•Αποµόνωση κλωνοποιηµένων γονιδίων

•Μεταφορά γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα (Γονιδιακή θεραπεία)

•Παραγωγή φαρµακευτικών ουσιών

Κλωνοποίηση γονιδιωµατικού DNA σε βιβλιοθήκες πλασµιδίων ή φάγων

1. Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA

2. Πέψη µε ένζυµα περιορισµού

3. ∆ηµιουργία ανασυνδυασµένων πλασµιδίων

4. Μετασχηµατισµός βακτηρίων

5. Ανάπτυξη βακτηρίων σε τρυβλία παρουσία αντιβιοτικού

6. Μεταφορά βακτηρίων σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης

7. Επεξεργασία νιτροκυτταρίνης για την πρόσδεση του πλασµιδιακούDNA

8. Υβριδοποίηση µε ραδιενεργό ανιχνευτή ειδικό για το επιθυµητόγονίδιο

9. Αυτοραδιογραφία

10. Επιλογή του κατάλληλου κλώνου

Κλωνοποίηση cDNA

1. Eπιλογή κατάλληλου ιστού στον οποίο εκφράζεται το γονίδιο

2. Αποµόνωση ολικού RNA από τον ιστό

3. Αποµόνωση mRNA µε χρωµατογραφία συγγένειας (ρητίνη µε ολιγο-dT)

4. Μετατροπή των mRNA σε cDNA µε αντίστροφη µεταγραφάση παρουσίαολιγο-dT (εκκινητής) που ζευγαρώνει µε πολύ-Α ουρές των mRNAs

5. ∆ιαχωρισµός DNA- mRNA κλώνων

6. Σύνθεση του συµπληρωµατικού DNA κλώνου από DNA πολυµεράση

7. Κλωνοποίηση σε πλασµίδιο

ΕφαρµογήcDNA χρησιµοποιείται για σύνθεση ανθρώπινων πρωτεΐνών σε βακτήρια

Κλωνοποίηση τµηµάτων DNA σε βακτήρια

1. Πέψη του DNA στόχουκαι του πλασµιδίου µε

περιοριστικές ενδονουκλεάσες

2. Αποµόνωση των επιθυµητώντµηµάτων DNA µετά από ηλεκτρο-φόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης

3. Σύνδεση των δύο τµηµάτωνµε λιγάση

4. Μετασχηµατισµός βακτηρίων

5. Επιλογή αποικιών παρουσίααντιβιοτικού

6. Καλλιέργεια βακτηρίων

7. Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA

8. Έλεγχος για την παρουσία τουDNA στόχου µε περιοριστικέςενδονουκλεάσες

ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

∆ιατήρηση ή ανάπτυξη κυττάρων σε καλλιέργεια για > 24 ώρες

Πρωτογενείς καλλιέργειες= η καλλιέργεια κυττάρων που προέρχεται από ένα ιστόή όργανο µετά την επίδραση ενζύµων πχ. θρυψίνης

∆ευτερογενείς καλλιέργειες= προέρχονται από τις πρωτογενείς και καλλιεργούνταικατ΄επανάληψη για εβδοµάδες ή µήνες, διατηρώντας τις βασικές τους ιδιότητεςπχ. ινοβλάστες, επιθηλιακά κύτταρα

Τα σωµατικά κύτταρα δεν είναι δυνατόν να καλλιεργούνται επ΄άπειρον. Ο αριθµός τωνγενιών µιας κυτταροκαλλιέργειας συµπίπτει µε τον ολικό αριθµό των µιτωτικώνδιαιρέσεων των ίδιων κυττάρων όταν αυτά βρίσκονται στον οργανισµό.

Κυτταρικές σειρές= αθάνατα καρκινικά κύτταρα που έχουν ληφθεί απ΄ευθείας από τονπάσχοντα οργανισµό ή από καλιεργούµενα κύτταρα που έχουν υποστεί κάποια αλλαγήκαι συµπεριφέρονται ώς καρκινικά (µετασχηµατισµένα, transformed).

Πάγωµα κυττάρων, αποθήκευση σε υγρό άζωτο, απόψυξη και καλλιέργεια.

