Clonage dans un plasmide (pUC)

• Site multiple de clonage au niveaud'une portion du gène de la β-galacto-sidase E. coli (LacZ').

• Sélection des bactéries transformées(plasmide avec ou sans insert): ampR

• Sélection des bactéries transformées(plasmide avec insert): crible blanc/bleuen présence d'IPTG et de X-gal.

• Réplication indépendante de celle duchromosome bactérien (ori)

• Capacité de clonage: 3 - 4 kb

Cycles du bactériophage λλλλ (phage tempéré)

Cycle lytique Cycle lysogénique

Injection de l'ADN du phage dans la bactérie

Réplication de l'ADN Intégration de l'ADN duphage dans le chromosome

bactérien (prophage)

Réplication en même tempsque le chromosome bactérien

Synthèse des protéinesde la capside

Assemblage desparticules phagiques

Lyse bactérienne Excision du prophage

Induction Stimulusexterne

Génome du phage λλλλ

cosL cosR

Gènes essentiels au déroulement du cyclelytique (synthèse ADN, assemblage des

particules phagiques, lyse) → 60% du génome

Gènes essentiels au déroulement ducycle lysogénique → 25% du génome

Génome λλλλ: ADN bicaténaire de 48,5 kb

Structures du génome• Molécule linéaire dans les particules phagiques• Circularisation au niveau des extrémités cos (segments d'ADN simplebrin complémentaires) dans les bactéries infectées par le phage

Construction du vecteur de clonageλλλλ de type sauvageDélétion des gènesnon essentiels audéroulement du cyclelytiquecosL cosR

BamH1

Fragment de substitution

cosL cosR

Gène de sélection (ex: lacZ)Vecteur de clonage λλλλ (≅ 45 kb)Insertion d'un fragment desubstitution (≅ 15 kb)

cosL cosR

ADN exogène

Délétion du fragmentde substitutionInsertion de l'ADNexogène

Contrainte liée à l'assemblage de particules phagiques infectieusesLa taille de la molécule d'ADN doit être comprise entre 38 et 51 kb

Clonage de fragments d'ADN exogène de tailles comprisesentre 9 et 22 kb

Procédure de clonagedans le phage λλλλ

(T4 DNA ligase)

cosRcosR

Clonage dans un cosmide

Sites cos λλλλ→ Encapsidation in vitro→ Particules virales capables d'infecter E. coli (efficacité > transformation)

Origine de réplication plasmidique→ Multiplication dans la bactérie de la même façon qu'un plasmide

Cosmide: site cos du phage λλλλ + plasmide → Clonage de fragment de 45 kb maximum (capacité λλλλ ×3)

Site de clonage (Bgl II)Sites cos

Origine de réplication (ori)

Gène de résistance à latétracycline (tet R)

Sélection des bactériescontenant un cosmide

recombinant

4-6 kb

Individualisation etstockage des clones

recombinants

Procédure de clonage dans un cosmide

Dephosphorylate(alkaline

phosphatase)

(T4 DNA ligase)

Kan R

LoxP

LoxP

pacpBR322 ori

P1 plasmidreplicon

P1 lyticreplicon

ScaI

BamHIsacB

pAD 10sacBII(30 kb)

Vecteurs PAC (P1-derived artificial chromosome)

Bactériophage P1 Phage tempéré; hôte E. coliTaille du génome: 115 kb

Capacité de clonage desvecteurs PAC : 75-95 kb

Structure du vecteurori: origine de réplication plasmidique

Pac ("packaging site"): le clivage de ce site permet l'assemblage des particules virales

kanR: gène de résistance à la kanamicyne

sacB: gène de saccharose synthase; crible de sélection des bactéries recombinantes; sitede clonage (BamH1). La dégradation du saccharose produit un composé hautement toxiquepour les bactéries. Sur un milieu contenant du saccharose, seules les bactéries dont legène sacB est modifié se développeront.

