BioengCourse-Stem Cell Bioengineering01

ΜΑΘΗΜΑ ETY-494

«ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ»

Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Υλικών, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Κρήτης

∆ρ. Γεώργιος Βλαστός (E-mail: [email protected])

Ιστοσελίδα Μαθήματος: http://www.materials.uoc.gr/courses/ETY494

Βιοϊατρική Μηχανική Βλαστοκυττάρων. Μέρος Α: Βασικές Έννοιες

Απώλεια κυττάρων και ιστού οργάνωνΑπώλεια κυττάρων και ιστού οργάνων

2

Γήρανση

Χημοθεραπεία

Σωματικό η ισχαιμικό τραύμαΈμφραγμα του μυοκαρδίου

ΕγκεφαλικόΕγκεφαλικό

Κάταγμα σπονδυλικής στήλης

Εκφυλιστικές ασθένειες

Alzheimer

Parkinson

Διαβήτηςβή η

Αρθρίτιδα

Οστεοπόρωση

Νεφρική ανεπάρκειαΝεφρική ανεπάρκεια

Βιοϊατρική Μηχανική ΒλαστοκυττάρωνΒιοϊατρική Μηχανική ΒλαστοκυττάρωνStem Cell BioengineeringStem Cell BioengineeringStem Cell BioengineeringStem Cell Bioengineering

3

Στο άμεσο μέλλον οι θεραπείες με βλαστοκύτταρα θα αποτελούν όλο και περισσότερο κλινική πρακτική και ερευνητικό αντικείμενο.

Η Αναπαραγωγική Ιατρική (Regenerative Medicine)Η Αναπαραγωγική Ιατρική (Regenerative Medicine) και η Ιστομηχανική (Tissue Engineering)συνδυάζουν τους κλάδους της Βιολογίας και της Βιοϊατρικής Μηχανικής για την ανάπτυξη βιολογικών υποκατάστατων που σκοπός τουςβιολογικών υποκατάστατων, που σκοπός τους είναι η επαναφορά και η αναπαραγωγή ιστών και οργάνων του σώματος ύστερα από βλάβες.

Επειδή στην Αναπαραγωγική Ιατρική τα πρόδρομα και βλαστικά κύτταρα (progenitor and stem cells) καλλιεργούνται σε τρισδιάστατα ικριώματα (scaffolds) όπου τα κύτταρα προσκολλούνται και διαφοροποιούνται, τα βιοϋλικά που χρησιμοποιούνται παίζουν κρίσιμο ρόλο.

Ανάπτυξη δυνατότητας εφαρμογών Γενετικής Μηχανικής για γονιδιακή θεραπεία.

Α ώ βλή έλλ ψ δ ώΑντιμετώπιση του προβλήματος έλλειψης δοτών οργάνων και παράνομου εμπορίου οργάνων κυρίως στον τρίτο κόσμο.Nature Biotechnology, Vol. 18, 201-206, 2001

Τι είναι τα βλαστοκύτταρα;Τι είναι τα βλαστοκύτταρα;

Το βλαστοκύτταρο ορίζεται με 3 κριτήρια

4

Το βλαστοκύτταρο ορίζεται με 3 κριτήρια:

1. Αυτο‐ανανέωση.

2. Δυνατότητα διαφοροποίησης σε πολλαπλούς κυτταρικούς τύπουςτύπους.

3. Ικανότητα να επαναφέρει στην αρχική του μορφή ένα δεδομένο ιστό.

Το πλέον πρωτόγονο βλαστοκύτταρο στον οργανισμό είναιΤο πλέον πρωτόγονο βλαστοκύτταρο στον οργανισμό είναι το γονιμοποιημένο ωάριο (fertilized oocyte or zygote).