ΤΡΟΠΟΙ ΕΙΣΑΓΩΓΗΣ DNA ΣΕ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗ (transfection)

1. Μικροένεση DNA στον προπυρήνα

2. Ηλεκτροπαλµός (electroporation), δηµιουργία παροδικών πόρων λόγω ηλεκτρικού παλµού

3. Χρήση πολυκατιόντων για την εξουδετέρωση των φορτίων σε DNA και κυτταρική µεµβράνη,

που παρεµποδίζουν την πρόσληψη του DNA

4. Πακετάρισµα του DNA σε λιποσώµατα και εισαγωγή του στο κύτταρο µε κυτταρική

σύντηξη

5. Μεταφορά µέσω σπέρµατος, πιθανόν σε συνδυασµό µε ενδοκυτταροπλασµατική ένεση

σπέρµατος (ICSI), ή µε ηλεκτροπαλµό.

Ενσωµάτωση του DNA στο γονιδίωµα γίνεται σε τυχαία θέση, συνήθως σε πολλαπλάαντίγραφα της ίδιας φοράς

Όταν µετασχηµατίζονται σωµατικά ή εµβρυικά βλαστικά κύτταρα, τότε απαιτείται έναςδείκτης θετικής επιλογής

Παροδική ή σταθερή έκφραση πρωτεϊνώνσε ευκαρυωτικά κύτταρα

Παρουσία αντιβιοτικού2 εβδοµάδες

Σταθερή έκφραση(ενσωµάτωση DNA)

48hrs

Συλλογή κυττάρωνΠαροδική έκφραση

(όχι ενσωµάτωση DNA)

Παροδική έκφραση=48hrs

Επιθυµητό Γονίδιο+

γονίδιο ανθεκτικότηταςσε αντιβιοτικό

Μετασχηµατισµός κυττάρωνµε Ηλεκτροπαλµό

Παρουσία αντιβιοτικού

Σταθερή έκφραση(>2 εβδοµάδες)

Μετασχηµατισµός κυττάρωνµε Λιποσώµατα

Συνθετική λιπιδικήδιπλοστιβάδα

Πλασµίδιο για υψηλή έκφραση γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα

Eφαρµογές• Μελέτη της λειτουργικότητας µιας πρωτεΐνης (φυσικού τύπου ή τροποποιηµένης)• Μελέτη της υπερέκφρασης µιας πρωτεΐνης• Παραγωγή φαρµακευτικών πρωτεϊνών (σωστή µετα-µεταφραστική τροποποίηση)• Μελέτη της ενεργότητας και ιστοειδικότητας υποκινητών ή ενισχυτών όταν η πρωτεΐνη που παράγεται

µπορεί εύκολα να ανιχνευθεί, είναι για παράδειγµα ένζυµο (β-γαλακτοσιδάση)

Μπορεί να επιτευχθεί παραγωγή πρωτεΐνης που να αντιστοιχεί στο 10% της πρωτεϊνικής παραγωγήςτου κυττάρου

ΓΟΝΙ∆ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ

Αντικατάσταση των µεταλλαγµένων γονιδίων που είναι υπεύθυνα για διάφορες ασθένειεςµε τα αντίστοιχα φυσιολογικά

Ακόµα σε πειραµατικό στάδιο

Ασθένειες στόχοι: κυστική ίνωση, αιµορροφιλία, υπερχοληστερολαιµία, µυική δυστροφία,έλλειψη της διαµινάσης της αδενοσίνης (ADA)

Απαραίτητες προϋποθέσεις: • Κλωνοποίηση του υπεύθυνου γονιδίου• Προσδιορισµός των κυττάρων που εµφανίζουν την βλάβη• Το γονίδιο πρέπει να ενσωµατωθεί στο γονιδίωµα κυττάρων που παραµένουν στονοργανισµό για µεγάλο χρονικό διάστηµα

Προβλήµατα:• Ακόµα δεν έχει βρεθεί ασφαλής φορέας για την αντικατάσταση του µεταλλαγµένου γονιδίου• Η ενσωµάτωση του γονιδίου γίνεται σε τυχαίες θέσεις κάτι που µπορεί να οδηγήσει σεκαταστροφή ενός ενδογενούς γονιδίου ή σε µείωση της έκφρασης ή µη έκφραση του γονιδίου.