LoxP: sites de recombinaison du phage P1

"P1 plasmid replicon": réplication et maintient d'une seule copie par bactérie

"P1 lytic replicon": gènes sous le contrôle du promoteur lac. Induction de par l'IPTG →l'amplification du nombre de copies du vecteur recombinant

Digestion du vecteurBamHI + ScaI

1. Digestion partielle d'ADNexogène de haut poidsmoléculaire2. Sélection des fragments de70-95 kb

Empaquetage in vitro

Infection E. coli (cre+)

Gène cre

Recombinase

Ligature → concaténairesClivage des sites pac (pacase)

P1 lyticreplicon

Circularisation

P1 plasmidreplicon

Sélection des colonies contenantun PAC recombinant

Milieu sélectifsaccharose + kanamycine

Individualisation etstockage des clones

lacZ'

Vecteurs BAC (Bacterial artificial chromosome)

Facteur F (fertilité) E. coli → plasmide impliqué dans la conjugaisonbactérienne.→ Intégration au chromosome bactérienréversible→ Excision du chromosome en même tempsqu'une portion du génome bactérien (× 10-100 kb → 4,6 Mb)

Structure des vecteurs BACoriS: origine de réplicationrepE: réplication du plasmide à partie de oriS;maintient du nombre de copies à 1-2 par celluleparA, parB: stabilité du plasmide; incompatibilitéavec d'autres facteurs F (parB)CMR: gène de résistance au chloramphénicolSite de clonage dans le gène lacZ': crible desélection blanc/bleu

Taille maximale des inserts300-350 kb, le plus souvent100-150 kb

Transformation E. coli parélectroporation

Étalement des bactéries sur unmilieu contenant du

chloramphénicol, de l'IPTG et del'X-gal

Sélection des colonies blanches

1. ADN de haut poids moléculairepartiellement digéré (HindIII)2. Sélection des fragments de taille > 150 kb (Electrophorèse en champ pulsé)

1. Digestion du vecteur (HindIII)2. Déphosphorylation(phophatase alcaline)

lacZ'

7 kbLigature

T4 DNA ligaseCMR

Stockage des clones(plaques de microtitration)

1 colonie bactérienne renfermant1 BAC recombinant

Cellules hôtesVecteur sans insert, circulaire→ E. coli → ori; agent de sélection: AmpR

Vecteur avec insert, YAC→ S. cerevisiae → ARS, CEN, TEL

AmpR

BamHI

TEL TEL

ori

TRP1

ARSCEN

EcoRISUP4

URA3pYAC4

(11,4 kb)

Vecteurs YAC (Yeast artificial chromosome)

Structure du vecteurARS: origine de réplication levureCEN4: centromère du chromosome IVTEL: Télomères du chromosome ITRP1 et URA3 : gène impliqué dans la synthèse du tryptophane (TRP1) et del'uracile (URA3); souche de levure mutée pour ces gènesSUP4: site de clonage; suppression d'une mutation qui confère une couleurblanche aux colonies de levure

Taille des inserts: 300-500 kb

1. Digestion partielle d'ADN de hautpoids moléculaire (EcoRI)2. Sélection de fragments > 200-300 kb(Electrophorèse en champ pulsé)1. Digestion du vecteur par BamHI + EcoR1

2. Déphosphorylation (phosphatase alcaline)

CEN

TRP1

TEL URA3 TEL

SUP4

CEN

TRP1

TEL URA3 TEL

Ligature T4 DNA ligase

Transformation S. cerevisiae(sphéroplastes; souche AB1380)

Culture sur milieu sélectif

Sélection des colonies recombinantes

1. Couleur rouge: présence d'un insert dans le YAC (disruption du gène SUP4)2. Croissance en absence d'uracile et de tryptophane: présence des 2 bras du vecteur

Individualisation et stockage des clones

Clonage dans un vecteur YAC

(Liliacée)Blé

OrgeHomme

MaïsTomate

Drosophile

Nématode

Levure

Nomcommun(famille)