Όταν το ωάριο διαιρείται, οι απόγονοί του ύστερα από δύο κυτταρικές διαιρέσεις αντιπροσωπεύουν τα ολοδυναμικά ύ (t ti t t ll ) δ ύ ίλκύτταρα (totipotent cells) που δημιουργούν μια κοίλη κυτταρική μπάλλα την βλαστοκύστη (blastocyst) η οποία περιέχει μία συστάδα από κύτταρα που ονομάζεται εσωτερική κυτταρική μάζα (inner cell mass). Από αυτήν

ύ έ β ά β ϊ άαναπτύσσεται το έμβρυο και παράγονται τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (πάνω).

Oι περισσότεροι ιστοί έχουν πολυδυναμικά κύτταρα (multipotent stem cells) που μπορούν να παράξουν περιορισμένες κυτταρικές σειρές (μέση).

Τα μονοδυναμικά βλαστοκύτταρα (unipotent stem cells) παράγουν ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρων (κάτω).

Goessler et al. Cells Tissues Organs 183:169–179, 2006

Προέλευση των βλαστοκυττάρωνΠροέλευση των βλαστοκυττάρωνρ η β ρρ η β ρ

5

Εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (embryonic stem cells)Παίρνονται από την βλαστοκύστη του εμβρύου.

Σε αργότερο στάδιο μπορούν να παρθούν πιο εξειδικευμένες κυτταρικές σειρές όπως π.χ. τα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (embryonic Endothelial Progenitor Cells, eEPC).

Στο νωτιαίο μυελό βρίσκουμε διάφορα είδη εφήβων βλαστοκυττάρων (adult stem cells)( )

Τα κυκλοφορούντα ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (circulating endothelial progenitor cells).

Τα αιματοποιητικά βλαστοκύτταρα (hematopoetic stem cells HSC)Τα αιματοποιητικά βλαστοκύτταρα (hematopoetic stem cells, HSC).

Τα μεσενχυμικά βλαστοκύτταρα (mesenchymal stem cells, MSC).

Τα πολυδυναμικά έφηβα πρόδρομα κύτταρα (multipotential adult progenitor cells, MAPC) είναι υποκατηγορία των μεσενχυμικών βλαστοκυττάρωνMAPC) είναι υποκατηγορία των μεσενχυμικών βλαστοκυττάρων.


Ανθρώπινη εξέλιξη και βλαστοκύτταρα Ανθρώπινη εξέλιξη και βλαστοκύτταρα (video)(video)ρ η ξ ξη β ρρ η ξ ξη β ρ ( )( )

6

Human embryonic development depends on stem cells During the cells. During the course of development, cells divide, migrate, and specialize. Early in development, a group of cells called the inner cell mass (ICM) forms. These cells are able to produce all the tissues of the body. Later in development, during gastrulation, the three germ layers form germ layers form, and most cells become more restricted in the types of cells that they can produce.

Blood Islands

Undiffer-entiated

VasculogenesisMouse day 7.5 Chorion

Ectoplacental Cone

entiated

EndodermEndothelialcells

The vascular system arises early in embryogenesis to meet h i i l d f

Mesoderm Blood cellsExocoelomic

Cavity

the nutritional needs of the developing organism. At E7.5 in the mouse, the extraembryonic

Allantois Vasculogenesissignifies de novo formation of bloodvessels from

mesodermal cells of the yolk sac aggregate into clusters that constitute the initial stage of blood island formation Shortly

1st Aortic Arch

vessels from angiogenic precursor cells. Later inembryogenesis, the vascular tree grows by

island formation. Shortly thereafter, blood islands differentiate into an external layer of endothelial cells and an i f bl d ll

Amniotic Cavity

Endocardium1st Aortic Arch

Amnionvascular tree grows by sprouting, celldivision, migration and assembly of endothelial cells

inner core of blood cells . At about the same time, embryonic cells of the proximal lateral mesoderm assemble Cavity endothelial cells

derivedfrom pre‐existing vessels through a process termed

into pre‐endocardial tubes that connect anteriorly togenerate cardiac endocardium around

Ectoderm

Mesoderm Endoderm Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

process termedangiogenesis

endocardium around the anterior intestinalportal.