Εισαγωγή DNA σε κύτταρα καλλιέργειας ή σε σωµατικά κύτταρα πειραµατικώνζώων µε ιούς (Μεταγωγή, transduction)

Ex vivo: Αποµόνωση κυττάρων από τον οργανισµόΓενετική τροποποίηση τους εκτός σώµατοςΜεταφορά τους και πάλι στον οργανισµό

In vivo: Απευθείας χορήγηση φορέων/γονιδίων στον οργανισµό

In vivo Ex vivo

Απλή, γρήγορη, οικονοµική Απαιτεί ειδικές εγκαταστάσεις,ακριβή

∆εν είναι κατάλληλοι όλοι οιφορείς

Μεγαλύτερη ποικιλία φορέων

Απευθείας µεταφορά φορέωνεγείρει ανησυχία για τηνασφάλεια

Τα γενετικώς τροποποιηµένακύτταρα µπορεί να ελεγχθούνπριν την εισαγωγή τους στονοργανισµό

∆εν απαιτεί αποµόνωση ιστών Απαιτεί αποµόνωση ιστών

Ιοί που ενσωµατώνονταιΡετροιοί

Ογκορετροιοί : Μολύνουν κύτταρα σε φάση διπλασιασµού, (MMLV) ευρέως διαδεδοµένοι σε κλινικές δοκιµές

Λεντι-ιοί: Μολύνει µη διπλασιαζόµενα κύτταρα, (HIV) δεν χρησιµοποιούνται ακόµα σε κλινικές δοκιµές

Αδενο-σχετιζόµενοι ιοί: Μολύνει µη διπλασιαζόµενα κύτταρα

Ιοί που δεν ενσωµατώνονταιΑδενοιοί: Μολύνει µη διπλασιαζόµενα κύτταρα, υψηλή αντιγονικότητα

ευρέως διαδεδοµένοι σε κλινικές δοκιµές

Ερπητοιοί: Μολύνει µη διπλασιαζόµενα κύτταρα, προκαλούν φλεγµονή,αρχικές γενιές ιών ήταν κυτταροτοξικές

ΡΕΤΡΟΙΟΙ

Αποτελείται από: •Ένα εξωτερικό φάκελο που προέρχεται από την κυτταρική µεµβράνη του κυττάρου ξενιστή•Αρκετά αντίγραφα µιας πρωτεΐνης φακέλου που βρίσκεται στην λιπιδική διπλοστιβάδα του φακέλου•Ένα καψίδιο; Ένα πρωτεινικό κέλυφος που περιβάλει:• δύο µόρια RNA και• το ένζυµο αντίστροφη µεταγραφάση (reverse transcriptase)

Το γονιδίωµα των ρετροιών

περιβάλλεται από επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες ("R") που• επιτρέπουν ενσωµάτωση στο γονιδίωµα του ξενιστή• λειτουργούν ως ενισχυτής

Όταν ένας ρετροιός µολύνει ένα κύτταρο :• Τα µόρια της αντίστροφης µεταγραφάσης µεταφέρονται στο κύτταρο συνδεδεµένα µε τα µόρια του RNA. • Η αντίστροφη µεταγραφάση συνθέτει DNA αντίγραφα του RNA. • Αυτά εισέρχονται στο πυρήνα και ενσωµατώνονται στο γονιδίωµα του κυττάρου. • Το DNA που ενσωµατώθηκε µεταγράφεται από τα ένζυµα του ξενιστή σε νέα µόρια RNA που εξέχρονται στοκυτταρόπλασµα όπου

•Κάποια µεταφράζονται από τα ριβοσώµατα του ξενιστή•Το γονίδιο gag µεταφράζεται σε µόρια της πρωτεϊνικής θήκης (καψιδίου)• Το γονίδιο pol µεταφράζεται σε µόρια αντίστροφης µεταγραφάσης• Το γονίδιο env µεταφράζεται στις πρωτεΐνες του φακέλου

