phagen aus phagmidtragenden Bakterien mittels Hel-ferphagen müssen durch mehrere Präzipitationsschritte die Phagen von löslichen scFvs undBakterien getrennt werden. Da die Suppression des Amber-Stop-Codons zwischen scFv undgp3-Protein in TG-1 Zellen nur zu 20% effektiv ist, wird auch lösliches scFv gebildet, wel-ches Bindungsstellen für scFv-tragende Phagen blockiert. Zudem werden die Antikörper-fragmente teilweise proteolytisch von den Phagen abgespalten und liegen ebenfalls frei vor.Vor einer Selektion müssen diese löslichen single chains entfernt werden, da es zu einerKompetition mit den scFv-tragenden Phagen kommen könnte.

MaterialGlycerolstamm TG-1 mit Ki-4-Phagmid2 x YT-Ampicillin-Flüssigmedium2 x YT-Ampicillin/Kanamycin-FlüssigmediumGlukose 20%PEG 20%TBS pH 7,5Helferphagen M13-KO7 (1011 pfu/ml)

Durchführung(1) 45 ml 2 x YT-Ampicillin werden in einem 250 ml Glaskolben mit 5 ml 20%iger Glu-

kose versetzt (Endkonzentration 2%) und mit 10-20 µl des TG-1-Glycerolstammsinokuliert.

(2) Die Bakterien werden bei 37°C und 250 rpm bis zu einer OD von 0,5 vermehrt.(3) Von der Bakterienkultur werden 5 ml abgenommen und in einem 50 ml Falcon-Röhr-

chen mit 50 µl Helferphagen 30 min. bei 37°C im Wasserbad inkubiert.

3 Methoden

76

(4) Die Bakterien werden 10 min. bei 4000 rpm abzentrifugiert und der Überstand wirdverworfen. Das Pellet wird in 25 ml 2 x YT-Ampicillin/Kanamycin aufgenommen. DieProduktion scFv-tragender Phagen erfolgt über Nacht bei 30°C und 250 rpm.

(5) Die Übernacht-Kultur wird in ein 50 ml-Röhrchen überführt und die Bakterien werden20 min. bei 4000 rpm und Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand enthält Fusions-protein-tragende Phagen, lösliche scFvs und Reste von Bakterien.

(6) Der Überstand wird in ein neues Gefäß transferiert, mit 5 ml PEG-Lösung gut ge-mischt und 1 Std. auf Eis inkubiert.

(7) Der Ansatz wird 15 min. bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert und der Überstand ver-worfen. Mit diesem Schritt werden Bakterien und Phagen pelletiert, lösliche scFvsverbleiben im Überstand.

(8) Das Pellet wird in 1 ml TBS gelöst und in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß pipettiert.Durch 2 minütige Zentrifugation bei 14.000 rpm (RT) werden die restlichen Bakterienpelletiert.

(9) Der phagenhaltige Überstand wird in einem neuen Gefäß mit 150 µl PEG versetzt,gemischt und 20 min. auf Eis gefällt.

(10) Phagen und Bakterien werden erneut abzentrifugiert (14.000 rpm, 5 min., RT) und in1 ml TBS resuspendiert. Abschließend werden die verbliebenen Bakterien durch Zen-trifugation (14.000 rpm, 2 min., RT) entfernt und der Überstand abermals in einfrisches Gefäß überführt. Die scFv-tragenden filamentösen Phagen können sofort zurSelektion eingesetzt oder einige Tage bei 4°C gelagert werden.

3.6.4 Titerbestimmung phage rescue

Material1,5 ml TG-1 OD 0,5, gepickt von Minimalplatte1 ml phage rescue2 x YT-Flüssigmedium2 x YT-Ampicillin kleine Platten

Durchführung(1) Die gewonnenen Phagen werden in 10-2 er Schritten bis 10-13 verdünnt (je 5 µl rescue

in 495 µl 2 x YT)(2) Je 500 µl von Verdünnung 10-9, 10-11 und 10-13 werden mit 500 µl TG-1 OD 0,5 ge-

mischt und 30 min. bei 37°C im Wasserbad inkubiert.(3) Die Bakterien-Phagen-Suspension wird 3 min. bei 6000 rpm zentrifugiert, das Pellet in

100 µl 2 x YT resuspendiert und auf 2 x YT-Ampicillin ausgestrichen.(4) Die Platten werden über Nacht bei 30°C inkubiert.(5) Am nächsten Morgen können die Kolonien auf den Titerplatten ausgezählt und der

Phagentiter bestimmt werden.Formel zur Titerberechnung: Koloniezahl x Verdünnungsfaktor x 2 = pfu/ml rescue

3 Methoden

77

3.6.5 Selektion der filamentösen Phagen auf Plaque Lifts

MaterialNitrozellulosefilter mit λ-Phagen-Fusionsprotein (Plaque Lifts)scFv exprimierende filamentöse PhagenTBSTMagermilchpulverWaschpuffer TBST + 1% BSA

Durchführung(1) Das λ-Phagen-Fusionsprotein wird wie unter 3.3.3 beschrieben auf Nitrozellulosefilter

übertragen, gewaschen und geblockt.(2) Die entsprechende Menge filamentöser Phagen (ca. 5 x 1013 pfu/ml rescue) pro Blot

wird in 20 ml TBST + 2% Magermilchpulver gelöst und eine Std. bei Raumtemperaturgeblockt. Die Phagen werden 1,5 Std. bei Raumtemperatur auf den Filtern selektio-niert.

(3) Da M13-Phagen die Eigenschaft besitzen, unspezifisch an unterschiedlichste Proteinezu binden, müssen die Blots intensiv gewaschen werden. Dies erfolgt 4 mal für 2 min.und dann 4 mal für je 10 min. mit Waschpuffer.

3.6.6 Nachweis gebundener Phagen

MaterialMaus anti-M13 AntikörperZiege anti-Maus Antikörper, gekoppelt an Alkalische PhosphataseWaschpuffer TBST + 1% BSATris-Cl pH 8,2Entwickler-Lösung siehe 3.3.4

Durchführung(1) Der anti-M13-Antikörper wird 1:1000 in Waschpuffer verdünnt (20 ml/Filter) und

1,5 Std. mit den Blots inkubiert.(2) Nach drei 5 minütigen Waschschritten erfolgt die Inkubation mit dem Ziege anti-

Maus-AP Antikörper (Verdünnung 1:7500 in Waschpuffer) für 1 Std.(3) Die Filter werden 2 mal mit Waschpuffer und abschließend 4 mal mit Tris-Cl pH 8,2 je

für einige min. gewaschen.(4) Die Blots werden 1,5 Std. bei 37°C unter leichtem Schütteln entwickelt.

Dissertation endgültige Fassung -...

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