Isolation of embryonic Endothelial Progenitor Cells Isolation of embryonic Endothelial Progenitor Cells (eEPCs)(eEPCs)

Embryo day 7.5 Properties of embryonic EPCs

1. Unlimited stem‐cell like growth

2. Amenable to genetic engineering

3. Early isolation: a panel of “WT” and “KO” eEPCs

4. Plasticity ‐ in vivo potential

Primary eEPC lines

Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

Παραγωγή εμβρυϊκών κυτταρικών σειρών στο Παραγωγή εμβρυϊκών κυτταρικών σειρών στο ήή ( id )( id )εργαστήριο εργαστήριο (video)(video)

9

The inner cell mass (ICM) cells of blastocyst-stage early human embryos can be removed and cultured. These cells can be grown in the lab indefinitely. Various growth factors cause these cells to develop into a variety of differentiated cells, such as muscle or nerve cells.

Gene induction: effector genesGene induction: effector genesgg

10

Angiogenesis

VEGFR-1

Coagulation

Thrombomodulin

Atherosclerosis

ApoE

Inflammation

E-selectinVEGFR-1

VEGFR-2

Tie-1

Tie 2

Thrombomodulin

vWF

Tissue Factor

thrombin receptor

ApoE

glutathione peroxidases

oxidative stress-induced protein

transthyretin

E-selectin

P-selectin

VE-cadherin

VCAM 1Tie-2

Eph-B4

ephrin-B2

G A

thrombin receptor

eNOS

PECAM-1

transthyretin

M-CSF

VCAM-1

Toll-like R2

Toll-like R4

C C 2 8VEGF-A

Ang2

TGFβ

CXCR 2, and 8

CCR 1, 3, 5 and 8

NF-κB

TGFβ RII

Alk-1

SCL

CBF


EMBRYONIC EPCs FORM VASCULAR STRUCTURESEMBRYONIC EPCs FORM VASCULAR STRUCTURES IN VIVOIN VIVOEMBRYONIC EPCs FORM VASCULAR STRUCTURES EMBRYONIC EPCs FORM VASCULAR STRUCTURES IN VIVOIN VIVO

A: Host

B: Donor (eEPCs)

C: Incorporation


eEPCs express key genes for vascular formation eEPCs express key genes for vascular formation and endothelial cell functionand endothelial cell functionand endothelial cell functionand endothelial cell function

‐ Undifferentiated+ Differentiated eEPCs

Induced genesHatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

Βλαστική ετερογένεια στους ιστούς και λειτουργικότητα Βλαστική ετερογένεια στους ιστούς και λειτουργικότητα των βλαστοκυττάρων γιά ανανέωσητων βλαστοκυττάρων γιά ανανέωσητων βλαστοκυττάρων γιά ανανέωσητων βλαστοκυττάρων γιά ανανέωση

13

Rando AT, Nature 2006

Διαφοροποίηση ανθρώπινων εμβρυϊκών Διαφοροποίηση ανθρώπινων εμβρυϊκών βλ άβλ ά ( id )( id )βλαστοκυττάρων βλαστοκυττάρων (video)(video)

14

As a human embryo develops, its cells become progressively restricted in the types restricted in the types of specialized cells that they can produce. Inner cell mass (ICM) cells of the blastocyst can make any type of body cell. Gastrula-stage cells can give rise to the cells of a given germ layer. Later, cells become even more restricted. For example, the pancreatic bud of the pancreatic bud of the endoderm layer can only make the cells of the pancreas.

Επίδραση των αυξητικών παραγόντων σε Επίδραση των αυξητικών παραγόντων σε οστεομυϊκούς ιστούςοστεομυϊκούς ιστούςοστεομυϊκούς ιστούςοστεομυϊκούς ιστούς

15

Για την καλλιέργεια και διαφοροποίηση βλαστοκυττάρων και μοσχευμάτων βλαστοκυττάρωνκαι μοσχευμάτων βλαστοκυττάρων χρησιμοποιούνται εξωτερικοί αυξητικοί παράγοντες όπως οι κυτοκίνες. Αυτές σπρώχνουν τα βλ ύβλαστοκύτταρα να διαφοροποιηθούν σε συγκεκριμένη κατεύθυνση, χρησιμοποιώντας την ανασυνδυαζόμενη τεχνολογίαανασυνδυαζόμενη τεχνολογία DNA. Οι αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών με τα κύτταρα και τα μηχανικά ικριώματα όπου δ άζ ύ έεδράζονται τα κύτταρα, έχουν μεγάλη σημασία γιά την αναπαραγωγή του ιστού.