9.21 × 1053. 07 × 1061. 15 × 107100 000Fritillaria assyriaca1.47 × 1054. 91 × 1051. 84 × 10616 000Triticum aestivum

87502.92 × 1041. 09 × 105950Lycopersicon esculentum2.43 × 1048.10 × 1043. 04 × 1052640Zea mays2.76 × 1049.21 × 1043. 45 × 1053000Homo sapiens4.50 × 1041.50 × 1055. 62 × 1054880Hordeum vulgare

152050601. 90 × 104165Drosophila melanogaster115038401. 45 × 104125Arabidopsis thaliana92030701. 15 × 104100Caenorhadditis elegans

110370138012Saccharomyces cerevisiae401405304.6Escherichia coli

YAC(500 kbp)

BAC(150 kbp)

Cosmide(40 kbp)

Taille dugénomeMbp/1C

Organisme

Nombre de clones (N) nécessaires pour avoir 99% de chances d'identifierune séquence particulière dans une banque de cosmide, de BAC ou de YAC,en fonction de l'espèce.

OCH2

H H

!"

H

H

H

BaseOP

O

O

!P

O

O

OP

O

O

O

Déoxyribonucléotidetriphosphate (dNTP)

O

H

OCH2

H H

!"

H H

BaseOP

O

!

Brin d'ADN en cours d'élongation

#$%

&$

OCH2

H H

"

H

H

H

BaseOP

O

O

OP

O

O

OP

O

O

O

Didéoxyribonucléotidetriphosphate (ddNTP)

Analogue structuraux des dNTP

Incorporation dans le brin encours d'élongation par uneADN polymérase

Blocage de l'incorporation denouveaux dNTP

Principe de la méthode de Sanger

Liaisonphosphodiester ADN polymérase

Réaction de séquence

P

A

P

C

P

G

P

G

P

C

P

T

P

A

P

C

P

P

T

P

G

P

C

P

C

!"

P

"

P

PP

G

!"

P

PP

A

ddNPT

dNPT

Amorce5'

3'

5'3'

Brin matrice

Mélange réactionnel• ADN matrice (double brin)• Amorce• dATP, dGTP, dTTP, dCTP• ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP• ADN polymerase thermostable

Incubation → Thermocycleur• Dénaturation (92-95°C)• Hybridation des amorces (55-60°C)• Elongation (70-72°C)

GddAGACCTddAGACCTAGddAGACCTAGAGTddA GACCTAGAGTATCddC

GAddCGACddCGACCTAGAGTATddC

ddGGACCTAddGGACCTAGAddG

GACCddTGACCTAGAGddTGACCTAGAGTAddT

ADN matrice + dNTP + Amorce marquée (fluorochrome ) + ADN polymérase

ddATP ddCTP ddGTP ddTTP

CCTATGAGATCCAG

-

+

CA G T

Faisceaulaser

Numérisation de l'image

Détermination de la séquence

Stockage de l'information

Amorce marquée(système LI-COR)

Enregistrement des signaux

CTGGATCTCATAGGGACCTAGAGTATCC

Brin matrice

CTGGATCTCATAGGGACCTAGAGTATCC

ADN matrice + dNTP + Amorce + ADN polymérase

ddGTPddCTPddATP

ddTTP+ ddNTP marqués

GGA

GAC

GACC

GACCTGACCTA

GACCTAGGACCTAGA

GACCTAGAG

GACCTAGAGT

GACCTAGAGTA

GACCTAGAGTAT

GACCTAGAGTATC

Analyse de la séquence

Stockage de l'information

Marquage terminal (ddNTP marqués)(système Applied Biosystems)

Lyse des bactéries

Préparation d'ADN plasmidiqueAmplification par PCR

Plasmide

Insert ADN bactérien

Séquençage

Préparation de l'ADN matrice pour le séquençage

Taille de l'insert: 1,5 kbp

Hybridation del'amorce avec le

brin -

Séquence du brin -Séquence du brin +

Séquençage à partir d'une matrice ADN double brin Hybridation del'amorce avec le

brin +Synthèse du brin -

Brin +Brin -

synthèse du brin +

Exemple: longueur maximale déterminée par le séquenceur = 1 kbp

Taille de l'insert: 3 kbp

Brin +Brin -

Zone de chevauchement

Séquence complète

Brin + Brin -

Séquence partielle

RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

Mutation ponctuelledisparition du site !