• άλλα µόρια RNA χρησιµοποιούνται για την δηµιουργία νέων ιών

Εισαγωγή DNA σε κύτταρα καλλιέργειας ή σε σωµατικά κύτταρα πειραµατικών ζώωνµέσω ρετροιών

Γονιδιακή κατασκευήΚύτταρα πακεταρίσµατος

Μεταφορά γονιδίων σε κύτταραµε ρετροιούς

• Το φυσιολογικό γονίδιο ενσωµατώνεται σ’ ένα ιικό φορέα

• Μολύνει κύτταρα πακεταρίσµατος

• Παράγονται ιοί που περιέχουν το RNA του γονιδίου

• Οι τροποποιηµένοι ιοί µολύνουν σωµατικά κύτταρα π.χ.λεµφοκύτταρα που έχουν ήδη απονονωθεί και καλλιεργηθείex vivo

• To RNA θα µετατραπεί σε DNA που θα ενσωµατωθεί στογονιδίωµα του ξενιστή

Γονιδιακή κατασκευή

8 kb

ΓονίδιοR RP

R (LTRs, long terminal repeats):αλληλουχίες απαραίτητες για την ενσωµάτωση του DNA στο γονιδίωµα του ξενιστή,λειτουργούν επίσης ως ενισχυτές επιτρέποντας έντονη µεταγραφή του «ξένου γονιδίου»

P: αλληλουχίες απαραίτητες για το πακετάρισµα του RNA σε ιικά σωµατίδια

Πλεονέκτηµα: Ενδείκνυται για µακρόχρονη έκφραση του γονιδίουMειονέκτηµα: η ενσωµάτωση δεν είναι ειδική οπότε µπορεί να καταστρέψει ενδογενή γονίδια

Εφαρµογές

Εισαγωγή DNA σε κύτταρα καλλιέργειας ή σε σωµατικά κύτταρα πειραµατικών ζώωνµέσω ρετροιών

Τροποποίηση της γαµετικής σειράς σε ψάρια, µαλάκια, πτηνά, ποντίκια, αγελάδες

Αδενοϊοί

∆ιπλής έλικας DNA που κωδικοποιεί 30 πρωτεΐνες

Οι φυσικού τύπου ιοί µολύνουν το ανώτερο αναπνευστικόσύστηµα του ανθρώπου

Το DNA δεν ενσωµατώνεται στο γονιδίωµα του ξενιστή οπότε χάνεται σε κύτταρα πουδιπλασιάζονται

Ενδείκνυται ως φορέας σε κύτταρα που δεν πολλαπλασιάζονται

Μειονέκτηµα: Υψηλή αντιγονικότητα

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΕΜΒΟΛΙΩΝ

Τα κλασικά εµβόλια αποτελούνται από νεκρές ή εξασθενηµένες µορφές ενόςπαθογόνου µικροοργανισµού που παρότι δεν είναι πλέον µολυσµατικός επάγειενεργητική ανοσία δηλ. παραγωγή αντισωµάτων

Στάδια παρασκευής: Καλλλιέργεια, αποµόνωση, νέκρωση ή απενεργοποίηση

Παραδείγµατα: διφθερίτιδα, τέτανος, ευλογιά, πολιοµυελίτιδα

Μειονεκτήµατα:• ∆εν µπορούν να αναπτυχθούν όλοι οι µολυσµατικοί παράγοντες σεΚυτταροκαλλιέργειες ή αναπτύσσονται µε πολύ αργό ρυθµό

• Κίνδυνος έκθεσης προσωπικού παρασκευής εµβολίων στον παθογόνο παράγοντα

ΝΕΑ ΓΕΝΙΑ ΕΜΒΟΛΙΩΝ ΜΕ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΘΟ∆ΟΥΣ

Εµβόλια υποµονάδες: πρόκειται για χορήγηση πρωτεϊνών επιφάνειας τουπαθογόνου παράγοντα που έχουν αντιγονική ιδιότηταΣτάδια παρασκευής:• Αποµόνωση του γονιδίου του παθογόνου παράγοντα που κωδικοποιεί τηνπρωτεΐνη µε την αντιγονική δράση• Εισαγωγή του γονιδίου σε κυτταροκαλλιέργειες• Παραγωγή της πρωτεΐνης σε µεγάλες ποσότητες• Αποµόνωση και καθαρισµός της πρωτεΐνηςΠαράδειγµα: εµβόλιο εναντίον του ιού της ηπατίτιδα-Β