Μεταγραφικοί παράγοντες που χαρακτηρίζουν τη διαφοροποιήση Μεταγραφικοί παράγοντες που χαρακτηρίζουν τη διαφοροποιήση των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε κύτταρα της καρδιάςτων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε κύτταρα της καρδιάςτων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε κύτταρα της καρδιάςτων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε κύτταρα της καρδιάς

16

Srivastava & Ivey, Nature 2006

AcLDL and Lectin staining of EPCs isolated from human peripheral blood after 6 days in culture on glass slides in DMEM supplemented with 20%FBS d 100 / L ECGSFBS and 100 μg/mL ECGS (Initial density of MNCs: 8.75x105 cells/well)

AcLDL Ulex Europaeus AcLDL / Ulex Europaeus

Double Staining

Rat VSMCs

Negative Control

20% FBS EBM+ Single Quots


Double Staining

Negative Control

EPCs Fibronectin


Double Staining

20% FBS DMEM + 100 μg/mL ECGS

S g

EPCs Gelatin

Adherent cells after 2 weeks on 24‐well fibronectin coated culture plates (8.75x105 MNCs/well)

Human microvascular ECs

Positive Control


Double Staining

Τα εμβρυϊκά πρόδρομα βλαστοκύτταρα είναιΤα εμβρυϊκά πρόδρομα βλαστοκύτταρα είναιανοσοπρονομιούχαανοσοπρονομιούχα ((immunoprivilegedimmunoprivileged))ανοσοπρονομιούχα ανοσοπρονομιούχα ((immunoprivilegedimmunoprivileged))

18

Τα εμβρυϊκά πρόδρομα βλαστοκύτταρα είναι ανοσοπρονομιούχα (immunoprivileged) και έτσι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε θεραπείες και να μην απορρίπτονται σαν μόσχευμα, κάτι που συμβαίνει με άλλους τύπους κυττάρων μετά από μέτρηση μεκυττάρων, μετά από μέτρηση με Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry, Fluorescent Activated Cell Sorting; FACS).

Σε υποξικές συνθήκες έχουμε ανεβασμένη έκφραση του VEGF σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. Το VEGF αυξάνει την αγγειογένεση και ασκεί πολλαπλασιαστική και αντι‐αποπτωτική επίδραση στύς όγκους και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των όγκωνενδοθηλιακά κύτταρα των όγκων.

Wei et al. Cancer Cell, 2004

Προοπτικές χρήσης των βλαστοκυττάρωνΠροοπτικές χρήσης των βλαστοκυττάρωνρ ς χρή ης β ρρ ς χρή ης β ρ

19

Η έρευνα στα ανθρώπινα βλαστοκύτταρα συναντά βιοηθικά εμπόδια, γι’ αυτό και έχει αναπτυχθεί πολύ η έρευνα στα βλαστοκύτταρα ποντικού που είναι γενετικά κοντά στον άνθρωπο.

Επίσης χρησιμοποιούνται συχνά ανθρώπινα έφηβα βλαστοκύτταρα τα οποία ανΕπίσης χρησιμοποιούνται συχνά ανθρώπινα έφηβα βλαστοκύτταρα τα οποία αν και λίγα σε αριθμό, είναι αυτόλογα, μπορούν να παρθούν από το αίμα και το νωτιαίο μυελό και βοηθούν να ξεπεραστούν τα βιοηθικά διλλήματα που υπάρχουν με την χρήση εμβρύων.υπάρχουν με την χρήση εμβρύων.