" # ! $

Sites de restriction de l'enzyme

Paire de chromosomeshomologues

Lignée A Lignée BSonde marquée radioactivement

Digestion de l'ADN parl'enzyme de restriction

Miration sur gel d'agarose

Transfert sur unemenbrane de nylon

(Southern blot)

Hybridation de la sonde Profil d'hybridation

-

+

Lign

ée A

Lign

ée B

F1Ségrégation 1:2:1 parmi

les descendants F2

Microsatellites (SSR pour Simple Sequence repeat)

11 répétitions du motif microsatellite

Paire de chromosomeshomologues

LignéeA

LignéeB

Amplification du locus par PCR→ Amorces marquées→ Incorporation de dNTP marqués

Miration sur gel de séquence(Séquenceur automatique)

Visualisation dupolymorphisme

-

+

Lign

ée A

Lign

ée B

F1Ségrégation 1:2:1 parmi

les descendants F2

16 répétitions du motif microsatellite

Sites d'hybridationdes amorces PCR

Détection du polymorphisme de séquences par SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)

Amplification PCR à partir d’amorces spécifiques de locus (introns, ADN non codant)

Polymorphisme de taille ou de restriction rarePolymorphisme de séquence fréquent

Homozygote AA Homozygote BBHétérozygote AB

Dénaturation: chaleur, formamide

Migration sur gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantesRévélation après coloration au nitrate d’argent

Cartes génétiques d'Arabidopsis thaliana (Alonso-Blanco et al., 1998)

A

A A

A

AB

BB

B

B

A: Ler × ColB: Ler × Cvi

Densité moyenne: 1 marqueur/cMRelation entre cartes génétiques et physiques: génome complet: 1 cM = 280 kb

Chr. 1: 1 cM = 240 kb Chr. 4: 1 cM = 215 kbChr. 2: 1 cM = 280 kb Chr. 5: 1 cM = 250 kbChr. 3: 1 cM = 310 kb

Relation entre distance physique et distance génétique

4570170350016 000Blé690(H)-1180(F)120(H)-210(F)2800(H)–4780(F)3300Homme *

44013527001200Soja134019018602500Maïs176010017003000Souris *

78075830650haricot7501051270950Tomate11805510201200Colza

0.2-8000.16Phage T4 *2.6-17504.6E. Coli *2.8260420012Levure *310320100Nématode *

200-260100-130480-630125A. Thaliana *60070280165Drosophile *2701301575430Riz *

(kbp)/cMChromosomeGénome (Mbp)

1800

Distance de carte(cM)

13 00015024 000Pin maritime

Longueur ADNLongueur du

génomeEspèce

Construction de cartes physiquesRegrouper et ordonner un ensemble de fragments d'ADN chevauchantsprovenant d'une (ou plusieurs) banques génomiques

Retrouver l'ordre linéaire des fragments d'ADN tels qu'il existe sur lechromosome dont ces fragments sont issus (assignation chromosomique)

1 contig

Contig de clones → ordonnancement de segments continus d'ADN sechevauchant partiellement

Insert de grande taille clonédans un YAC ou un BAC

Carte physique saturée lorsque le nombre de contigs est identique aunombre de chromosomes et que l'ensemble des contigs couvretotalement le génome

Etablissement de contigs à partir de cartes de restrictiondes inserts (Restriction Fragment Fingerprinting) %