Εµβόλια από ζωντανούς γενετικά τροποποιηµένους ιούςΤο γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη µε την αντιγονική δράση ενσωµατώνεταισε ένα άλλο ιό που είναι αβλαβής για τον άνθρωπο (ιός δαµαλίτιδας). Ο γενετικάτροποποιηµένος ιός χορηγείται στον άνθρωπο.Παράδειγµα: εµβόλιο εναντίον του πλασµωδίου που προκαλεί ελονοσία

Χηµική σύνθεση πεπτιδίων που αντιστοιχούν στα ανοσογενή τµήµατα τωνπρωτεϊνών επιφάνειας

Πως λειτουργούν τα εµβόλια

Παραγωγή ινσουλίνης από βακτήρια

Παρελθόν: αποµόνωση ινσουλίνης από πάνγκρεας χοίρου ή αγελάδαςΜειονέκτηµα: η αµινοξική αλληλουχία δεν είναι πανοµοιότυπη µεαυτή του ανθρώπου οπότε κάποιοι ασθενείς ανάπτυσσαν αντισώµατα

Ανασυνδυασµένη ινσουλίνη: πεπτίδιο Α+ ΒΣτάδια• Κατασκευή 2 ξεχωριστών πλασµιδιακών φορέων που παράγουντην Α και την Β αλυσίδα της ινσουλίνης στο καρβοξυτελικό άκροτης β-γαλακτοσιδάσης• Μετασχηµατισµός βακτηρίων• Καλλιέργεια βακτηρίων• Αποµόνωση β-γαλακτοσιδάσης-ινσουλίνης χιµαιρικής πρωτεΐνης• Αποικοδόµηση της β-γαλακτοσιδάσης µε πέψη κυανογόνου βρωµιδίου• Καθαρισµός Α και Β αλυσίδων• Συνένωση των Α και Β αλυσίδων σε ενεργή ινσουλίνη(δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών)

ΠΡΟΣΟΧΗΧρησιµοποιείται µόνο cDNA και πότε γενωµικό DNA(τα βακτήρια δεν µπορούν να κάνουν µάτισµα)

Οι πρωτεΐνες που παράγονται δεν έχουν µετα-µεταφραστικέςτροποποιήσεις όπως συµβαίνει στα θηλαστικά π.χ. γλυκοζυλίωση

Παραγωγή φαρµακευτικών πρωτεϊνών από κτηνοτροφικά ζώα

1. Επιλογή υποκινητών γονιδίων που εκφράζονται σεκύτταρα του µαστικού αδένα π.χ. καζεΐνη, β-γαλακτοσφαιρίνη

2. Προετοιµασία διαγονιδιακής κατασκευής

3. Εισαγωγή διαγονιδίου στον προπυρήνα γονιµοποιηµένουωαρίου µε µικροένεση

4. Εµφύτευση σε θετή µητέρα

5. Ταυτοποίηση διαγονιδιακών απογόνων µε PCR

6. Συλλογή γάλακτος

7. Αποµόνωση και καθαρισµός φαρµακευτικής πρωτεΐνηςαπό το γάλα

Παραδείγµατα φαρµακευτικών πρωτεϊνών που παράγονταιαπό διαγονιδιακά ζώα

Πρωτεΐνη ΑσθένειαΙνσουλίνη Σακχαρώδης

∆ιαβήτηςΠαράγοντας ΙΧ Αιµορροφιλία Α,ΒΕνεργοποιητήςΠλασµινογόνου

Θροµβώσεις, έµφραγµα

Ιντερφερόνες Καρκίνος∆ιαµεµβρανικόςρυθµιστής

Κυστική ίνωση

Αυξητική ορµόνη ΑχονδροπλασίαΑ1-Αντιθρυψίνη Πνευµονικό εµφύσηµαΠαράγοντας CD4 AIDS