Πρόσφατες ανακαλύψεις που μετατρέπουν π.χ. τα δερματικά κύτταρα σε άλλους ύ ά βλέ ύ ύ έλλτύπους κυττάρων, προβλέπεται να χρησιμοποιούνται ευρύτατα στο μέλλον για την Αναπαραγωγική Ιατρική.

Embryonic endothelial Embryonic endothelial progenitorprogenitor cell (cell (eEPCeEPC) homing ) homing i i h i /h i i i h i /h i in ischemic/hypoxic areasin ischemic/hypoxic areas

20

Tα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά βλαστοκύτταρα έχουν την ιδιότητα να καταφεύγουν σε ισχαιμικές/υποξικές περιοχέςισχαιμικές/υποξικές περιοχές της κυκλοφορίας.

Προωθούν την δημιουργία νέων αγγείων και βελτιώνουν την αποκατάσταση των ιστών μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου.

Μπορούν να χρησιμοποιηθούνΜπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν κυτταρικό όχημα γιά γονιδιακή θεραπεία.

Δεν γνωρίζουμε το μηχανισμό h iτου homing.

Είναι πιθανό τα βλαστοκύτταρα να εκφράζουν παράγοντες που λόγω αυτών ρ γ ς γνα έλκονται στις ισχαιμικές περιοχές.

Kupatt et al. FASEB, 2005

Τεχνική μικροσυστοιχίας Τεχνική μικροσυστοιχίας DNA (video)DNA (video)χ ή μ ρ χ ςχ ή μ ρ χ ς ( )( )

21

Dr. Melton describes the process used to process used to extract DNA from a cell and to analyze it on a gene chip. Also featured on the DVD Potent Biology: Potent Biology: Stem Cells, Cloning, and Regeneration, available free from HHMI.

Εκκρινόμενοι παράγοντες από τα εμβρυϊκά Εκκρινόμενοι παράγοντες από τα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταραενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (( EPCEPC))ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταραενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα ((eEPCeEPC))

22

...συνέχεια

23

...συνέχεια

24

Ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα σε καλλιέργειαΑνθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα σε καλλιέργεια( id )( id )(video)(video)

25

Cell cultures derived from human embryonic stem cells can reproduce indefinitely and also differentiate into specialized cell types, including beating heart cells. Also featured on the DVD Potent Biology: Stem Cells, Cloning, and Regeneration, available free from HHMI.

Μεταφορά πυρήνα σωματικού κυττάρουΜεταφορά πυρήνα σωματικού κυττάρου (video)(video)

26

φ ρ ρή μ ρφ ρ ρή μ ρ ( )( )

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is performed looking through a microscope through a microscope and using small glass pipettes to handle human eggs and to remove and transfer nuclei from one cell to another. SCNT is used to produce clones of cells with the same genetic background g gas the donor nucleus. Also featured on the DVD Potent Biology: Stem Cells, Cloning, and Regeneration and Regeneration, available free from HHMI.

ΕπόμενοΕπόμενο σεμινάριο: Μηχανική Βλαστοκυττάρωνσεμινάριο: Μηχανική Βλαστοκυττάρων..Μέρος Β: Κλινικές εφαρμογέςΜέρος Β: Κλινικές εφαρμογέςΜέρος Β: Κλινικές εφαρμογέςΜέρος Β: Κλινικές εφαρμογές

27

Στο επόμενο μάθημα θα ασχοληθούμε με κλινικές εφαρμογές της Μηχανικής μ ς φ ρμ γ ς ης ηχ ήςΒλαστοκυττάρων.

Θα επικεντρωθούμε στις εφαρμογές στο καρδιοαγγειακό σύστημα.

Τρόποι έκχυσης βλαστοκυττάρων στο σώμα.

Γονιδιακή Μηχανική.ή ηχ ή

Επισκόπηση των σημαντικότερων μελετών σε ζώα και ανθρώπους.

Προβλήματα τεχνικής και ηθικήςΠροβλήματα τεχνικής και ηθικής φύσεως...

BioengCourse-Stem Cell Bioengineering01

Documents

Transcript of BioengCourse-Stem Cell Bioengineering01