Colonies bactériennes contenantdes BAC recombinants

Isolement de l'ADN des BAC

Digestion totale de l'ADN par unenzyme de restriction (6 bp)

Migration des profils derestriction sur gel d'agarose

Numérisation des images

23.112.2

5.1

2.0

0.4

kb

Ligne dedépôt

Marra et al., 1999. A map forséquence analysis of Arabidopsis

thaliana genome

Digestion HindIII

M

Etablissement de contigs à partir de cartes de restrictiondes inserts (Restriction Fragment Fingerprinting) &

Images numériséesDétermination de la taille des

produits de digestion dechacun des inserts

Carte de restriction desinserts et assemblage

des contigs

Assignationchromosomique Alignement

correctAlignementincorrect

Utilisation des données de cartographie génétique ( marqueursRFLP et microsatellites) pour la construction de cartes physiques

Dépôt de l'ADN des clones de labanque sur une série de menbrane

de nylon

Hybridation de chacunedes sondes avec l'ADN

des clones

Position des marqueurs moléculairessur le groupe de liaison

Sondes RFLP%%%% &&&& '''' (((( )))) **** ++++ ,,,,

(((( + ))))

%%%% + &&&&

&&&&

''''

**** + ++++

++++ + ,,,,)))) + ****

%%%% &&&&'''' (((( ))))

****++++

,,,,

Assemblage des contigs

Assignationchromosomique

Chromosome 4 Chromosome 5

Cartes physiques et génétiques deschromosomes 4 et 5 d'Arabidopsis thaliana

Source: http://nasc.nott.ac.uk/JIC-contig/

Utilisation des remaniements chromosomiques pourassigner des locus marqueurs à un chromosome

Remaniement chromosomique: modification visible de la séquence linéaire desgènes portés par un chromosome

Etudes de descendances: parent à caryotype normal × parent à caryotyperéarrangé

→ délétion, insertion, duplication, inversion, translocation de fragmentschromosomiques

Chromosome9 normal

Chromosome9 réarrangé

Chromosomesrecombinants

Assignation chromosomiquechez le maïs (Creighton etMcClintock, 1931)

Hybridation d'une sonde de β-tubuline sur des chromosomespolytènes de drosophile

Hybridation simultanée de 6 sondesspécifiques de chromosomes humainsrévélées par des fluorochromesdifférents.

Hybridation d'un mélange de sondescorrespondant à un contig de BAClocalisé à une des extrémité duchromosome 2 d'Arabidopsis thalialiana

Arabidopsis thalialiana → signal unique

Brassica rapa → signaux détectés sur 6paires de chromosomes

Hybridation simultanée de 6 sondes couvrant un contig de clones BAC de 431 kbp

Mycoplasmeset BactériesO.5 - 6 Mbp

Levure: 12 Mbp → 0.75 Mbp/chr.A. thaliana: 125 M bp → 25 Mbp/chr.Homme: 3000 Mbp → 130 Mbp/chr.

Techniques deséquençage

Comment déterminer la séquence des ces génome ?

Cartesphysiques

Cartesgénétiques

Banquesgénomiques

OutilsDéfinition

destratégies

Déterminer l'ordre desclones les uns par rapportaux autre (YAC, BAC, PAC)

Déterminer laséquence des clones

(Cosmides, plasmides)

Etablir le lien entre laséquence des clones etleur position physique

sur le génome

Cartes génétiquesMarqueurs cytologiques

Hybridation in situHybrides somatiques

Cartes physiques

Séquençage

" #

" Statégie dirigée → carte physique → sous clonage et séquence d'un minimum declones redondants

# Statégie directe ou aléatoire (whole genome shotgun sequencing) → banques deplasmides et de cosmides → séquences aléatoire des clones → carte physique

! Stratégie intermédiaire (hierarchical shotgun sequencing) → carte physique → sousclonage → séquences aléatoire des clones